Jednokomórkowy pomiar uwalniania dopaminy z jednoczesnym cęgowaniem napięcia i amperometrią
21 listopada 2012
Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki, wykrywając prąd oksydacyjny wytwarzany przez spontaniczne utlenianie dopaminy. Jednoczesna metodologia cęgowania napięcia i amperometrii ujawnia mechanistyczny związek między ogólną "aktywnością" transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w odwrotnym transporcie dopaminy.
Celem tej procedury jest pomiar odwrotnego transportu dopaminy w neuronie, który jest napięty przy użyciu jednoczesnego zacisku krosowego i pirometrii w celu pomiaru uwalniania D za pośrednictwem DAT. Osiąga się to poprzez najpierw przetestowanie integralności elektrody pirometrycznej za pomocą dopaminy. Drugim krokiem jest umieszczenie elektrody pirometrycznej w pobliżu komórki i uzyskanie całego plastra komórkowego neuronu za pomocą pipety z łatą.
Następnie napięcie ogniwa jest kontrolowane za pomocą pipety krostowej, a dopamina uwalniana przez ogniwo za pośrednictwem DAT jest jednocześnie rejestrowana za pomocą elektrody pirometrycznej. Ostatnim krokiem jest dodanie blokera DAT i ponowne zarejestrowanie całej komórki i prądów pirometrycznych, aby umożliwić odjęcie prądu specyficznie pośredniczonego przez transporter dopaminy. Znaczenie tej techniki polega na możliwości pomiaru odwrotnego transportu dopaminy przez transporter dopaminy przy jednoczesnym kontrolowaniu napięcia neuronu dopaminergicznego.
Jednoczesny system rejestracji patch clamp i barometrii wymaga odwróconego mikroskopu z doskonałą optyką DIC i soczewką o dużej odległości roboczej do wygenerowania źródła światła DC dla systemu. Przy niskim poziomie szumów elektrycznych podłącz latarnię morską mikroskopu do akumulatora samochodowego. Mikromanipulatory hydrauliczne są stosowane, ponieważ nie przyczyniają się znacząco do poziomu hałasu w naszej konfiguracji.
Manipulator praworęczny służy do cęgowania napięcia, zapisu całej komórki, a manipulator leworęczny do pirometrii. Aby przygotować elektrodę do zapisu hurtowego, należy wyciągnąć pipetę kwarcową ze ściągaczem P 2000. Zazwyczaj używamy pipety o rezystancji od trzech do czterech megaomów.
Następnie napełnij elektrodę roztworem pipety zawierającym jedną milimolową dopaminę. Następnie zamontuj go na uchwycie pipety na prawym manipulatorze. Pamiętaj, aby owinąć pojemnik zawierający roztwór pipety zawierający dopaminę folią aluminiową i trzymać go na lodzie, gdy nie jest używany.
Ponieważ dopamina ulega utlenieniu, utrzymywanie roztworu na lodzie i ochrona przed światłem zmniejszy szybkość utleniania. Nawlecz srebrny drut na uchwyt elektrody, a następnie nakręć adapter parametryczny am na uchwyt elektrody. Następnie napełnij elektrodę tric wystarczającą ilością rtęci, aby zetknęła się ze srebrnym drutem.
Gdy elektroda jest zamontowana na adapterze, należy sprawdzić pod mikroskopem elektrodę z włókna węglowego i elektrodę parametryczną pro CFE o niskim poziomie hałasu, aby upewnić się, że końcówka jest czysta i nienaruszona. Pamiętaj, aby przytrzymać drugi koniec włókna węglowego, aby chronić końcówkę włókna węglowego przed uszkodzeniem. Następnie zamontuj elektrodę pro CFE Tric.
Następnie zamontuj zmontowaną elektrodę na lewym manipulatorze hydraulicznym, aby sprawdzić integralność elektrody tric. Zanurz go na szalce Petriego ze szklanym dnem zawierającej roztwór zewnętrzny. Zapisz prąd podstawowy przy braku dopaminy.
Następnie dodaj do naczynia 10 mikrolitrów jednomilimolowego roztworu dopaminy. Dobra elektroda metryczna emper powinna rejestrować wzrost prądu utleniania. Pamiętaj, aby sprawdzić integralność elektrody metrycznej emper przed i po eksperymentach.
W tej procedurze należy pobrać z inkubatora neurony dopaminowe lub komórki zmodyfikowane do ekspresji transportera dopaminy umieszczone na szklanej szalce Petriego. Delikatnie umyj komórki lub neurony dopaminowe trzy razy ciepłym roztworem zewnętrznym. Aby zwizualizować komórki i przeprowadzić eksperyment, zamontuj szklaną płytkę Petriego na stoliku mikroskopu i znajdź właściwy punkt ogniskowy, aby wyraźnie zwizualizować komórki.
Następnie zastosuj nadciśnienie do elektrody łatowej. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra delikatnie zanurz obie elektrody w roztworze i zbliż ogniwo za pomocą mikromanipulatorów. Następnie umieść elektrodę metryczną emper po lewej stronie ogniwa, a elektrodę krosową po prawej.
Gdy elektroda plastra dotyka ogniwa. Zastosuj lekkie ssanie ustami lub strzykawką, aby utworzyć giga uszczelnienie na komórce. Następnie rozerwij uszczelkę za pomocą ssania, aby uzyskać konfigurację całej komórki, i odczekaj od pięciu do ośmiu minut na dializę wewnętrznego roztworu zawierającego dopaminę do komórki.
Następnie rejestruj prądy, w których pośredniczy DAT, przesuwając napięcie błony komórkowej między minus 60 a plus 100 miliwoltów z potencjału podtrzymania minus 40 miliwoltów przez pipetę. Aby określić specyficzną dopaminę, w której pośredniczy DAT, należy zarejestrować prądy metryczne emper pod nieobecność i obecność antagonisty DAT. Specyficzny prąd tric, w którym pośredniczy DAT, jest następnie określany przez odjęcie śladów zarejestrowanych w obecności antagonisty DAT od śladów emper zarejestrowanych bez antagonisty.
Odchylenie prądów trycznych w górę odpowiada pokazanemu tutaj strumieniowi dopaminy na zewnątrz. Prądy za pośrednictwem DAT zarejestrowane przez zwiększenie napięcia membrany o 20 miliwoltów między minus 60 a plus 100 miliwoltów z potencjału podtrzymania minus cztery miliwolty C za pomocą pipety zawierającej dwie milimolowe dopaminy w trybie łatania całej komórki. Oto prąd metryczny Empera uzyskany jednocześnie z prądem całego ogniwa.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć odwrotny transport dopaminy przez transporter dopaminy w neuronie z zaciśniętym napięciem. Pamiętaj, aby sprawdzić integralność elektrody parametrycznej przed i po eksperymentach i nie zapomnij odjąć śladów zarejestrowanych w obecności tego antagonisty od śladów tric zarejestrowanych bez antagonisty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę pomiaru odwrotnego transportu dopaminy w neuronach z wykorzystaniem jednoczesnego patch clamp i pirometrii. Metoda ta pozwala na ocenę uwalniania dopaminy z pośrednictwem transportera dopaminy (DAT) przy kontrolowaniu napięcia neuronu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Dynamika neuroprzekaźników
Tło
- Dopamina jest krytycznym neuroprzekaźnikiem zaangażowanym w różne funkcje mózgu.
- Transporter dopaminy odgrywa kluczową rolę w regulowaniu poziomów dopaminy.
- Rozumienie mechanizmów transportu odwrotnego jest istotne dla poznania sygnalizacji dopaminergicznej.
- Ta technika łączy zaciskanie napięciowe z pomiarami amperometrycznymi dla lepszej dokładności.
Cel badania
- Zmierzyć odwrotny transport dopaminy w neuronach z zaciskanym napięciem.
- Zbadać związek między aktywnością DAT a uwalnianiem dopaminy.
- Zapewnienie metody badania funkcji neuronów dopaminergicznych w czasie rzeczywistym.
Stosowane metody
- Testowanie integralności elektrody pirometrycznej z dopaminą.
- Osiągnięcie pełnego połączenia z komórką neuronu za pomocą pipety patch.
- Kontrolowanie napięcia komórkowego za pomocą pipety patch.
- Rejestrowanie uwalniania dopaminy z pośrednictwem DAT za pomocą elektrody pirometrycznej.
Główne wyniki
- Skuteczne pomiary uwalniania dopaminy podczas zaciskania napięcia.
- Wykazanie wpływu blokad DAT na transport dopaminy.
- Zapewnienie wglądu w mechanizmy regulacyjne transportu dopaminy.
- Walidacja metody badania dynamiki dopaminy neuronowej.
Wnioski
- Technika skutecznie mierzy odwrotny transport dopaminy.
- Jednoczesna kontrola napięcia poprawia zrozumienie funkcji DAT.
- Ta metoda może być zastosowana do dalszych badań nad sygnalizacją dopaminergiczną.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of dopamine efflux via the dopamine transporter under voltage control, providing mechanistic insight into transporter function relevant to neuropsychiatric drug discovery. By isolating DAT-mediated release in real time, it supports target validation and de-risks hypotheses about dopaminergic signaling in disease models. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking transporter activity to neurotransmitter dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the dopamine transporter's efflux mechanism to validate functional target engagement in live neurons.
- Operational Value: Enables simultaneous electrophysiological and amperometric recording to correlate membrane potential with transporter-mediated dopamine flux.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved oxidative current readouts that reflect DAT-dependent dopamine release under controlled voltage steps.
- Operational Value: Establishes a reproducible assay format for measuring transporter-mediated efflux, supporting compound screening for DAT modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links DAT efflux activity to extracellular dopamine homeostasis, informing disease models where transporter dysfunction is implicated.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system to assess genetic or pharmacological perturbations of dopamine transporter function.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by enabling mechanistic de-risking of dopamine transporter targets prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transporter reversal mechanisms and pathway clarification in dopaminergic neurons.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound effects on DAT-mediated efflux.
- Analytics: Provides simultaneous whole-cell current and amperometric measurements to isolate DAT-specific signals via pharmacological subtraction.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling dopamine dysregulation in voltage-controlled neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing transporter function across multiple neuronal models or disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by directly measuring efflux-mediated dopamine release under physiological voltage control.
- Operational Value: Promotes assay standardization through synchronized patch clamp and amperometry, reducing variability in neurotransmitter flux measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying transporter mechanism of action, reducing late-stage attrition due to mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DAT-targeting compounds based on functional efflux modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, amperometry, and neuronal culture to maintain electrode integrity and signal fidelity.
- Depends on low-noise instrumentation including hydraulic manipulators, dual Axopatch 200B amplifiers, and carbon fiber electrodes for simultaneous recording.
- Necessitates cross-team standardization of voltage protocols and antagonist subtraction methods to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations for different neuronal models, particularly regarding dopamine transporter expression levels and membrane health.
- Includes practical limitations such as dopamine solution oxidation, requiring protective handling and baseline validation before and after experiments.
