Metoda oparta na immunofluorescencji do ilościowego określania stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych

Zacznij od komórek rakowych zawierających IdU, syntetyczny substytut nukleotydu tymidynowego, już zintegrowany z ich DNA. Kiedy komórki te napotykają stres replikacyjny, ich synteza DNA zatrzymuje się, ujawniając IdU w odsłoniętych jednoniciowych regionach DNA.

Napraw komórki i dodaj cząsteczki detergentu, aby błona komórkowa była przepuszczalna.

Dodaj BSA, aby zablokować miejsca wiązania przeciwciał niebędących celem.

Wprowadź przeciwciała anty-IdU, które oddziałują z jednoniciowym DNA znakowanym IdU.

Dodaj zielone przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które są ukierunkowane na przeciwciała anty-IdU. Usunąć niezwiązane przeciwciała.

Umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku zawierającym podłoże montażowe z barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuj niebieskie jądra.

Zielone ogniska fluorescencji reprezentują przeciwciała wiążące się z jednoniciowym DNA.

Policz liczbę ognisk, aby określić ilościowo poziom stresu replikacji.

Dodać 1 mililitr zawiesiny komórkowej na szkiełkach nakrywkowych z poli-L-lizyny umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki i hodować komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach. Po podwojeniu jednej populacji odessać istniejące pożywki z płytki i pulsować komórki 10 mikromolowymi IdU w celu uzyskania dwóch kolejnych podwojeń populacji.

Aby zebrać komórki, zastąp podłoże lodowatym 0,5% PBSTx na lodzie przez 5 minut. W celu utrwalenia komórek odessać PBSTx i inkubować komórki przez 15 minut z 3% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej. Po 3 do 4 praniach z PBS utrzymuj stałe komórki w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Po utrwaleniu należy przepuszczać komórki za pomocą 0,5% PBSTx na lodzie przez 5 minut, upewniając się, że pokryto całe szkiełko nakrywkowe. Po umyciu komórek 3 do 4 razy 1 mililitrem 0,2% PBST w temperaturze pokojowej, odessać PBST i zablokować próbki, używając 5% BSA wykonanego w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Do barwienia immunologicznego przygotuj nawilżoną komorę, kładąc mokry ręcznik papierowy na płaskim dnie Tupperware. Przykryj pokrywę płytki 24-dołkowej parafilmem. Umieść go w nawilżonej komorze i połóż szkiełka nakrywkowe na pokrywie płytki. Dodać 60 mikrolitrów rozcieńczonego pierwszorzędowego przeciwciała mysiego anty-BrdU na wierzch szkiełka nakrywkowego.

Alternatywnie, aby zmniejszyć wysychanie przeciwciała i zużyć mniejszą objętość, umieść kroplę rozcieńczonego przeciwciała na parafilmie i odwróć na nią szkiełko nakrywkowe. Następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe.

Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i umyć je 4 razy 0,2% PBST. Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe na szkiełko nakrywkowe, jak pokazano wcześniej, i inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Oznacz szkiełko mikroskopowe i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach za pomocą nośnika montażowego DAPI. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, jeśli podłoże montażowe wymaga utwardzenia lub utwardzenia.