Generowanie i utrzymywanie astrosfer przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zacznij od płytki pokrytej ECM i skupisk nasion ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w pożywce wzrostowej zawierającej inhibitory kinazy Rho.

ECM zwiększa przyczepianie komórek, podczas gdy inhibitory blokują kinazy Rho, zapobiegając apoptotycznej śmierci komórek i promując przeżycie i proliferację komórek.

Wprowadź pożywkę różnicowania neuronalnego, aby indukować różnicowanie komórek macierzystych w nerwowe komórki progenitorowe.

Leczyć roztworem odłączającym; enzymy w tym roztworze degradują ECM i kontakt komórkowy, uwalniając komórki.

Przenieść je do niepowlekanej kolby zawierającej inhibitory kinazy Rho.

Inhibitory ułatwiają przeżycie komórek i spontaniczną agregację w trójwymiarowe struktury lub sferoidy.

Uzupełnij sferoidy bogatą w czynnik wzrostu pożywką różnicującą neurony, umożliwiając neuronalnym komórkom progenitorowym różnicowanie się w progenitory astrocytów i tworzenie astrosfer.

Regularnie dodawaj roztwór odłączający, aby rozdzielić astrosfery na mniejsze gromady. Dzięki temu składniki odżywcze docierają do wewnętrznych komórek sferoidy i utrzymują ich żywotność.

Utrzymuj astrosfery w świeżym podłożu, aby przodkowie mogli dojrzeć do astrocytów.

Zacznij od wysiewu klastrów hPSC w 2 mililitrach pożywki hPSC zawierającej inhibitor kinazy Rho Y-27632 do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej ECM. Utrzymuj komórki macierzyste do momentu, gdy osiągną około 50% zlewania się. Następnie zmień pożywkę na pożywkę neuronową zawierającą SP-431542 i DMH1, aby promować indukcję neuronalną.

Gdy komórki są w około 95% zlewne, podziel każdą studzienkę od 1 do 6 do nowych studzienek pokrytych ECM. W dniu 14 należy rozdzielić komórki roztworem oddzielającym i przenieść zawartość każdej studzienki do niepowlekanej kolby T-25 z pożywką zawierającą Y-27632 w celu pobudzenia tworzenia agregatów.

Aby wygenerować progenitory astrocytów i astrocyty w spontanicznie utworzonych agregatach 3D, przełącz się na pożywkę neuronalną zawierającą EGF i FGF2 i podawaj co trzy do czterech dni, aż tożsamość astrocytów zostanie potwierdzona po czterech do sześciu miesiącach.

Domyślnie ten protokół wytwarza astrocyty kory grzbietowej. Jednak podtypy astrocytów można określić regionalnie poprzez dodanie morfogenów wzorcowych, jeśli jest to pożądane.

Raz w tygodniu, gdy pojawią się ciemne centra, zbierz kulki przez odwirowanie, a następnie delikatnie odłącz agregaty H-astro za pomocą roztworu odłączającego. Ponownie plateruj tylko te kule, które nie przyczepiają się spontanicznie, aby uniknąć przejścia komórek innych niż OUN i nienerwowych.