Name: Jednokomórkowy pomiar uwalniania dopaminy z jednoczesnym cęgowaniem napięcia i amperometrią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę pomiaru uwalniania dopaminy w neuronach z zastosowaniem cęgowania napięcia i amperometrii. Technika ta umożliwia badanie aktywności transportera dopaminy DAT przy jednoczesnej kontroli napięcia komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Sanice Chirwie za krytyczną recenzję niniejszego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (DA026947, DA021471 oraz NS071122).

1. Sprzęt i materiały
<ol>
	<li>Zamontuj klatkę Faradaya na stole antywibracyjnym (TMI), aby zmniejszyć szum tła.</li>
	<li>System do jednoczesnego rejestrowania prądów metodą patch-clamp i amperometrii wymaga mikroskopu odwróconego z doskonałą optyką DIC i obiektywem o dużej odległości roboczej. Podłącz oświetlenie mikroskopu do akumulatora samochodowego. To źródło światła prądu stałego (DC) dla systemu pozwoli na dalszą redukcję szumów elektrycznych.</li>
	<li>Hydrauliczne mikromanipulatory (Siskiyou) dodatkowo zmniejszają poziom szumów. W naszej konfiguracji używamy manipulatora praworęcznego do rejestracji z całej komórki (whole cell recording), a leworęcznego do amperometrii.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrod do rejestracji
<ol>
	<li>Wytocz elektrody do patch-clampu za pomocą pipet kwarcowych w wyciągaczu P-2000 (Sutter). Nasz proces wyciągania trwa około 5 s i obejmuje dwa cykle grzania. Taki czas nagrzewania pozwolił uzyskać powtarzalną rezystancję (3-4 MΩ) w naszych pipetach do konfiguracji whole-cell.</li>
	<li>Napełnij elektrodę roztworem do pipety zawierającym 2 mM dopaminy i zamocuj ją w prawym manipulatorze. Pojemnik z roztworem zawierającym DA owiń folią aluminiową. Przechowuj w lodzie. Dopamina ulega utlenianiu. Przechowywanie roztworu w lodzie, z ochroną przed światłem, zmniejszy tempo utleniania dopaminy.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij z pudełka do przechowywania niskoszumową amperometryczną elektrodę z włókna węglowego ProCFE (Dagan), napełnij ją rtęcią, zamocuj w adapterze amperometrycznym (jak pokazano na Rysunku 1), a następnie zamocuj w prawym manipulatorze. Chroń końcówkę włókna węglowego przed uszkodzeniem, trzymając włókno za dalny koniec. Sprawdź elektrodę pod mikroskopem laboratoryjnym, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nieuszkodzona.</li>
	<li>Sprawdź sprawność elektrody amperometrycznej, umieszczając ją w szalce Petriego z szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zarejestruj prąd bazowy w obecności dopaminy. Dodaj do szalki 10 μl roztworu DA o stężeniu 1mM. Sprawna elektroda amperometryczna zarejestruje wzrost prądu utleniania. Powtarzaj ten krok na początku i na końcu każdego eksperymentu, aby upewnić się, że elektroda amperometryczna działa prawidłowo.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pierwotnej hodowli neuronów dopaminergicznych lub komórek zmodyfikowanych w celu ekspresji transportera dopaminy w szalkach Petriego z szklanym dnem
<ol>
	<li>Komórki lub neurony dopaminergiczne należy delikatnie przemyć trzykrotnie ciepłym roztworem zewnętrznym.</li>
	<li>Szalkę Petriego z szklanym dnem należy zamocować na stoliku mikroskopu.</li>
</ol>
4. Wizualizacja komórki i przeprowadzenie eksperymentu
<ol>
	<li>Znajdź odpowiednią płaszczyznę ogniskowania, aby wyraźnie zwizualizować komórki. Przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody patch. Następnie ostrożnie wprowadź obie elektrody do roztworu, blisko komórki.</li>
	<li>Ustaw elektrodę amperometryczną obok komórki (po lewej stronie), a elektrodę patch po prawej stronie.</li>
	<li>Uzyskaj uszczelnienie gigaohmiczne (gigaohm seal) na komórce za pomocą elektrody patch. Przerwij uszczelnienie za pomocą ssania, aby uzyskać konfigurację whole cell.</li>
	<li>Odczekaj 5-8 min na dializę roztworu wewnętrznego zawierającego dopaminę do wnętrza komórki.</li>
	<li>Zastosuj wybrany protokół skokowy lub rampowy napięcia. Jednocześnie zbieraj dane z pipety patch oraz elektrody amperometrycznej, aby zmierzyć prądy whole cell i transport wsteczny dopaminy przez transporter dopaminy, podczas gdy potencjał błonowy jest kontrolowany za pomocą pipety patch.</li>
</ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Jednoczesne zastosowanie techniki clamp voltage (zacisk potencjału) oraz amperometrii niesie ze sobą następujące korzyści. Dostępne są wszystkie typy komórek, które mogą być wykorzystane do rejestracji. Identyfikacja komórek lub neuronów, w których prowadzone są pomiary, jest prosta i bezpośrednia. W szczególności, jeśli komórka jest znakowana fluorescencyjnie poprzez dodanie znacznika do białka zainteresowania, badacz może łatwo wybrać docelową komórkę lub neuron. Konfiguracja eksperymentalna umożliwia jednorodne i kont...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny z klatką Faradaya</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>seria 63-500</td><td>używamy modelu 63-543</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon TE-2000</td><td>Nikon</td><td>wycofany z produkcji</td><td>obecnie Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Dwa niskoszumowe wzmacniacze axopatch 200b</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5577</td></tr><tr><td>Głowica 1-CV 203 BU</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5578</td></tr><tr><td>Uchwyt do pipet 1-HL-U</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5579</td></tr><tr><td>Przetwornik A/C Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>800-635-5580</td></tr><tr><td>Dwa manipulatory Siskyou, lewostronny i prawostronny</td><td>Siskiyou</td><td>MX6600R MX6600L</td><td>877-313-6418</td></tr><tr><td>Laserowy wyciągacz pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>888-883-0128</td></tr><tr><td>Niskoszumowa amperometryczna elektroda z włókna węglowego</td><td>ProCFE</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dagan.com&quot; target=&quot;_blank">www.dagan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Niskoszumowa pipeta kwarcowa</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-7.5</td><td>888-883-0128</td></tr><tr><td>Akumulator samochodowy 12 V</td><td></td><td></td><td>powszechnie dostępny</td></tr><tr><td>Ładowarka do akumulatorów samochodowych</td><td></td><td></td><td>powszechnie dostępna</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednopodstawny (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Po uwolnieniu do szczeliny synaptycznej dopamina wykazuje swoje właściwości biologiczne poprzez cele presynaptyczne i postsynaptyczne1. Sygnał dopaminergiczny jest przerywany przez dyfuzję2-3, enzymy zewnątrzkomórkowe4 oraz transportery błonowe5. Transporter dopaminy, zlokalizowany w szczelinie perisynaptycznej neuronów dopaminergicznych, usuwa uwolnione aminy poprzez dośrodkowy strumień dopaminy (wychwyt). Transporter dopaminy może również działać w kierunku odwrotnym, uwalniając aminy z wnętrza na zewnątrz w procesie zwanym transportem odśrodkowym lub efleuksem dopaminy5. Ponad 20 lat temu Sulzer et al. zgłosili, że transporter dopaminy może działać w dwóch trybach aktywności: w przód (wychwyt) i w tył (efleuks)5. Neuroprzekaźnik uwalniany poprzez efleuks przez transporter może przemieścić dużą ilość dopaminy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wykazano, że odgrywa on kluczową rolę regulacyjną w homeostazie zewnątrzkomórkowej dopaminy6. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób jednoczesny pomiar metodą patch clamp i amperometrii może być wykorzystany do pomiaru uwalnianej dopaminy poprzez mechanizm efleuksu z milisekundową rozdzielczością czasową przy kontrolowanym potencjale błonowym. W tym celu prąd z całej komórki (whole-cell) oraz sygnały oksydacyjne (amperometryczne) są mierzone jednocześnie przy użyciu wzmacniacza Axopatch 200B (Molecular Devices, z filtrem dolnoprzepustowym Bessela ustawionym na 1,000 Hz dla pomiaru prądu whole-cell). Do pomiaru amperometrycznego elektroda z włókna węglowego jest podłączona do drugiego wzmacniacza (Axopatch 200B), umieszczona w sąsiedztwie błony plazmatycznej i utrzymywana przy potencjale +700 mV. Prądy whole-cell i oksydacyjne (amperometryczne) mogą być rejestrowane, a zależność prąd-napięcie może zostać wygenerowana przy użyciu protokołu skoków napięcia. W przeciwieństwie do zwykłej kalibracji amperometrycznej, która wymaga przeliczenia na stężenie, prąd jest raportowany bezpośrednio bez uwzględnienia objętości efektywnej7. Zatem wynikowe dane reprezentują dolną granicę efleuksu dopaminy, ponieważ część przekaźnika jest tracona do roztworu objętościowego.

Połączenie techniki patch clamp z amperometrią pozwala na pomiar zależnego od napięcia wypływu DA pośredniczonego przez DAT. Rycina 2A przedstawia reprezentatywną konfigurację eksperymentalną oraz zapis wypływu DA pośredniczonego przez DAT, gdy środowisko wewnątrzkomórkowe i potencjał błonowy są stabilizowane przez pipetę do patch clampu w konfiguracji whole-cell. Przy użyciu tej techniki komórki wykazujące ekspresję białek YFP-DAT są poddawane stabilizacji napięcia za pomocą pipety whole-cell, podczas g...

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Po uwolnieniu do szczeliny synaptycznej dopamina wykazuje swoje właściwości biologiczne poprzez oddziaływanie na cele presynaptyczne i postsynaptyczne1. Sygnał dopaminergiczny jest ...

Celem niniejszej procedury jest pomiar transportu zwrotnego dopaminy w neuronie poddanym zaciskaniu potencjału (voltage clamp), przy jednoczesnym zastosowaniu techniki patch clamp i pyrometrii w celu pomiaru uwalniania dopaminy za pośrednictwem białka DAT. Proces ten rozpoczyna się od sprawdzenia sprawności elektrody pyrometrycznej za pomocą dopaminy. W drugim kroku elektrodę pyrometryczną umieszcza się w pobliżu komórki, a następnie za pomocą pipety patch clamp uzyskuje się konfigurację whole cell neuronu.Następnie, za pomocą pipety do patch-clampu kontrolowane jest napięcie komórki, a jednocześnie przy użyciu elektrody pyrometrycznej rejestrowane jest uwalnianie dopaminy pośredniczone przez DAT. Ostatnim krokiem jest dodanie blokera DAT i ponowne zarejestrowanie prądów z całej komórki oraz prądów pyrometrycznych, co pozwala na odjęcie prądu specyficznie pośredniczonego przez transporter dopaminy. Znaczenie tej techniki polega na możliwości pomiaru transportu zwrotnego dopaminy poprzez transporter dopaminy przy jednoczesnej kontroli napięcia neuronu dopaminergicznego.System do jednoczesnej rejestracji metodą patch-clamp i barometrii wymaga mikroskopu odwróconego z doskonałą optyką DIC oraz obiektywem o dużej odległości roboczej w celu wytworzenia źródła światła DC dla systemu. Aby zminimalizować szumy elektryczne, oświetlenie mikroskopu należy podłączyć do akumulatora samochodowego. Zastosowano hydrauliczne mikromanipulatory, ponieważ w naszej konfiguracji nie wpływają one w znacznym stopniu na poziom szumów.Do rejestracji w konfiguracji voltage clamp i whole cell wykorzystuje się manipulator praworęczny, natomiast do pyrometrii manipulator leworęczny. Aby przygotować elektrodę do rejestracji whole cell, należy wyciągnąć pipetę kwarcową za pomocą wyciągacza P 2000. Zazwyczaj stosujemy pipety o oporności od trzech do czterech mega omów.Następnie napełnij elektrodę roztworem pipetowym zawierającym 1 mM dopaminy. Potem zamontuj ją w uchwycie pipety na prawym manipulatorze. Pamiętaj, aby owinąć folią aluminiową pojemnik z roztworem pipetowym zawierającym dopaminę i przechowywać go w lodzie, gdy nie jest on używany.Ponieważ dopamina ulega utlenianiu, przechowywanie roztworu w lodzie i w ciemności zmniejszy tempo utleniania. Wsuń srebrny drut do uchwytu elektrody, a następnie nakręć adapter parametryczny na uchwyt elektrody. Następnie napełnij elektrodę trójfunkcyjną wystarczającą ilością rtęci, aby nawiązać kontakt ze srebrnym drutem.Po zamontowaniu elektrody do adaptera należy obejrzeć pod mikroskopem włókno węglowe o niskim poziomie szumów pro CFE oraz elektrodę parametryczną, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nieuszkodzona. Należy trzymać za dalszy koniec włókna węglowego, aby chronić jego końcówkę przed uszkodzeniem. Następnie zamontuj elektrodę pro CFE Tric.Następnie zamocuj zmontowaną elektrodę w lewym manipulatorze hydraulicznym, aby sprawdzić integralność elektrody tric. Opuść ją do szalki Petriego z szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zarejestruj prąd bazowy w obecności dopaminy.Następnie dodaj do naczynia 10 µL roztworu dopaminy o stężeniu 1 mM. Prawidłowo działająca elektroda amperometryczna powinna zarejestrować wzrost prądu utleniania. Należy pamiętać o sprawdzeniu sprawności elektrody amperometrycznej przed i po przeprowadzeniu eksperymentów.W tej procedurze należy wyjęć z inkubatora szalkę Petriego z dnem szklanym zawierającą neurony dopaminergiczne lub komórki zmodyfikowane w celu ekspresji transportera dopaminy. Komórki lub neurony dopaminergiczne należy delikatnie przemyć trzykrotnie ciepłym roztworem zewnętrznym. Aby zwizualizować komórki i przeprowadzić eksperyment, należy umieścić szalkę Petriego z dnem szklanym na stoliku mikroskopu i ustawić odpowiednią ogniskową, aby wyraźnie widzieć komórki.Następnie przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody patch. Używając strzykawki o pojemności jednego mililitra, delikatnie wprowadź obie elektrody do roztworu i przybliż je do komórki za pomocą mikromanipulatorów. Następnie ustaw elektrodę amperometryczną po lewej stronie komórki, a elektrodę patch po prawej.Gdy elektroda patch styka się z komórką, zastosuj lekkie zasysanie za pomocą ust lub strzykawki, aby utworzyć tzw. giga seal na komórce. Następnie przerwij uszczelnienie poprzez zasysanie, aby uzyskać konfigurację whole-cell, i odczekaj od pięciu do ośmiu minut na dializę wewnętrznego roztworu zawierającego dopaminę do wnętrza komórki.Następnie zarejestruj prądy zależne od DAT, zmieniając napięcie błony komórkowej w zakresie od −60 do +100 mV, przy potencjale utrzymującym wynoszącym −40 mV, podawanym przez pipetę. Aby wyznaczyć specyficzny strumień dopaminy zależny od DAT, zarejestruj prądy empiryczne w obecności i przy braku antagonisty DAT. Specyficzny prąd zależny od DAT wyznacza się następnie poprzez odjęcie śladów zarejestrowanych w obecności antagonisty DAT od śladów empirycznych zarejestrowanych bez antagonisty.Odchylenie w górę prądów tric odpowiada zewnętrznemu strumieniowi dopaminy pokazanemu tutaj. Prądy pośredniczone przez DAT zarejestrowane poprzez skokowe zmiany napięcia błony o 20 mV w zakresie od -60 do +100 mV z potencjałem spoczynkowym -4 C mV przy użyciu pipety zawierającej 2 mM dopaminy w trybie whole cell patching. Poniżej znajduje się prąd amperometryczny nabyty jednocześnie z prądem whole cell.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak mierzyć transport wsteczny dopaminy poprzez transporter dopaminy w neuronie w warunkach zaciskania napięcia. Pamiętaj o sprawdzeniu szczelności elektrody parametrycznej przed i po eksperymentach oraz nie zapomnij odjąć śladów zarejestrowanych w obecności tego antagonisty od śladów zarejestrowanych bez antagonisty.

single-cell-measurement-dopamine-release-with-simultaneous-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednokomórkowe pomiary uwalniania dopaminy z jednoczesnym zacięciem napięciowym i amperometrią

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Wykorzystanie szybkoskanującej woltamperometrii cyklicznej do pomiaru elektrycznie wywołanej dynamiki dopaminy presynaptycznej w skrawkach mózgowych prążkowia.

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Film demonstruje rejestrowanie aktywności elektrycznej w neuronach fotoreceptorowych ommatidium Drosophila poprzez ustanowienie konfiguracji całej komórki. Podkreśla on aktywację przejściowych kanałów potencjału receptora przez impulsy świetlne, co skutkuje mierzalnymi wstrząsami kwantowymi.

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Szybko-skanująca cykliczna woltamperometria może monitorować in vivo neurotransmisję dopaminy w kontekście leków, chorób i innych eksperymentalnych manipulacji. W niniejszej pracy opisano implementację QNsim1.0, oprogramowania do modelowania elektrycznie stymulowanych odpowiedzi dopaminy zgodnie z ilościowym modelem neurobiologicznym w celu ilościowego oszacowania dynamiki uwalniania i wychwytu zwrotnego dopaminy.

Modelowanie danych szybkiego skanowania woltamperometrii cyklicznej na podstawie elektrycznie stymulowanych danych neurotransmisji dopaminy przy użyciu QNsim1.0

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Poznaj metodę pomiaru uwalniania dopaminy w neuronach z zastosowaniem cęgowania napięcia i amperometrii. Technika ta umożliwia badanie aktywności transportera dopaminy DAT przy jednoczesnej kontroli napięcia komórkowego.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Przeglądaj więcej filmów