Metoda oparta na immunofluorescencji do ilościowego określania stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:37 min. • July 8th, 2025
Zacznij od komórek rakowych zawierających IdU, syntetyczny substytut nukleotydu tymidynowego, już zintegrowany z ich DNA. Kiedy komórki te napotykają stres replikacyjny, ich synteza DNA zatrzymuje się, ujawniając IdU w odsłoniętych jednoniciowych regionach DNA.
Napraw komórki i dodaj cząsteczki detergentu, aby błona komórkowa była przepuszczalna.
Dodaj BSA, aby zablokować miejsca wiązania przeciwciał niebędących celem.
Wprowadź przeciwciała anty-IdU, które oddziałują z jednoniciowym DNA znakowanym IdU.
Dodaj zielone przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które są ukierunkowane na przeciwciała anty-IdU. Usunąć niezwiązane przeciwciała.
Umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku zawierającym podłoże montażowe z barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuj niebieskie jądra.
Zielone ogniska fluorescencji reprezentują przeciwciała wiążące się z jednoniciowym DNA.
Policz liczbę ognisk, aby określić ilościowo poziom stresu replikacji.
Dodać 1 mililitr zawiesiny komórkowej na szkiełkach nakrywkowych z poli-L-lizyny umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki i hodować komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach. Po podwojeniu j
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych