Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja i ilościowe określenie zdarzeń translacji z podziałem na przedziały, zachodzących podczas początkowych etapów adhezji komórek. Ta metoda ma szerokie zastosowanie. Używaj go zawsze, gdy może być testem szybkiej specyficznej odpowiedzi translacji, na przykład podczas analizy migracji komórek, adhezji lub wczesnej odpowiedzi na lek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa, szybka i opłacalna. Wymaga jedynie puromycyny, przeciwciał skierowanych przeciwko puromycynie i standardowego systemu obrazowania konfokalnego. Na początek wykonaj zawiesinę komórek MRC-5.

Zastosować trypsynizację, a następnie odwirowanie, usunięcie supernatantu, a następnie ponowne zawieszenie w DMEM z dziesięcioprocentowym FBS, w ilości 40 tysięcy komórek na mililitr. Inkubuj zawiesinę z delikatnym obracaniem przez 20 minut, aby całkowicie zdysocjować ogniskowe kompleksy adhezyjne. Ma to kluczowe znaczenie.

Następnie do dwóch naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów dodaj dwie mililitrowe porcje zawiesiny i inkubuj je, aby umożliwić adhezję komórkową i tworzenie SiC. Po 40 minutach potraktuj jedną płytkę cykloheksymidem i włóż ją z powrotem do inkubatora. Płytka ta będzie pełnić funkcję kontroli negatywnej.

Po 55 minutach nałóż puromycynę na obie płytki w ustalonym stężeniu i inkubuj płytki przez kolejne pięć minut. Po godzinie wysiewu i pięciu minutach puromycyny we współpracy, umyj każdą płytkę dwukrotnie dwoma mililitrami lodowatego PBS. Następnie utrwal komórki jednym mililitrem czteroprocentowego formaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu umyj komórki trzykrotnie PBS, a następnie przeniknij komórki za pomocą 500 mikrolitrów 0,5 procent trytonu X-100 w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj płytki trzykrotnie PBS, a następnie nałóż 500 mikrolitrów jednego procenta BSA w PBS. Kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej jeszcze przez 20 minut.

Aby usunąć nadmiar BSA, umyj komórki trzykrotnie 0,1 procentem Tween-20 w PBS. Teraz inkubuj komórki z 300 mikrolitrami przeciwciała anty-puromycyny. Usuń niezwiązane przeciwciało, przemywając je trzykrotnie 0,1 procentem Tween-20.

Następnie nałóż trzysta mikrolitrów mieszaniny dwóch przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem, aby uwidocznić puromykolowane polipeptydy i de factem. Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po godzinie umyj płytki trzykrotnie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie nałóż trzysta mikrolitrów 0,1% roztworu Tween-20, uzupełnionego DAPI.

Pozwól DAPI pozostać w komórkach przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec umyj komórki jeszcze cztery razy, kończąc praniem w czystym PBS. Następnie przechowuj komórki w dwóch mililitrach PBS do obrazowania.

Korzystając z dowolnego dostępnego na rynku systemu obrazowania konfokalnego, najpierw określ odpowiednie ustawienia, które maksymalizują zakres dynamiczny do oznaczania ilościowego. Skupienie się na kwantyfikacji można uzyskać tylko wtedy, gdy unika się nasycenia wielkością piku, a stężenie jest odpowiednio dostosowane. Ustawienie można osiągnąć, ostrożnie dostosowując przewagę mocy lasera i przesunięcia.

Najpierw dostosuj współczynnik powiększenia i liczbę pikseli, aby zoptymalizować rozmiar piksela. Zrób to zgodnie z twierdzeniem Nyquista. Następnie zmniejsz prędkość skanowania i użyj uśredniania, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.

Następnie ręcznie określ odpowiednie górne i dolne płaszczyzny ogniskowej wzdłuż osi Z i ustaw StepSize, obliczając rozdzielczość osiową i dzieląc tę odległość przez 2,3. Typowy wynik to od 20 do 25 warstw obrazu. Po dostosowaniu ustawień uzyskaj konfokalny obraz całej pojedynczej komórki za pomocą 60-krotnego obiektywu zanurzeniowego Plan Apo z aperturą numeryczną 1,42.

Aby określić ilościowo i przeanalizować sygnały fluroforowe, najpierw otwórz obraz odpowiadający warstwie płaszczyzny z będącej przedmiotem zainteresowania na obrazie J. Następnie, za pomocą narzędzia do rysowania, narysuj linię przez komórkę, w której pożądana jest kwantyfikacja. Następnie zmodyfikuj wąchać linię, klikając dwukrotnie prosto. Wartości intensywności zostaną uśrednione na całej szerokości linii, więc użyj cieńszej linii, aby uniknąć nakładania się sygnałów z różnych struktur.

Następnie należy sprofilować gęstość sygnału wzdłuż linii. Teraz powtórz proces zbierania gęstości sygnału wzdłuż tej samej linii w kanale, który odpowiada fluroforowi. Wartości będą zawsze uporządkowane według orientacji linii.

Teraz skopiuj dane profilu i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Powtórz ten proces zbierania danych z każdego interesującego obrazu płaszczyzny Z przed przystąpieniem do analizy statystycznej. Alternatywnie, zamiast zbierać sygnał wzdłuż osi, sygnał może być zbierany z obszaru obrazu.

Najpierw użyj funkcji formularza geometrycznego, aby wybrać interesujący Cię obszar. Następnie dostosuj poziom progu, aby uniknąć tła. Na histogramie intensywności pikseli przesuń suwak, aby dostosować, które piksele zostaną uwzględnione w kwantyfikacji.

Ustaw próg, aby wyeliminować wszystkie czerwone piksele poza komórką. Teraz zdefiniuj parametry pomiarowe potrzebne do pomiaru interesującego nas sygnału, a nie sygnału tła. Przełącz limit na opcje progu i zintegrowanej gęstości.

Następnie użyj polecenia zmierz. Spowoduje to otwarcie nowego okna ze średnimi wartościami szarości i liczbą pikseli w wybranym obszarze. Teraz powtórz proces, stosując ten sam próg, aby określić intensywność sygnału w całej komórce.

Następnie użyj tych danych, aby obliczyć stosunek sygnału w wybranym obszarze do sygnału całej komórki. W celu dokładnego pomiaru zdarzeń translacji za pomocą inkorporacji purmycyny, najpierw oceniono optymalne warunki dla pomiaru osiowego. Porównano spektrum stężeń w porównaniu z pięcio- lub dziesięciominutową kuracją.

Dopuszczalne stężenie puromycyny dla komórek MRC-5 i HeLa było nieco wyższe niż to, co jest potrzebne dla komórek Huh-7. Komórki traktowane przez dziesięć minut wysokimi stężeniami puromycyny generowały głównie mniejsze polipeptydy puromykolowane. Mniejsze polipeptydy rozbrajają się szybciej i nie są pożądane.

Krótszy czas inkubacji uznano zatem za bardziej pożądany. Leczenie cykloheksymidem jest skuteczną i ważną metodą kontroli negatywnej. W komórkach MRC-5 po leczeniu cykloheksymidem wykryto tylko słaby sygnał puromycyny.

Korzystając z kwantyfikacji sygnału osiowego, można ocenić ogólną lokalizację polipeptydów puromykolowanych odpowiadających nowo zsyntetyzowanym białkom na różnych poziomach w komórce. Możliwy był również ilościowy rozkład sygnału w całej komórce. W przypadku każdej z tych technik ważne było ilościowe określenie sygnału dla każdej płaszczyzny Z w stosie obrazów, aby dokładnie ocenić zdarzenia translacji w całej komórce.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić zdarzenie translacji w przedziale subkomórkowym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Kiedy myśli się o tej procedurze, należy pamiętać, że ważne jest stężenie puromycyny i czas jej inkubacji.

Aby ograniczyć dyfuzję, lepiej jest ograniczyć czas inkubacji. Ważne jest również, aby zdać sobie sprawę, że jakość typu akwizycji obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników. Nie zapominaj, że praca z formaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze chemicznym.