Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania nanocząsteczek polimerowych do nadekspresji genów terapeutycznych w komórkach macierzystych z wykorzystaniem morskiego modelu niedokrwienia kończyny tylnej. Cel ten osiąga się poprzez syntezę polimerów biodegradowalnych w dwuetapowej reakcji polimeryzacji z otwarciem pierścionka, a następnie wytwarzanie nanocząsteczek polimerowych kodujących geny terapeutyczne. Drugim etapem jest transfekcja ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro w celu nadekspresji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego.

Następnie zaprogramowane komórki macierzyste wstrzykuje się domięśniowo do niedokrwionej kończyny tylnej w celu produkcji czynników terapeutycznych. Ostatnim krokiem jest monitorowanie przeżywalności komórek oraz reperfuzji krwi w niedokrwionej kończynie w czasie, przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego i obrazowania laserem Dopplera. Ostatecznie można przeprowadzić ilościową analizę ekspresji genów oraz badania histologiczne, aby wykazać lokalną ekspresję czynników terapeutycznych i skuteczność regeneracji tkanek.

Zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi metodami angiogenezy jest wykorzystanie komórek macierzystych jako nośników do dostarczania leków. Strategia ta pozwala na wykorzystanie naturalnej zdolności komórek macierzystych do homingu, czyli migracji w kierunku obszarów niedokrwiennych, a także umożliwia dynamiczne reakcje na sygnały z mikrośrodowiska. Nanocząstki stosowane do dostarczania plazmidowego DNA są wysoce wydajne i biodegradowalne, co przekłada się na niższą cytotoksyczność oraz większą liczbę kopii DNA dostarczonych do wnętrza komórek.

Tę technikę można zastosować w wielu klinicznie istotnych terapiach opartych na komórkach, ponieważ wykorzystuje ona biodegradowalny wektor niewirusowy do wprowadzania genów do komórek autologicznych. Pracując w dygestorium, odważ butane dial DLI i przenieś materiał do szklanej fiolki inhalacyjnej zawierającej mieszadło magnetyczne. Następnie dodaj podgrzany five amino one pentol do tej samej fiolki. Natychmiast umieść fiolkę na mieszalce magnetycznej i ustaw prędkość na 600 RPM.

Przenieś fiolkę do pieca ustawionego na 90 °C i po czterech godzinach zwiększ prędkość mieszania do 1000 RPM, następnie zmniejsz prędkość do 300 RPM i mieszaj przez kolejne 12 do 16 godzin. Po przygotowaniu dodaj 10 ml bezwodnego tetrahydrofuranu do 5 g C 32 w szklanej fiolce z mieszadłem magnetycznym. Po owinięciu folią mieszaj w wortexerze na wysokich obrotach aż do całkowitego rozpuszczenia; w oddzielnej szklanej fiolce z mieszadłem magnetycznym dodaj 10 mM tetraetylenoglikolu diaminy.

Dodaj 40 mililitrów THF do tej fiolki, a następnie umieść obie fiolki na mieszadle magnetycznym na pięć minut przed ich połączeniem. Przykryj otrzymaną mieszaninę folią i pozostaw do mieszania w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Produkt końcowy określono jako C 32 1 22.

Następnie przenieś 30 mililitrów bezwodnego eteru dietylowego do każdej z pięciu probówek typu Falcon o pojemności 50 mililitrów. Po dodaniu C 32 1 22 do bezwodnego eteru dietylowego powstanie biały, mętny roztwór; wymieszaj zawartość probówki w wirówce typu vortex, a następnie ją odwiruj. Wyekstrahowany polimer zgromadzi się na dnie probówki; odlej górną warstwę roztworu i powtórz te kroki jeszcze dwukrotnie.

Po ekstrakcji umieścić otwarte probówki w eksykatorze i poddać działaniu próżni przez noc, upewniając się, że probówki są chronione przed światłem. Następnego dnia zważyć probówki zawierające C 32 1 22, aby określić masę końcową. Na koniec rozpuścić wyekstrahowany polimer w bezwodnym DMSO w stężeniu 100 mg/mL.

Do przygotowania nanocząsteczek. Najpierw rozcieńcz plazmidowe DNA do stężenia końcowego 120 µg/ml w octanie sodu; w drugiej probówce rozcieńcz C 32 1 22 do stężenia końcowego 3,6 mg/ml w octanie sodu. Połącz zawartość obu probówek w jednej probówce Falcon o pojemności 15 ml i natychmiast wymieszaj w wortexie na wysokich obrotach przez 10 sekund.

Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić formowanie się nanocząstek. Wymień medium w wcześniej przygotowanej kolbie do hodowli tkanek na 7,8 ml pełnego suplementowanego DMEM.

Przenieś roztwór nanocząsteczek do kolby do hodowli tkankowej i rozprowadź go równomiernie przed umieszczeniem w inkubatorze. Po dwóch godzinach zastąp pożywkę zawierającą nanocząsteczki świeżym DMEM. Po czterech godzinach komórki są gotowe do iniekcji in vivo.

Gdy przetransfekowane komórki będą gotowe, należy je przeliczyć i zawiesić w PBS w zagęszczeniu 10 × 10⁶ komórek na mililitr, aby zapewnić każdemu zwierzęciu otrzymanie równą ilość. Rozdziel zawiesiny komórkowe do probówek typu Eppendorf w objętości 110 µL. Następnie podaj znieczulenie myszy, u której wcześniej wywołano niedokrwienie kończyn tylnych.

Po potwierdzeniu znieczulenia za pomocą ucisku palca u nogi, należy oczyścić miejsce wstrzyknięcia strzykawką o rozmiarze 27 G. Ponownie zawiesić komórki i pobrać 100 µL zawiesiny. Wstrzyknąć połowę zawiesiny komórkowej w obszar mięśnia przywodziciela, a następnie pozostałą połowę w obszar mięśnia łydki.

Po wstrzyknięciu pozostaw strzykawkę w miejscu podania przez co najmniej 15 do 30 sekund, aby zapobiec wyciekowi. Po zakończeniu iniekcji zapewnij zwierzęciu ciepło aż do pełnego wybudzenia. W przypadku obrazowania bioluminescencyjnego potwierdź stan znieczulenia testem uszczypnięcia palca, a następnie oczyść miejsce wstrzyknięcia zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami.

Napełnij strzykawkę insulinową 100 µL Lucifеру i wstrzyknij go domięśniowo. Przed umieszczeniem zwierzęcia w komorze obrazowania lucyferazy IVIS, wykonaj obrazowanie myszy przy czasie ekspozycji wynoszącym jedną minutę. Po uzyskaniu obrazu zaznacz obszar zainteresowania.

W tym przypadku w niedokrwionej kończynie w miejscu wstrzyknięcia komórek należy kontynuować pomiar sygnału lucyferazy co trzy do pięciu minut, aż sygnał osiągnie szczyt i zacznie spadać. Wartość ta jest wykorzystywana do porównań między myszami oraz w różnych punktach czasowych; po zakończeniu pomiarów należy wyjąć myszy z komory i utrzymywać zwierzęta w cieple do pełnego wybudzenia. Tkanki są pobierane w wybranych punktach czasowych.

Po transfekcji i eutanazji nacięto obwodowo skórę wokół kończyny tylnej w dystalnym obszarze brzucha i proksymalnie względem kończyny tylnej. Po odsunięciu skóry amputowano kończynę pomiędzy stawem miednicznym a kością udową. Na koniec wyizolowano mięsień przywodziciel przyśrodkowy oraz mięśnie brzuchate łydki.

W ramach dalszej analizy obrazy te przedstawiają syntezę C 32 1 22. W tym przypadku ACR-zakończony C 32 AC powstał w wyniku reakcji addycji mika pomiędzy monomerem z grupami końcowymi DAL a monomerem z pierwszorzędową grupą końcową am mean. W tym przykładzie zmodyfikowane polimery PBAE można otrzymać poprzez dodanie monomerów zakończonych grupą mean w celu zwiększenia wydajności transfekcji.

Prawidłowa transfekcja jest widoczna dzięki nadekspresji zielonego białka fluorescencyjnego, co przedstawiono tutaj. Te dane obrazowania bioluminescencyjnego pokazują mysz w dniu zerowym oraz w dniu 14. Po wstrzyknięciu do kończyny tylnej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, wykazujących ekspresję GFP i lucyferazy, reprezentatywne obrazy Dopplera demonstrują indukcję niedokrwienia w jednej z przeciwstawnych kończyn tylnych w dniu zerowym oraz pomyślną reperfuzję krwi.

14 dni po wstrzyknięciu mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z nadekspresją VEGF. Metoda R-T-P-C-R potwierdziła pomyślną nadekspresję vgf, kodującego białko terapeutyczne, w grupie leczonej cztery dni po wstrzyknięciu komórek, podczas gdy w grupie kontrolnej PBS nie wykryto ekspresji. W celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych wspomagających regenerację tkanek można zastosować inne metody wykorzystujące połączone podejście polegające na dostarczaniu komórek macierzystych i genów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat syntezy polimerów biodegradowalnych do niewirusowej terapii genowej oraz wykorzystania tych polimerów do programowania komórek macierzystych w celu leczenia niedokrwienia in vivo. Wykorzystanie niewirusowo zmodyfikowanych komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych in situ może znaleźć szerokie zastosowanie w leczeniu wielu chorób degeneracyjnych.