Obrazowanie drugiej generacji harmonicznych w modelu szczurzym w celu zbadania wad tubuliny

Zacznij od wycinka tkanki mózgowej szczura zamontowanego na szklanym szkiełku i zanurzonego w buforze.

Szczur cierpi na tubulinopatię, stan spowodowany defektami tubuliny, elementów budulcowych mikrotubul, co prowadzi do ich nieprawidłowej akumulacji i rozerwania.

Wpływa to również na produkcję mieliny w ośrodkowym układzie nerwowym.

Umieść plasterek pod zakrytym mikroskopem wzbudzenia dwufotonowego, aby uzyskać szczegółowe obrazowanie.

Regularnie nawilżaj plasterek, aby zachować jego integralność.

Ustaw mikroskop w trybie obrazowania bez deskanacji, czyli bezznacznikowej technice wykrywania słabych sygnałów.

Wystaw tkankę na działanie pulsacyjnego lasera na podczerwień.

Mikrotubule emitują światło jako wykrywalne sygnały znane jako generacja drugiej harmonicznej lub sygnały SHG.

Obszary z nieprawidłową akumulacją mikrotubul wzmacniają te sygnały, zwiększając ich wykrywalność.

Zastosuj filtry optyczne, aby uściślić te sygnały.

Przechwycony obraz ujawnia gęstość i nieprawidłowości mikrotubul, przy czym wysoka intensywność SHG i grupowanie wskazują na defekty tubuliny i zmniejszoną produkcję mieliny.

Umieść próbkę pod mikroskopem i umieść ją odpowiednio pod obiektywem, prowadząc bezpośrednią obserwację przez okulary ze światłem przechodzącym. Usunąć nadmiar HBSS tak, aby cienka warstwa cieczy pokryła całą próbkę. Co kilka minut należy sprawdzać wzrokowo film cieczy, aby uniknąć nadmiernego parowania i wysuszenia próbki.

Przygotuj stolik mikroskopowy do obrazowania bez deskanowania, które obejmuje zamknięcie wszystkich drzwi ciemnej komory inkubacyjnej lub przykrycie komory inkubacyjnej czarną nylonową tkaniną pokrytą poliuretanem. Wybierz tryb obrazowania bez deskancji wzdłuż ścieżki transmisji. W ten sposób wychwytywanie słabego sygnału SH tubuliny zostanie zoptymalizowane.

Następnie wybierz cel. Następnie ustaw moc lasera z czasem przebywania piksela wynoszącym 12,6 mikrosekundy. Rób zdjęcia nie większe niż 512 na 512 pikseli, z prędkością 5 i średnią 2, co daje średni czas akwizycji 15 sekund. Najpierw uchwyć obrazy za pomocą 485-nanometrowego filtra krótkoprzepustowego. W drugim kroku dodaj ostry filtr pasmowo-przepustowy 405 nm.