Name: Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Poznaj trzy metody analizy proliferacji komórek w liniach raka piersi MCF-7: klasyczne liczenie, luminescencyjna wykrywalność oraz liczenie za pomocą imagera komórkowego. Porównaj ich zalety i ograniczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr Hamishowi Campbellowi i Prof. Antony'emu Braithwaite'owi za pomoc w rozwoju transdukowanych linii komórkowych MCF-7-LeGO. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe ze strony Fundacji Bloomfield Group za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute. BCM jest wspierany przez stypendium APA za pośrednictwem Uniwersytetu w Newcastle oraz stypendium MM Sawyer za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute.

1. Przygotowanie komórek do testów proliferacji
Uwaga: Przygotuj dwie linie komórkowe w ten sam sposób i zasiewaj w tym samym formacie dla każdej metody, która ma być analizowana.
<ol>
	<li>Hoduj 7 komórek MCF-7-LeGO i MCF-7-Δ40p53 do 75-80% konfluencji w kolbach do hodowli tkankowych T 75 cm2 przy użyciu wolnego od czerwieni fenolu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 mM L-glutaminy, 2 μg/ml insuliny i 1 μg/ml Puromycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Obsługa komórek w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. 
	Uwaga: Czas potrzebny do wyhodowania komórek do zbiegu różni się w zależności od rozcieńczenia siewu. W ramach przygotowań do posiewu komórek do testów proliferacji, wysiewaj komórki w rozcieńczeniu 1:3 w uzupełnionym DMEM i utrzymuj w normalnych warunkach wzrostu przez 3 dni do zbiegu 75-80%.</li>
	<li>Aby usunąć komórki z kolby, należy wylać pożywkę do pojemnika na odpady. Natychmiast umyj warstwę komórkową 2 ml podgrzanej 2x trypsyny. Odessać trypsynę. Dodać kolejne 2 ml wstępnie podgrzanej trypsyny do warstwy komórkowej i umieścić w inkubatorze na 5 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
	<ol>
		<li>Po odłączeniu komórek umyj je 10 ml podgrzanego, świeżo uzupełnionego DMEM. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 491 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Ostrożnie odessać i usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżo uzupełnionego DMEM. Wykonaj liczenie komórek, aby określić prawidłową gęstość do zasiewu komórek na 96-dołkowych płytkach.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny komórkowej w 900 μl 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS). Umieść nowy czujnik 60 μm na automatycznym liczniku komórek. Przytrzymaj tłok i zanurz czujnik w zawiesinie rozcieńczonej komórki. Powoli zwolnić tłok na liczniku ogniw. Po zakończeniu wyjmij czujnik z licznika ogniw. 
		Uwaga: Liczba komórek zostanie wyświetlona na liczniku komórek w komórkach/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki nasienne w końcowej objętości 100 μl (w DMEM) na 96-dołkowej płytce przy ~20% konfluencji, aby zapewnić miejsce na wzrost komórek i pomiar proliferacji w ciągu 3-5 dni (patrz Tabela 1). Wysiewaj wszystkie linie komórkowe w trzech egzemplarzach. 
	Uwaga: W tym eksperymencie oceniono trzy różne gęstości komórek w celu określenia optymalnej gęstości komórek. Wymagane numery komórek podsumowano w tabeli 1. Komórki nasienne o mniejszej gęstości, jeśli wymagany jest pomiar bardziej długoterminowego wzrostu.
	<ol>
		<li>W przypadku hemocytometru i testów opartych na luminescencji należy przygotować jedną płytkę na punkt czasowy (tj. 4 płytki na test). Do testu obrazowania komórek należy przygotować tylko jedną płytkę na czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Określanie liczby komórek za pomocą hemocytometru
<ol>
	<li>Podgrzej zarówno pożywkę, jak i trypsynę do temperatury 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych, piekarniku lub łaźni wodnej. Odessać pożywkę z komórek do pojemnika na odpady, przemyć raz 30 μl 2x trypsyny i odessać trypsynę.</li>
	<li>Ponownie umyć komórki 30 μl 2x trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukać w krawędź płytki, aby usunąć komórki z płytki. Dodać 50 μl uzupełnionego DMEM i mieszać komórki przez pipetowanie, aż komórki utworzą zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Przygotuj hemocytometr, czyszcząc powierzchnię i szklaną pokrywę 70% etanolem.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe na komorach liczących i przymocować tak, aby między krawędziami szkiełka nakrywkowego a hemocytometrem można było zobaczyć "pierścienie załamania Newtona". 
	Uwaga: Oznacza to, że szkiełko nakrywkowe prawidłowo przylegało do hemocytometru.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować 20 μl zawiesiny komórek pod szkiełkiem nakrywkowym, wypełniając komorę liczenia ruchem kapilarnym. Umieść hemocytometr pod 10-krotnym powiększeniem mikroskopu i zwizualizuj komory zliczające w układzie siatki.</li>
	<li>Policz komórki w 4 zewnętrznych kwadratach układu siatki. Aby zwiększyć dokładność, w razie potrzeby powtórz liczenie dodatkowych zewnętrznych kwadratów lub do momentu, gdy liczba osiągnie 70 - 100 komórek14,15.
	<ol>
		<li>Oblicz stężenie komórek na ml w następujący sposób: Średnia liczba komórek na kwadrat x współczynnik rozcieńczenia (jeśli jest używany) x 104</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.1-2.8 co 24 godziny przez 96 godzin po wysiewie.</li>
</ol>
3. Określanie proliferacji komórek za pomocą testu opartego na luminescencji
Uwaga: To jest pomiar końcowy. Po dodaniu odczynnika do komórek, płytkę można oznaczyć ilościowo tylko raz.
<ol>
	<li>Rozmrażać odczynnik luminescencyjny w łaźni wodnej o temperaturze 22 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj odczynnik, odwracając butelkę, aby uzyskać jednorodną mieszankę.</li>
	<li>Równowaga jednej płytki z wysianymi komórkami (z kroku 1.5) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl odczynnika luminescencyjnego do każdej studzienki. Mieszaj zawartość na wytrząsarce orbitalnej przez 2 minuty. Pozostawić płytkę do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Konfiguracja eksperymentu luminescencyjnego za pomocą wielotrybowego oprogramowania do odczytywania płytek.
	<ol>
		<li>Włącz wielotrybowy czytnik płytek i otwórz oprogramowanie. W "menedżerze zadań" wybierz "eksperymenty" i "utwórz nowe". Wybierz "plik" z bocznego paska narzędzi, a następnie w zakładce "protokół" wybierz "procedura".</li>
		<li>Wybierz typ tabliczki "Grenier 96 z płaskim dnem" i zaznacz pole "użyj pokrywy". Wybierz akcję "odczyt" w polu "metoda odczytu". Wybierz metodę wykrywania "luminescencji". Kliknij "OK".</li>
		<li>W polu kroku odczytu wybierz studzienki, które mają zostać zeskanowane w zakładce "pełna płyta", a następnie wybierz studzienki, które mają pełnić rolę studni ślepych.</li>
		<li>Ustaw zestaw filtrów na pusty filtr (np. wtyczka, Em: otwór, lustro: brak). Ustaw wzmocnienie na 135, z czasem integracji 0,5 sekundy na studzienkę i wysokością odczytu 6,5 mm. Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia odczytu luminescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie odczytu luminescencyjnego
	<ol>
		<li>Wysuń uchwyt płyty, wybierając zakładkę "sterowanie instrumentem" i kliknij "wyjdź z płyty". Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki, upewniając się, że pokrywka jest założona. Zamknij uchwyt tabliczki rejestracyjnej, klikając przycisk "wejście tablicy" w zakładce "sterowanie instrumentem". Kliknij "przeczytaj teraz" na pasku narzędzi, aby wykonać odczyt luminescencyjny.</li>
		<li>Eksportuj pomiary względnych jednostek luminescencyjnych (RLU) dla każdej studzienki do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.6, aby rejestrować proliferację co 24 godziny do 96 godzin po wysianiu komórek.</li>
</ol>
4. Określanie liczby komórek za pomocą skanera komórek
<ol>
	<li>Konfigurowanie eksperymentu obrazowania komórkowego za pomocą oprogramowania do obrazowania komórek w wielu trybach
	<ol>
		<li>Włącz wielotrybowy imager komórek i otwórz oprogramowanie.</li>
		<li>W "menedżerze zadań" wybierz zakładkę "eksperymenty" i "utwórz nowy". Na pasku narzędzi "plik" kliknij zakładkę "protokół" i otwórz zakładkę "procedura". Wybierz akcję "ustaw temperaturę". Ustaw inkubator w pozycji "włączonej" i ustaw temperaturę na 37 °C, a następnie zaznacz pole "podgrzewanie" przed przejściem do następnego kroku. Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia.</li>
		<li>Wybierz akcję "odczyt". Kliknij metodę wykrywania "obraz", wybierz typ odczytu "punkt końcowy/kinetyczny" i typ optyki "filtry". Kliknij "OK". Kliknij zakładkę "pełna płyta" i wybierz dołki na płycie, które mają zostać zobrazowane. Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia.</li>
		<li>Wybierz obiektyw 2,5X z rozwijanych opcji "Cele". W zakładce "kanały" wybierz dwa kanały: GFP 469, 525 i Bright Field. Sprawdź "automatyczną" ekspozycję dla obu kanałów i wybierz dobrze automatyczną ekspozycję.</li>
		<li>Aby określić ustawienia autofokusa, wybierz "autofokus" i kliknij "opcje". Aby uzyskać opcje automatycznego ustawiania ostrości, wybierz metodę "skanuj, a następnie automatyczne ustawianie ostrości". Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia.</li>
		<li>Ustaw przesunięcie poziome i pionowe od środka studzienki (μm) na 0.Wybierz, aby zeskanować wiele obrazów na studzienkę w montażu 3 x 2, z odstępami poziomymi (μm) = 2,881 i odstępami pionowymi (μm) = 2,127. Kliknij 'OK', aby zapisać ustawienia procedury. 
		Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z odczytanymi parametrami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentu odczytu na wybranej płycie
	<ol>
		<li>Kliknij zakładkę "sterowanie instrumentem" i wybierz funkcję "plate out". Umieść 96-dołkową płytkę w uchwycie na płytkę, upewniając się, że pokrywka jest założona. W zakładce "Sterowanie instrumentami" wybierz funkcję "wejście na płytę". Wybierz "przeczytaj teraz" z zakładki płyty. Powtarzaj odczyt co 24 godziny do 96 godzin po wysiewie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza liczby komórek za pomocą oprogramowania Cell Imager.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować obraz, kliknij zakładkę "dane" na zobrazowanej płycie, wybierz "obraz [GFP 469, 525 + Jasne pole]". Kliknij dwukrotnie na zobrazowaną studnię.</li>
		<li>Kliknij załadowany obraz. Wybierz opcję "analizuj" i wybierz pojedynczy obraz montażu, który ma zostać poddany analizie. Kliknij "OK". Sprawdź tylko kanał "GFP" i ustaw parametry zgodnie z opisem w Tabeli 3. Kliknij "START", aby zastosować parametry do obrazowanych komórek.</li>
		<li>Obserwuj maskę zliczania komórek umieszczoną nad obrazowanymi komórkami, która służy do określania liczby komórek na obrazie. Kliknij "zastosuj zmiany" i zachowaj te ustawienia dla każdej zobrazowanej płyty w trakcie eksperymentu.</li>
		<li>Po powrocie na zobrazowaną płytę kliknij menu rozwijane "dane" i wybierz "liczba komórek". Spowoduje to wygenerowanie całkowitej liczby komórek na studzienkę.</li>
		<li>Wyeksportuj wszystkie dane do arkusza kalkulacyjnego, klikając zakładkę "eksport", aby uzyskać dalszą analizę liczby komórek na dołku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+p53%2C+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer. p53, guardian of the genome.</a> Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).</li>
<li>Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+mutations+in+human+cancers%3A+origins%2C+consequences%2C+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).</li>
<li>Olivier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+value+of+somatic+TP53+gene+mutations+in+1%2C794+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer.</a> Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).</li>
<li>Bourdon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+isoforms+can+regulate+p53+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity.</a> Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).</li>
<li>Avery-Kiejda, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecular+weight+variants+of+p53+are+expressed+in+human+melanoma+cells+and+are+induced+by+the+DNA-damaging+agent+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin.</a> Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).</li>
<li>Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+mRNA+expression+of+p53+isoforms+in+breast+cancer+is+associated+with+clinical+features+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome.</a> Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).</li>
<li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+%26%2334%3Bgene+ontology%26%2334%3B+%28LeGO%29+vectors+for+functional+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A multicolor panel of novel lentiviral &#34;gene ontology&#34; (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Cell+Biology%22">Cell Biology</a>. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).</li>
<li>Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+to+measure+cell+proliferation+in+two+and+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions.</a> Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).</li>
<li>Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButzler%2C+M+%22Automated+cytotoxicity+profiling+using+the+CyBi-FeliX+instrument%2C+cell+health+assays+and+thaw-and-use+cells%22">Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells">http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells</a> (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CellTiter-Glo+2.0+Assay+Technical+Manual+%23403%22">CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf">http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf</a> (2015).</li>
<li>Banks, P., Brescia, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanks%2C+P+%22Application+Guide%3A+Automated+Digital+Microscopy%22">Application Guide: Automated Digital Microscopy</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html">http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html</a> (2015).</li>
<li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBastidas%2C+O+%22Cell+Counting+with+Neubauer+Chamber%3A+Basic+Hemocytometer+Usage%22">Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php">http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php</a> (2016).</li>
<li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBastidas%2C+O+%22Technical+Note%3A+Cell+Count+for+Low+Concentration+Samples%0A++%22">Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples
 </a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf">http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf</a> (2012).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%5BInternet%5D%22">Assay Guidance Manual[Internet]</a>. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) 
 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/</a> (2013).</li>
<li>Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuent%2C+VM+%22J+Cell+Mol+Med%22">J Cell Mol Med</a>. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li>
<li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+J+%22Cell+Cycle+Analysis+Using+the+BD+BrdU+FITC+Assay+on+the+BD+FACSVerse+System%22">Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System</a>. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) 
 
 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf</a> 1-12 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W protokole tym zbadano trzy różne metody pomiaru proliferacji komórek w hodowanych komórkach. Każda metoda była w stanie zapewnić powtarzalne i dokładne pomiary proliferacji komórek w ciągu 96 godzin, a wyniki były porównywalne między każdą z badanych metod (ryc. 2 i 3). Zarówno test oparty na luminescencji, jak i metoda obrazowania komórek dały najbardziej wiarygodne wyniki, wykazując liniowy wzrost proliferacji komórek po 96 godzinach (Figura 2b, c). Ponadto obrazowan...

Gen supresorowy nowotworu, p53, jest niezbędnym regulatorem wielu procesów komórkowych, w tym zatrzymania cyklu komórkowego, apoptozy i starzeniasię 1. Jest odpowiedzialny za utrzymanie stabilności genomu, a zatem ma kluczowe znaczenie dla utrzymania równowagi między śmiercią komórki a wzrostem komórki. Mutacje p53 są powszechne w raku i są główną przyczyną inaktywacji p53 prowadzącej do niekontrolowanej proliferacji komórek rakowych2. Co ciekawe, mutacje w p53 odpowiadają tylko za około 25% nowotworów piersi3, co sugeruje, że inne mechanizmy są odpowiedzialne za utratę funkcji p53. Wykazano, że niedawno odkryte izoformy p53 ulegają nadekspresji w wielu nowotworach u ludzi i mogą modulować funkcję p534,5. Wcześniej wykazaliśmy, że izoforma p53, Δ40p53, jest izoformą o najwyższej ekspresji w raku piersi i jest znacznie podwyższona w komórkach raka piersi w porównaniu z normalną sąsiednią tkanką6. Następnie stabilnie transdukowaliśmy ludzką linię komórkową raka piersi MCF-7 do nadekspresji Δ40p53 za pomocą wektora LeGO-iG2-puro + (GFP+)7. Komórki te wykorzystano do zbadania, czy wysoka ekspresja Δ40p53 zwiększa tempo proliferacji komórek w komórkach raka piersi.
Istnieje wiele bezpośrednich i pośrednich metod pomiaru proliferacji komórek hodowanych in vitro8,9. Można je wykonywać albo jako pomiary ciągłe w czasie, albo jako testy końcowe10. Nadal przydatne są konwencjonalne metody, takie jak zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Ten test jest tanią i bezpośrednią miarą liczby komórek, ale opiera się na dużej liczbie komórek i wysoko wykwalifikowanym szkoleniu w celu zminimalizowania błędów i dużych odchyleń standardowych od zliczeń. Potrzeba wykonywania pomiarów zgodnych z formatami o wysokiej przepustowości doprowadziła do opracowania testów na płytkach wielodołkowych. Te testy oparte na luminescencji mierzą liczbę komórek na podstawie sygnału luminescencyjnego, który jest proporcjonalny do aktywności metabolicznej komórki11,12. Niedawne wprowadzenie platform obrazowania o wysokiej zawartości umożliwiło opracowanie nowych narzędzi, które monitorują proliferację komórek, zapewniając jednocześnie ilościowe i jakościowe gromadzenie danych fenotypowych i obejmują różne systemy13. Wszystkie te metody zapewniają możliwości pomiaru wzrostu komórek, zarówno za pomocą pomiarów ciągłych, jak i testów końcowych, a każda z nich ma szereg zalet i wad w odniesieniu do czułości, przepustowości liczby próbek i informacji o komórkach, z których wszystkie można odpowiednio zważyć w zależności od pytania badawczego.
Ten protokół opisuje trzy różne metody pomiaru proliferacji komórek in vitro, z których każda wykorzystuje różne zakresy czułości, odtwarzalności i formatów płytek wielodołkowych. Protokół ten miał na celu porównanie wykorzystania komory zliczającej hemocytometru, testu żywotności komórek opartego na luminescencji i obrazowania komórek w pomiarze proliferacji komórek w ciągu 96 godzin. W tym celu porównano wzrost komórek transdukowanych wektorem (MCF-7-LeGO) z komórkami transdukowanymi w celu nadekspresji Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), przy użyciu trzech różnych gęstości komórek. Proliferację komórek mierzono co 24 godziny przez okres do 96 godzin. Stwierdzono, że każda metoda ma swoje zalety i wady, a w zależności od celu eksperymentu, każda z nich jest cenną metodą dostarczania informacji na temat tempa proliferacji.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Uzupełniony 10% FBS, 200 mM L-glutaminy, 2 i mikro; g/ml insuliny i 1 &mikro; g/ml puromycyny,</td></tr><tr><td>roztwór L-glutaminy (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek Puromycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5% roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Rozcieńczyć do 2x w DPBS</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych, 75 cm2 obszar wzrostu</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Licznik komórek</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka wielodołkowa, płaskie dno</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszony hemocytometr Neubauera</td><td>BOECO Niemcy</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus IX51</td><td>Test Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Test oparty na luminescencji</td></tr><tr><td>Cytacja 3 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy</td><td>BioTek</td><td></td><td>Czytnik płytek do luminescencji, fluorescencji i obrazowanie komórek w jasnym polu</td></tr><tr><td>Gen5 Oprogramowanie do analizy danych BioTek</td><td></td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Pomiar proliferacji komórek może być przeprowadzony za pomocą wielu różnych metod, z których każda ma inny poziom czułości, powtarzalności i kompatybilności z formatowaniem o wysokiej przepustowości. Protokół ten opisuje zastosowanie trzech różnych metod pomiaru proliferacji komórek in vitro, w tym konwencjonalnej komory zliczającej hemocytometr, testu opartego na luminescencji, który wykorzystuje zmianę aktywności metabolicznej żywych komórek jako miarę względnej liczby komórek, oraz wielotrybowego obrazowania komórek, który mierzy liczbę komórek za pomocą algorytmu zliczania. Każda metoda ma swoje zalety i wady w pomiarze proliferacji komórek, w tym czas, koszt i kompatybilność o wysokiej przepustowości. Protokół ten pokazuje, że każda metoda może dokładnie mierzyć proliferację komórek w czasie i jest czuła na wykrywanie wzrostu przy różnych gęstościach komórek. Ponadto pomiar proliferacji komórek za pomocą obrazowania komórek był w stanie dostarczyć dalszych informacji, takich jak morfologia, konfluencja i pozwolił na ciągłe monitorowanie proliferacji komórek w czasie. Podsumowując, każda metoda jest w stanie zmierzyć proliferację komórek, ale wybrana metoda zależy od użytkownika.

W celu zbadania różnych metod pomiaru proliferacji hodowli komórkowych, proliferację komórek MCF-7-Δ40p53 poddanych transdukcji porównano z nietransdukowaną linią komórkową raka piersi MCF-7-LeGO. Trzy porównane metody – konwencjonalną metodę z użyciem hemocytometru, luminescencyjny test żywotności komórek oraz analizę obrazowania komórek – przedstawiono na schemacie (Rysunek 1). Każda z tych metod posiada zalety i wady w kontekście dokładnego pomiaru liczby komórek w cza...

Ten protokół opisuje użycie trzech różnych metod analizy proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi. Obejmuje to stosowanie konwencjonalnego zliczania komórek, żywotności komórek na podstawie luminescencji oraz zliczania komórek za pomocą obrazowania komórek. Każdy z nich oferuje korzyści w zakresie powtarzalnego pomiaru proliferacji komórek.

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Ogólnym celem niniejszej demonstracji jest porównanie trzech różnych testów proliferacji komórek oraz przedstawienie zalet i wad każdej z metod. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak wybór najbardziej odpowiedniej metody oceny proliferacji komórek. Przygotowanie do tej procedury jest krytyczne, ponieważ kroki związane z obsługą analizatora obrazu komórek są trudne do opanowania.Wymagane jest ustawienie ostrości na komórkach przed zastosowaniem odpowiedniej maski do liczenia komórek. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj dwie linie komórkowe MCF-7 przez trzy dni do uzyskania 75 do 80% konfluencji w kolbach do hodowli tkanek o powierzchni 75 cm², stosując DMEM bez czerwieni fenolowej. Po trzech dniach usuń komórki z kolb, odlewając medium do pojemnika na odpady.Następnie niezwłocznie przemyj warstwę komórek dwoma mililitrami podgrzanej dwukrotnie rozcieńczonej trypsyny. Odessij trypsynę i dodaj kolejne dwa mililitry podgrzanej trypsyny do warstwy komórek, a następnie umieść naczynie w inkubatorze. Po odklejeniu się komórek przemyj je 10 mililitrami podgrzanego, świeżego, uzupełnionego DMEM.Następnie przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i wiruj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach ostrożnie odessaj i usuń nadsącz. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki DMEM z dodatkami.Aby przeprowadzić zliczenie komórek, należy rozcieńczyć 100 µl zawiesiny komórkowej w 900 µl 1x DPBS. Następnie należy umieścić nowy czujnik 60-µm w automatycznym liczniku komórek. Przytrzymując tłok, należy zanurzyć czujnik w rozcieńczonej zawiesinie komórkowej.Powoli zwolnij tłok licznika komórek. Następnie, po zakończeniu procesu, wyjmij czujnik z licznika komórek. Wysiej komórki w końcowej objętości 100 µL na płytkę 96-dołkową przy konfluencji około 20%, aby zapewnić miejsce do wzrostu komórek i pomiaru proliferacji w ciągu od trzech do pięciu dni.Aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru, należy uprzednio ogrzać zarówno medium, jak i trypsynę do 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych, piecu lub kąpieli wodnej. Następnie odessaj medium z komórek do pojemnika na odpady. Po tym przemyj je raz 30 µL dwukrotnie stężonej trypsyny i ponownie odessaj medium do pojemnika na odpady.Następnie ponownie przemyj komórki 30 µL dwukrotnym roztworem trypsyny i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie stuknij w krawędź płytki, aby odczepić komórki. Następnie dodaj 50 µL uzupełnionej pożywki DMEM i wymieszaj komórki poprzez pipetowanie, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Umieść szklaną lamellkę nad komorami liczbowymi i dociśnij ją, aż między krawędziami lamellki a helocytometrem pojawią się pierścienie Newtona. Następnie delikatnie nanieś pipetą 20 µL zawiesiny komórkowej pod lamellkę i pozwól, aby komora liczbowa wypełniła się w wyniku działania sił kapilarnych. Następnie obejrzyj komory liczbowe w układzie siatki przy 10-krotnym powiększeniu.W tej procedurze od thawing odczulaj odczyn luminescencyjny w kąpieli wodnej o temperaturze 22°C przez 30 minut. Delikatnie odwróć butelkę, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Następnie doprowadź jedną płytkę z wysianymi komórkami do temperatury pokojowej przez 30 minut.Następnie do każdej studni dodaj 100 µL odczynnika luminescencyjnego. Wymieszaj zawartość na wytrząsarku orbitalnym przez dwie minuty. Następnie inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Aby przygotować eksperyment luminescencyjny przy użyciu oprogramowania czytnika płytek wielomodułowych, włącz czytnik płytek wielomodułowych i uruchom oprogramowanie. W Menedżerze zadań wybierz Eksperymenty i Utwórz nowy. Następnie wybierz Plik z bocznego paska narzędzi, a w zakładce Protokół wybierz Procedurę.Następnie w polu typu płytki wybierz Greiner 96 flat bottom i zaznacz pole Use Lid. W polu metody odczytu (Read method) wybierz czynność Read. Następnie jako metodę detekcji wybierz Luminescence i kliknij OK. W oknie Read Step, w zakładce Full Plate, zaznacz studzienki do przeskanowania oraz wybierz studzienki, które będą pełnić rolę prób kontrolnych (blank).Ustaw Zestaw Filtrów (Filter Set) na Filtr Pusty (Empty Filter). Ustaw Wzmocnienie (Gain) na 135, czas całkowania (Integration Time) na 5 sekund na studzienkę oraz wysokość odczytu (Read Height) na 6,5 mm. Kliknij OK, aby zapisać ustawienia odczytu luminescencji.Aby przeprowadzić odczyt luminescencji, wysuń uchwyt na płytkę, wybierając kartę Instrument Control i klikając Plate Out. Umieść płytkę 96-dołkową na uchwycie, upewniając się, że jest ona przykryta. Zamknij uchwyt na płytkę, klikając Plate In w karcie Instrument Control.Następnie kliknij Read Now na pasku narzędzi, aby przeprowadzić pomiar luminescencji. Po tym kroku wyeksportuj pomiary RLU dla każdej studzienki do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Aby przygotować eksperyment obrazowania komórek, włącz wielomodalny system obrazowania komórek i uruchom oprogramowanie.W Menedżerze Zadań (Task Manager) wybierz zakładkę Eksperymenty (Experiments) i opcję Utwórz Nowy (Create New). Na pasku narzędzi Plik (File) kliknij zakładkę Protokół (Protocol), a następnie zakładkę Procedura (Procedure). Wybierz akcję Ustaw Temperaturę (Set Temperature).Włącz inkubator i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Zaznacz opcję Preheat, a następnie kliknij OK, aby zapisać ustawienia. Następnie wybierz czynność Read.Wybierz opcję Image jako metodę detekcji. Następnie wybierz typ odczytu Endpoint/Kinetic oraz typ optyki Filters, a następnie kliknij OK. Po tym kliknij kartę Full Plate i zaznacz studzienki na płytce, które mają zostać zobrazowane. Kliknij OK, aby zapisać ustawienia.Teraz z rozwijanej listy Objectives należy wybrać obiektyw 2,5x. W karcie Channels należy zaznaczyć GFP 469,525 oraz Bright Field. Dla obu kanałów należy zaznaczyć opcję Auto Exposure, a następnie wybrać studzienkę do automatycznej ekspozycji.Aby określić ustawienia automatycznego ustawiania ostrości, kliknij Options. W opcjach automatycznego ustawiania ostrości wybierz metodę Scan, a następnie auto focus. Kliknij OK, aby zapisać ustawienia.Następnie ustaw przesunięcie poziome i pionowe względem środka dołka na zero. Wybierz opcję skanowania wielu obrazów na dołek w układzie montażu trzy na dwa. Następnie kliknij OK, aby zapisać ustawienia procedury.Aby odczytać eksperyment na wybranej płytce, kliknij kartę Instrument Control i wybierz funkcję Plate Out. Umieść płytkę 96-dołkową w uchwycie na płytki, upewniając się, że pokrywka jest zamknięta. W karcie Instrument Control wybierz funkcję Plate In.Następnie z karty płytki (plate tab) wybierz opcję Read Now i powtarzaj odczyt co 24 godziny, aż do 96 godzin po wysianiu. Aby przeanalizować obraz, kliknij kartę Data na obrazowanej płytce i wybierz Picture GFP 469, 525 plus Bright Field. Następnie dwukrotnie kliknij obrazowaną studzienkę.Teraz kliknij na załadowany obraz. Wybierz Analyze, a następnie zaznacz pojedynczy obraz z montażu, który ma zostać przeanalizowany. Następnie kliknij OK. Po tym sprawdź tylko kanał GFP i ustaw parametry zgodnie z Tabelą 3.Następnie kliknij Start, aby zastosować parametry do obrazów komórek. Obserwuj maskę liczenia komórek nałożoną na obrazowane komórki, która służy do określenia liczby komórek na obrazie. Kliknij Apply Changes i zachowaj te ustawienia dla każdej płytki obrazowanej w trakcie eksperymentu.Na tym rysunku przeprowadzono analizę regresji liniowej w celu porównania zależności korelacyjnych między różnymi metodami badanymi pod kątem pomiaru proliferacji komórek w liniach MCF-7-LeGO oraz MCF-7-delta 40p53. Obliczono współczynnik korelacji Pearsona i określono istotność pomiędzy różnymi metodami pomiaru proliferacji komórek. Najsilniejszą korelację zaobserwowano w porównaniu testu opartego na luminescencji oraz obrazowania komórek.Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy komórek raka piersi MCF-7-LeGO i MCF-7-delta 40p53 wykazujących pozytywną ekspresję GFP, wykonane za pomocą analizatora komórek co 24 godziny, aż do momentu, gdy komórki osiągnęły niemal 100% konfluencji. Metoda ta dostarcza przydatnych informacji komórkowych, w tym umożliwia wizualne monitorowanie wzrostu komórek przez wiele dni oraz porównywanie wielkości i morfologii komórek pomiędzy różnymi liniami komórkowymi. Poniżej przedstawiono podsumowanie zalet i wad każdej przetestowanej metody, co demonstruje ich wszechstronność i pomoże czytelnikom w wyborze najodpowiedniejszej techniki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć trzy różne testy proliferacji komórek i być w stanie określić, który z nich najlepiej pasuje do Państwa własnego planu doświadczalnego.

comparison-three-different-methods-for-determining-cell-proliferation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Ten film opisuje hodowlę komórek raka piersi przylegających do eksplantatów kości udowej w celu zmierzenia proliferacji i kolonizacji komórek rakowych w systemie modelowym ludzkiej tkanki kostnej.

Współkultura komórek BC: hodowla komórek raka piersi z fragmentami kości w celu zbadania proliferacji komórek rakowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Opisany jest wykonalny moduł laboratoryjny dla studentów biologii, który bada zaawansowane koncepcje komórkowe i molekularne przy użyciu hodowli komórek zwierzęcych. Studenci hodują, charakteryzują i manipulują modelem komórkowym raka piersi poprzez ekspozycję na środki chemioterapeutyczne. Żywotność komórek jest oznaczana poprzez zliczanie komórek przy użyciu zarówno metody standardowej, jak i nowatorskiej.

Wykorzystanie komórek nowotworowych sutka myszy do nauczania podstawowych pojęć biologicznych: prosty moduł laboratoryjny

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Badanie to ocenia proliferacyjne efekty czynników wydzielniczych związanych ze starzeniem (SASP) pochodzących z komórek HeLa na komórki HeLa niestarzejące, wykorzystując trzy modele in vitro z monitoringiem w czasie rzeczywistym. Zalety i ograniczenia każdej metody były systematycznie porównywane, aby lepiej zrozumieć interakcje komórki w nowotworach.

Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii

Poznaj trzy metody analizy proliferacji komórek w liniach raka piersi MCF-7: klasyczne liczenie, luminescencyjna wykrywalność oraz liczenie za pomocą imagera komórkowego. Porównaj ich zalety i ograniczenia.

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Przeglądaj więcej filmów