Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii dotyczące tego, w jaki sposób komunikacja międzykomórkowa między wieloma typami ludzkich komórek nerwowych przyczynia się do tworzenia i funkcjonowania obwodów synaptycznych. Technika ta szybko i systematycznie generuje trójwymiarowe sfery kokultury funkcjonalnie dojrzałych astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Można je wykorzystać do rygorystycznych badań eksperymentalnych.

Odtwarzalność i skalowalność tego protokołu stanowi zdefiniowaną alternatywę dla pojawiających się technologii organoidowych. Są one obiecujące dla rozwoju nowych leków i terapii wszczepienia komórek w celu promowania regeneracji neurologicznej po urazie lub chorobie. Zacznij od umieszczenia klastrów HPSC w dwóch mililitrach pożywki HPSC zawierającej inhibitor kinazy rho-27632 w każdym dołku sześciodołkowej płytki pokrytej ECM.

Utrzymuj komórki macierzyste do momentu, gdy osiągną około 50% zlewania się, a następnie zmień pożywkę na pożywkę nerwową zawierającą SB431542 i DMH1, aby promować indukcję neuronalną. Gdy komórki są w około 95% zlewne, podziel każdą studzienkę od jednego do sześciu do nowych studzienek pokrytych ECM. W dniu 14 należy rozdzielić komórki roztworem oddzielającym i przenieść zawartość każdej studzienki do niepowlekanej kolby T25 z pożywką zawierającą Y-27632 w celu pobudzenia tworzenia agregatów.

Aby wygenerować progenitory astrocytów i astrocyty w spontanicznie powstałych agregatach 3D, przełącz się na pożywkę neuronową zawierającą EGF i FGF2 i podawaj co trzy do czterech dni, aż tożsamość astrocytów zostanie potwierdzona po czterech do sześciu miesiącach. Domyślnie ten protokół wytwarza astrocyty kory grzbietowej. Jednak podtypy astrocytów można określić regionalnie przez dodanie morfogenów wzorcowych, jeśli jest to pożądane.

Raz w tygodniu, gdy pojawią się ciemne centra, zbierz kulki przez odwirowanie, a następnie delikatnie odłącz agregaty H-astro za pomocą roztworu odłączającego. Ponownie plateruj tylko te kule, które nie przyczepiają się spontanicznie, aby uniknąć przejścia komórek innych niż OUN i nienerwowych. Po czterech do sześciu miesiącach od ekspansji potwierdź tożsamość komórki w pożywce do zamrażania i kriokonserwacji zgodnie z instrukcjami producenta lub natychmiast użyj do eksperymentów.

W celu wytworzenia nietransgenicznych progenitorów neuronalnych w neuronach lub neuronach H, należy wysiać neuronalne progenitory pochodzące z HPSC dnia 14 do sześciodołkowych płytek pokrytych ECM z dwoma mililitrami pożywki neuronowej i Y-27632 na studzienkę. Jeśli pracujesz z iNeuronami indukowanymi doksycykliną, dodaj pożywkę neuronalną zawierającą doksycyklinę, gdy komórki są w około 35% zlewne, aby wywołać różnicowanie i aktywować ekspresję genów. Po dwóch dniach nakarm linie transgeniczne i nietransgeniczne dwoma mililitrami pożywki neuronowej na studzienkę dziennie.

Kontynuuj, aż komórki będą gotowe do podniesienia przy 70% zbiegu. W przypadku kokultur najpierw delikatnie oddziel H-astros od agregatów 3D za pomocą roztworu oddzielającego. Następnie przystąp do dysocjacji neuronów H lub iNeuronów od monowarstwy 2D.

Najpierw usuń pożywkę z płytki sześciodołkowej i dodaj 500 mikrolitrów roztworu oddzielającego do każdej studzienki zawierającej kultury jednowarstwowe. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji delikatnie dodaj dwa do trzech mililitrów pożywki DMEM-F12, aby usunąć przyłączone komórki.

Następnie zbierz komórki w pożywce w 15-mililitrowej stożkowej probówce i odwiruj przy 300 razy G przez jedną minutę. Odessać supernatant, dodać jeden mililitr świeżej pożywki i delikatnie pipetować w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Policz każdy typ komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.

Dodaj żądany stosunek zdysocjowanych H-astros i H-neuronów lub iNeuronów w łącznej objętości dwóch mililitrów do każdego dołka mikropłytki. Odwirować płytkę w temperaturze 100 razy G przez trzy minuty i wrócić do inkubatora na dwa dni. Po jednym dniu w płytce powinny uformować się gęsto upakowane mikrosfery.

Użyj mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby delikatnie usunąć kulki z mikrostudzienek. Lekko przyłóż siłę do dna mikrostudzienek za pomocą medium, aby usunąć wszelkie dodatkowe przylegające kule. Po zebraniu wszystkich kulek w 15-mililitrowej stożkowej rurce pozostaw do osiadania.

Następnie umyj kulki, najpierw zasysając stare podłoże, a następnie dodając co najmniej dwa mililitry świeżego podłoża. Dodaj kulki do kolby obrotowej zawierającej od 50 do 60 mililitrów pożywki. Umieścić kolbę w inkubatorze na magnetycznej płytce mieszającej ustawionej na 60 obr./min.

Do powstania synaps potrzebne są co najmniej trzy tygodnie w hodowli. Rozpocznij od pokrycia powierzchni każdej matrycy wieloelektrodowej lub MEA jednym mililitrem poliornityny, aby powierzchnia była hydrofilowa, i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Po inkubacji należy usunąć poliornitynę i umyć powierzchnię każdego MEA wodą dejonizowaną.

Następnie dodaj jeden mililitr macierzy zewnątrzkomórkowej i wróć do inkubatora na co najmniej cztery godziny. Gdy będziesz gotowy, usuń macierz zewnątrzkomórkową, a następnie nałóż kulki w 1,5 mililitra podłoża na powierzchnię MEA, upewniając się, że kulki są umieszczone na górze układu elektrod. Pozostawić do przylegania na dwa dni.

Aby zmierzyć aktywność elektryczną kul neuronowych, umieść MEA na stoliku głowy o kontrolowanej temperaturze. Użyj pięciohercowego filtra górnoprzepustowego i 200-hercowego filtra dolnoprzepustowego oraz progu skoku pięciokrotnego odchylenia standardowego, aby zarejestrować spontaniczną aktywność elektryczną. Zapisuj nieprzetworzone dane, w tym częstotliwość i amplitudę skoków na potrzeby analizy statystycznej.

Markery białkowe ograniczone typem komórek nerwowych, takie jak MAP2 dla neuronów i GFAP dla astrocytów, wizualnie pokazują równomiernie rozproszone rozmieszczenie i dojrzałość astrocytów w neuronach w sferach 3D. Maksymalna projekcja morfologii i rozgałęzień astrocytów jest pokazana w reprezentatywnej sferze 3D z H-astros słabo znakowanymi GFP związanym z błoną. Dojrzałe markery ekspresji H-astros, w tym GFAP.

Mimo że iNeurony wyrażają białka pre i postsynaptyczne, jak pokazano na rysunku po lewej, gęstość synaps jest znacznie zwiększona przez obecność H-astros i kokultury. Podczas nagrań zdrowe kule iNeuronów umieszczone na MEA będą spontanicznie wywoływać skoki napięcia większe niż 40 mikrowoltów przy stałych częstotliwościach wypalania. Sfery kokultury wykazują większą łączność sieciową z obecnością H-astros, co skutkuje wzrostem synchronicznych impulsów sieciowych.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie wapnia, w celu zmierzenia fizjologicznej odpowiedzi astrocytów na aktywność synaptyczną. Ponadto można przeprowadzić przeszczep do modeli zwierzęcych w celu zbadania połączeń z istniejącymi wcześniej obwodami synaptycznymi. Postępując zgodnie z tym podejściem bioinżynieryjnym, można włączyć biomateriały zewnątrzkomórkowe i dodatkowe typy komórek, takie jak oligodendrocyty, komórki mikrogleju i komórki eteliczne, w określonych proporcjach w celu modelowania złożonej sygnalizacji zachodzącej w mózgu.