Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Protokół ten ma na celu ukierunkowanie wytwarzania samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w mikrokolumnie hydrożelowej o rozmiarach mikronów do wykorzystania jako model neurobiologiczny in vitro lub jako terapia neuroregeneracyjna. Urazy i choroby neurodegeneracyjne są szczególnie szkodliwe dla pacjentów ze względu na ograniczoną zdolność neurogenną w środowisku hamującym, które ograniczają regenerację ośrodkowego układu nerwowego. Zmodyfikowane wiązki astrocytarne rozwiązują problemy obecnych strategii leczenia, próbując odtworzyć kluczowe cechy neuroanatomiczne i mechanizmy rozwojowe pośredniczone przez glej, aby promować ukierunkowaną migrację komórek i odnajdywanie ścieżki aksonów.

Architektura tych astrocytarnych rusztowań jest przede wszystkim inspirowana wyrównanymi procesami astrocytarnymi w rurach glejowych rostralnego strumienia migracyjnego. Zacznij od przygotowania roztworu agarozy o stężeniu 3% wagowym na objętość i DPBS w sterylnej zlewce. Utrzymuj ogrzewanie i mieszanie, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu.

Włóż igłę do akupunktury do dolnego otworu dozownika żarówki. Umieść rurkę kapilarną na odsłoniętej igle i zabezpiecz je, wkładając jej część w gumową część cylindra dozownika bańki. Zakręć cylinder, aby zakończyć montaż.

Przenieś jeden mililitr płynnej agarozy na powierzchnię pustej szalki Petriego. Ściskając gumową nasadkę dozownika żarówki, włóż jeden koniec rurki kapilarnej do agarozy i zwolnij nacisk na nasadkę, aby wciągnąć agarozę do probówki. Umieść bańkę, rurkę, zespoły igieł na szalce Petriego i pozwól agarozie zestalić się w rurkach kapilarnych przez 5 minut.

Następnie wyciągnij igłę z rurki kapilarnej, pozostawiając mikrokolumnę nadal otaczającą igłę. Użyj końcówek foreceps, aby popchnąć mikrokolumnę do końca igły, a następnie przytrzymaj igłę nad otwartą szalką Petriego zawierającą DPBS i wepchnij mikrokolumnę do DPBS. Aby wyprodukować łodzie z mikrokolumnami, które ułatwiają późniejszą obsługę tych konstrukcji, zacznij od przygotowania 4% roztworu agarozy o wadze 4% na objętość, a następnie utrzymuj roztwór w cieple i mieszaniu.

Użyj kleszczy, aby przesunąć mikrokolumnę na pustą szalkę Petriego. Następnie, pracując pod stereoskopem, za pomocą mikroskalpela przyciąć mikrokolumny do żądanej długości, z końcami przyciętymi pod kątem 45 stopni. Po przycięciu trzech kolejnych mikrokolumn ustaw je równolegle.

Załaduj pipetę 50 mikrolitrami 4% roztworu agarozy i dozuj linię płynu przez układ mikrokolumn, aby połączyć i związać konstrukcje w łódź. Pozostawić do ostygnięcia na 1 do 2 minut, aby umożliwić żelowanie 4% agarozy. Następnie za pomocą cienkich kleszczy podnieś łódź z mikrokolumną za łączący most agarozowy.

I przenieś go na szalkę Petriego zawierającą DPBS. Przenieś łódź z mikrokolumną do szafy bezpieczeństwa biologicznego i sterylizuj pod wpływem światła ultrafioletowego przez trzydzieści minut. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przygotuj 1 miligram na mililitr roztworu kolagenu typu 1 z ogona szczura w pożywce do kohodowli.

A następnie umieść go na lodzie. W razie potrzeby dostosować pH roztworu ECM kwasem lub zasadą, aż pH ustabilizuje się w zakresie od 7,2 do 7,4. Przenieś łódkę z mikrokolumną na szalkę Petriego o pojemności 35 lub 60 ml za pomocą kleszczy.

Korzystając ze stereoskopu jako wskazówek, umieść końcówkę mikropipety o pojemności 10 ml na jednym końcu każdej mikrokolumny i odsysaj, aby opróżnić światło DPBS i pęcherzyki powietrza. Naładuj mikropipetę P10 roztworem kolagenu. Umieść końcówkę o pojemności 10 ml na jednym końcu każdej mikrokolumny i dostarcz wystarczającą ilość roztworu, aby wypełnić światło.

Następnie odpipetować zbiornik ECM na obu końcach mikrokolumny. Po napełnieniu wszystkich kolumn należy odpipetować pożywkę do kokultury w pierścieniu wokół płytki Petriego, aby zapobiec wysychaniu kolumn. Inkubuj naczynie zawierające mikrokolumny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej godzinę, aby promować polimeryzację kolagenu przed dodaniem komórek.

Następnie umieść końcówkę mikropipety P10 na jednym końcu mikrokolumny i przenieś około 5 ml roztworu komórkowego do światła, aby go napełnić. Po umieszczeniu wszystkich mikrokolumn w łodzi, inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 1 godzinę, aby promować przyczepianie astrocytów do ECM. Po okresie inkubacji ostrożnie napełnić szalki zawierające osadzone mikrokolumny 3 lub 6 ml pożywki kokulturowej, odpowiednio na 35 lub 60 ml pożywek Petriego.

Utrzymuj platerowane mikrokolumny i kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby promować samoorganizację wyrównanych wiązek astrocytów, które powinny utworzyć wiązkę, przypominającą strukturę po sześciu do dziesięciu godzinach. Godzinę po posiewie astrocyty mają kulisty kształt i rozpraszają się w całym konstrukcie. Po pięciu godzinach od posiewu astrocyty inicjują wydłużenie i skurcz procesu.

Po ośmiu godzinach od posiewu astrocyty wyrównały się i skurczyły. W ciągu 24 godzin po posiewie w tym przykładzie utworzył się gęsty wiązka procesów astrocytowych. Ta w pełni uformowana wiązka astrocytów, 24 godziny po poszyciu, pokazuje efekt zamka błyskawicznego, w którym końce przyczepiają się do wyraźnych końców ścianki światła.

Ten film pokazuje wiązanie w akcji, od 3 do 10 godzin po poszyciu. Znakowanie immunologiczne rusztowań astrocytarnych pokazuje podłużne wyrównanie procesów astrocytowych. Na tym konfokalnym obrazie wiązki astrocytarnej odczytywany jest marker astrocytarny GFAP.

A jądra są widoczne na niebiesko. To większe powiększenie pęczka pozwala na wizualizację cytoarchitektury astrocytów w mikrokolumnach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wytworzyć żywe rusztowania składające się z podłużnie ustawionych wiązek astrocytarnych z biologicznie inspirowaną cytoarchitekturą w obudowie z biomateriału.

Po tej procedurze można zaprojektować strategię przeszczepu, aby dostarczyć wiązki astrocytarne z lub bez obudowy biomateriałowej do uszkodzonej tkanki mózgowej, aby promować ukierunkowaną migrację komórek z regionów neurogennych i działać zgodnie ze wskazówkami do ograniczającego mikrośrodowiska OUN. Ponadto technika ta może zostać rozszerzona o zjawisko neurobiologiczne oparte na platformie modelowania biofidelicznego, w którym pośredniczy glej, czerpiąc korzyści z naśladowania natywnego środowiska trójwymiarowego i nieodłącznej eksperymentalnej kontroli systemów in vitro.