Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie zastosowania nanocząstek polimerowych do nadekspresji genów terapeutycznych w komórkach macierzystych przy użyciu modelu niedokrwienia kończyn tylnych morskich. Osiąga się to poprzez syntezę biodegradowalnych polimerów poprzez dwuetapową reakcję edycji mikrofonowej, a następnie wytwarzanie nanocząstek polimerowych kodujących geny terapeutyczne. Drugim krokiem jest transfekcja ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro do nadekspresji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego.

Następnie zaprogramowane komórki macierzyste są wstrzykiwane domięśniowo w niedokrwioną kończynę tylną w celu NC dwóch czynników terapeutycznych. Ostatnim krokiem jest monitorowanie przeżycia komórek i reperfuzji krwi w niedokrwionej kończynie w czasie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i laserowego obrazowania dopplerowskiego. Ostatecznie można przeprowadzić ilościową ekspresję genów i histologię, aby wykazać miejscową ekspresję czynników terapeutycznych i skuteczność regeneracji tkanek.

Przewagą tej techniki nad konwencjonalnymi metodami angiogenezy jest wykorzystanie komórek macierzystych jako nośników do dostarczania leków. Strategia ta pozwala nam wykorzystać naturalną zdolność komórek macierzystych do migracji w kierunku niedokrwienia, a także umożliwia dynamiczne reakcje na sygnały mikrośrodowiskowe. Nanocząstki używane do dostarczania DNA w osoczu są wysoce wydajne i biodegradowalne, co zapewnia niższą cytotoksyczność i większą liczbę kopii DNA dostarczanych wewnątrzkomórkowo.

Technika ta może być stosowana w wielu klinicznie istotnych terapiach komórkowych, ponieważ wykorzystuje biodegradowalny wektor niewirusowy do wprowadzania genów do komórek autologicznych Pracując w dygestorium, zważ tarczę butanu DLI i przenieś materiał do szklanej fiolki do inhalacji zawierającej mieszadło. Następnie dodaj podgrzane pięć aminokwasów i pentol do tej samej fiolki. Natychmiast umieścić fiolkę na płytce mieszającej i ustawić prędkość na 600 obr./min.

Przenieś fiolkę do piekarnika ustawionego na 90 stopni Celsjusza i zwiększ prędkość mieszania do 1000 obr./min po czterech godzinach, zmniejsz prędkość do 300 obr./min i mieszaj przez dodatkowe 12 do 16 godzin. Gdy będzie gotowy, dodaj 10 mililitrów bezwodnego tetra hydro uranu do pięciu gramów C 32 w szklanej fiolce zawierającej mieszadło. Po zawinięciu w folię, wirować na wysokich obrotach, aż do całkowitego rozpuszczenia, w oddzielnej szklanej fiolce zawierającej mieszadło, dodać 10 milimoli diaminy glikolu tetraetylenowego.

Dodaj 40 mililitrów THF do tej fiolki, umieść obie fiolki na płytce mieszającej na pięć minut przed połączeniem ich razem. Przykryj powstały materiał folią i pozostaw do spoczynku do temperatury pokojowej na 24 godziny. Produkt końcowy jest określany jako C 32 1 22.

Następnie przenieś 30 mililitrów bezwodnego eteru dathyl do każdej z pięciu 50-mililitrowych probówek Falcona. Po dodaniu C 32 1 22 do bezwodnego eteru dylowego tworzy się biały mętny roztwór, który należy odwirować probówkę, a następnie odwirować ją. Wyekstrahowany polimer zbierze się u podstawy probówki, wyrzuć górny roztwór i powtórz te kroki jeszcze dwa razy.

Po wyjęciu umieść otwarte probówki w osuszaczu i odkurz przez noc, upewnij się, że probówki są chronione przed światłem. Następnego dnia zważyć probówki zawierające C 32 1 22 w celu określenia końcowej masy. Na koniec rozpuść wyekstrahowany polimer w bezwodnym DMSO w stężeniu 100 miligramów na mililitr.

Do otrzymywania nanocząstek. Najpierw rozcieńczyć DNA osocza do końcowego stężenia 120 mikrogramów na mililitr w octanie sodu w drugiej probówce rozcieńczyć C 32 1 22 do końcowego stężenia 3,6 miligrama na mililitr. W octanie sodu połącz zawartość każdej probówki w pojedynczą 15-mililitrową probówkę Falcona i natychmiast wiruj na wysokim poziomie przez 10 sekund.

Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby podczas formowania się nanocząstek powstały nanocząstki. Zastąp pożywkę w uprzednio umieszczonej kolbie do hodowli tkankowej 7,8 mililitra. W pełni uzupełniony DMEM.

Przenieść roztwór nanocząstek do kolby do hodowli tkankowej i równomiernie rozprowadzić przed umieszczeniem w inkubatorze. Po dwóch godzinach zastąp pożywkę zawierającą nanocząstki DMEM. Po czterech godzinach komórki są gotowe do wstrzyknięcia in vivo.

Gdy transfekowane komórki są gotowe, policz komórki z gęstością 10 razy 10 z sześciu komórek na mililitr w PBS, aby upewnić się, że każda mysz otrzyma równą ilość. Rozdzielić zawiesiny komórek do probówek einor o objętości 110 mikrolitrów. Następnie znieczul mysz, która wcześniej przeszła niedokrwienie kończyn tylnych.

Po potwierdzeniu znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, należy oczyścić miejsce wstrzyknięcia strzykawką o rozmiarze 27. Ponownie zawiesić komórki i pobrać 100 mikrolitrów zawiesiny. Wstrzyknąć połowę zawiesiny komórkowej do obszaru mięśnia przywodziciela, a następnie wstrzyknąć drugą połowę w obszar mięśnia łydki.

Po wstrzyknięciu należy pozostawić strzykawkę na miejscu przez co najmniej 15 do 30 sekund, aby zapobiec wyciekowi. Po zakończeniu wstrzyknięć należy utrzymywać zwierzę w cieple aż do całkowitego wyzdrowienia. W przypadku obrazowania bioluminescencyjnego potwierdź znieczulenie szczyptą palca u nogi, a następnie oczyść miejsce wstrzyknięcia, jak pokazano wcześniej.

Napełnij strzykawkę insulinową 100 mikrolitrami Lucyfera i wstrzyknij go dootrzewnowo. Przed umieszczeniem zwierzęcia w komorze obrazowania lucyferazy ivus, zobrazuj myszy z czasem ekspozycji wynoszącym jedną minutę. Po uzyskaniu obrazu zaznacz obszar zainteresowania.

W tym przypadku niedokrwienna kończyna w miejscu wstrzyknięcia komórki kontynuuje pomiar sygnału lucyferazy co trzy do pięciu minut, aż sygnał osiągnie szczyt i zacznie spadać. Jest to wartość używana do porównania między myszami i punktami czasowymi po zakończeniu, wyjmij myszy z komory i utrzymuj zwierzę w cieple, aż w pełni wyzdrowieje. Tkanki są zbierane w wybranym czasie.

Punkty po transfekcji po eutanazji, przeciąć skórę otaczającą kończynę tylną obwodowo w dystalnej okolicy brzucha i proksymalnie do kończyny tylnej. Po odciągnięciu skóry do tyłu amputuj kończynę między miednicą a stawem udowym. Na koniec izolowany jest przyśrodkowy przywodziciel i mięśnie brzucha.

Dla dalszej analizy, obrazy te przedstawiają syntezę C 32 1 22. W tym przypadku zakończony C 32 AC związany z ACR został utworzony w wyniku reakcji edycji mikrofonowej między monomerem z grupami końcowymi DAL a monomerem z pierwotną grupą końcową am. W tym przykładzie i zmodyfikowanych polimerach PBAE można formować przez dodanie średnio zakończonych monomerów w celu zwiększenia wydajności transfekcji.

Udana transfekcja jest widoczna przez nadekspresję białka zielonej fluorescencji, jak widać tutaj. Te dane z obrazowania bioluminescencyjnego pokazują mysz w dniu zero i dniu 14. Po wstrzyknięciu lucyferazy GFP dodatnich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do kończyny tylnej, reprezentatywne obrazy dopplerowskie wykazują indukcję niedokrwienia po jednej stronie lustrzanej kończyny tylnej w dniu zero i udaną reperfuzję krwi.

14 dni po wstrzyknięciu VEGF z nadekspresją komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej. R-T-P-C-R potwierdził skuteczną regulację w górę VGF, kodowanego białka terapeutycznego w grupie leczonej cztery dni po wstrzyknięciu komórki, podczas gdy w grupie kontrolnej PBS nie wykryto żadnej ekspresji. Inne metody, które wykorzystują połączone podejście do dostarczania komórek macierzystych i genów, mogą być stosowane w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych wspomagających regenerację tkanek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować biodegradowalne polimery do niewirusowej terapii genowej i używać tych polimerów do programowania komórek macierzystych do leczenia niedokrwienia i vivo Stosowanie niewirusowych zmodyfikowanych komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych in situ może być szeroko przydatne w leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych.