Name: Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji ilościowej do wizualizacji i pomiaru lokalizowanej translacji w komórkach MRC-5 podczas adhezji. Technika ta jest szybka, tania i wymaga tylko podstawowego systemu obrazowania konfokalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Komórkowego Centrum Badawczego za pomoc techniczną. M.-É. Huot jest młodszym stypendystą naukowym Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (grant nr CIHR, MOP-286437 dla M.-É. Huot).

1. Określenie warunków Puromycilacji
UWAGA: Ta technika opisuje metodę używaną do oceny zlokalizowanej translacji podczas procesu adhezji komórek MRC-55. Ponieważ puromycylację można przeprowadzić w dowolnej komórce, ważne jest, aby zoptymalizować warunki puromycylacji dla konkretnych linii komórkowych, które mają być użyte, ponieważ warunki leczenia nie są identyczne dla każdej linii komórkowej pod względem stężenia puromycyny i pożądanego czasu inkubacji. Aby pokazać, jak definiowane są te warunki, trzy przykładowe linie komórkowe (tj. HeLa, MRC-5 i Huh-7) potraktowano rosnącymi stężeniami puromycyny dla różnych czasów inkubacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Wyhodować identyczną liczbę komórek na 24-dołkowej płytce w 0,5 ml odpowiedniej kompletnej pożywki hodowlanej 16 godzin przed badaniem. Wysiewaj 30 000 komórek MRC-5, 50 000 komórek HeLa lub 50 000 komórek HuH-7 na studzienkę. Upewnij się, że nie przekraczasz 60-70% zbiegu.</li>
	<li>Przygotuj 6 probówek z 1,5 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych o rosnącym stężeniu puromycyny (0, 5, 10, 15, 20 i 30 μg/ml). Wstępnie podgrzane w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dla każdego stężenia pożywki puromycyny (przygotowanej w kroku 1.2) przenieść 0,5 ml z każdej probówki do 6 nowych probówek i dodać cykloheksymid w końcowym stężeniu 50 μg/ml do wszystkich 6 nowych probówek. Wstępnie podgrzane w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmienić pożywkę na 0,5 ml kompletnej pożywki hodowlanej (wiersz 1 i 2). Do trzeciego rzędu dodaj 0,5 ml kompletnej pożywki hodowlanej uzupełnionej 50 μg/ml cykloheksymidu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). 
	UWAGA: Leczenie cykloheksymimidem zostało uznane za najlepszą kontrolę ujemną dla puromycylacji białek ze względu na jego zdolność do blokowania wydłużenia translacji. Ponieważ inkorporacja puromycyny wymaga wydłużenia translacji, leczenie cykloheksymidem prowadzi do utraty sygnałów białkowych puromycylowanych5,18.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C (5% CO2 ).</li>
	<li>Dodać 0,5 ml pożywki puromycyny przygotowanej w kroku 1.2 do drugiego rzędu, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0, 2,5, 5, 7,5, 10 i 15 μg/ml w kolumnach A, B, C, D, E i F. W tym samym czasie dodaj 0,5 ml puromycyny do pożywki uzupełnionej cykloheksymidem (krok 1.3) w trzecim rzędzie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C (5% CO2 ).</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml pożywki puromycyny przygotowanej w kroku 1.2 do pierwszego rzędu, aby uzyskać końcowe stężenia 0,0, 2,5, 5, 7,5, 10 i 15 μg/ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C (5% CO2 ).</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę z rzędów od 1 do 3 1 ml lodowatego soli fizjologicznej 1X buforowanej fosforanem (PBS) 5 minut po dodaniu puromycyny do studzienek pierwszego rzędu (przemyć dwukrotnie). Dodaj 75 μl buforu 1X Laemmli (4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 4% 2-merkaptoetanolu, 0,120 M Tris HCl pH 6,8, 0,004% błękitu bromofenolowego i 10% glicerolu), aby uzyskać lizaty całokomórkowe dla każdego stanu.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę w żelu poliakryloamidowym 10% SDS (SDS-PAGE) przy użyciu 1/3 przygotowanych próbek, aby ocenić włączenie puromycyny.
	<ol>
		<li>Określić poziom inkorporacji puromycyny za pomocą analizy Western blot przy użyciu przeciwciała anty-puromycyny (12D10) rozcieńczonego w stosunku 1:25 000 w buforze do inkubacji przeciwciał pierwotnych (2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 i 0,01% azydku sodu). 
		UWAGA: Reprezentatywne obrazy odpowiadające różnym ekstraktom linii komórkowych wykonanym zgodnie z opisem w kroku 1 są pokazane jako przykłady w Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wizualizacja tłumaczenia zlokalizowanego w Cellulo
UWAGA: Opisana tutaj technika została użyta do oceny zlokalizowanej translacji w obrębie SIC w komórkach MRC-5 podczas procesu adhezji5. Chociaż w tym przypadku stosuje się komórki MRC-5, inne linie komórkowe mogą być używane przy użyciu tej samej metodologii opisanej w kroku 2.1.
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek.
	<ol>
		<li>Odłącz komórki MRC-5 za pomocą 0,25% trypsyny/2,21 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Osadzać komórki przez wirowanie (5 minut przy 200 x g) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i zawiesić je w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w stężeniu 40 000 komórek/ml po zliczeniu w komorze zliczającej.</li>
		<li>Inkubować zawieszone komórki w temperaturze 37 °C przy delikatnym obracaniu za pomocą rotatora rurkowego przez 20 minut, aby utrzymać je w zawiesinie. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić całkowitą dysocjację ogniskowych kompleksów adhezyjnych.</li>
		<li>Płytka 2 ml zawieszonych komórek MRC-5 (40 000 komórek/ml) w dwóch naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Do testu puromicycylacji należy użyć pierwszej płytki ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (patrz krok 2.1.5), a drugiej jako kontroli ujemnej (patrz krok 2.1.6).</li>
		<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C (5% CO2) przez 55 minut, aby umożliwić adhezję komórkową i tworzenie SIC.</li>
		<li>Dodać puromycynę do pożywki w 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem (oznaczenie) przy użyciu stężenia określonego wcześniej w sekcji 1. Do leczenia komórek MRC-5 należy stosować 10 μg/ml puromycyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C (5% CO2 ).</li>
		<li>Jako kontrolę ujemną dodaj cykloheksymid do drugiego 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem 40 minut po wysianiu komórek, aby wstępnie potraktować je cykloheksymidem 50 μg / ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B). Następnie, 15 minut po dodaniu cykloheksymidu, dodać puromycynę do pożywki, stosując takie samo stężenie i czas inkubacji, jak w kroku 2.1.5 (np. użyć 10 μg/ml puromycyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C (5% CO2) dla MRC-5).</li>
		<li>Umyj każdą płytkę dwukrotnie 2 ml lodowatego 1X PBS i utrwal komórki 1 ml 4% formaldehydu (rozcieńczonego w 1X PBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
		Uwaga: Paraformaldehyd musi być stosowany wyłącznie w okapie chemicznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne.
	<ol>
		<li>Po utrwaleniu paraformaldehydu przemyć trzykrotnie 2 ml 1X PBS i inkubować w 500 μl PBS-TritonX-100 (0,5%) przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek.</li>
		<li>Aby zapobiec wiązaniu przeciwciał nieswoistych, należy zablokować próbkę 500 μL PBS – BSA (1%) na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie 2 ml PBS-Tween20 (0,1%) i inkubować z 300 μl przeciwciała anty-puromycyny (12D10) rozcieńczonego w stosunku 1:12,500 w 1X PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć 3 razy 2 ml PBS-Tween20 (0,1%) i inkubować z 300 μl anty-mysiej IgG sprzężonej z fluoroforem (tutaj, 488 nm) rozcieńczonym w PBS w celu uwidocznienia puromycylowanych polipeptydów i z falloidyną sprzężoną z innym fluoroforem (tutaj, 555 nm), aby uwidocznić F-aktynę. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie 2 ml PBS-Tween20 (0,1%), a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w 300 μl PBS-Tween20 (0,1%) uzupełnionej 1 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI).</li>
		<li>Umyj trzy razy 2 ml PBS-Tween20 (0,1%), a następnie umyj 2 ml 1X PBS. Zapobiegaj wysychaniu komórek, trzymając próbkę w 2 ml 1X PBS podczas akwizycji obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu immunofluorescencyjnego
UWAGA: Poniższa metodologia może być stosowana z dowolnym dostępnym na rynku systemem obrazowania konfokalnego.
<ol>
	<li>Określ odpowiednie ustawienia dla każdego fluoroforu, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny do oznaczania ilościowego. 
	UWAGA: Reprezentatywną kwantyfikację można uzyskać tylko wtedy, gdy unika się nasycenia pikseli, a próg sygnału jest odpowiednio dostosowany. Ustawienia te można osiągnąć, starannie dostosowując moc lasera, wysokie napięcie (HV), wzmocnienie i przesunięcie.
	<ol>
		<li>Dostosuj współczynnik powiększenia (5x) i liczbę pikseli (512 x 512), aby zoptymalizować rozmiar piksela. 
		UWAGA: Powinna być co najmniej 2,3 razy mniejsza niż rozdzielczość optyczna, zgodnie z twierdzeniem Nyquista.</li>
		<li>Zmniejsz prędkość skanowania (12,5-20 μs/piksel) i użyj uśredniania (2-3 razy), aby poprawić stosunek sygnału do szumu zgodnie z powyższymi ustawieniami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ręcznie określ odpowiednie górne i dolne płaszczyzny ogniskowej wzdłuż osi Z z optymalnym rozmiarem kroku (0,4 μm/plaster). 
	UWAGA: Płaszczyzna wielkości kroku jest określana przez rozdzielczość osiową podzieloną przez 2,3, zgodnie z twierdzeniem Nyquista. Zazwyczaj potrzeba 20-25 warstw, aby pokryć całą głębokość komórek przylegających.</li>
	<li>Uzyskaj konfokalny obraz całej pojedynczej komórki za pomocą 60-krotnego obiektywu immersyjnego Plan Apo (apertura numeryczna 1,42).</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja obrazu immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Oznaczanie wzbogacenia.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz odpowiadający interesującej warstwie płaszczyzny z z uzyskanego pliku danych komórki za pomocą oprogramowania ImageJ (freeware dostępnego pod adresem http://fiji.sc).</li>
		<li>Narysuj linię za pomocą narzędzia do rysowania linii (pasek narzędzi → Prosty) przez obszary komórki, w których pożądana jest kwantyfikacja. Zmodyfikuj szerokość linii, klikając dwukrotnie "prosty; " wartości intensywności zostaną uśrednione przez szerokość linii (ustawionej na 8 cali <silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Preferowana jest cieńsza linia, aby uniknąć nakładania się sygnałów z różnych struktur.</li>
		<li>Po prawidłowym ustawieniu linii należy wyprofilować gęstość sygnału wzdłuż wyznaczonej osi (pasek menu → Analizuj → Profil wykresu). 
		UWAGA: Otworzy się nowe okno, które pokazuje profil odpowiadający intensywności sygnału dla każdego piksela wybranego kanału (specyficzny fluorofor) wzdłuż linii dla wybranego odcinka płaszczyzny z.
		<ol>
			<li>Powtórz proces dla każdego kanału odpowiadającego użytemu fluoroforowi (tj. jedna kwantyfikacja dla 488, jedna dla 568 i jedna dla 405). 
			UWAGA: Wartość natężenia sygnału będzie zawsze uporządkowana zgodnie z orientacją narysowanej linii.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby uzyskać liczbowe wartości w skali szarości dla każdego piksela profilu odpowiadające kwantyfikacjom wybranej warstwy płaszczyzny z, skopiuj dane profilu (pasek menu w oknie obrazu → Kopiuj) i wklej je w dowolnym oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.1.1-4.1.4 dla każdego przekroju płaszczyzny z uzyskanego obrazu konfokalnego i każdego kanału, w którym pożądana jest kwantyfikacja. 
		UWAGA: Kwantyfikacja różnych warstw płaszczyzny Z może być łączona w celu uzyskania ogólnej oceny specjalnego wzbogacenia sygnału poprzez obliczenie sumy wartości każdego piksela wzdłuż linii dla każdej warstwy płaszczyzny z. Ten rodzaj łączenia można osiągnąć tylko wtedy, gdy narysowana linia jest identyczna dla każdej warstwy płaszczyzny z uwzględnionej w wartościach średnich.</li>
		<li>Jako alternatywną metodę kwantyfikacji całych komórek różnych kanałów z dużą liczbą warstw należy użyć makra o nazwie StackprofileData (patrz plik uzupełniający). 
		UWAGA: To makro jest dostępne swobodnie w https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt i może być używane w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Wklej makro do pliku tekstowego i zapisz je.</li>
			<li>Otwórz plik obrazu, który zawiera wszystkie warstwy konfokalne komórki.</li>
			<li>Narysuj linię, zgodnie z opisem w kroku 4.1.2, otwórz nowe okno, aby zaimportować makro (pasek menu → Wtyczki → Makra→ Uruchom), wybierz poprzednio zapisany plik tekstowy odpowiadający makrowi StackprofileData i kliknij "Otwórz." 
			UWAGA: Po zaimportowaniu makr otworzy się nowe okno o nazwie "Wyniki", w którym wszystkie dane ilościowe wzdłuż wyznaczonej osi zostaną wyświetlone dla każdej warstwy i kanału płaszczyzny z obecnych w plikach obrazów.</li>
			<li>Skopiuj dane dla każdego kanału (pasek menu → Edytuj → Kopiuj), aby uzyskać graficzną reprezentację profilu odpowiadającą kwantyfikacjom sygnału. Wklej go do dowolnego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych. Oblicz wartość sumy każdego kanału dla każdego piksela wzdłuż linii dla każdej warstwy płaszczyzny z. Użyj tych wartości, aby utworzyć reprezentację graficzną podobną do tej przedstawionej w Rysunek 3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja sygnału w wyznaczonym obszarze komórkowym lub objętości.
	<ol>
		<li>Otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
		<li>Narysuj obszar, aby oznaczyć obszar zainteresowania za pomocą funkcji formy geometrycznej (pasek narzędzi →"prostokąt", "owal" lub "wielokąt"). 
		UWAGA: Wartość ilościowa zostanie określona dla obszaru odpowiadającego wylosowanej formie.</li>
		<li>Dostosuj poziom progu, aby uniknąć sygnału tła (pasek menu → Image Adjust → Threshold); pojawi się nowe okno reprezentujące intensywność pikseli w formie histogramu. Zmień wartości uwzględniania/wykluczania pikseli w kwantyfikacji za pomocą suwaka. Wybierz próg, który eliminuje czerwone piksele poza komórką, ponieważ piksele wyróżnione na czerwono zostaną uwzględnione w kwantyfikacji.</li>
		<li>Zdefiniuj parametry pomiaru, aby określić ilościowo sygnał pikselowy w wybranym obszarze, bez sygnału tła (pasek menu → Analizuj → ustaw pomiary) i upewnij się, że zaznaczyłeś pola "Limit do progu" i "Zintegrowana gęstość".</li>
		<li>Zmierz wartości ilościowe dla wybranego obszaru (pasek menu → Analizuj → Mierz). 
		UWAGA: Kwantyfikacja intensywności sygnału zostanie przedstawiona w nowym oknie pod oznaczeniem "IntDen", które reprezentuje iloczyn średnich wartości szarości i liczby pikseli w wybranym obszarze.</li>
		<li>Narysuj obszar obejmujący całą komórkę za pomocą formy geometrycznej (pasek narzędzi → "prostokąt", "owal" lub "wielokąt") i wykonaj kroki 4.2.3-4.2.5, aby uzyskać wartość odpowiadającą całkowitemu sygnałowi. Oblicz stosunek sygnału w wybranym obszarze do całego sygnału, aby uzyskać procent sygnału w obszarze zainteresowania.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.2.2-4.2.6, aby uzyskać ilościowe określenie objętości komórki dla każdej płaszczyzny z. Dostosuj formę geometryczną zgodnie z potrzebami.</li>
		<li>Skopiuj/wklej dane uzyskane z okien "Wyniki" dla każdej warstwy płaszczyzny z do arkusza kalkulacyjnego w celu przedstawienia graficznego i znalezienia wartości średniej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li>
<li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li>
<li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRICK%3A+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li>
<li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li>
<li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population%3A+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192(2016).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li>
<li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells%2C+necessary+for+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET%3A+a+valid+alternative+to+traditional+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Sport+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li>
<li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li>
<li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+cells+move+messages%3A+the+biological+functions+of+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li>
<li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+the+bicoid+morphogen+gradient+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li>
<li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analysis+of+mRNA%2C+Translation%2C+and+Protein+Localization%3A+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li>
<li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968(2012).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ostatnie osiągnięcia technologiczne pozwoliły na lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z translacyjną regulacją w górę lub tłumieniem określonych mRNA w procesach biologicznych, takich jak rozwój neuronów, odpowiedź na leki i przerzuty. Opisana tutaj ekonomiczna metodologia umożliwia wizualizację zdarzeń translacji w komórkach w celu zbadania, w jaki sposób białka wiążące RNA regulują procesy przerzutowe, takie jak adhezja komórkowa, migracja i inwazja.
Chociaż opracowano wiele metod oceny...

Regulacja translacji przez różne funkcje komórkowe skłoniła wiele zespołów badawczych do opracowania nowych narzędzi i metod do określenia subkomórkowej lokalizacji translacji mRNA i regulowanej syntezy białek1,2,3,4. Te najnowsze osiągnięcia technologiczne pozwalają na lepsze zrozumienie mechanizmów obejmujących translację w górę, regulację lub represję określonych mRNA podczas procesów biologicznych, takich jak rozwój neuronów, odpowiedź na leki i przerzuty5,6,7,8. Jednak większość z tych metod wymaga drogich lub niebezpiecznych odczynników i specjalnego sprzętu, który może nie być dostępny dla większości laboratoriów. W związku z tym opracowano opłacalną metodę umożliwiającą szybką ocenę zdarzeń związanych z tłumaczeniem, aby uniknąć tych potencjalnych problemów. Metoda ta wykrywa ostre modulacje translacyjne, które zachodzą podczas określonych procesów komórkowych, a także pozwala na lokalizację translacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Opisane tutaj metody były używane do monitorowania zlokalizowanej translacji w obrębie subkomórkowych przedziałów zwanych centrami inicjacji rozprzestrzeniania się (SIC)5. SIC to przejściowe struktury znajdujące się w komórkach nasiennych, które są zlokalizowane na powstających kompleksach adhezyjnych. Chociaż SIC i kompleksy adhezyjne są różne, ich losy są ze sobą ściśle powiązane. Rzeczywiście, wiadomo, że SIC stopniowo zanikają po dojrzewaniu kompleksu adhezji ogniskowej w miejscu adhezji w początkowej fazie adhezji. Odkryliśmy, że białka wiążące RNA, o których wiadomo, że specyficznie kontrolują translację mRNA (np. Sam68, FMRP i G3BP1) oraz poliadenylowane RNA były wzbogacone w tych strukturach5. Korzystając z opisanych tutaj metod, wykazaliśmy, że regulacja translacji mRNA związanej z SIC działa jak punkt kontrolny umożliwiający komórkom zasianym konsolidację adhezji komórkowej. Metoda ta, oparta na inkorporacji puromycyny, może być uważana za zaadaptowaną wersję testu translacji z wykrywaniem powierzchni (SunSET). Pierwotnie opracowana do pomiaru globalnego tempa syntezy białek przy użyciu nieznakowanego radioaktywnie aminokwasu, puromycylacja białek oferuje skuteczny sposób wizualizacji syntezy białek de novo9. Metoda ta opiera się na wewnętrznym zachowaniu puromycyny, antybiotyku, który blokuje translację poprzez przedwczesne zakończenie łańcucha w rybosomie10. Rzeczywiście, puromycyna jest strukturalnie analogiczna do tyrozylo-tRNA, co pozwala na włączenie do wydłużających się łańcuchów peptydowych poprzez tworzenie wiązania peptydowego. Jednak wiązanie puromycyny z rosnącym łańcuchem peptydowym zapobiega tworzeniu się nowego wiązania peptydowego z następnym aminoacylo-tRNA, ponieważ puromycyna ma niehydrolizowalne wiązanie amidowe zamiast hydrolizowalnego wiązania estrowego znajdującego się w tRNA. Tak więc włączenie puromycyny do wydłużających się polipeptydów powoduje przedwczesne uwalnianie licznych skróconych polipeptydów puromycylowanych odpowiadających aktywnie translowanemu mRNA9,11,12.
Korzystając z tej metody, można było ocenić aktywną translację w krótkim czasie (np. 5 minut) podczas adhezji komórkowej za pomocą specyficznego przeciwciała skierowanego przeciwko puromycynie na komórkach, które były uzupełniane antybiotykiem przez 5-minutowe okresy w różnych punktach czasowych procesu adhezji komórek5. Precyzja tego testu opiera się na wysoce specyficznych przeciwciałach skierowanych przeciwko ugrupowaniu puromycylowemu. Immunofluorescencyjne wykrywanie puromycylowanego polipeptydu zapewnia ogólną subkomórkową repartycję nowo translowanego mRNA, którą można również określić ilościowo z dużą dokładnością za pomocą systemów obrazowania konfokalnego.
Stąd, ta metoda stanowi istotną opcję dla dużej liczby laboratoriów badających translacyjne mechanizmy regulacyjne związane z procesami takimi jak granulacja neuronów6,13,14,15, lokalizacja mRNA morfogenu i translacja podczas rozwoju16,17. Doskonale nadaje się również do badania zlokalizowanej lub przedziałowej translacji podczas gwałtownych zdarzeń biologicznych, takich jak migracja komórek, adhezja lub inwazja, lub po prostu do oceny leczenia farmakologicznego, które może wywołać zmiany translacyjne5,7,18. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta pozwala na wizualizację zlokalizowanych lub kontrolowanych zdarzeń tłumaczeniowych w szybki, precyzyjny i opłacalny sposób.

<table><tbody><tr><td>Żubr DMEM</td><td></td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Żubr trypsynowy</td><td></td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Puroycyny 12D10</td><td>EMD milipory</td><td>MABE343</td><td>western blot rozcieńczenie 1:25 000 Rozcieńczenie immunofluorescencji 1:10 000</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG, sygnalizacja komórkowa przeciwciał sprzężona z HRP</td><td> technologia</td><td>7076</td><td>rozcieńczenie western blot 1:8,000</td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>technologia <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>4408</td><td>rozcieńczenie immunofluorescencji 1:400</td></tr><tr><td>CF568 Biotium falloidyny</td><td></td><td>00044</td><td>rozcieńczenie immunofluorescencji 1:400</td></tr><tr><td>Cykloheksmid</td><td>Sigma</td><td>C1988-1G</td><td>50&mikro; g / ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>stężenie końcowe 1&mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>bio-Basic</td><td>PJ593</td><td>2,5 i mikro; g / ml do 10 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Ibidi &micro;-Dish 35 mm, wysoka, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MRC-5</td><td>Komórki ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Komórki</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7</td><td>od Dr. Mazroui (Universit&eacute; Laval)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fv1000</td><td>olympus</td><td></td><td>system obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Fidżi <td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td><td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37% roztwór</td><td>bio-Basic</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>bio-Basic</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Mechanizmy regulujące translację mRNA są zaangażowane w różne procesy biologiczne, takie jak rozwój linii zarodkowej, różnicowanie komórek i organogeneza, a także w wiele chorób. Liczne publikacje przekonująco wykazały, że określone mechanizmy ściśle regulują translację mRNA. Zwiększone zainteresowanie indukowaną translacją regulacją ekspresji białek doprowadziło do opracowania nowych metod badania i śledzenia syntezy białek de novo w celuli. Jednak większość z tych metod jest złożona, co czyni je kosztownymi i często ogranicza liczbę celów mRNA, które można badać. W artykule tym zaproponowano metodę, która wymaga jedynie podstawowych odczynników i konfokalnego systemu obrazowania fluorescencyjnego do pomiaru i wizualizacji zmian w translacji mRNA, które zachodzą w dowolnej linii komórkowej w różnych warunkach. Metoda ta została niedawno wykorzystana do pokazania zlokalizowanej translacji w strukturach subkomórkowych przylegających komórek w krótkim okresie czasu, oferując w ten sposób możliwość wizualizacji translacji de novo przez krótki okres podczas różnych procesów biologicznych lub walidacji zmian w aktywności translacyjnej w odpowiedzi na określone bodźce.

Aby dokładnie obserwować zdarzenia translacyjne przy użyciu wbudowywania puromycyny, kluczowe jest określenie optymalnych warunków dla każdej linii komórkowej, ponieważ każda z nich wykazuje inną kinetykę wbudowywania puromycyny (Ryc. 1)9,11,12,18. Zatem w celu walidacji wbudowywania puromycyny konieczne jest poddanie badanej linii ...

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja i ilościowe określenie zdarzeń translacji w przedziałach komórkowych, które zachodzą podczas początkowych etapów adhezji komórkowej. Metoda ta ma szerokie zastosowanie. Należy ją wykorzystywać wszędzie tam, gdzie konieczne jest badanie szybkiej i specyficznej odpowiedzi translacyjnej, na przykład podczas analizy migracji komórek, adhezji lub wczesnej odpowiedzi na lek.Głównymi zaletami tej techniki są jej prostota, szybkość oraz efektywność kosztowa. Wymaga ona jedynie puromycyny, przeciwciał skierowanych przeciwko puromycynie oraz standardowego systemu obrazowania skanującego konfokalnego. W celu rozpoczęcia przygotuj zawiesinę komórek MRC-5.Należy przeprowadzić trypsynizację, a następnie wirowanie, usunięcie supernatantu i resuspensję w DMEM z dziesięcioprocentowym FBS, do uzyskania stężenia 40 tysięcy komórek na mililitr. Zawiesinę należy inkubować przy łagodnym obracaniu przez 20 minut, aby całkowicie rozbić kompleksy adhezji ogniskowej. Jest to kluczowy etap.Następnie do dwóch szalek z szklanym dnem o średnicy 35 mm należy dodać alikwoty zawiesiny o objętości 2 ml i inkubować je, aby umożliwić adhezję komórek oraz tworzenie się

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji mRNA związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach hodowli tkanek ssaków. Technika ta polega na selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej digitoniną w celu usunięcia zawartości cytoplazmatycznej, a następnie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia masowych mRNA poli(A) lub specyficznych transkryptów.

Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Precyzyjna lokalizacja mieszkańców Golgi jest kluczowa dla zrozumienia funkcji komórkowych Golgiego. Jednak konwencjonalna mikroskopia optyczna nie jest w stanie rozstrzygnąć struktury sub-Golgiego. Tutaj opisujemy protokół dla konwencjonalnej metody superrozdzielczości opartej na mikroskopii, mającej na celu ilościowe określenie sub-Golgiego lokalizacji białka.

Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Poznaj metodę immunofluorescencji ilościowej do wizualizacji i pomiaru lokalizowanej translacji w komórkach MRC-5 podczas adhezji. Technika ta jest szybka, tania i wymaga tylko podstawowego systemu obrazowania konfokalnego.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Przeglądaj więcej filmów