Jednokomórkowy pomiar uwalniania dopaminy z jednoczesnym cęgowaniem napięcia i amperometrią
21 listopada 2012
Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki, wykrywając prąd oksydacyjny wytwarzany przez spontaniczne utlenianie dopaminy. Jednoczesna metodologia cęgowania napięcia i amperometrii ujawnia mechanistyczny związek między ogólną "aktywnością" transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w odwrotnym transporcie dopaminy.
Celem tej procedury jest pomiar odwrotnego transportu dopaminy w neuronie, który jest napięty przy użyciu jednoczesnego zacisku krosowego i pirometrii w celu pomiaru uwalniania D za pośrednictwem DAT. Osiąga się to poprzez najpierw przetestowanie integralności elektrody pirometrycznej za pomocą dopaminy. Drugim krokiem jest umieszczenie elektrody pirometrycznej w pobliżu komórki i uzyskanie całego plastra komórkowego neuronu za pomocą pipety z łatą.
Następnie napięcie ogniwa jest kontrolowane za pomocą pipety krostowej, a dopamina uwalniana przez ogniwo za pośrednictwem DAT jest jednocześnie rejestrowana za pomocą elektrody pirometrycznej. Ostatnim krokiem jest dodanie blokera DAT i ponowne zarejestrowanie całej komórki i prądów pirometrycznych, aby umożliwić odjęcie prądu specyficznie pośredniczonego przez transporter dopaminy. Znaczenie tej techniki polega na możliwości pomiaru odwrotnego transportu dopaminy przez transporter dopaminy przy jednoczesnym kontrolowaniu napięcia neuronu dopaminergicznego.
Jednoczesny system rejestracji patch clamp i barometrii wymaga odwróconego mikroskopu z doskonałą optyką DIC i soczewką o dużej odległości roboczej do wygenerowania źródła światła DC dla systemu. Przy niskim poziomie szumów elektrycznych podłącz latarnię morską mikroskopu do akumulatora samochodowego. Mikromanipulatory hydrauliczne są stosowane, ponieważ nie przyczyniają się znacząco do poziomu hałasu w naszej konfiguracji.
Manipulator praworęczny służy do cęgowania napięcia, zapisu całej komórki, a manipulator leworęczny do pirometrii. Aby przygotować elektrodę do zapisu hurtowego, należy wyciągnąć pipetę kwarcową ze ściągaczem P 2000. Zazwyczaj używamy pipety o rezystancji od trzech do czterech megaomów.
Następnie napełnij elektrodę roztworem pipety zawierającym jedną milimolową dopaminę. Następnie zamontuj go na uchwycie pipety na prawym manipulatorze. Pamiętaj, aby owinąć pojemnik zawierający roztwór pipety zawierający dopaminę folią aluminiową i trzymać go na lodzie, gdy nie jest używany.
Ponieważ dopamina ulega utlenieniu, utrzymywanie roztworu na lodzie i ochrona przed światłem zmniejszy szybkość utleniania. Nawlecz srebrny drut na uchwyt elektrody, a następnie nakręć adapter parametryczny am na uchwyt elektrody. Następnie napełnij elektrodę tric wystarczającą ilością rtęci, aby zetknęła się ze srebrnym drutem.
Gdy elektroda jest zamontowana na adapterze, należy sprawdzić pod mikroskopem elektrodę z włókna węglowego i elektrodę parametryczną pro CFE o niskim poziomie hałasu, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nienaruszona. Pamiętaj, aby przytrzymać drugi koniec włókna węglowego, aby chronić końcówkę włókna węglowego przed uszkodzeniem. Następnie zamontuj elektrodę pro CFE Tric.
Następnie zamontuj zmontowaną elektrodę na lewym manipulatorze hydraulicznym, aby sprawdzić integralność elektrody tric. Zanurz go na szalce Petriego ze szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zapisz prąd podstawowy przy braku dopaminy.
Następnie dodaj do naczynia 10 mikrolitrów jednomilimolowego roztworu dopaminy. Dobra elektroda metryczna emper powinna rejestrować wzrost prądu utleniania. Pamiętaj, aby sprawdzić integralność elektrody metrycznej emper przed i po eksperymentach.
W tej procedurze należy pobrać z inkubatora neurony dopaminowe lub komórki zmodyfikowane do ekspresji transportera dopaminy umieszczone na szklanej szalce Petriego. Delikatnie umyj komórki lub neurony dopaminowe trzy razy ciepłym roztworem zewnętrznym. Aby zwizualizować komórki i przeprowadzić eksperyment, zamontuj szklaną płytkę Petriego na stoliku mikroskopu i znajdź właściwy punkt ogniskowy, aby wyraźnie zwizualizować komórki.
Następnie zastosuj nadciśnienie do elektrody łatowej. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie zanurz obie elektrody w roztworze i zbliż ogniwo za pomocą mikromanipulatorów. Następnie umieść elektrodę metryczną emper po lewej stronie ogniwa, a elektrodę krosową po prawej.
Gdy elektroda plastra dotyka ogniwa. Zastosuj lekkie ssanie ustami lub strzykawką, aby utworzyć giga uszczelnienie na komórce. Następnie rozerwij uszczelkę za pomocą ssania, aby uzyskać konfigurację całej komórki, i odczekaj od pięciu do ośmiu minut na dializę wewnętrznego roztworu zawierającego dopaminę do komórki.
Następnie rejestruj prądy, w których pośredniczy DAT, przesuwając napięcie błony komórkowej między minus 60 a plus 100 miliwoltów z potencjału podtrzymania minus 40 miliwoltów przez pipetę. Aby określić specyficzną dopaminę, w której pośredniczy DAT, należy zarejestrować prądy metryczne emper pod nieobecność i obecność antagonisty DAT. Specyficzny prąd tric, w którym pośredniczy DAT, jest następnie określany przez odjęcie śladów zarejestrowanych w obecności antagonisty DAT od śladów emper zarejestrowanych bez antagonisty.
Odchylenie prądów trycznych w górę odpowiada pokazanemu tutaj strumieniowi dopaminy na zewnątrz. Prądy za pośrednictwem DAT zarejestrowane przez zwiększenie napięcia membrany o 20 miliwoltów między minus 60 a plus 100 miliwoltów z potencjału podtrzymania minus cztery miliwolty C za pomocą pipety zawierającej dwie milimolowe dopaminy w trybie łatania całej komórki. Oto prąd metryczny Empera uzyskany jednocześnie z prądem całego ogniwa.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć odwrotny transport dopaminy przez transporter dopaminy w neuronie z zaciśniętym napięciem. Pamiętaj, aby sprawdzić integralność elektrody parametrycznej przed i po eksperymentach i nie zapomnij odjąć śladów zarejestrowanych w obecności tego antagonisty od śladów tric zarejestrowanych bez antagonisty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę pomiaru transportu zwrotnego dopaminy w neuronach z wykorzystaniem jednoczesnego zastosowania techniki patch clamp oraz pyrometrii. Metoda ta pozwala na ocenę uwalniania dopaminy za pośrednictwem transportera dopaminy (DAT) przy jednoczesnej kontroli napięcia neuronu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Dynamika neuroprzekaźników
Wstęp
- Dopamina jest kluczowym neurotransmiterem uczestniczącym w różnych funkcjach mózgu.
- Transporter dopaminy odgrywa kluczową rolę w regulacji poziomu dopaminy.
- Zrozumienie mechanizmów transportu wstecznego jest niezbędne do uzyskania wiedzy na temat sygnalizacji dopaminergicznej.
- Technika ta łączy metodę clampowania napięcia z pomiarami amperometrycznymi w celu zwiększenia dokładności.
Cel badania
- Aby zmierzyć transport zwrotny dopaminy w neuronach z zastosowaniem clampingu napięcia.
- Aby zbadać zależność między aktywnością DAT a uwalnianiem dopaminy.
- Aby przedstawić metodę badania funkcji neuronów dopaminergicznych w czasie rzeczywistym.
Użyte metody
- Sprawdzanie szczelności elektrody pyrometrycznej przy użyciu dopaminy.
- Uzyskanie konfiguracji whole cell patch neuronu za pomocą pipety patchowej.
- Kontrola napięcia komórki za pomocą pipety patchowej.
- Rejestracja uwalniania dopaminy za pośrednictwem DAT przy użyciu elektrody pyrometrycznej.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar uwalniania dopaminy podczas zaciskania napięcia.
- Wykazano wpływ blokerów DAT na transport dopaminy.
- Dostarczono informacji na temat mechanizmów regulacyjnych transportu dopaminy.
- Zwalidowano metodę badania dynamiki dopaminy w neuronach.
Wnioski
- Technika ta pozwala na skuteczne pomiary transportu zwrotnego dopaminy.
- Jednoczesna kontrola napięcia pogłębia zrozumienie funkcji DAT.
- Metodę tę można zastosować w dalszych badaniach nad sygnalizacją dopaminergiczną.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośredni pomiar odpływu dopaminy poprzez transporter dopaminy w warunkach kontroli napięcia, co pozwala na uzyskanie wglądu w mechanizmy działania transportera istotne dla opracowywania leków neuropsychiatrycznych. Dzięki izolacji uwalniania zapśredniczonego przez DAT w czasie rzeczywistym, metoda ta wspiera walidację celu i pozwala na weryfikację hipotez dotyczących sygnalizacji dopaminergicznej w modelach chorobowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków poprzez powiązanie aktywności transportera z dynamiką neurotransmiterów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Badanie mechanizmu odpływu transportera dopaminy w celu walidacji funkcjonalnego oddziaływania na cel w żywych neuronach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia jednoczesną rejestrację elektrofizjologiczną i amperometryczną w celu skorelowania potencjału błonowego ze strumieniem dopaminy zależnym od transportera.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty prądu utleniania, które odzwierciedlają zależne od DAT uwalnianie dopaminy przy kontrolowanych skokach napięcia.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny format testu do pomiaru efektu odpływu pośredniczonego przez transporter, wspierając przesiewanie związków będących modulatorami DAT.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy aktywność efektu wypływu DAT z pozakomórkową homeostazą dopaminy, dostarczając informacji dla modeli chorób, w których zaangażowana jest dysfunkcja transportera.
- Wartość operacyjna: Zapewnia istotny w kontekście chorób system do oceny genetycznych lub farmakologicznych zaburzeń funkcji transportera dopaminy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, umożliwiając mechanistyczną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów w postaci transporterów dopaminy jeszcze przed podjęciem działań mających na celu identyfikację związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów odwrócenia transportu oraz wyjaśnianie szlaków w neuronach dopaminergicznych.
- Przesiewowanie: Dostarcza gotowe do analizy, ilościowe wyniki do oceny wpływu związków na efekt efluksu zależny od DAT.
- Analityka: Umożliwia jednoczesny pomiar prądów całokomórkowych i pomiary amperometryczne w celu wyizolowania sygnałów specyficznych dla DAT poprzez subtrakcję farmakologiczną.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie dysregulacji dopaminy w neuronalnych systemach sterowanych napięciem.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcji transporterów w wielu modelach neuronalnych lub kontekstach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośredni pomiar zależnego od efektu wypływu uwalniania dopaminy pod kontrolą fizjologicznego napięcia.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji testu dzięki synchronizacji techniki patch-clamp i amperometrii, co redukuje zmienność w pomiarach strumienia neurotransmiterów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie mechanizmu działania transportera, co zmniejsza odsetek niepowodzeń w późnych etapach z powodu błędnego zrozumienia mechanizmów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków celujących w DAT w oparciu o dane dotyczące funkcjonalnej modulacji wypływu, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu elektrofizjologii, amperometrii i hodowli neuronów w celu zachowania integralności elektrod oraz wierności sygnału.
- Zależne od instrumentacji o niskim poziomie szumów, w tym manipulatorów hydraulicznych, podwójnych wzmacniaczy Axopatch 200B oraz elektrod z włókna węglowego do jednoczesnej rejestracji.
- Wymaga standaryzacji protokołów napięciowych i metod odejmowania antagonistów pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności eksperymentów.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dla różnych modeli neuronowych, w szczególności w odniesieniu do poziomów ekspresji transportera dopaminy oraz stanu błon komórkowych.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak utlenianie roztworu dopaminy, co wymaga ochrony podczas obchodzenia się z próbką oraz walidacji linii bazowej przed i po eksperymentach.
