Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source
16 grudnia 2014
Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.
Ogólnym celem tej procedury jest obiektywny pomiar odpowiedzi poszczególnych komórek poprzez ilościowe określenie określonych intensywności markerów fluorescencyjnych na podstawie obrazów mikroskopowych. Osiąga się to poprzez najpierw poddanie przylegających komórek hodowli tkankowej knockdownowi genów za pośrednictwem irna. W drugim etapie komórki są barwione fluorescencyjnie, a następnie obrazowane pod kątem kilku interesujących markerów.
W ostatnim kroku ekspresja markerów w określonych regionach subkomórkowych jest definiowana algorytmicznie, są to pojedyncze komórki. Ostatecznie, odpowiedzi komórkowe na sygnały biologiczne wynikające z knockdownu genów można przeanalizować, mierząc poziomy ekspresji fluorescencyjnej markerów będących przedmiotem zainteresowania i ich translokacji subkomórkowej. Chociaż procedura ta zapewnia wgląd w regulację tranzytu cyklu komórkowego G w odpowiedzi na siRNA.
Może być również stosowany w badaniach generujących obrazy fluorescencyjne komórek, badających transport jądrowy i homeostazę białek. Procedurę zademonstrują Daniel Wek i koledzy z Car K HO z mojego laboratorium Zacznij od dozowania 70 mikrolitrów 200 nanomolowego irna, rozcieńczonego buforu irna do odpowiednich dołków sterylnej 96-dołkowej płytki w sterylnym kapturze do hodowli tkanek. Następnie dodać 105 mikrolitrów lipidów do transfekcji rozcieńczonych w 40 objętościach pożywki DMEM wolnej od surowicy do każdej studzienki sir i wymieszać płytkę przez delikatne wibracje temperatury pokojowej, a następnie po 10 minutach podzielić powstałe 175 mikrolitrów na trzy powtórzenia po 50 mikrolitrów na cel do nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej poddanej działaniu kultury tkankowej z przezroczystą podstawą.
Następnie dozuj 8 000 komórek na studzienkę w 150 mikrolitrach DMEM z 10% surowicą bezpośrednio na 50 mikrolitrów kompleksów lipidowo-irnowych bez mieszania. Następnie uszczelnij płytkę sterylną, samoprzylepną, oddychającą membraną i umieść ją w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. 48 godzin później odessać pożywkę z płytek.
Następnie utrwalić komórki w 100 mikrolitrach 4% buforu formaldehydu w dygestorium w temperaturze pokojowej Po 10 minutach odessać utrwalacz i po ostatnim praniu wykonać trzy 100 mikrolitrowe płukania PBS. Usunąć PBS i perforować komórki trzema cyklami inkubacji roztworu permającego 100 mikrolitrów każdy, trwających 10 minut każdy, w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Po ostatniej inkubacji usunąć roztwór przenikający, a następnie dodawać 100 mikrolitrów roztworu blokowego na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie odessać roztwór blokowy i sondować komórki 50 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w ciągu dwóch tygodni od znakowania mikroskopu konfokalnego uc obiektywem 20x, aby wykonać oddzielne 16-bitowe obrazy TIFF w skali szarości w trzech kanałach odpowiadających barwnikowi DNA, GFP i barwieniu immunologicznemu. Czwórki flory przechwytują wiele nienakładających się na siebie zestawów obrazów lub ramek, aby zobrazować około 1000 do 2000 komórek na studzienkę. Systematyczne nazywanie pliku obrazu informacjami o metadanych, tak aby każda nazwa pliku była unikalną kombinacją nazwy eksperymentu, adresu studni, numeru ramki i identyfikatora kanału.
Następnie otwórz oprogramowanie do profilowania komórek i kliknij plik i importuj potok. Następnie, w obszarze od pliku, wybierz plik three channels pipeline CP pipe file, który zawiera niezbędne instrukcje dla oprogramowania do interpretacji metadanych pliku obrazu z zapisanej nazwy pliku Convention Cell Profiler może być teraz używany do powiązania obrazów, wyodrębnienia intensywności jądrowego DNA i przeciwciał z plików oraz użycia kanału GFP do obliczenia stosunku intensywności jądra do cytoplazmy. Dla każdej wykrytej komórki kliknij przycisk wyświetl ustawienia wyjściowe, a następnie kliknij domyślne foldery wejściowe i domyślne foldery wyjściowe.
Wybór odpowiednio lokalizacji plików graficznych do analizy i miejsca docelowego dla wyodrębnionych danych. Następnie w oknie modułów analizy kliknij odpowiednie ikony oczu, aby obserwować okna identyfikuj obiekty podstawowe i obiekty trzeciorzędne podczas analizy, a następnie kliknij przycisk analizuj obrazy po zakończeniu analizy. Kliknij przycisk OK w oknie komunikatu i przejdź do domyślnego folderu wyjściowego Lokalizacja, w której wszystkie pliki danych są zapisywane jako pliki z wartościami rozdzielanymi przecinkami.
Aby przeprowadzić ekstrakcję danych, znajdź nowy plik CSV jąder zawarty wśród danych wyjściowych profilera komórek, który zawiera dane poszczególnych komórek dla intensywności przeciwciał jądrowych fluorescencyjnych i intensywności jądrowego DNA GFP CDK dwóch wartości współczynnika reporterowego. Skopiuj dostarczony plik skryptu impulsowego do klasyfikatora chodu PL do tego samego folderu, co plik danych CSV jądra. Następnie kliknij dwukrotnie ikonę Pearl Script.
A po wyświetleniu monitu wpisz pełną nazwę pliku danych, a następnie nazwę pliku DOT CSV dla pliku, w którym komórki mają być bramkowane, oraz wartości bramek dla fluorescencji przeciwciała i G FP CDK dwóch danych reporterowych. Upewnij się, że nowo utworzony plik łączy surowe wartości testu poszczególnych komórek z oryginalnego profilu komórkowego danych z etykietami subpopulacji pokazującymi, jak każda komórka z każdej studzienki działa przeciwko obu bramkom. Teraz otwórz oprogramowanie R Studio, aby wykreślić dane dla każdego warunku eksperymentalnego przy użyciu etykiet subpopulacji poszczególnych komórek, klikając plik i otwórz plik, a następnie wybierając podany plik analizy kropki r.
Wpisz adres komputera folderu zawierającego bramkowane dane, w tym literę dysku i nazwę samego pliku. Następnie zaznacz linie od 1 do 17 w lewym górnym oknie naszego studia i kliknij przycisk uruchamiania, aby wprowadzić wartości progowe danych eksperymentalnych i szczegóły lokalizacji odwiertu. Na koniec zaznacz poszczególne bloki pozostałego kodu poniżej wiersza 17 i kliknij przycisk uruchom, aby utworzyć odpowiednie wykresy.
Obserwuj działki w oknie w prawym dolnym rogu naszego studia, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać je w różnych formatach. Opisany tutaj przepływ pracy analizuje obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego w celu uzyskania surowych danych w postaci listy szczegółowo opisującej każdą zidentyfikowaną komórkę i odpowiadające jej wartości testowe. Istnieje wiele możliwości analizy tych danych.
Na przykład na tych wykresach histogramu wartości testu dla komórek poddanych działaniu kontrolnego RNA umożliwiają identyfikację odpowiednich bramek progowych dla każdego testu. Progi bramkowania są następnie stosowane za pomocą skryptu impulsowego w celu oznaczenia każdej komórki w surowych danych zgodnie z wynikiem testu. Takie podejście do znakowania pomaga we wstępnej wizualnej, jak również w automatycznej ocenie relacji między leczeniem a dystrybucją subpopulacji nawet bardzo dużych zestawów danych dotyczących pojedynczych komórek.
Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie warunki knockdownu trzech irna spowodowały kontrastujące rozkłady komórek względem bramek w dwóch testach. Wykresy R używają etykiet do obliczania procentowego rozkładu komórek w każdym kwadrancie. Etykiety umożliwiają również powiązanie dodatkowych pomiarów fluorescencyjnych z danymi testowymi.
W tym eksperymencie subpopulacje komórek traktowanych SI CDK 6 pogrupowano zgodnie z odpowiednimi etykietami testowymi i wykreślono jako histogramy barwienia jądrowego DNA. To użycie etykiet danych komórkowych ujawnia związek między dwoma testami komórkowymi a zawartością DNA w komórkach. Podczas wykonywania tej procedury zawsze należy pamiętać o przetestowaniu i dostosowaniu parametrów segmentacji obrazu podczas korzystania z profilera komórek.
Jest to szczególnie ważne w przypadku korzystania z nowych lub nieprzetestowanych plików graficznych po raz pierwszy. Porządku.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia elastyczny przepływ pracy informatycznej dla wielokrotnej analizy opartej na obrazach komórek oznaczonych fluorescencją. Przepływ pracy ilościowo oznacza markery jądrowe i cytoplazmatyczne, umożliwiając obliczenie translokacji markerów między tymi przedziałami.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Tło
- Rozumienie reakcji komórkowych na tłumienie genów jest kluczowe dla badania różnych procesów biologicznych.
- Markery fluorescencyjne są niezbędne do wizualizacji i ilościowego określania składników komórkowych.
- Analiza oparta na obrazach zapewnia potężne narzędzie do oceny zachowania komórek.
- Niezawodne metody wykrywania markerów są potrzebne do uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Obiektywne mierzenie reakcji pojedynczych komórek na wskazówki biologiczne.
- Ilościowe określenie intensywności określonych markerów fluorescencyjnych z obrazów mikroskopowych.
- Analiza translokacji markerów między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi.
Stosowane metody
- Tłumienie genów komórek kultur tkankowych przywierających za pomocą siRNA.
- Fluorescencyjne barwienie komórek z późniejszym obrazowaniem wielu markerów.
- Algorytmiczne określenie ekspresji markerów w obrębie podkomórkowych regionów.
- Wyodrębnianie i analiza danych przy użyciu Cell Profiler i R Studio.
Główne wyniki
- Udane ilościowe określenie intensywności markerów jądrowych i cytoplazmatycznych.
- Analiza reakcji komórkowych na tłumienie genów poprzez poziomy ekspresji fluorescencyjnej.
- Identyfikacja subkomórkowych wzorców translokacji markerów.
- Generowanie szczegółowych plików danych dla wartości pojedynczych komórek w badaniu.
Wnioski
- Przepływ pracy umożliwia kompleksową analizę oznaczonych fluorescencyjnie komórek.
- Daje wgląd w reakcje komórkowe i mechanizmy regulacyjne.
- Ta metodologia może być stosowana w różnych badaniach z zastosowaniem fluorescencyjnego obrazowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This workflow enables biopharma R&D teams to extract quantitative, single-cell fluorescence data from standard microscope images, supporting mechanistic de-risking in target validation. By quantifying marker translocation and subcellular localization at single-cell resolution, it enhances predictive confidence in early discovery and reduces reliance on population-averaged assays that mask heterogeneous responses. The open-source nature of the pipeline lowers barriers to adoption, promoting reproducibility and cross-functional data sharing across discovery biology and assay development teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking siRNA-mediated gene knockdown to quantitative changes in nuclear/cytoplasmic marker ratios.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data that clarifies pathway activity and functional target engagement beyond bulk measurements.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying subpopulation-specific responses that may indicate differential compound sensitivity or resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative single-cell outputs compatible with high-content screening formats and plate-based perturbation studies.
- Reproducibility: Uses algorithmic segmentation and gating via Cell Profiler to minimize user bias and ensure consistent feature extraction across laboratories.
- Scalability: Processes thousands of cells per well, enabling robust statistical analysis of heterogeneous responses in large-scale siRNA or compound screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links phenotypic screening readouts to mechanistic biomarkers by correlating marker translocation with functional outcomes like cell cycle progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target pathway modulation versus off-target effects through subcellular resolution of signaling dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by quantifying the penetrance and uniformity of cellular responses across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative imaging-based phenotyping that informs hit selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic perturbations alter biomarker localization and intensity in defined subcellular compartments.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized single-cell data suitable for Z'-factor calculation and hit confirmation in multiplexed fluorescence assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of subpopulation distributions using gated outputs from Cell Profiler and R-based visualization, facilitating condition-to-condition comparisons.
- Translational Research: Connects imaging phenotypes to downstream validation by preserving single-cell resolution data that can be correlated with orthogonal assays like flow cytometry or Western blot.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable informatics pipeline for multiplexed image analysis that can be adapted across disease models and marker panels without revalidation of core algorithms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing heterogeneous responses and translocation dynamics masked in population averages.
- Operational Value: Promotes standardization through open-source tools (Cell Profiler, R) and defined file-naming conventions that reduce variability across sites.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content-like analysis on universal fluorescence microscopes, reducing dependency on specialized, high-cost instrumentation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying the consistency and depth of target engagement across genetic or chemical perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image-based assay design, and basic scripting for pipeline execution in Cell Profiler and R Studio.
- Depends on access to fluorescence-capable microscopes and storage infrastructure for managing large TIFF image datasets generated during screening campaigns.
- Necessitates cross-team agreement on image naming conventions, segmentation parameters, and gating thresholds to ensure data comparability across experiments and users.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to new cell types, marker combinations, or subcellular regions of interest, requiring validation of identification and classification modules.
- Practical limitations include reliance on adequate signal-to-noise ratio in fluorescence channels and the need for optimization of illumination and exposure settings to prevent saturation or bleed-through.
