Name: Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensacji pęcherza moczowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę cystometrii u małych gryzoni do badania chemosensacji pęcherza moczowego. Technika ta pozwala mierzyć ciśnienie wewnątrz pęcherza i objętość wydalanego moczu w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z rządu federalnego Belgii (IUAP P6/28), Fundacji Badawczej Flandrii (F.W.O.) (G.0565.07 oraz G.0686.09), nagrodę Astellas European Foundation Award 2009 oraz Radę Badawczą KU Leuven (GOA 2009/07, EF/95/010 oraz PFV/10/006). P.U. i W.E. są stypendystami doktoranckimi Fundacji Badawczej Flandrii (FWO). M.B. jest stypendystą programu Marie Curie, a D.D.R. stypendystą podstawowo-klinicznym FWO.

1. Zwierzęta laboratoryjne
<ol>
 <li>Zwierzęta (myszy, szczury) są utrzymywane w specjalistycznym zwierzęciu w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność z dostępem ad libitum do wody i standardowej karmy w formie peletu. Zarówno wiek, jak i płeć zwierząt są istotnymi parametrami, które należy zestandaryzować zgodnie z potrzebami. Zazwyczaj wykonujemy cystometrię u samic w wieku 10–12 tygodni5,6.</li>
 <li>Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Rady Wspólnoty Unii Europejskiej i zostały zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
 <li>Do przeprowadzania małych zabiegów chirurgicznych stosuje się znieczulenie izofluranem, ponieważ dzięki krótkiemu okresowi półtrwania jest on łatwy do dawkowania. Podczas stosowania izofluranu niezbędne jest odpowiednie odprowadzanie gazów odlotowych.
 <ol class="lalpha">
 <li>Zwierzęta umieszcza się w zamkniętym pudełku, w którym podaje się 5% izofluranu w czystym tlenie (1 l/min).</li>
 <li>Po indukcji odpowiedni poziom znieczulenia utrzymuje się za pomocą małej maski (odciętej strzykawki 10 ml), podając tlen z prędkością 0,8 - 1 l/min z dodatkiem 1 - 1,5% izofluranu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W przypadku myszy podczas rejestracji funkcjonalnych stosuje się znieczulenie uretanem (patrz poniżej). Znieczulenie uretanem jest stosowane podczas rejestracji funkcjonalnych, ponieważ w przeciwieństwie do większości innych środków znieczulających, nie znosi ono odruchu mikcyjnego4. Uretan w dawce 1,2 g/kg masy ciała podaje się podskórnie (s.c.) 60 min przed rozpoczęciem rejestracji. W razie potrzeby dawkę uretanu niezbędną do uzyskania właściwego znieczulenia można miareczkować, podając dodatkowe dawki (0,1 g/kg) podskórnie. Należy jednak zauważyć, że dodatkowe znieczulenie może zmienić efektywność opróżniania pęcherza, a w konsekwencji częstotliwość mikcji7,8. Dlatego też rejestracje cystometryczne powinny być ściśle monitorowane i odrzucane w przypadku zaobserwowania istotnych odchyleń od zachowania kontrolnego. Aby uniknąć błędnej interpretacji danych, nie należy podawać środków znieczulających w czasie aplikacji badanych związków.</li>
</ol>
3. Procedura chirurgiczna - implantacja cewnika pęcherza moczowego
<ol>
 <li>Narzędzia chirurgiczne przed użyciem należy wysterylizować w autoklawie. Brzuch zwierzęcia należy ogolić, zdezynfekować 70% etanolem i wykonać niską laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić pęcherz moczowy.</li>
 <li>Pod mikroskopem chirurgicznym należy założyć szew pierścieniowy (tzw. purse-string suture) w kopule pęcherza, używając niewchłanialnej nici monofilamentowej (rozmiar 6-0).</li>
 <li>Wewnątrz szwu pierścieniowego należy wykonać niewielką cystostomię (preferencyjnie przy użyciu igły 18 G) i przez ten otwór wprowadzić cewnik polietylenowy PE 50 z niewielką mankietą na końcu (uzyskaną poprzez ostrożne podgrzanie rurki). W naszej praktyce cieńsze rurki (PE 10) wykazują wyższy i bardziej zmienny opór. Rurkę można zdezynfekować, zanurzając ją w 70% roztworze etanolu lub wysterylizować w autoklawie. Przed implantacją rurkę należy przepłukać solą fizjologiczną.</li>
 <li>Szew pierścieniowy należy zabezpieczyć wokół rurki za pomocą węzła chirurgicznego. Cewnik należy delikatnie wyciągnąć na zewnątrz, aż dzwonkowata końcówka znajdzie się bezpośrednio pod szwem. Aby zapobiec wyciekom, w stronę szwu należy wsunąć fragment cewnika 18 G.</li>
 <li>Należy delikatnie wprowadzić niewielką objętość soli fizjologicznej (100 - 200 μl), aby sprawdzić szczelność. W przypadku stwierdzenia wycieków należy założyć dodatkowy szew.</li>
 <li>Mięśnie brzucha należy zamknąć szwami monofilamentowymi, pozostawiając przejście dla cewnika w górnej części nacięcia.</li>
 <li>Rurkę należy przeprowadzić tunelem do obszaru międzymistrzowego za pomocą pustego w środku metalowego pręta, co zapobiegnie przegryzieniu rurki przez zwierzęta podczas eksperymentu.</li>
 <li>Skórę zamyka się niewchłanialnymi szwami monofilamentowymi. Implantowany cewnik należy przepłukać solą fizjologiczną w celu sprawdzenia jego drożności.</li>
 <li>Przed wybudzeniem zwierząt podaje się podskórnie leki przeciwbólowe (buprenorfina, 0.05 mg/kg).</li>
</ol>
4. Przygotowanie i cystometria
<ol>
 <li>W zależności od pytania badawczego (oraz gatunku zwierząt) cystometrię wykonuje się u zwierząt budzących się (unieruchomionych lub nie) lub znieczulonych uretanem. Podczas gdy cystometria jest w pełni możliwa do przeprowadzenia u świadomych szczurów, które zazwyczaj pozostają spokojne w środowisku unieruchomienia, w przypadku myszy zazwyczaj wykonujemy cystometrię w znieczuleniu uretanem (1,2 mg/kg, podskórnie)3,5,6,9.</li>
 <li>U znieczulonych myszy temperatura ciała jest stale monitorowana i utrzymywana na poziomie 36,5 °C ± 0,2 °C za pomocą sondy temperatury i lampy grzewczej.</li>
 <li>Układ jest kalibrowany przed każdym eksperymentem zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Zaimplantowany cewnik jest połączony za pomocą końcówki Luer z kranikiem trójdrożnym, który z jednej strony jest podłączony do przetwornika ciśnienia (Edwards Lifesciences), a z drugiej do pompy infuzyjnej (Harvard Apparatus). Przetwornik ciśnienia jest połączony poprzez wzmacniacz (monitor 78534c, Hewlett Packard) z systemem akwizycji danych (DI-730-USB, Dataq instruments) i komputerem. Do rejestracji można użyć oprogramowania Windaq/Lite.</li>
 <li>Uruchamia się pompę infuzyjną, umożliwiając infuzję soli fizjologicznej lub PBS, na przykład z prędkością 100 μl/min (u szczurów) lub 20 μl/min (u myszy). W ten sposób pęcherz jest napełniany ze stałą prędkością, podczas gdy rejestrowane jest ciśnienie wewnątrz pęcherza.</li>
 <li>Rysunek 5 przedstawia typowy zapis ciśnienia: podczas infuzji płynu w pęcherzu następuje powolny wzrost ciśnienia, aż do osiągnięcia określonej objętości/ciśnienia, czyli progu mikcji. Po osiągnięciu tego progu pęcherz ulega skurczowi, a następnie otwiera się zwieracz cewki moczowej, umożliwiając przepływ moczu przez cewkę. W ten sposób pęcherz zostaje opróżniony, skurcz ustaje, a ciśnienie ponownie spada do poziomu „podstawowego”.</li>
 <li>Ponieważ szczur jest umieszczony w klatce metabolicznej nad wagą cyfrową, można jednocześnie zmierzyć objętość wydalonego moczu, co dostarcza informacji o objętości mikcji. Ze względu na małe objętości wydalanego moczu u myszy, zastosowanie tego systemu może być bardzo trudne. Dlatego objętość wydalonego moczu określa się za pomocą małych papierów filtracyjnych ważonych przed i po mikcji.</li>
 <li>Zazwyczaj pozwalamy układowi na equilibrację przez 30 min, po czym następuje 30-minutowy okres rejestracji. Następnie leki mogą być podawane ogólnoustrojowo lub do pęcherza, a następnie rejestruje się kolejne 30 min.</li>
 <li>Zarejestrowane dane można wyeksportować do plików .csv, które można zaimportować do specjalistycznego oprogramowania do analizy ilościowej. Zazwyczaj używamy programu Origin (OriginLab Corporation, MA, USA).</li>
 <li>Po zakończeniu eksperymentów zwierzęta są uśmiercane poprzez zwichnięcie karku (myszy) lub zatrucie CO2 (szczury).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Schemat anatomii myszy ilustrujący etapy i identyfikację narządów rozrodczych." src="/files/ftp_upload/3869/3869fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd laparotomii. A) Umieszczenie szczura w pozycji na plecach. B) Ogolenie i antyseptyczne przygotowanie pola operacyjnego. C) Nacięcie skóry. D) Nacięcie mięśni brzusznych i odsłonięcie pęcherza moczowego.
<img alt="Schemat elektrostatyki balonów; wizualizacja ładunku statycznego; ustawienie eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3869/3869fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Szew kaloszowy.
<img alt="Schemat cewnikowania pęcherza przedstawiający etapy nakłucia, wprowadzenia, szycia i uszczelniania." src="/files/ftp_upload/3869/3869fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Implantacja cewnika.
<img alt="Schemat procesu operacji u gryzoni: implantacja cewnika, zamknięcie mięśnia, tunelowanie, zamknięcie skóry." src="/files/ftp_upload/3869/3869fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Tunelowanie cewnika.
Przykłady pomiarów ciśnienia uzyskane podczas wlewu dokanałowego soli fizjologicznej u świadomego szczura oraz znieczulonej myszy przedstawiono na Rysunku 5. Z sygnału ciśnienia można wyodrębnić wiele parametrów (np. odstęp między skurczami, ciśnienie podstawowe i ciśnienie progowe). Szczegółowe opisy tych parametrów znajdują się w publikacjach Andersson et al. (ref 4) oraz Yoshiyama et al. (ref 10).
Niedawno wykorzystaliśmy cystometrię do zidentyfikowania celów molekularnych olejku musztardowego (MO), wysoce reaktywnego związku, który od dawna jest stosowany w modelach eksperymentalnych zapalenia i hiperalgezji narządów trzewnych, takich jak pęcherz moczowy11,12. Wlewy dokanałowe 10 mM MO wywołały silny wzrost częstotliwości mikcji (skrócenie odstępu międzyskurczowego) u myszy typu dzikiego (Rycina 6A, B) oraz zmniejszenie objętości wydalonego moczu6. Co ciekawe, MO wywołało podobne zmiany u myszy z deficytem receptora MO TRPA1. Z kolei MO wywołało znacznie słabsze zmiany parametrów cystometrycznych u myszy Trpv1 KO niż u myszy WT i nie wywołało żadnego efektu u myszy Trpa1/Trpv1 KO. Wraz z pomiarami uwalniania peptydy związanego z genem kalcytoniny (CGRP)6, dane te wykazują, że TRPV1 może odgrywać kluczową rolę w podrażnieniu trzewnym indukowanym przez MO.
<img alt="Analiza ciśnienia w pęcherzu świadomego szczura i znieczuplonej myszy; wykres przedstawia odstępy między skurczami." src="/files/ftp_upload/3869/3869fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Reprezentatywne zapisy ciśnienia wewnątrz pęcherza zarejestrowane u świadomej samicy szczura (A) oraz u znieczulonej samicy myszy (B). Najniższe ciśnienie zdefiniowano jako „ciśnienie bazowe” (czerwone strzałki). Ciśnienie na koniec fazy napełniania zaznaczono niebieskimi strzałkami. Objętość płynu wprowadzonego między tymi punktami, podzielona przez różnicę ciśnień, pozwala na obliczenie podatności ściany pęcherza (podatność = objętość wprowadzonego płynu/(ciśnienie progowe - ciśnienie bazowe). „Odstęp między skurczami” (ICI) to czas pomiędzy dwoma skurczami opróżniającymi.
 
<img alt="Analiza ekspresji genów; wykres porównujący Trpa1, Trpv1, typ dziki; względna częstotliwość w czasie." src="/files/ftp_upload/3869/3869fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Wpływ wlewu dokanałowego olejku musztardowego na wzorzec cystometryczny u myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem Trpa1, Trpv1 i Trpa1/Trpv1. (A) Reprezentatywne przykłady zmian ciśnienia wewnątrz pęcherza zarejestrowane u myszy WT, Trpa1 KO, Trpv1 KO oraz Trpa1/Trpv1 KO w odpowiedzi na infuzję soli fizjologicznej i 10 mM MO. (B) Przebieg czasowy średniej chwilowej częstotliwości mikcji przed i podczas wlewu dokanałowego MO. Dla wszystkich myszy dane zostały znormalizowane do średniej częstotliwości uzyskanej podczas infuzji soli fizjologicznej. Dane te zostały zaadaptowane z pracy Everaerts et al. (ref 6), za zgodą wydawnictwa Elsevier.

<ol><li>Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+bladder+sensing%3A+Tr%28i%29ps+in+urology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol.+Urodyn%22%5BJournal%5D)">On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology.</a> Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).</li>
<li>Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+and+their+use+in+understanding+lower+urinary+tract+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol.+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction.</a> Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).</li>
<li>Gevaert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+transient+receptor+potential+cation+channel+TRPV4+impairs+murine+bladder+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding.</a> J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).</li>
<li>Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+urodynamic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol.+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Rodent models for urodynamic investigation.</a> Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).</li>
<li>Everaerts, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+cation+channel+TRPV4+improves+bladder+function+in+mice+and+rats+with+cyclophosphamide-induced+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).</li>
<li>Everaerts, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor+TRPV1+is+a+crucial+mediator+of+the+noxious+effects+of+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil.</a> Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).</li>
<li>Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+LY274614%2C+a+competitive+NMDA+receptor+antagonist%2C+on+the+micturition+reflex+in+the+urethane-anaesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat.</a> Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).</li>
<li>Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+MK-801+on+the+micturition+reflex+in+the+rat--possible+sites+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).</li>
<li>Boudes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+a+Chronic+Cyclophosphamide-Induced+Overactive+Bladder+Model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol.+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice.</a> Neurourol. Urodyn. , (2011).</li>
<li>Yoshiyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-related+differences+in+activity+of+lower+urinary+tract+in+response+to+intravesical+acid+irritation+in+decerebrate+unanesthetized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).</li>
<li>McMahon, S. B., Abel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+study+of+visceral+pain+states%3A+chronic+inflammation+of+the+chronic+decerebrate+rat+urinary+bladder+by+irritant+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals.</a> Pain. 28, 109-127 (1987).</li>
<li>Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+channel+A1+involved+in+sensory+transduction+of+rat+urinary+bladder+through+C-fiber+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway.</a> Urology. 70, 826-831 (2007).</li>
<li>Streng, T., Santti, R., Talo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+female+and+male+rat+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol.+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in female and male rat voiding.</a> Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).</li>
<li>Igawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystometric+findings+in+mice+lacking+muscarinic+M2+or+M3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors.</a> J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).</li>
<li>Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrusor+responses+to+prostaglandin+E2+and+bladder+outlet+obstruction+in+wild-type+and+Ep1+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice.</a> J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+lower+urinary+tract+in+mice+lacking+alpha1d-adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor.</a> J. Urol. 174, 370-374 (2005).</li>
<li>May, V., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+dysfunction+and+altered+somatic+sensitivity+in+PACAP-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice.</a> J. Urol. 183, 772-779 (2010).</li>
<li>Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urodynamic+properties+and+neurotransmitter+dependence+of+urinary+bladder+contractility+in+the+BK+channel+deletion+model+of+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj technika cystometrii pozwala na wykonywanie pomiarów funkcji pęcherza in vivo w modelach zwierzęcych. Szczury są prawdopodobnie najczęściej wykorzystywanym modelem zwierzęcym. Myszy są trudniejsze w obsłudze, ale oferują zaletę możliwości stosowania zwierząt manipulowanych genetycznie. Ze względu na trudności techniczne związane z wykorzystaniem myszy przytomnych, które mają tendencję do wysokiej aktywności, co prowadzi do poluzowania wszczepionego cewnika i zmian ciśnienia w jamie brzusznej,...

<table><tbody><tr><td>uretan</td><td>Urethane, Sigma-Aldrich</td><td>315419</td><td>karcynogen grupy 2B</td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Isoba, Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cewnik polietylenowy</td><td>Przewody polietylenowe Intramedic PE50, Becton Dickinson</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop chirurgiczny</td><td>Op-Mi 6, Carl Zeiss</td><td>Op-Mi 6</td><td></td></tr><tr><td>szew typu woreczkowy</td><td>Prolene 6/0, Ethicon</td><td>8610H</td><td></td></tr><tr><td>szew powięzi i skóry</td><td>Ethilon 4/0 lub 5/0, Ethicon</td><td>662G lub 661G</td><td></td></tr><tr><td>pooperacyjne leki przeciwbólowe</td><td>Temgesic, Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>dawka dla szczurów: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>wzmacniacz</td><td>monitor 78534c, Hewlett Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wagi analityczne i oprogramowanie do akwizycji danych z wag</td><td>FZ 300i, A&amp;amp;D</td><td>FZ-300i</td><td></td></tr><tr><td>pompy infuzyjne</td><td>pompa 33, Harvard apparatus</td><td>HA33</td><td></td></tr><tr><td>system rejestracji cystometrii</td><td>Dataq instruments, seria DI-730 oraz Windaq/Lite</td><td>DI-730-USB Windaq/Lite</td><td></td></tr><tr><td>rejestracja temperatury</td><td>termometr Fluke 52 KJ</td><td>52 KJ</td><td></td></tr><tr><td>przetworniki ciśnienia</td><td>Edwards Lifesciences, zestaw do monitorowania ciśnienia</td><td>T322247A</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensytywności pęcherza moczowego

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

Dolne drogi moczowe (LUT) pełnią funkcję dynamicznego zbiornika, który jest w stanie magazynować mocz i efektywnie go wydalać w dogodnym czasie. Podczas magazynowania moczu pęcherz jest jednak przez dłuższy czas narażony na kontakt z produktami przemiany materii. Dzięki działaniu jako szczelna bariera, wyściółka nabłonkowa LUT, czyli urothelium, zapobiega reabsorpcji szkodliwych substancji. Co więcej, drażniące substancje chemiczne stymulują unerwienie nocyceptywne pęcherza i inicjują skurcze mikcyjne, które usuwają jego zawartość. Co ciekawe, wrażliwość pęcherza na drażniące substancje chemiczne była z sukcesem wykorzystywana w praktyce klinicznej poprzez wlewanie do pęcherza agonistów TRPV1, takich jak kapsaicyna, w celu leczenia neurogennej nadaktywności pęcherza1. Podkreśla to zasadność postrzegania pęcherza jako organu chemosensorycznego i skłania do dalszych badań klinicznych. Jednak kwestie etyczne znacznie ograniczają możliwości przeprowadzania u ludzi inwazyjnych pomiarów, które są niezbędne do wyjaśnienia podstaw molekularnych farmakologii klinicznej LUT. Sposobem na przełamanie tego ograniczenia jest zastosowanie kilku modeli zwierzęcych2. W niniejszej pracy opisujemy wdrożenie cystometrii u myszy i szczurów – techniki umożliwiającej pomiar ciśnienia wewnątrz pęcherza w warunkach kontrolowanej perfuzji pęcherza.
	Po laparotomii w kopule pęcherza moczowego implantuje się cewnik, który jest prowadzony podskórnie do obszaru międzyłopatkowego. Następnie pęcherz można napełniać w kontrolowanym tempie, pozostawiając cewkę moczową wolną do micturition. Podczas powtarzających się cykli napełniania i opróżniania można mierzyć ciśnienie wewnątrz pęcherza za pomocą zaimplantowanego cewnika. W ten sposób zmiany ciśnienia mogą zostać ilościowo określone i przeanalizowane. Co więcej, jednoczesny pomiar objętości wydalonego moczu pozwala odróżnić skurcze opróżniające od skurczów nieopróżniających3.
	Warto zaznaczyć, że ze względu na różnice w kontroli mikcji między gryzoniami a ludźmi, pomiary cystometryczne u tych zwierząt mają ograniczoną wartość translacyjną4. Niemniej jednak są one niezwykle przydatne w badaniu patofizjologii i farmakologii pęcherza w eksperymentalnych warunkach przedklinicznych. Niedawne badania z wykorzystaniem tej techniki ujawniły kluczową rolę nowych cząsteczek w mechanicznych i chemicznych właściwościach sensorycznych pęcherza.

Cystometria jest wydajną techniką pomiaru funkcji pęcherza moczowego u małych zwierząt in vivo. Do pęcherza prowadzona jest ciągła infuzja z szybkością kontrolowaną poprzez cewnik wewnątrz pęcherza, podczas gdy cewka moczowa pozostaje wolna, aby umożliwić mikcję. Pozwala to na wielokrotne napełnianie i opróżnianie pęcherza, przy jednoczesnym rejestrowaniu ciśnienia wewnątrz pęcherza oraz objętości wydalonego moczu.

Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensytywności pęcherza moczowego

Dolne drogi moczowe (LUT) pełnią funkcję dynamicznego zbiornika, który jest w stanie magazynować mocz i wydalać go w sposób efektywny w dogodnym czasie. Podczas gdy ...

Celem niniejszej procedury jest określenie wpływu związków chemicznych na funkcje magazynowania i opróżniania pęcherza moczowego. Jest to realizowane poprzez wcześniejszą implantację cewnika do pęcherza. Po krótkim okresie rekonwalescencji przez cewnik podaje się roztwór kontrolny przez 30 minut.Podczas gdy ciśnienie wewnątrz pęcherza i objętość oddawanego moczu są rejestrowane przez kolejne 30 minut, zwierzęciu podaje się badany związek. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, w jaki sposób substancje drażniące wpływają na wzorzec mikcji poprzez analizę częstotliwości oddawania moczu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rejestracja kurczliwości izolowanego pęcherza, jest możliwość badania funkcji tego narządu w warunkach bardziej fizjologicznych.Na przykład zachowane zostają funkcje regulacyjne ośrodkowego układu nerwowego. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy operacji są trudne do opanowania ze względu na szereg szczegółów technicznych i manewrów, które należy przestrzegać, aby zapewnić sukces eksperymentu. Aby przygotować rurkę do implantacji w pęcherzu, należy najpierw odciąć rurkę PE 50 o żądanej długości i nałożyć mały biały fragment cewnika 18 G na cewnik główny.Następnie utworzyć mały mankiet na końcu, opalając jeden koniec rurki, i przemyć ją solą fizjologiczną, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Teraz wprowadzić znieczulenie u samicy szczura w wieku od 10 do 12 tygodni za pomocą izofluranu. Po wprowadzeniu znieczulenia ustawić poziom podtrzymujący izofluranu.Ułóż zwierzę na plecach i załóż małą maskę anestezjologiczną wykonaną z strzykawki 10 cc. Po zgoleniu sierści z brzucha i zdezynfekowaniu skóry przystąp do operacji. Poniższą procedurę operacyjną przeprowadza się w ten sam sposób zarówno u szczurów, jak i u myszy.Zacznij od wykonania laparotomii w linii środkowej poniżej pępka w celu odsłonięcia pęcherza moczowego. Następnie przejdź do najkrytyczniejszego etapu operacji. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj szew typu „marszczący” (purse string) w kopule pęcherza, używając niewchłanialnej nici monofilamentowej o rozmiarze 6/0.Następnie, używając igły, wykonaj niewielką cystostomię wewnątrz szwu zaciskowego. Przez ten otwór wprowadź cewnik PE 50 z balonikiem. Cieńsze cewniki, takie jak PE 10, mogą wykazywać wyższy i bardziej zmienny opór, dlatego nie są zalecane.Zabeziecz szew purse-string wokół rurki, używając węzła chirurgicznego. Następnie delikatnie wyciągnij cewnik na zewnątrz, aż końcówka z mankietem znajdzie się bezpośrednio pod szwem. Kawałek cewnika o rozmiarze 18G należy przesunąć w stronę szwu, aby zapobiec wyciekom.Sprawdź, czy nie występują przecieki między cewnikiem a pęcherzem, delikatnie wlewając sól fizjologiczną. Ewentualne przecieki uszczelnij dodatkowymi szwami.Następnie zamknij mięśnie brzucha, używając szwów monofilamentowych, pozostawiając przejście dla cewnika w górnej części nacięcia. Poprowadź cewnik do obszaru międzyłopatkowego, wykorzystując pusty metalowy pręt, aby zapobiec przegryzaniu rurki przez zwierzęta. Po operacji pręt metalowy powinien zostać umieszczony pod skórą, powyżej mięśni brzusznych i grzbietowych.Przesuń pręt podskórnie przez ciało zwierzęcia do obszaru międzyłopatkowego. Zakończ zabieg, zszywając mięśnie brzucha oraz skórę niewchłanialnymi szwami monofilamentowymi. Obecnie kluczowe jest sprawdzenie drożności i stabilności wszczepionego cewnika poprzez przemycie go roztworem soli fizjologicznej.Roztwór infuzyjny powinien wypływać z pęcherza przez cewkę moczową. Po podaniu leku przeciwbólowego podskórnie, zamknąć zewnętrzny koniec cewnika folią plastikową i przymocować cewnik do skóry w dolnej części grzbietu szczura. Na koniec pozostawić zwierzę do wybudzenia na 30 minut.Przed rozpoczęciem cytometrii należy upewnić się, że instrumenty zostały odpowiednio skalibrowane. Umieść szczura w klatce metabolicznej nad naczyniem zawierającym olej, które spoczywa na wadze cyfrowej. Następnym krokiem jest połączenie wszczepionego cewnika z zaworem trójdrożnym za pomocą złączki Luer.Kurek powinien zostać podłączony do przetwornika ciśnienia oraz pompy infuzyjnej. Przetwornik ciśnienia jest dodatkowo połączony za pomocą wzmacniacza z systemem akwizycji danych oraz komputerem, który za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania rozpoczyna pomiary kontrolne poprzez uruchomienie pompy infuzyjnej w celu wprowadzenia soli fizjologicznej do pęcherza. Przez okres 30 minut klatka metaboliczna jest zawieszona nad wagą cyfrową, która służy do szacowania objętości oddanego moczu szczura.Ciśnienie wewnątrz pęcherza jest rejestrowane podczas jego napełniania i opróżniania. W następnym kroku leki mogą być podawane systemowo lub wewnątrz pęcherza podczas kolejnych 30 minut gromadzenia danych. Po zakończeniu eksperymentu zwierzę powinno zostać uśmiercone.Typowy zapis ciśnienia u szczura wykazuje, że podczas infuzji płynu w pęcherzu następuje powolny wzrost ciśnienia, aż do osiągnięcia określonego progu. Następnie pęcherz kurczy się, a zwieracz cewki moczowej otwiera się, umożliwiając przepływ wprowadzonego roztworu przez cewkę moczową. W ten sposób pęcherz zostaje opróżniony.Skurcz ustanie, a ciśnienie ponownie spadnie do poziomu podstawowego. Dane zebrane od myszy wykazują wszystkie te same cechy. Cytometrię wykorzystano do zidentyfikowania celów molekularnych olejku musztardowego lub mo MO jest wysoko reaktywnym związkiem, który od dawna jest stosowany w modelach eksperymentalnych zapalenia i hiperalgezji narządów trzewnych, takich jak pęcherz moczowy.Zgodnie z oczekiwaniami, wlewek wewnątrzpęcherzowy 10 mM MO wywołał silny spadek interwału skurczowego u myszy typu dzikiego. Co ciekawe, myszy z niedoborem receptora MO TRPA1 wykazały wynik podobny do osobników typu dzikiego w tych samych warunkach. W przeciwieństwie do tego, MO wywołało znacznie słabszą zmianę parametrów systemetrycznych u myszy z knockautem TRPV1 niż u myszy typu dzikiego; myszy z podwójnym knockautem zarówno TRPA1, jak i TRPV1 były niemal niewrażliwe na dawkę MO.Dane sugerują, że TRP V1 może odgrywać kluczową rolę w podrażnieniu trzewnym wywołanym przez MO. Średnia chwilowa częstotliwość mikcjowania przed i w trakcie wlewu dounaczniowego MO potwierdza te dane. Średnia częstotliwość jest określona względem wlewu soli fizjologicznej.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie, aby cewnik pozostał mocno przymocowany do pęcherza, co zapobiegnie wyciekowi wlewanego roztworu do jamy brzusznej. Po obejrzeniu tego filmu należy posiąść właściwą wiedzę na temat pomiaru ciśnienia wewnątrz pęcherza, co obejmuje implantację cewnika w pęcherzu oraz umieszczenie zwierząt budzących się lub znieczulonych na stole cytometrycznym przy kontrolowanej perfuzji pęcherza.

the-use-cystometry-small-rodents-study-bladder

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: Badanie chemosensacji pęcherza

Etapy chirurgiczne powiększenia pęcherza moczowego opisano z wykorzystaniem rusztowań 3-D w modelach mysich i szczurzych. W celu przetestowania skuteczności konfiguracji biomateriałów do zastosowania w powiększeniu pęcherza przedstawiono techniki cystometrii przeprowadzanej zarówno u zwierząt w stanie czuwania, jak i znieczulonych.

Ocena biomateriałów do augmentacji pęcherza moczowego z wykorzystaniem analiz cystometrycznych w różnych modelach gryzoni

W tym filmie opisujemy procedurę opartą na cewniku, która ma na celu opróżnienie i przepłukanie pęcherza moczowego modelu myszy. Tak przygotowana mysz może być następnie wykorzystana do dalszych procedur eksperymentalnych.

Wyczerpanie moczu i płukanie pęcherza moczowego w modelu mysim: procedura oparta na cewniku do opróżniania i mycia mysiego pęcherza moczowego

Około 3-8 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych cierpi na śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego/zespół bólu pęcherza moczowego (IC/BPS), wyniszczający stan charakteryzujący się częściowo bólem miednicy. W celu zbadania udziału układu nerwowego w tym stanie, stosuje się fizjologiczny model bólu pęcherza moczowego u myszy i szczurów.

Wzdęcie pęcherza moczowego wywołało reakcje trzewnomotoryczne jako model bólu pęcherza moczowego u myszy

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

To badanie opisuje procedury chirurgiczne i techniki eksperymentalne do wykonywania cystometrii na jawie u swobodnie poruszającej się myszy. Ponadto dostarcza dowodów eksperymentalnych wspierających jego optymalizację i standaryzację.

Ocena procedury wykonywania cystometrii w stanie czuwania w modelu mysim

Ten protokół po pierwsze opisuje procedurę chirurgiczną polegającą na stałym wszczepieniu cewnika do pęcherza moczowego w połączeniu z zewnętrznymi elektrodami zwieracza cewki moczowej, a po drugie, pomiar funkcji pęcherza moczowego i zewnętrznego zwieracza cewki moczowej u wszczepionych obudzonych zwierząt.

Pomiary cystometryczne i zewnętrznego zwieracza cewki moczowej u obudzonych szczurów z wszczepionym cewnikiem i elektrodami umożliwiającymi wielokrotne pomiary

Opisujemy użycie ultradźwięków o wysokiej częstotliwości z obrazowaniem kontrastowym jako metody pomiaru objętości pęcherza, grubości ściany pęcherza, prędkości moczu, objętości miki, czasu trwania miki i średnicy cewki moczowej. Strategia ta może być stosowana do oceny dysfunkcji mikcji i skuteczności leczenia w różnych mysich modelach dysfunkcji dolnych dróg moczowych (LUTD).

Ultrasonografia dróg moczowych dorosłego mężczyzny w celu badania czynnościowego moczu

Ten protokół opisuje procedurę pomiaru stężenia ATP w świetle pęcherza moczowego u znieczulonego gryzonia.

In vivo (in vivo) Pomiar luminalny wywołanego rozdęciem urotelialnego uwalniania ATP u gryzoni

Ten artykuł opisuje nową metodę badania zachowania myszy podczas mikcji poprzez włączenie monitoringu wideo do konwencjonalnego testu pustego miejsca. Takie podejście dostarcza czasowych, przestrzennych i wolumetrycznych informacji na temat zdarzeń mikcji i szczegółów zachowania myszy podczas jasnych i ciemnych faz dnia.

Test pustej przestrzeni w czasie rzeczywistym

Ten protokół zawiera przewodnik do impregnacji skóry cyjanoakrylem, aby zapobiec wchłanianiu moczu przez sierść i skórę. Zawiera instrukcję nakładania kleju na skórę, wszczepiania cewnika do pęcherza moczowego oraz elektrody do cystometrii i zapisy elektromiografii zewnętrznego zwieracza cewki moczowej u obudzonych myszy.

Optymalizacja technik urodynamicznych myszy w celu zwiększenia dokładności

Poznaj metodę cystometrii u małych gryzoni do badania chemosensacji pęcherza moczowego. Technika ta pozwala mierzyć ciśnienie wewnątrz pęcherza i objętość wydalanego moczu w warunkach fizjologicznych.

Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensytywności pęcherza moczowego

Przeglądaj więcej filmów