Name: Analiza lotności owoców za pomocą elektronicznego nosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj szybką analizę związków lotnych w owocach za pomocą elektronicznego nosa. Ta metoda pozwala badać wpływ odmiany, dojrzałości i warunków przechowywania na jakość owoców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Billowi Copesowi (Harris Moran Seed Company, Davis) za dostarczenie owoców melona do niniejszej analizy. Projekt ten jest finansowany z programu grantowego Specialty Crops Research Initiative Competitive Grants Program, grant nr 2009-51181-05783 z USDA National Institute of Food and Agriculture.

1. Przygotowanie próbek
<ol>
 <li>Zbiór owoców w pożądanym stadium dojrzałości. Płukanie wodą z kranu w celu usunięcia zanieczyszczeń i kurzu.</li>
 <li>Wybór owoców do analizy na podstawie braku wad zewnętrznych i wewnętrznych oraz jednorodności rozmiaru.</li>
 <li>Przecięcie owoców wzdłuż na ćwiartki do wykorzystania w pobieraniu związków lotnych. W razie potrzeby usunięcie skórki, nasion, tkanki wnętrza nasion lub pestki. Dobór tkanki owocowej musi być spójny w całym eksperymencie i uwzględniać zmienność wewnątrz jednego owocu (tzn. pobranie próbek w równych częściach z okolic równika, kwiatu i szypułki).</li>
 <li>Połączenie wybranej tkanki owocowej, wymieszanie jej w celu randomizacji, a następnie odważenie 200 g do blendera.</li>
 <li>Dodanie 200 mL nasyconego roztworu CaCl2 (372,5 g w 20 °C w 500 mL wody dejonizowanej) oraz 50 μL 100 mM roztworu izowaleronianu 2-metylobutylu w metanolu. CaCl2 ma służyć jako inhibitor aktywności enzymatycznej, która może wystąpić po pocięciu i homogenizacji miąższu owoców. Izowaleronian 2-metylobutylu jest dodawany jako standard wewnętrzny w celu monitorowania ewentualnych strat związków lotnych podczas procesu homogenizacji.</li>
 <li>Homogenizacja mieszaniny w blenderze laboratoryjnym (Waring, USA) przez 30 sekund przy 18 000 rpm, a następnie natychmiastowe przelanie do szklanej butelki i zamknięcie pokrywką z Teflonu. Przechowywanie homogenatu w butelce w temperaturze pokojowej do czasu przygotowania wszystkich próbek.</li>
 <li>Po przelaniu homogenatu do butelki należy odczekać 10 minut, aby piana oddzieliła się od cieczy, a następnie pipetować aliquoty 5 mL cieczy, bez piany, do 20 mL szklanych fiolek bursztynowych i zamknąć fiolki stalowymi zakrętkami z septami teflonowo-silikonowymi. Procedura ta jest odpowiednia dla przygotowania homogenatu z melona i gruszki. W przypadku użycia innych owoców do analizy może być wymagany etap wirowania. W takim przypadku należy usunąć pianę, a następnie odwirować ciecz, aby osadzić cząstki, które mogłyby zablokować pipetę. Należy przygotować co najmniej trzy fiolki na próbkę, które posłużą jako powtórzenia techniczne.</li>
 <li>Na tym etapie próbki można analizować natychmiast lub zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze ultra-niskiej (-80 °C) do późniejszej analizy.</li>
 <li>W przypadku próbek mrożonych, w dniu analizy należy wyjąć próbki z zamrażarki i pozostawić je do rozmrożenia przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu i przed analizą należy wymienić zakrętkę fiolki na nową z czystym i suchym septem. Jeśli septum nie zostanie wymienione, woda skroplona na septum podczas rozmrażania może zostać zassana do instrumentu i go uszkodzić.</li>
</ol>
2. Konfiguracja układu chromatografii gazowej z detekcją fal powierzchniowych (GC-SAW) i pozyskiwanie danych
<ol>
 <li>Wczytaj odpowiednią metodę analizy do urządzenia zNose. 
 Do analizy profilu lotnych związków bogatych w estry w melonach, parametry w oprogramowaniu MicroSense wersja 5.44.22 (Newbury Park, CA, USA) są następujące: zasysanie przestrzeni nadpróbkowej do wlotu przez 20 sekund z przepływem 30 mL min-1 za pomocą pompy; temperatura wlotu 200 °C; temperatura pułapki Tenax 225 °C; szybkość przepływu gazu nośnego (hel czystości 99,999%) 2,9 mL min-1; program temperatury kolumny (kolumna DB-5, 1 m × 0,25mm I.D.× 0,25 μm grubości warstwy) od 45 °C do 180 °C z szybkością 10 °C sec-1; temperatura sensora 40 °C; zawór 165 °C. Całkowity czas analizy wynosi 1 minutę na próbkę.</li>
 <li>Podłącz igłę ze stali nierdzewnej z końcówką niepowcinową do wlotu zNose i kilkukrotnie przedmuchaj system powietrzem otoczenia, aż linia bazowa stanie się stabilna, a wykryte piki nie będą przekraczać 200 Counts (Ct).</li>
 <li>Przeprowadź strojenie instrumentu za pomocą roztworu alkanów o łańcuchu prostym (C6-C14). Wynik strojenia jest wykorzystywany przez oprogramowanie instrumentu do przeliczenia czasu retencji eluowanych pików z jednostek czasu na jednostki Indeksu Kovatsa (KI). W konsekwencji, po zestrojeniu systemu, czasy retencji są raportowane w jednostkach KI.</li>
 <li>Przed analizą pozostaw próbkę do wyrównania ciśnienia przez 30 minut. Aby przeanalizować jedną z fiolek z próbką, wprowadź igłę przez membranę fiolki, aby zredukować ciśnienie. Następnie wprowadź igłę podłączoną do wlotu instrumentu przez membranę fiolki i rozpocznij próbkowanie przestrzeni nadpróbkowej. Przeanalizuj co najmniej trzy powtórzenia techniczne dla każdej próbki.</li>
 <li>Uruchom instrument ręcznie, klikając przycisk „Play”; pompa aktywuje się i odsysa opary znajdujące się nad próbką. Na koniec analizy na ekranie pojawia się chromatogram, a sensor jest automatycznie podgrzewany do 150 °C przez 10 sekund w celu jego oczyszczenia. Gdy przycisk w polu stanu systemu ponownie zmieni kolor na zielony, instrument jest gotowy do analizy kolejnej próbki.</li>
 <li>Aby zapewnić stabilną linię bazową i prawidłowe oczyszczenie systemu, przeprowadź co najmniej jedną próbę ślepą z powietrzem pomiędzy każdą próbką. W celu monitorowania możliwego zanieczyszczenia lotnymi związkami z fiolki i zakrętki, przeanalizuj dwie próbki ślepe fiolki (pusta fiolka z zakrętką) na początku i na koniec dnia.</li>
</ol>
3. Eksport i analiza danych
<ol>
 <li>Po akwizycji wyeksportuj dane do pliku Microsoft Excel, korzystając z funkcji „Peak logging” w oprogramowaniu MicroSense. Po wyeksportowaniu danych dodaj kolumny zawierające etykiety zmiennych i powtórzeń.</li>
 <li>Zmień format danych w celu ułatwienia manipulacji, używając opracowanego przez nas skryptu w języku Python (wersja 2.6; dostępny bezpłatnie online) o nazwie „reform_data.py” (przykład formatu danych przed i po użyciu skryptu „reform_data.py” przedstawiono na Rysunku 1). Nazwę pliku źródłowego (format xls) i nazwę arkusza dla danych wejściowych, a także pożądaną nazwę pliku wyjściowego (format xls), edytuje się bezpośrednio w skrypcie.</li>
 <li>Uruchom program „kim_interface.py” (również napisany w Python 2.6; patrz Rysunek 2) i zaimportuj dane z pliku wygenerowanego w poprzednim kroku. W szczególności analiza opiera się na przeglądaniu i analizowaniu liczby detekcji każdej wartości KI („KI hits”). W związku z tym program wyświetla wykres słupkowy wystąpień KI dla każdej wartości KI.</li>
 <li>Oceń wystąpienia KI dla określonych podzbiorów próbek, analizując każdą grupę powtórzeń technicznych razem. Aby to zrobić, analizuj każdą próbę lub zmienną oddzielnie, zaznaczając lub odznaczając odpowiednie pola wyboru. Szczegółowy opis funkcji graficznego interfejsu użytkownika (GUI) znajduje się w podpisie do Rysunku 2.</li>
 <li>Po określeniu szerokości każdego okna KI za pomocą GUI, wybierz losowo niektóre z odpowiadających im chromatogramów w oprogramowaniu Microsense i oceń nakładanie się pików w powtórzeniach technicznych. Przykład nałożonych na siebie chromatogramów dwóch powtórzeń technicznych przedstawiono na Rysunku 3.</li>
 <li>Po wyznaczeniu okna KI użyj funkcji „Merge” dostępnej w GUI, aby połączyć wartości KI mieszczące się w oknie z najbardziej liczną wartością KI. Dzięki tej funkcji piki oznaczone zakresem wartości KI są konsolidowane pod jedną etykietą KI, co pozwala traktować takie piki jako jedną zmienną. 
 Aby to zrobić, najpierw kliknij przycisk „Merge”, aby aktywować tę funkcję, a następnie wybierz najbardziej liczne KI jako centrum okna, klikając lewym przyciskiem myszy odpowiedni słupek. Po wybraniu słupek zmienia kolor na zielony. Aby połączyć wartości KI mieszczące się w oknie z wybranym KI, kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednie słupki; spowoduje to zmianę koloru słupków na czerwony, a nad centralnym KI zostanie dodany niebieski słupek o odpowiedniej długości (patrz Rysunek 4). Gdy wszystkie wybrane wartości KI zostaną połączone z odpowiednim centralnym KI, kliknij ponownie przycisk „Merge”, aby zatwierdzić zmiany; spowoduje to zmianę koloru przycisku „Merge” na żółty. W przypadku pomyłek dostępny jest również przycisk „Unmerge”. Aby cofnąć łączenie, kliknij przycisk „Unmerge” w GUI, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony słupek, który chcesz odłączyć. Słupek zmieni kolor z czerwonego na niebieski. Kliknij ponownie przycisk „Unmerge”, aby zatwierdzić zmiany.</li>
 <li>W przypadku próby błędnego połączenia dwóch pików w jednej próbce w jedną wartość KI, wyświetlony zostanie komunikat o błędzie. W takiej sytuacji dokładnie sprawdź chromatogram i przedefiniuj okno KI w tym regionie.</li>
 <li>Po przeprowadzeniu wszystkich operacji łączenia zapisz plik.</li>
 <li>Przed przystąpieniem do analizy statystycznej przeanalizuj chromatogramy prób ślepych powietrza i fiolek, aby monitorować możliwe zanieczyszczenia. Po zidentyfikowaniu wartości KI pików w próbkach ślepych, odejmij pole powierzchni piku wykrytego w ślepej próbie powietrza i/lub fiolki od pola powierzchni piku obecnego w próbce. 
 Następnie przystąp do analizy statystycznej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Elektroniczny nos był w stanie wykryć różnice w profilach lotnych związków w owocach melona zbieranych w różnych stadiach dojrzałości (Rysunek 5). W obrębie wszystkich próbek zidentyfikowano dwadzieścia okien KI. Analiza wariancji wykazała, że 14 pików wykrytych przez elektroniczny nos różniło się istotnie w zależności od stadium dojrzałości. Na Rysunku 6 przedstawiono logarytm średnich pól pików tych 14 komponentów, aby ukazać różnice w ich liczności pomiędzy dwoma stadiami dojrzałości: owocami wczesnodojrzałymi oraz w pełni dojrzałymi.
<img alt="Tabela wyników chromatografii porównująca próbkę KI i wartości powierzchni piku, analiza danych metody." src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przykłady formatu danych eksportowanych z oprogramowania instrumentu (A) oraz po transformacji wykonanej za pomocą skryptu „reform_data.py” (B). Aby ułatwić manipulację i analizę danych, wszystkie unikalne KI są identyfikowane we wszystkich próbkach, a następnie dane są reorganizowane tak, aby informacje o próbkach znajdowały się w wierszach, a powierzchnie pików w kolumnach, odpowiadających unikalnym KI. Jeśli dla danej wartości KI w próbce nie wykryto piku, odpowiadająca mu komórka pozostaje pusta.
<img alt="Wykres analizy danych przedstawiający liczbę trafień na KI z regulowanymi parametrami progu dla segmentacji danych." src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zrzut ekranu z pliku skryptu „kim_interface.py”. Wykres w centrum przedstawia liczbę trafień na KI w funkcji KI. „Trafienia na KI” to liczba próbek, w których wykryto pik o konkretnej wartości KI. Po lewej stronie znajdują się trzy żółte pola służące do sterowania wybranymi danymi. Wyświetlają one parametry służące do podziału zbioru danych (zabiegi, powtórzenia, zmienne jakościowe itp.). Na tej rycinie są to (od góry do dołu): odmiana, data sadzenia oraz stadium dojrzałości podczas zbiorów. Na dole: poprzez kliknięcie w trzy paski i przesuwanie niebieskiego suwaka w lewo lub w prawo można wybrać wartość minimalną i maksymalną zakresu KI oraz minimalną powierzchnię piku („Threshold”). Po prawej stronie: przycisk „Merge” umożliwia łączenie wybranych wartości KI poprzez ręczne klikanie w paski na wykresie. Przycisk „Unmerge” pozwala cofnąć ten proces dla wybranych przypadków.
<img alt="Wykres chromatograficzny indeksu Kovatsa z danymi powtórzonymi dla analizy związków." src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Nałożone na siebie chromatogramy (czarny i czerwony) dwóch powtórzeń technicznych z przestrzeni nad próbką lotnych związków melona, ilustrujące przesunięcie czasu retencji.
<img alt="Analiza histogramu, scalone KI, rozkład danych, diagram, edukacyjne narzędzie do wizualizacji wykresów." src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykład procedury scalania KI. Na środkowym wykresie zielony słupek (Central KI) reprezentuje najliczniejsze KI, które zostało wybrane jako centrum okna KI. KI X oraz KI Y to KI mieszczące się w interesującym nas oknie, które muszą zostać scalone z centralnym KI. Po kliknięciu prawym przyciskiem myszy na słupku KI X zmienia on kolor na czerwony, a jednocześnie nad zielonym słupkiem pojawia się niebieski słupek o tej samej długości co słupek KI X. Powtórzenie tej samej procedury dla KI Y spowoduje zwiększenie długości niebieskiego słupka (Merged KIs) o odpowiadającą mu wartość. Po dodaniu wszystkich KI, kliknięcie zielonego przycisku „Merge” kończy proces scalania, zmiany zostają zapisane, a kolor przycisku zmienia się na żółty.
<img alt="Analiza chromatografii gazowej; związki lotne; owoce niedojrzałe i dojrzałe; indeks Kovatsa; piki związków." src="/files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Dwa chromatogramy próbek melona zebranych w różnych stadiach dojrzałości, wczesnej (góra) i pełnej (dół), ilustrujące zdolność elektronicznego nosa do wykrywania różnic w zawartości związków lotnych.
<img alt="Wykres radarowy porównujący wczesny etap dojrzałości i etap pełnej dojrzałości w analizie rozwoju owoców." src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Wykres radarowy przedstawiający powierzchnie pików 14 składników obecnych w dwóch próbkach melona na dwóch różnych etapach dojrzałości: wczesnej dojrzałości i pełnej dojrzałości. Powierzchnie pików przedstawiono w skali logarytmicznej, aby ułatwić wizualizację porównania. Liczby na końcach każdego promienia reprezentują odpowiadające im indeksy Kovatsa.

<ol><li>Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavor+quality+of+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Flavor quality of fruits and vegetables.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).</li>
<li>Persaud, K., Dodd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+discriminant+mechanisms+in+the+mammalian+olfactory+system+using+a+model+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose.</a> Nature. 299, 352-355 (1982).</li>
<li>Gardner, J. W., Bartlett, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief-history+of+electronic+noses%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%22%5BJournal%5D)">A brief-history of electronic noses.</a> Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).</li>
<li>Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+nose%3A+Current+status+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Electronic nose: Current status and future trends.</a> Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).</li>
<li>Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apple+deterioration+using+an+electronic+nose+and+zNose%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Asabe%22%5BJournal%5D)">Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose.</a> Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).</li>
<li>Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ripeness+and+rot+evaluation+of+%27Tommy+Atkins%27+mango+fruit+through+volatiles+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Eng%22%5BJournal%5D)">Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection.</a> J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).</li>
<li>Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+exploration+of+fast+gas+chromatography-surface+acoustic+wave+sensor+to+the+analysis+of+thymus+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species.</a> J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).</li>
<li>Watkins, P., Wijesundera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zNose+for+the+analysis+of+selected+grape+aroma+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds.</a> Talanta. 70, 595-601 (2006).</li>
<li>Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+vegetable+oils+by+surface+acoustic+wave+sensing+electronic+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose.</a> Food Chem. 89, 507-518 (2005).</li>
<li>Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+SAW+Sensor+Electronic+Nose+for+Detecting+the+Adulteration+of+Virgin+Coconut+Oil+with+RBD+Palm+Kernel+Olein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Oil+Chemists+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).</li>
<li>Evans, M. B., Haken, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+gas-chromatographic+index+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the gas-chromatographic index scheme.</a> Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Elektroniczne nosy stanowią obiecującą metodę szybkiej, obiektywnej oceny profilów aromatycznych owoców lub próbek bogatych w substancje lotne. Jednak przesunięcia czasu retencji stanowią wyzwanie dla identyfikacji piku i mogą prowadzić do błędnej interpretacji danych, gdy dwa chromatogramy nie są idealnie dopasowane. Inspekcja wizualna chromatogramów wykazała, że zmienność czasów retencji między próbkami często powodowała, iż ten sam pik był oznaczany nieco różnymi wartościami KI (około ±10). Przekładało się to na zawyżoną liczbę wykrytych unikalnych KI. Aby wykorzystać fakt, że (a) na różnych etapach dojrzałości występują różne związki oraz (b) powtórzenia techniczne są niemal identyczne, opracowano dwa skrypty komputerowe („kim_merge.py”, zawierający procedury obsługi zestawu danych, oraz „kim_interface.py”, zapewniający graficzny interfejs użytkownika (GUI)), aby systematycznie porównywać próbki w sposób półautomatyczny, co znacznie skróciło czas potrzebny na analizę chromatogramów w dużych zestawach danych. Programy te umożliwiają, w stosownych przypadkach, konsolidację pików oznaczonych zakresem wartości KI pod jedną etykietą KI. Służy to dwóm ważnym celom: (a) umożliwia analizie statystycznej traktowanie takich pików jako jednej zmiennej oraz (b) ułatwia identyfikację pików i ich porównanie z innymi systemami oraz opublikowanymi wartościami. Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że próbki melona można rozróżnić na podstawie dojrzałości i profilowania aromatu przy użyciu systemu zNose w połączeniu z odpowiednią identyfikacją KI. Stanowi to obiecującą nową technologię analizy substancji lotnych, która może być wykorzystana w programach kontroli jakości.

<table><tbody><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>MP Biomedicals</td><td>195088</td><td></td></tr><tr><td>izowaleronian 2-metylobutylu</td><td>SAFC Global</td><td>W350613</td><td>&amp;#8805; 98%, naturalny, FCC</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A411-4</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860098</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860101</td><td></td></tr><tr><td>Blender laboratoryjny</td><td>Laboratorium Waringa</td><td>7009G</td><td>blender dwubiegowy; szklany pojemnik o pojemności 1 litra</td></tr><tr><td>Butelka</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1C</td><td>Pyrex, 500 ml; z polipropylenową zatyczką uszczelniającą </td></tr><tr><td>Igła</td><td>Technologia czujników elektronicznych</td><td>TLC101046</td><td>boczny otwór luer</td></tr><tr><td>roztwór alkanów</td><td>Technologia czujników elektronicznych</td><td></td><td>roztwór alkanów C6-C14 w metanolu</td></tr><tr><td>zNose</td><td>Technologia czujników elektronicznych</td><td>Model 4500</td><td></td></tr><tr><td>kolumna GC DB-5</td><td>Technologia czujników elektronicznych</td><td>SYS4500C5</td><td></td></tr><tr><td>MicroSense</td><td>Technologia czujników elektronicznych</td><td>Wersja 5.44.22</td><td></td></tr><tr><td>Python 2.6</td><td></td><td></td><td>Wolno dostępne online</td></tr><tr><td>&quot;reform_data.py&quot; i &quot;kim_interface.py&quot; skrypty</td><td></td><td></td><td>Skrypty dostępne jako materiały uzupełniające w JoVE</td></tr></tbody></table>

analiza lotnych związków owoców z wykorzystaniem elektronicznego nosa

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Podczas dojrzewania owoców zachodzi szereg różnorodnych zmian fizjologicznych, w tym rozwój specyficznej mieszaniny związków lotnych, która nadaje owocom charakterystyczny aromat. Stopień dojrzałości w momencie zbioru jest jednym z kluczowych czynników wpływających na jakość smakową owoców i warzyw1. Walidacja niezawodnych metod szybkiej oceny dojrzałości owoców i jakości ich aromatu pozwoliłaby na usprawnienie zarządzania zaawansowanymi programami hodowlanymi, praktykami produkcyjnymi oraz procesami powysiewnymi i pozbiórczymi.
W ciągu ostatnich trzech dekad przeprowadzono wiele badań nad opracowaniem tzw. nosów elektronicznych, czyli urządzeń zdolnych do szybkiego wykrywania zapachów i aromatów2-4. Obecnie na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych nosów elektronicznych umożliwiających analizę substancji lotnych, opartych na różnych technologiach. Nos elektroniczny wykorzystany w naszej pracy (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA) składa się z ultraszybkiej chromatografii gazowej sprzężonej z czujnikiem fali akustycznej powierzchniowej (UFGC-SAW). Technologia ta została już przetestowana pod kątem możliwości monitorowania jakości różnych towarów, w tym w wykrywaniu psucia się jabłek5, ocenie dojrzałości i gnicia mango6, profilowaniu aromatu gatunków thymus7, analizie lotnych związków C6 w jagodach winogron8, charakterystyce olejów roślinnych9 oraz wykrywaniu zanieczyszczeń w nierafinowanym oleju kokosowym10.
System ten może przeprowadzać trzy główne etapy analizy aromatu: pobieranie próbki z przestrzeni nad próbką (headspace), rozdział związków lotnych oraz detekcję. W ciągu około jednej minuty generowany jest wynik w postaci chromatogramu, a po cyklu płukania instrument jest gotowy do dalszych analiz. Wyniki uzyskane za pomocą zNose można porównać z wynikami innych systemów chromatografii gazowej poprzez obliczenie indeksów Kovatsa (KI). Po skalibrowaniu instrumentu za pomocą wzorca alkanów, czasy retencji są automatycznie przeliczane na KI. Należy jednak spodziewać się niewielkich zmian temperatury i szybkości przepływu w czasie, co powoduje dryft czasów retencji. Ponadto, w zależności od polarności fazy stacjonarnej kolumny, powtarzalność obliczeń KI może różnić się o kilka jednostek indeksu11. Opracowano zatem szereg programów i interfejsów graficznych w celu półautomatycznego porównywania obliczonych KI pomiędzy próbkami. Programy te skracają czas wymagany do analizy chromatogramów w dużych zbiorach danych i minimalizują ryzyko błędnej interpretacji danych w sytuacjach, gdy chromatogramy nie są idealnie wyrównane.
Przedstawiamy metodę szybkiej analizy związków lotnych w owocach. Omówiono również procedury przygotowania próbek, pozyskiwania i przetwarzania danych.

Opisano szybką metodę analizy związków lotnych w owocach. Związki lotne obecne w przestrzeni nad próbką homogenatu są szybko rozdzielane i wykrywane za pomocą ultraszybkiej chromatografii gazowej (GC) sprzężonej z czujnikiem fali akustycznej powierzchniowej (SAW). Omówiono również procedurę przetwarzania i analizy danych.

Analiza lotnych związków owoców z wykorzystaniem elektronicznego nosa

Podczas dojrzewania owoców zachodzi szereg różnorodnych zmian fizjologicznych, w tym rozwój specyficznej mieszaniny związków lotnych, która charakteryzuje owoce ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie szybkiej analizy związków lotnych w owocach. Osiąga się to najpierw poprzez pocięcie i homogenizację tkanki owocu. Następnie faza par nad próbką ciekłą jest analizowana za pomocą elektronicznego nosa.Po analizie za pomocą elektronicznego nosa dane są eksportowane i przekształcane. Ostatnim krokiem procedury jest zidentyfikowanie okien indeksu covas i skonsolidowanie pików pod jedną etykietą indeksu covas przy użyciu interfejsu graficznego. Ostatecznie wyniki wykazują, że różnice w obfitości folikuli owoców mierzone elektronicznym nosem mogą być powiązane z zabiegami eksperymentalnymi, takimi jak odmiana owoców, stopień dojrzałości i warunki przechowywania.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna chromatografia gazowa, jest możliwość szybszej analizy związków lotnych w owocach. Podczas przeprowadzania tej analizy mogą wystąpić niewielkie zmiany w czasach retencji analitów. Mogłoby to prowadzić do błędnej interpretacji danych bez dokładnego uwzględnienia procesu wyrównywania piku.Po zbiorze owoców na odpowiednim etapie dojrzałości, należy je opłukać wodą z kranu. Następnie należy wybrać owoce do analizy, usuwając te zanieczyszczone brudem i kurzem. W oparciu o brak zewnętrznych i wewnętrznych defektów oraz wielkość i jednorodność, owoce należy przekroić wzdłuż na cząstki w celu pobrania próbek substancji lotnych.Jeśli dotyczy, usuń nasiona ze skóry, tkankę z jam nasion lub pestki z owoców. Dobór tkanek musi być spójny w całym eksperymencie, a zmienność w obrębie jednego owocu powinna zostać uwzględniona. Na przykład próbki należy pobierać w równym stopniu z części równikowej, od strony kwiatu oraz od strony szypułki.Połączyć wybrane tkanki owoców, wymieszać je w celu randomizacji, a następnie odważyć 200 g i przełożyć do komercyjnego blendera. Dodać 200 ml nasyconego roztworu chlorku wapnia. Chlorek wapnia ma za zadanie działać jako inhibitor aktywności enzymatycznej, która może wystąpić po krojeniu i homogenizacji miąższu owoców.Następnie dodaj 50 µL 100 mM roztworu izomaślanu 2-metylobutylu w metanolu. Roztwór ten jest dodawany jako standard wewnętrzny w celu monitorowania ewentualnych strat związków lotnych podczas procesu homogenizacji. Następnie homogenizuj mieszaninę w blenderze laboratoryjnym przez 30 sekund przy 18 000 RPM.Następnie niezwłocznie przelej zawartość do szklanej butelki i szczelnie zamknij pokrywką teflonową. Przechowuj homogenizat w butelce aż do momentu przygotowania wszystkich próbek. Pipetą pobierz pięciomililitrowe aliquoty soku bez piany do 20-mililitrowych szklanych fiolek bursztynowych, przygotowując co najmniej trzy fiolki na każdą próbkę.Aby służyły jako powtórzenia techniczne. Zamknąć fiolki stalowymi zakrętkami z septami z teflonu i silikonu. Na tym etapie próbki można analizować niezwłocznie lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze ultraniskiej do późniejszej analizy.Załaduj odpowiednią metodę analizy do urządzenia Xenos. Wprowadź parametry zgodnie z protokołem pisemnym. Podłącz do wlotu Xenos igłę ze stali nierdzewnej z końcówką nieusuwającą rdzenia.Przepłucz system kilkakrotnie powietrzem otoczenia, aż linia bazowa stanie się stabilna i nie będą wykrywane żadne piki przekraczające 200 zliczeń. W celu przygotowania instrumentu do strojenia wprowadź igłę do septa fiolki zawierającej roztwór acas o łańcuchu prostym, aby wyrównać ciśnienie. Następnie wprowadź igłę połączoną z wlotem instrumentu do septa.Przeprowadź strojenie, inicjując próbkowanie przestrzeni nad cieczą. Wynik strojenia jest wykorzystywany przez oprogramowanie instrumentu do konwersji czasu retencji wspomnianych pików z jednostek czasu na indeksy covas lub jednostki KI. W konsekwencji, po zestrojeniu systemu, czasy retencji są raportowane w jednostkach KI.Rozpocznij analizę próbki po 30-minutowym wyrównaniu stanu próbki, wprowadzając igły do septa fiolki z próbką. Postępuj analogicznie jak w przypadku roztworu prostych łańcuchów acas. Uruchom pobieranie próbki z przestrzeni nad próbką (headspace) ręcznie, klikając przycisk odtwarzania, co aktywuje pompę i spowoduje odessać pary znajdujące się nad próbką.Po zakończeniu analizy na ekranie wyświetla się chromatogram, a czujnik jest automatycznie podgrzewany do 150 °C przez 10 sekund w celu jego oczyszczenia. Gdy pole stanu systemu ponownie zmieni kolor na zielony, urządzenie jest gotowe do analizy kolejnej próbki. Aby zapewnić stabilną linię bazową i właściwe oczyszczenie systemu, należy przeprowadzić co najmniej jeden pomiar ślepy z powietrzem pomiędzy każdą próbką.Przeanalizuj co najmniej trzy powtórzenia techniczne dla każdej próbki, a także próbki ślepe z fiolki. Po akwizycji wyeksportuj dane do pliku Microsoft Excel, korzystając z funkcji zapisu danych dziennika (log stored data) w oprogramowaniu Mense. Po wyeksportowaniu danych dodaj kolumny zawierające etykiety dla zmiennych i powtórzeń.Format danych eksportowanych z oprogramowania urządzenia może zostać przekształcony w celu łatwiejszej manipulacji za pomocą skryptu Python 0.6 opracowanego w tym laboratorium. Nazwa pliku źródłowego i nazwa arkusza dla danych wejściowych, a także pożądana nazwa pliku wyjściowego są edytowane bezpośrednio w skrypcie. Skrypt ten ułatwia manipulację danymi i ich analizę poprzez identyfikację unikalnych kis we wszystkich próbkach.Dane zostają przeorganizowane tak, aby informacje o próbkach znajdowały się w wierszach, a unikalne wartości KIS w kolumnach, przy czym każda komórka reprezentuje odpowiadającą jej powierzchnię piku. Jeśli dla danej wartości KI w próbce nie wykryto piku, odpowiednia komórka pozostaje pusta. Następnie, przy użyciu drugiego skryptu wygenerowanego przez ten import laboratorium, przetwarzane są dane z pliku edytowanego w poprzednim kroku.Analiza opiera się na obserwacji i ocenie liczby wystąpień każdej wartości KI. W związku z tym program wyświetla wykres słupkowy trafień KI. Dla każdej wartości KI należy ocenić liczbę trafień K w określonych podzbiorach próbek, analizując każdą grupę powtórzeń technicznych łącznie.Aby to zrobić, należy analizować każdą próbę lub zmienną osobno, zaznaczając lub odznaczając odpowiednie pola. Po określeniu szerokości każdego okna KI za pomocą interfejsu graficznego, należy losowo wybrać kilka odpowiadających im chromatogramów. W oprogramowaniu mense należy ocenić nakładanie się pików pomiędzy powtórzeniami technicznymi.Po wyodrębnieniu okna KI, w interfejsie graficznym wykorzystuje się funkcję łączenia (merge), aby połączyć KIS znajdujące się w oknie z najbardziej licznie obsadzonym ki. Kliknij przycisk merge, aby aktywować tę funkcję, a następnie wybierz najbardziej licznie obsadzone ki w centrum okna, klikając lewym przyciskiem myszy odpowiedni słupek. Po wybraniu słupka zmienia on kolor na zielony; aby połączyć KIS znajdujące się w oknie z wybranym ki, kliknij prawym przyciskiem myszy na odpowiednie słupki.Powoduje to zmianę koloru słupków na czerwony, podczas gdy nad centralnym ki dodawany jest niebieski słupek o odpowiadającej mu długości. Gdy wszystkie wybrane kis zostaną scalone z odpowiednim centralnym ki, ponownie kliknij przycisk scalania, aby zaakceptować zmiany. Sprawia to, że przycisk scalania zmienia kolor na żółty w przypadku wystąpienia błędów.Przycisk „unmerge” służy również do rozdzielania. Kliknij przycisk „unmerge” w interfejsie graficznym, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony pasek, który ma zostać rozdzielony.Słupek zmienia kolor z czerwonego na niebieski. Ponownie kliknij przycisk odłączania (un merge), aby zatwierdzić zmiany. W przypadku próby nieprawidłowego połączenia dwóch piku w jednej próbce w jedną wartość KI, wyświetli się komunikat o błędzie.Po zapisaniu pliku po wszystkich operacjach łączenia i przed przystąpieniem do analizy statystycznej, analizuje się chromatogramy próbek ślepych powietrza i fiolek w celu monitorowania ewentualnych zanieczyszczeń. Po zidentyfikowaniu ki pików oraz próbek ślepych, należy odjąć powierzchnię piku wykrytego w próbce ślepej powietrza i/lub fiolki od powierzchni piku obecnego w próbce. Elektronowy nos był w stanie wykryć różnice w profilach lotnych substancji w owocach melona zbieranych na różnych etapach dojrzałości.Przedstawiono tutaj przykłady chromatogramów z owoców w stadium wczesnej dojrzałości oraz owoców w pełni dojrzałych, ukazujące różnice w powierzchniach pików. Dla wielu pików zidentyfikowano okna 20 K we wszystkich próbkach. Analiza wariancji wykazała, że spośród tych różnych kis, obfitość 14 pików wykrytych przez elektroniczny nos różniła się znacząco pomiędzy dwoma stadiami dojrzałości. Tutaj obfitość pików owoców w stadium wczesnej dojrzałości dla każdego z tych kis przedstawiono kolorem zielonym, a obfitość pików owoców w pełni dojrzałych kolorem pomarańczowym.Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas, w celu zidentyfikowania składników odpowiadających poszczególnym pikom uzyskanym za pomocą nosa elektronicznego po jego opracowaniu. Technika ta dostarczy szybkiego narzędzia analitycznego i pozwoli badaczom z zakresu patologii roślin, fizjologii roślin, biologii pozbiórkowej oraz nauki o żywności badać zmiany w składzie związków lotnych w owocach w zależności od stopnia dojrzałości, odmiany lub warunków przechowywania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko analizować związki lotne za pomocą nosa elektronicznego oraz jak przeprowadzać wyrównanie pików przy użyciu naszego interfejsu graficznego.

fruit-volatile-analysis-using-an-electronic-nose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza lotnych związków owoców za pomocą elektronicznego nosa

Wtórna spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (SESI-MS) umożliwia detekcję lotnych związków organicznych (LZO) bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące szybkiej (w ciągu kilku minut) charakteryzacji bakteryjnych LZO przy użyciu SESI-MS.

Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Ten film przedstawia protokół do analizy spektrometrycznej mas związków lotnych i wrażliwych na utlenianie za pomocą jonizacji uderzeniowej elektronów. Przedstawiona technika jest szczególnie interesująca dla chemików nieorganicznych, pracujących z metalami organicznymi, silanami lub fosfanami, z którymi należy obchodzić się w warunkach obojętnych, takich jak technika Schlenka.

Analiza związków lotnych i wrażliwych na utlenianie przy użyciu systemu zimnego wlotu i spektrometrii mas z uderzeniem elektronów

Czas reakcji transferu protonów w locie Spektrometria mas umożliwia bardzo czułą, szybką i nieinwazyjną analizę lotnych związków organicznych. Aby pokazać jej potencjał, podajemy trzy przykłady: fermentację mlekową jogurtu (monitorowanie bioprocesów on-line), różne genotypy jabłek (badania przesiewowe na dużą skalę) oraz przestrzeń zanosową po wypiciu kawy (analiza przestrzeni nosowej).

PTR-ToF-MS w połączeniu ze zautomatyzowanym systemem pobierania próbek i dostosowaną analizą danych do badań żywności: monitorowanie bioprocesów, badania przesiewowe i analiza przestrzeni nosowej

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół zbierania substancji lotnych o zapachu kwiatowym z kwitnących kwiatów, przy użyciu nieniszczącej procedury pobierania próbek.

Szybkie zbieranie lotnych substancji zapachowych o kwiatowych zapachach przy użyciu techniki zbierania lotnych substancji w przestrzeni nad powierzchnią do pobierania próbek desorpcji termicznej GC-MS

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. W szczególności stosujemy mikroekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z chromatografią gazową ze spektrometrią mas do analizy lotnych składników zapachów zwierzęcych i oznaczeń zapachowych.

Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Platforma mikroekstrakcji gazowej w fazie stałej jest tutaj opisana do szybkiej, niezawodnej i półautomatycznej identyfikacji i kwantyfikacji substancji lotnych w dojrzałych owocach czarnej porzeczki. Technika ta może być wykorzystana do poszerzenia wiedzy na temat aromatu owoców oraz do selekcji odmian o wzmocnionym smaku do celów hodowlanych.

Profilowanie związków lotnych w owocach czarnej porzeczki przy użyciu mikroekstrakcji w fazie stałej w przestrzeni nad powierzchnią sprzężoną z chromatografią gazową i spektrometrią mas

Przedstawiona tutaj jest metoda wzbogacania i analizy lotnych składników ekstraktów herbaty za pomocą wspomaganego rozpuszczalnikiem odparowywania smaku i ekstrakcji rozpuszczalnikowej, a następnie chromatografii gazowej i spektrometrii mas, która może być stosowana do wszystkich rodzajów próbek herbaty.

Analiza aromatu herbaty w oparciu o wspomagane rozpuszczalnikiem wzbogacanie aromatu

Poznaj szybką analizę związków lotnych w owocach za pomocą elektronicznego nosa. Ta metoda pozwala badać wpływ odmiany, dojrzałości i warunków przechowywania na jakość owoców.

Analiza lotnych związków owoców z wykorzystaniem elektronicznego nosa

Przeglądaj więcej filmów