Name: Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę tworzenia 3D kokultur neuronów i astrocytów z ludzkich komórek macierzystych do badania aktywności synaptycznej. Technika ta umożliwia pomiary za pomocą analizy immunologicznej i wieloelektrodowych macierzy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Erikowi Ullianowi (UCSF) za intelektualny wkład w projektowanie tych procedur, Dr. Michaelowi Wardowi (NIH) za porady techniczne dotyczące różnicowania iNeuron oraz Sabie Barlasowi za wstępną analizę obrazu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisujemy systematyczną metodę produkcji sfer 3D kokultur neuronowych. Kule składają się z astrocytów i neuronów, które pochodzą niezależnie od hPSC. Chociaż nie jest to przedmiotem tego protokołu, generowanie czystych populacji astrocytów z hPSC28 jest krytycznym krokiem i może być technicznie trudne, jeśli zostanie przeprowadzone bez wcześniejszego doświadczenia. Ten pierwszy krok w generowaniu tych mikroukładów synaptycznych powinien być wykonany z drobiazgowym wyczuciem czasu i...

Astrocyty to bardzo liczny typ komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) z różnorodnymi funkcjonalnymi obowiązkami poza wsparciem strukturalnym. Poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników synaptogennych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), astrocyty pomagają w tworzeniu i grupowaniu dojrzałych synaps podczas rozwoju1. Odgrywają również kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia i plastyczności synaps poprzez sygnalizację zewnątrzkomórkową2,3,4,5 i przyczyniają się do długoterminowej stabilności środowisk homeostatycznych poprzez regulację zewnątrzkomórkowego potasu i glutaminianu, a także wydzielanie substratów energetycznych i ATP6,7,8. Wreszcie, mogą przyczyniać się do neurotransmisji poprzez wpływ na prądy pozasynaptyczne9, a także mogą pośrednio wpływać na aktywność poprzez inne typy komórek, takie jak promowanie mielinizacji10. Co ważne, ponieważ nieprawidłowość lub dysfunkcja astrocytów może prowadzić do wielu zespołów neurorozwojowych i neuropatologii dorosłych, istnieje oczywista potrzeba włączenia astrocytów wraz z neuronami do zaprojektowanych sieci neuronowych w celu uzyskania lepszego modelu endogennego środowiska mózgu. Integralną cechą astrocytów jest ich zdolność do tworzenia dynamicznych interakcji z synapsami neuronalnymi1,11,12. W przypadku braku gleju neurony tworzą ograniczoną liczbę synaps, które na ogół również nie mają dojrzałości funkcjonalnej13.
Ludzkie astrocyty wykazują cechy morfologiczne, transkrypcyjne i funkcjonalne — takie jak zwiększony rozmiar i złożoność rozgałęzień, a także geny specyficzne dla gatunku — które nie są rekapitulowane u gryzoni12,14,15. W rezultacie, badania wykorzystujące ludzkie pluripotencjalne komórki neuronalne pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stały się powszechnie akceptowane jako sposób badania chorób związanych z OUN in vitro przy jednoczesnym opracowywaniu nowych terapii, modeli urazów i paradygmatów hodowlanych16,17. Co więcej, hPSC pozwalają na badanie powstawania i funkcjonowania ludzkich synaps bez konieczności stosowania pierwotnych tkanek 18,19.
Barierą w zrozumieniu, jak różne typy komórek i sygnały przyczyniają się do funkcjonowania obwodów synaptycznych, jest brak odpowiednich modeli ludzkiego mózgu. Istnieje zapotrzebowanie na odpowiednią platformę, aby podsumować jego sieci synaptyczne z wysoką wiernością i odtwarzalnością. Ostatnio pojawiło się zainteresowanie produkcją systemów hodowli 3D (szeroko znanych jako "organoidy", "sferoidy" lub "mini mózgi")20 do modelowania złożonych trójwymiarowych (3D) struktur na poziomie komórkowym i makro. Systemy hodowli 3D zachowują ECM i interakcje komórka-komórka, które zwykle są nieobecne lub ograniczone podczas typowych paradygmatów kokultury 2D21,22. Istnieje wiele technik hodowli sferoid neuronowych 3D23,24,25; Jednak wiele z nich wymaga długich okresów hodowli (od miesięcy do lat) w celu spontanicznego rozwoju i zachowania warstw, a użytkownik wykazuje bardzo małą kontrolę nad wyjściem.
Tutaj ilustrujemy systematyczną metodę szybkiego i konsekwentnego bioinżynierii interakcji neuronalnych między wieloma typami komórek (wstępnie zróżnicowanymi neuronami i astrocytami) pochodzących z hPSC poprzez składanie komórek w kokultury sferyczne ('asteroidy')26, które podsumowują specyficzne dla człowieka zawiłości morfologiczne w 3D. Ten system neuronowy o dużej gęstości generuje równomiernie rozproszone podtypy neuronów, które z czasem nabierają dojrzałych właściwości i mogą być badane przesiewowo lub testowane w sposób wysokoprzepustowy. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że ludzkie astrocyty indukują aktywność pęknięć sieci synaptycznych w tych kokulturach 3D. Ponadto protokół ten można łatwo dostosować do generowania kul o różnych rozmiarach, wykorzystywania komórek określonych dla różnych tożsamości regionalnych OUN oraz do badania interakcji wielu innych typów komórek zgodnie z potrzebami.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Roztwór do oddzielania</td></tr><tr><td>Płytka AggreWell</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>Zapobiegaj komórkom przyczepność do płytek mikrodołkowych</td></tr><tr><td>Anty/anty</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Suplement mediów</td></tr><tr><td>Podłoże neuronalne BrainPhys</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5790</td><td>Neurofizjologiczna alternatywa dla podłoża podstawowego</td></tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Technologie</td><td>7930</td><td>Pożywka do kriokonserwacji z 10% DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>Z suplementem GlutaMAX</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>ZAGROŻENIE: Toksyczny po połknięciu. Stężenie robocze: 2 i mu; M</td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>Stężenie robocze: 5% w pierwotnym buforze blokującym, 1% w wtórnym buforze blokującym</td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksycykliny (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>ZAGROŻENIE: Toksyczne dla kobiet w ciąży. Stężenie robocze: 2 i mu; g / ml</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Stężenie robocze: 10 ng / ml</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Stężenie robocze: 10 ng / ml</td></tr><tr><td>Roztwór montażowy Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Laboratoria Biologiczne Lampire</td><td>7332500</td><td>Stężenie robocze: 5% w pierwotnym buforze blokującym, 1% w wtórnym buforze blokującym</td></tr><tr><td>Hemacytometr lub automatyczny licznik komórek</td><td>Technologie życia</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>Stężenie robocze: 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Płyta magnetyczna</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca</td> <td>membranowaRoztwór powłokowy Corning</td><td>354230</td><td>ECM. Stężenie robocze: 80 &mu; g/ml. Przygotuj na lodzie i upewnij się, że pipety, probówki i media są wstępnie schłodzone.</td></tr><tr><td>System MEA 2100</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie montażowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Suplement mediów</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Roztwór do zatapiania tkanek do kriosekcji</td></tr><tr><td>Pap Pen (Aqua Hold)</td><td>Laboratorium urządzeń naukowych</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd ( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>ZAGROŻENIE: Działa toksycznie w przypadku wdychania. Stężenie robocze: 4% w PBS</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poli-l-ornityna (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Stężenie robocze: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe prostokątne</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>Odłączanie i pasażowanie odczynnik</td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Stężenie robocze: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>Stężenie robocze: 2 i mu; M</td></tr><tr><td>Kolby obrotowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>Stężenie robocze: 20% lub 30% w PBS</td></tr><tr><td>T25 Kolba</td> hodowlana <td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Nasadki wentylowane</td></tr><tr><td>T75 Kolba hodowlana</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>Nasadki wentylowane</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Detergent. Stężenie robocze: 1%</td></tr><tr><td>TeSR-E8 podłoże podstawowe</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)</td></tr><tr><td>TeSR-E8 Suplementy</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Suplementy dla pożywki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Detergent do przenikania komórek. Stężenie robocze: 0,25% w buforze blokującym</td></tr><tr><td>błękit trypanowy</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; astrocyty perisynaptyczne</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; astrocyty</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Przeciwciało pierwotne; astrocyty</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Dar od dr Jeffreya Rothsteina</td><td>brak</td><td>Przeciwciało pierwotne; astrocyty</td></tr><tr>Systemy <td>synaptyczne</td><td>Homera</td><td>160 011</td><td>Przeciwciało pierwotne; neurony postsynaptyczne</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>188 004</td><td>Przeciwciało pierwotne; neurony</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Przeciwciało pierwotne; neurony, postsynaptyczne</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Przeciwciało pierwotne; astrocyty</td></tr><tr><td>Synapsyna 1</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>106 103</td><td>Przeciwciało pierwotne; neurony presynaptyczne</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta; 3-tubulina (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; neurony</td></tr></tbody></table>

modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3d astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Barierą dla naszego zrozumienia, w jaki sposób różne typy komórek i sygnały przyczyniają się do funkcjonowania obwodów synaptycznych, jest brak odpowiednich modeli do badania ludzkiego mózgu. Jedną z pojawiających się technologii mających na celu rozwiązanie tego problemu jest wykorzystanie trójwymiarowych (3D) hodowli komórek nerwowych, zwanych "organoidami" lub "sferoidami", w celu długoterminowego zachowania interakcji międzykomórkowych, w tym cząsteczek adhezyjnych zewnątrzkomórkowych. Jednak te systemy hodowli są czasochłonne i nie są generowane systematycznie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę szybkiego i konsekwentnego wytwarzania kokultur 3D neuronów i astrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po pierwsze, wstępnie zróżnicowane astrocyty i progenitory neuronów są dysocjowane i zliczane. Następnie komórki są łączone w naczyniach tworzących kule z inhibitorem kinazy Rho i w określonych proporcjach, aby wytworzyć kule o powtarzalnych rozmiarach. Po kilku tygodniach hodowli jako unoszące się kule, kokultury ("asteroidy") są ostatecznie dzielone na sekcje w celu barwienia immunologicznego lub posiewane na matrycach wieloelektrodowych w celu zmierzenia gęstości i siły synaptycznej. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że ten protokół przyniesie sfery neuronowe 3D, które wyświetlają markery ograniczone do dojrzałych typów komórek, tworzą funkcjonalne synapsy i wykazują spontaniczną aktywność impulsów sieci synaptycznej. Łącznie system ten umożliwia badania przesiewowe leków i badania mechanizmów choroby w bardziej odpowiednim modelu w porównaniu z hodowlami jednowarstwowymi.

Prawidłowe wykonanie niniejszego protokołu pozwoli na uzyskanie zdefiniowanych populacji funkcjonalnych kokultur astrocytów28,33,34 i neuronów35 wygenerowanych z hPSC (Rysunek 1A-1C), zgodnie z wcześniejszymi szczegółami26 i opisem w krokach 2.1–2.2. Oczekuje się, że ta etapowa procedura, z wykorzystani...

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii dotyczące tego, w jaki sposób komunikacja międzykomórkowa między wieloma typami ludzkich komórek nerwowych przyczynia się do tworzenia i funkcjonowania obwodów synaptycznych. Technika ta szybko i systematycznie generuje trójwymiarowe sfery kokultury funkcjonalnie dojrzałych astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Można je wykorzystać do rygorystycznych badań eksperymentalnych.Odtwarzalność i skalowalność tego protokołu stanowi zdefiniowaną alternatywę dla pojawiających się technologii organoidowych. Są one obiecujące dla rozwoju nowych leków i terapii wszczepienia komórek w celu promowania regeneracji neurologicznej po urazie lub chorobie. Zacznij od umieszczenia klastrów HPSC w dwóch mililitrach pożywki HPSC zawierającej inhibitor kinazy rho-27632 w każdym dołku sześciodołkowej płytki pokrytej ECM.Utrzymuj komórki macierzyste do momentu, gdy osiągną około 50% zlewania się, a następnie zmień pożywkę na pożywkę nerwową zawierającą SB431542 i DMH1, aby promować indukcję neuronalną. Gdy komórki są w około 95% zlewne, podziel każdą studzienkę od jednego do sześciu do nowych studzienek pokrytych ECM. W dniu 14 należy rozdzielić komórki roztworem oddzielającym i przenieść zawartość każdej studzienki do niepowlekanej kolby T25 z pożywką zawierającą Y-27632 w celu pobudzenia tworzenia agregatów.Aby wygenerować progenitory astrocytów i astrocyty w spontanicznie powstałych agregatach 3D, przełącz się na pożywkę neuronową zawierającą EGF i FGF2 i podawaj co trzy do czterech dni, aż tożsamość astrocytów zostanie potwierdzona po czterech do sześciu miesiącach. Domyślnie ten protokół wytwarza astrocyty kory grzbietowej. Jednak podtypy astrocytów można określić regionalnie przez dodanie morfogenów wzorcowych, jeśli jest to pożądane.Raz w tygodniu, gdy pojawią się ciemne centra, zbierz kulki przez odwirowanie, a następnie delikatnie odłącz agregaty H-astro za pomocą roztworu odłączającego. Ponownie plateruj tylko te kule, które nie przyczepiają się spontanicznie, aby uniknąć przejścia komórek innych niż OUN i nienerwowych. Po czterech do sześciu miesiącach od ekspansji potwierdź tożsamość komórki w pożywce do zamrażania i kriokonserwacji zgodnie z instrukcjami producenta lub natychmiast użyj do eksperymentów.W celu wytworzenia nietransgenicznych progenitorów neuronalnych w neuronach lub neuronach H, należy wysiać neuronalne progenitory pochodzące z HPSC dnia 14 do sześciodołkowych płytek pokrytych ECM z dwoma mililitrami pożywki neuronowej i Y-27632 na studzienkę. Jeśli pracujesz z iNeuronami indukowanymi doksycykliną, dodaj pożywkę neuronalną zawierającą doksycyklinę, gdy komórki są w około 35% zlewne, aby wywołać różnicowanie i aktywować ekspresję genów. Po dwóch dniach nakarm linie transgeniczne i nietransgeniczne dwoma mililitrami pożywki neuronowej na studzienkę dziennie.Kontynuuj, aż komórki będą gotowe do podniesienia przy 70% zbiegu. W przypadku kokultur najpierw delikatnie oddziel H-astros od agregatów 3D za pomocą roztworu oddzielającego. Następnie przystąp do dysocjacji neuronów H lub iNeuronów od monowarstwy 2D.Najpierw usuń pożywkę z płytki sześciodołkowej i dodaj 500 mikrolitrów roztworu oddzielającego do każdej studzienki zawierającej kultury jednowarstwowe. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji delikatnie dodaj dwa do trzech mililitrów pożywki DMEM-F12, aby usunąć przyłączone komórki.Następnie zbierz komórki w pożywce w 15-mililitrowej stożkowej probówce i odwiruj przy 300 razy G przez jedną minutę. Odessać supernatant, dodać jeden mililitr świeżej pożywki i delikatnie pipetować w górę iw dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Policz każdy typ komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.Dodaj żądany stosunek zdysocjowanych H-astros i H-neuronów lub iNeuronów w łącznej objętości dwóch mililitrów do każdego dołka mikropłytki. Odwirować płytkę w temperaturze 100 razy G przez trzy minuty i wrócić do inkubatora na dwa dni. Po jednym dniu w płytce powinny uformować się gęsto upakowane mikrosfery.Użyj mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby delikatnie usunąć kulki z mikrostudzienek. Lekko przyłóż siłę do dna mikrostudzienek za pomocą medium, aby usunąć wszelkie dodatkowe przylegające kule. Po zebraniu wszystkich kulek w 15-mililitrowej stożkowej rurce pozostaw do osiadania.Następnie umyj kulki, najpierw zasysając stare podłoże, a następnie dodając co najmniej dwa mililitry świeżego podłoża. Dodaj kulki do kolby obrotowej zawierającej od 50 do 60 mililitrów pożywki. Umieścić kolbę w inkubatorze na magnetycznej płytce mieszającej ustawionej na 60 obr./min.Do powstania synaps potrzebne są co najmniej trzy tygodnie w hodowli. Rozpocznij od pokrycia powierzchni każdej matrycy wieloelektrodowej lub MEA jednym mililitrem poliornityny, aby powierzchnia była hydrofilowa, i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Po inkubacji należy usunąć poliornitynę i umyć powierzchnię każdego MEA wodą dejonizowaną.Następnie dodaj jeden mililitr macierzy zewnątrzkomórkowej i wróć do inkubatora na co najmniej cztery godziny. Gdy będziesz gotowy, usuń macierz zewnątrzkomórkową, a następnie nałóż kulki w 1,5 mililitra podłoża na powierzchnię MEA, upewniając się, że kulki są umieszczone na górze układu elektrod. Pozostawić do przylegania na dwa dni.Aby zmierzyć aktywność elektryczną kul neuronowych, umieść MEA na stoliku głowy o kontrolowanej temperaturze. Użyj pięciohercowego filtra górnoprzepustowego i 200-hercowego filtra dolnoprzepustowego oraz progu skoku pięciokrotnego odchylenia standardowego, aby zarejestrować spontaniczną aktywność elektryczną. Zapisuj nieprzetworzone dane, w tym częstotliwość i amplitudę skoków na potrzeby analizy statystycznej.Markery białkowe ograniczone typem komórek nerwowych, takie jak MAP2 dla neuronów i GFAP dla astrocytów, wizualnie pokazują równomiernie rozproszone rozmieszczenie i dojrzałość astrocytów w neuronach w sferach 3D. Maksymalna projekcja morfologii i rozgałęzień astrocytów jest pokazana w reprezentatywnej sferze 3D z H-astros słabo znakowanymi GFP związanym z błoną. Dojrzałe markery ekspresji H-astros, w tym GFAP.Mimo że iNeurony wyrażają białka pre i postsynaptyczne, jak pokazano na rysunku po lewej, gęstość synaps jest znacznie zwiększona przez obecność H-astros i kokultury. Podczas nagrań zdrowe kule iNeuronów umieszczone na MEA będą spontanicznie wywoływać skoki napięcia większe niż 40 mikrowoltów przy stałych częstotliwościach wypalania. Sfery kokultury wykazują większą łączność sieciową z obecnością H-astros, co skutkuje wzrostem synchronicznych impulsów sieciowych.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie wapnia, w celu zmierzenia fizjologicznej odpowiedzi astrocytów na aktywność synaptyczną. Ponadto można przeprowadzić przeszczep do modeli zwierzęcych w celu zbadania połączeń z istniejącymi wcześniej obwodami synaptycznymi. Postępując zgodnie z tym podejściem bioinżynieryjnym, można włączyć biomateriały zewnątrzkomórkowe i dodatkowe typy komórek, takie jak oligodendrocyty, komórki mikrogleju i komórki eteliczne, w określonych proporcjach w celu modelowania złożonej sygnalizacji zachodzącej w mózgu.

synaptic-microcircuit-modeling-with-3d-cocultures-astrocytes-neurons

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film pokazuje rozwój hodowli neuronów 3D połączonej z planarnym układem mikroelektrod z neuronami hipokampa. Izolowane neurony tworzą sieć 2D w obszarze aktywnym układu mikroelektrod i przylegają do szklanych mikrokulek w wielodołkowej płytce z wkładką membranową. Po przeniesieniu tych pokrytych neuronami mikrokulek do elektrody, organizują się one w połączoną sieć neuronową 3D.

Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Film demonstruje metodę generowania astrosfer z komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Polega na wzroście i proliferacji komórek macierzystych z pożywkami zawierającymi czynniki wzrostu i inhibitory kinaz. Komórki te następnie agregują się i różnicują w astrocyty, tworząc astrosfery.

Generowanie i utrzymywanie astrosfer przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film demonstruje procedurę kokulturacji astrocytów i neuronów w celu utworzenia sfer 3D. Te sfery 3D stanowią odrębną platformę do badania tworzenia synaps i integracji sieci neuronowych, służąc tym samym jako potencjalny model do badań w neuronauce rozwojowej, chorobach neurodegeneracyjnych i interwencjach neurofarmakologicznych.

Generowanie 3D sfer kokulturowych astrocytów i neuronów w celu indukowania tworzenia synaps

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

Ten film demonstruje ustanowienie wspólnej kultury neuronów i astrocytów do rejestrowania aktywności sieci neuronalnej. Po ustaleniu wspólnej hodowli neuronów ruchowych i astrocytów na płytce z matrycą wieloelektrodową (MEA), synchroniczna rytmiczna aktywność elektryczna sieci neuronalnej została zarejestrowana zewnątrzkomórkowo za pomocą MEA.

Rejestrowanie aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnej w kokulturze neuron-astrocyt

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji 3D-drukowanych biologicznie kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC. Ten model kokultury, wygenerowany w rusztowaniu hydrożelowym w formatach 96- lub 384-dołkowych, wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i wzrost neurytów w ciągu 7 dni oraz pokazuje ekspresję markerów dojrzałości dla obu typów komórek.

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

Poznaj metodę tworzenia 3D kokultur neuronów i astrocytów z ludzkich komórek macierzystych do badania aktywności synaptycznej. Technika ta umożliwia pomiary za pomocą analizy immunologicznej i wieloelektrodowych macierzy.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów