Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Ogólnym celem tej demonstracji jest porównanie trzech różnych testów proliferacji komórek oraz przedstawienie zalet i wad każdej z metod. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak zastosowanie najbardziej odpowiedniej metody proliferacji komórek. Przygotowanie tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki obrazowania komórek są trudne do nauczenia.

Wymagają one skupienia się na komórkach przed nałożeniem odpowiedniej maski zliczającej komórki. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj dwie linie komórkowe MCF-7 przez trzy dni do 75 do 80% konfluencji w kolbach do hodowli tkankowych T75 centymetrów kwadratowych przy użyciu DMEM wolnego od czerwieni fenolowej. Po trzech dniach usunąć komórki z kolb, wylewając pożywkę do pojemnika na odpady.

Następnie natychmiast umyj warstwę komórek dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej dwukrotnie trypsyny. Odessać trypsynę i dodać kolejne dwa mililitry wstępnie podgrzanej trypsyny do warstwy komórek przed umieszczeniem jej w inkubatorze. Po odłączeniu komórek umyj je 10 mililitrami podgrzanego, świeżo uzupełnionego DMEM.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej 15-mililitrowej probówki i odwiruj ją przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach ostrożnie odessać i usunąć supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach świeżo uzupełnionego DMEM.

Aby przeprowadzić zliczanie komórek, rozcieńczyć 100 mikrolitrów zawiesiny komórek w 900 mikrolitrach jednorazowego DPBS. Następnie umieść nowy czujnik 60 mikrometrów na automatycznym liczniku komórek. Przytrzymaj tłok i zanurz czujnik w zawiesinie rozcieńczonej komórki.

Powoli zwolnić tłok na liczniku ogniw. Następnie, po zakończeniu, wyjmij czujnik z licznika ogniw. Zasiej komórki w końcowej objętości 100 mikrolitrów na 96-dołkowej płytce przy około 20% zbieganiu, aby zapewnić miejsce na wzrost komórek i pomiar proliferacji w ciągu trzech do pięciu dni.

Aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru, należy wstępnie podgrzać zarówno pożywkę, jak i trypsynę do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych, piekarniku lub łaźni wodnej. Następnie odessać pożywkę z komórek do pojemnika na odpady. Następnie umyj je raz 30 mikrolitrami dwukrotnej trypsyny i ponownie zassaj pożywkę do pojemnika na odpady.

Następnie ponownie umyj komórki 30 mikrolitrami dwukrotnej trypsyny i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie postukaj w krawędź płytki, aby usunąć komórki. Następnie dodać 50 mikrolitrów uzupełnionego DMEM i wymieszać komórki przez pipetowanie, aż utworzy się zawiesina pojedynczej komórki.

Umieść szkiełko nakrywkowe na komorach liczących i przymocuj je tak, aby pierścienie załamania Newtona były widoczne między krawędziami szkiełka nakrywkowego a helocytometrem. Następnie delikatnie odpipetować 20 mikrolitrów supension ogniwa pod szkiełkiem nakrywkowym i pozwolić, aby komora licząca została napełniona ruchem kapilarnym. Następnie zwizualizuj komory liczące w układzie siatki pod 10-krotnym powiększeniem.

W tej procedurze rozmrażaj odczynnik luminescencyjny w łaźni wodnej o temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 30 minut. Delikatnie odwróć butelkę, aby uzyskać jednorodną mieszankę. Następnie równowaga jednej płytki wysianych komórek w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów odczynnika luminescencyjnego do każdej studzienki. Mieszaj zawartość na wytrząsarce orbitalnej przez dwie minuty. Następnie pozostaw płytkę do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Aby przeprowadzić eksperyment luminescencyjny za pomocą oprogramowania do wielomodowego czytnika płytek, włącz wielomodowy czytnik płytek i otwórz oprogramowanie. W Menedżerze zadań wybierz pozycję Eksperymenty i Utwórz nowy. Następnie wybierz pozycję Plik z bocznego paska narzędzi, a następnie na karcie Protokół wybierz pozycję Procedura.

Następnie wybierz Greiner 96 z płaskim dnem jako typ płyty i zaznacz pole Użyj pokrywy. Wybierz akcję Odczyt w polu Metoda odczytu. Następnie wybierz Luminescencja jako metodę wykrywania i kliknij OK.In polu Krok odczytu, wybierz studzienki do skanowania na karcie Pełna płyta i wybierz studzienki, które mają pełnić rolę studni ślepych.

Ustaw Filtr ustawiony na Pusty filtr. Ustaw wzmocnienie na 135, z czasem integracji 5 sekund na studzienkę i wysokością odczytu 6,5 milimetra. Kliknij przycisk OK, aby zapisać ustawienia odczytu luminescencji.

Aby wykonać odczyt luminescencji, wysuń uchwyt płytki, wybierając kartę Instrument Control (Sterowanie instrumentem) i kliknij przycisk Plate Out. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki, upewniając się, że pokrywka jest założona. Zamknij uchwyt tabliczki, klikając opcję Plate In (Wejście płyty) na karcie Instrument Control (Sterowanie instrumentem).

Następnie kliknij przycisk Czytaj teraz na pasku narzędzi, aby wykonać odczyt luminescencyjny. Następnie wyeksportuj pomiary RLU dla każdego dołka do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Aby skonfigurować eksperyment z obrazowaniem komórek, włącz wielotrybowy imager komórek i otwórz oprogramowanie.

W Menedżerze zadań wybierz kartę Eksperymenty i utwórz nowy. Na pasku narzędzi Plik kliknij kartę Protokół, a następnie kartę Procedura. Wybierz akcję Ustaw temperaturę.

Ustaw inkubator w pozycji Włączone i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Zaznacz opcję Podgrzej, a następnie kliknij przycisk OK, aby zapisać ustawienia. Następnie wybierz akcję Odczyt.

Kliknij Obraz jako metodę wykrywania. Następnie wybierz typ odczytu końcowego/kinetycznego oraz typ optyki filtrów, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie kliknij kartę Pełna płyta i wybierz dołki na płycie, które mają zostać zobrazowane. Kliknij przycisk OK, aby zapisać ustawienia.

Teraz wybierz cel 2,5 razy z rozwijanej opcji Cele. Na karcie Channels (Kanały) wybierz opcję GFP 469.525 (GFP 469.525) i Bright Field (Jasne pole). Sprawdź opcję Auto Exposure (Automatyczna ekspozycja) dla obu kanałów i wybierz odpowiednią opcję Auto Exposure (Automatyczna ekspozycja).

Aby określić ustawienia automatycznego ustawiania ostrości, kliknij przycisk Opcje. Jako opcje automatycznego ustawiania ostrości wybierz metodę Skanowanie, a następnie autofokus. Kliknij przycisk OK, aby zapisać ustawienia.

Następnie ustaw przesunięcie poziome i pionowe od środka studni na zero. Wybierz, aby zeskanować wiele obrazów na studzienkę w montażu trzy na dwa. Następnie kliknij przycisk OK, aby zapisać ustawienia procedury.

Aby odczytać eksperyment na wybranej płycie, kliknij na zakładkę Instrument Control i wybierz funkcję Plate Out. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki, upewniając się, że pokrywka jest założona. Na karcie Instrument Control (Sterowanie instrumentem) wybierz funkcję Plate In (Wejście płyty).

Następnie wybierz opcję Czytaj teraz z zakładki płytki i powtarzaj odczyt co 24 godziny, do 96 godzin po wysiewie. Aby przeanalizować obraz, kliknij kartę Dane na zobrazowanej płycie i wybierz Obraz GFP 469, 525 plus Jasne pole. Następnie kliknij dwukrotnie obrazowaną studnię.

Teraz kliknij załadowany obraz. Wybierz opcję Analizuj, a następnie wybierz pojedynczy obraz montażu, który ma zostać przeanalizowany. Następnie kliknij przycisk OK. Następnie należy sprawdzić tylko kanał GFP i ustawić parametry zgodnie z opisem w Tabeli 3.

Następnie kliknij Start, aby zastosować parametry do obrazowanych komórek. Obserwuj maskę zliczania komórek umieszczoną nad obrazowanymi komórkami, która służy do określania liczby komórek na obrazie. Kliknij przycisk Zastosuj zmiany i zachowaj te ustawienia dla każdej płyty zobrazowanej w trakcie eksperymentu.

Na tym rysunku przeprowadzono analizę regresji liniowej w celu porównania korelacji między różnymi metodami badanymi do pomiaru proliferacji komórek w komórkach MCF-7-LeGO i komórkach MCF-7-delta 40p53. Obliczono współczynnik korelacji Pearsona i określono znaczenie między różnymi metodami pomiaru proliferacji komórek. Najsilniejszą korelację zaobserwowano między porównaniem testu opartego na luminescencji a obrazowania komórek.

Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy komórek raka piersi GFP z dodatnim wynikiem MCF-7-LeGO i MCF-7-delta 40p53 uchwyconych za pomocą obrazowania komórek co 24 godziny, aż komórki osiągną bliską 100% konfluencji. Ta metoda dostarcza przydatnych informacji komórkowych, w tym umożliwia wizualne monitorowanie wzrostu komórek przez wiele dni oraz porównywanie wielkości komórek i morfologii komórek między różnymi liniami komórkowymi. Poniżej przedstawiono podsumowanie zalet i wad każdej z testowanych metod, które pokazuje wszechstronność każdej z metod i pomoże czytelnikom w wyborze najbardziej odpowiedniej metody.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć trzy różne testy proliferacji komórek i powinieneś być w stanie określić, który z nich najlepiej pasuje do twojego własnego projektu eksperymentalnego.