Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensytywności pęcherza moczowego

Celem niniejszej procedury jest określenie wpływu związków chemicznych na funkcje magazynowania i opróżniania pęcherza moczowego. Jest to realizowane poprzez wcześniejszą implantację cewnika do pęcherza. Po krótkim okresie rekonwalescencji przez cewnik podaje się roztwór kontrolny przez 30 minut.

Podczas gdy ciśnienie wewnątrz pęcherza i objętość oddawanego moczu są rejestrowane przez kolejne 30 minut, zwierzęciu podaje się badany związek. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, w jaki sposób substancje drażniące wpływają na wzorzec mikcji poprzez analizę częstotliwości oddawania moczu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rejestracja kurczliwości izolowanego pęcherza, jest możliwość badania funkcji tego narządu w warunkach bardziej fizjologicznych.

Na przykład zachowane zostają funkcje regulacyjne ośrodkowego układu nerwowego. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy operacji są trudne do opanowania ze względu na szereg szczegółów technicznych i manewrów, które należy przestrzegać, aby zapewnić sukces eksperymentu. Aby przygotować rurkę do implantacji w pęcherzu, należy najpierw odciąć rurkę PE 50 o żądanej długości i nałożyć mały biały fragment cewnika 18 G na cewnik główny.

Następnie utworzyć mały mankiet na końcu, opalając jeden koniec rurki, i przemyć ją solą fizjologiczną, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Teraz wprowadzić znieczulenie u samicy szczura w wieku od 10 do 12 tygodni za pomocą izofluranu. Po wprowadzeniu znieczulenia ustawić poziom podtrzymujący izofluranu.

Ułóż zwierzę na plecach i załóż małą maskę anestezjologiczną wykonaną z strzykawki 10 cc. Po zgoleniu sierści z brzucha i zdezynfekowaniu skóry przystąp do operacji. Poniższą procedurę operacyjną przeprowadza się w ten sam sposób zarówno u szczurów, jak i u myszy.

Zacznij od wykonania laparotomii w linii środkowej poniżej pępka w celu odsłonięcia pęcherza moczowego. Następnie przejdź do najkrytyczniejszego etapu operacji. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj szew typu „marszczący” (purse string) w kopule pęcherza, używając niewchłanialnej nici monofilamentowej o rozmiarze 6/0.

Następnie, używając igły, wykonaj niewielką cystostomię wewnątrz szwu zaciskowego. Przez ten otwór wprowadź cewnik PE 50 z balonikiem. Cieńsze cewniki, takie jak PE 10, mogą wykazywać wyższy i bardziej zmienny opór, dlatego nie są zalecane.

Zabeziecz szew purse-string wokół rurki, używając węzła chirurgicznego. Następnie delikatnie wyciągnij cewnik na zewnątrz, aż końcówka z mankietem znajdzie się bezpośrednio pod szwem. Kawałek cewnika o rozmiarze 18G należy przesunąć w stronę szwu, aby zapobiec wyciekom.

Sprawdź, czy nie występują przecieki między cewnikiem a pęcherzem, delikatnie wlewając sól fizjologiczną. Ewentualne przecieki uszczelnij dodatkowymi szwami.

Następnie zamknij mięśnie brzucha, używając szwów monofilamentowych, pozostawiając przejście dla cewnika w górnej części nacięcia. Poprowadź cewnik do obszaru międzyłopatkowego, wykorzystując pusty metalowy pręt, aby zapobiec przegryzaniu rurki przez zwierzęta. Po operacji pręt metalowy powinien zostać umieszczony pod skórą, powyżej mięśni brzusznych i grzbietowych.

Przesuń pręt podskórnie przez ciało zwierzęcia do obszaru międzyłopatkowego. Zakończ zabieg, zszywając mięśnie brzucha oraz skórę niewchłanialnymi szwami monofilamentowymi. Obecnie kluczowe jest sprawdzenie drożności i stabilności wszczepionego cewnika poprzez przemycie go roztworem soli fizjologicznej.

Roztwór infuzyjny powinien wypływać z pęcherza przez cewkę moczową. Po podaniu leku przeciwbólowego podskórnie, zamknąć zewnętrzny koniec cewnika folią plastikową i przymocować cewnik do skóry w dolnej części grzbietu szczura. Na koniec pozostawić zwierzę do wybudzenia na 30 minut.

Przed rozpoczęciem cytometrii należy upewnić się, że instrumenty zostały odpowiednio skalibrowane. Umieść szczura w klatce metabolicznej nad naczyniem zawierającym olej, które spoczywa na wadze cyfrowej. Następnym krokiem jest połączenie wszczepionego cewnika z zaworem trójdrożnym za pomocą złączki Luer.

Kurek powinien zostać podłączony do przetwornika ciśnienia oraz pompy infuzyjnej. Przetwornik ciśnienia jest dodatkowo połączony za pomocą wzmacniacza z systemem akwizycji danych oraz komputerem, który za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania rozpoczyna pomiary kontrolne poprzez uruchomienie pompy infuzyjnej w celu wprowadzenia soli fizjologicznej do pęcherza. Przez okres 30 minut klatka metaboliczna jest zawieszona nad wagą cyfrową, która służy do szacowania objętości oddanego moczu szczura.

Ciśnienie wewnątrz pęcherza jest rejestrowane podczas jego napełniania i opróżniania. W następnym kroku leki mogą być podawane systemowo lub wewnątrz pęcherza podczas kolejnych 30 minut gromadzenia danych. Po zakończeniu eksperymentu zwierzę powinno zostać uśmiercone.

Typowy zapis ciśnienia u szczura wykazuje, że podczas infuzji płynu w pęcherzu następuje powolny wzrost ciśnienia, aż do osiągnięcia określonego progu. Następnie pęcherz kurczy się, a zwieracz cewki moczowej otwiera się, umożliwiając przepływ wprowadzonego roztworu przez cewkę moczową. W ten sposób pęcherz zostaje opróżniony.

Skurcz ustanie, a ciśnienie ponownie spadnie do poziomu podstawowego. Dane zebrane od myszy wykazują wszystkie te same cechy. Cytometrię wykorzystano do zidentyfikowania celów molekularnych olejku musztardowego lub mo MO jest wysoko reaktywnym związkiem, który od dawna jest stosowany w modelach eksperymentalnych zapalenia i hiperalgezji narządów trzewnych, takich jak pęcherz moczowy.

Zgodnie z oczekiwaniami, wlewek wewnątrzpęcherzowy 10 mM MO wywołał silny spadek interwału skurczowego u myszy typu dzikiego. Co ciekawe, myszy z niedoborem receptora MO TRPA1 wykazały wynik podobny do osobników typu dzikiego w tych samych warunkach. W przeciwieństwie do tego, MO wywołało znacznie słabszą zmianę parametrów systemetrycznych u myszy z knockautem TRPV1 niż u myszy typu dzikiego; myszy z podwójnym knockautem zarówno TRPA1, jak i TRPV1 były niemal niewrażliwe na dawkę MO.

Dane sugerują, że TRP V1 może odgrywać kluczową rolę w podrażnieniu trzewnym wywołanym przez MO. Średnia chwilowa częstotliwość mikcjowania przed i w trakcie wlewu dounaczniowego MO potwierdza te dane. Średnia częstotliwość jest określona względem wlewu soli fizjologicznej.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie, aby cewnik pozostał mocno przymocowany do pęcherza, co zapobiegnie wyciekowi wlewanego roztworu do jamy brzusznej. Po obejrzeniu tego filmu należy posiąść właściwą wiedzę na temat pomiaru ciśnienia wewnątrz pęcherza, co obejmuje implantację cewnika w pęcherzu oraz umieszczenie zwierząt budzących się lub znieczulonych na stole cytometrycznym przy kontrolowanej perfuzji pęcherza.