May 20th, 2017
To badanie opisuje procedury chirurgiczne i techniki eksperymentalne do wykonywania cystometrii na jawie u swobodnie poruszającej się myszy. Ponadto dostarcza dowodów eksperymentalnych wspierających jego optymalizację i standaryzację.
Ogólnym celem tego zabiegu mikrochirurgicznego jest wszczepienie rurki dopęcherzowej do pęcherza moczowego i zarejestrowanie funkcji dolnych dróg moczowych u obudzonej myszy. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu powtarzalnych danych eksperymentalnych z cystometrii w stanie czuwania oraz w testowaniu funkcji pęcherza moczowego w zdrowych i chorych modelach myszy. Głównym celem tej techniki jest zapewnienie znormalizowanej metody opartej na danych eksperymentalnych do wykonywania cystometrii wypełniającej w modelu mysim.
Aby przygotować rurkę do implantacji, najpierw przetnij siedmiocentymetrowy kawałek rurki pe10 i powoli przesuwaj jeden koniec w kierunku otwartego płomienia, aby wytworzyć rozbłysk, szybko wycofując rurkę, gdy tylko rozwinie się zaostrzenie. Następnie użyj ustawienia niskiej temperatury na pistolecie do klejenia, aby nałożyć trzy krople uniwersalnego gorącego kleju w odległości 4.5, 5 i 5.5 centymetra od rozszerzonego końca tuby. Użyj nożyczek, aby przyciąć nierówności z pęcherzyków kleju.
Nałóż gorący klej na jeden koniec igły o rozmiarze 30, która posłuży do zatkania rurki pe10 po jej wszczepieniu. Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Po wysterylizowaniu górnej części pleców i dolnej części brzucha alkoholem i betadyną, wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie między skalpulą i umieść zwierzę w pozycji leżącej na plecach na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza pokrytej sterylnymi zasłonami pod mikroskopem preparacyjnym.
Teraz wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie skóry brzucha w dolnej linii środkowej. Następnie następuje pasujące nacięcie przez powięź wzdłuż kresy białej i mięśnia, aby odsłonić kopułę i górną połowę pęcherza moczowego. Utrzymując wilgotne wnętrzności brzucha ciepłym solą fizjologiczną, obróć zwierzę na bok, aby uzyskać dostęp do nacięcia na karku.
Przepchnij wąski hemostat podskórnie przez nacięcie, aby uruchomić kanał podskórny z tyłu i kontynuować wzdłuż boku zwierzęcia. Gdy końcówka instrumentu dotrze do dna klatki piersiowej, obróć końcówkę w kierunku linii środkowej po wewnętrznej stronie brzucha i kontynuuj przesuwanie hemostatu, aż końcówka zostanie odsłonięta w nacięciu brzucha pod warstwą mięśniową. Gdy końcówka hemostatyku znajdzie się w nacięciu, ściśnij skórę powyżej ramienia i zastosuj trakcję, aby ustabilizować zwierzę, aż końcówka narzędzia będzie widoczna w nacięciu brzucha.
Teraz użyj hemostatu, aby chwycić nierozszerzony koniec rurki i powoli cofnij hemostat, wyciągając koniec rurki z nacięcia z tyłu szyi i regulując rozszerzony koniec rurki tak, aby leżał bezpośrednio nad kopułą pęcherza. Ustabilizuj pęcherz za pomocą małej rolki niestrzępiącej się chusteczki. Umieść luźno zawiązany, niewchłanialny szew monofilamentowy 6-O na kopule pęcherza.
Używając ręki niedominującej i zakrzywionych mikrokleszczyków Dumonta numer siedem, chwyć kopułę pęcherza moczowego i użyj igły o rozmiarze 21 w dominującej ręce, aby wykonać cystotomię w wierzchołku kopuły. Delikatnie sonduj cystotomię za pomocą zamkniętej pary zakrzywionych mikrokleszczyków numer pięć, aby upewnić się, że cewnik może łatwo przejść przez otwór i umieść rozszerzony koniec cewnika pe10 w pęcherzu, dociskając flarę w dół do szyjki pęcherza, aby nie wyślizgnęła się podczas zabezpieczania. Z opaską monofilamentową umieszczoną z przodu rurki, zaciśnij szew 6-O wokół kopuły pęcherza i rurki jak najwyżej na pęcherzu, aby uniknąć sztucznego zmniejszania pojemności pęcherza.
Alternatywnie, umieść luźny szew ze sznurka torebki na kopule pęcherza, wykonaj cystotomię, jak właśnie pokazano, i włóż rozszerzony koniec cewnika do nakłucia. Następnie zawiąż szew wokół kopuły i rurki, jak pokazano dla szwu płaskiego. W obu przypadkach należy zadbać o zabezpieczenie rurki, nie powodując rozległych obrażeń ściany pęcherza.
Jeśli zostanie pobrana zbyt duża ilość tkanki, pojemność pęcherza zostanie zmniejszona. Jeśli zostanie pobrana za mało, połączenie będzie nieszczelne. Aby sprawdzić szczelność i położenie rurki w pęcherzu, przymocuj strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 30 do dystalnego końca rurki i powoli napełniaj pęcherz 0,1 do 0,2 mililitra 0,9% chlorku sodu, aż w ujściu cewki moczowej pojawi się kropla.
Jeśli uszczelka jest niekompletna, załóż pętlę szwu wokół pęcherza i retie. Następnie opróżnij pęcherz przez aspirację. Jeśli w kopule nie występują żadne nieszczelności, napnij pęcherz za pomocą pary zakrzywionych mikrokleszczyków i delikatnie pociągnij za rurkę, aż flara oprze się o wnętrze kopuły pęcherza.
Ponownie przetestuj uszczelkę, korzystając z wcześniej opisanej metody. Przytnij ogony szwu, usuń rolkę tkanki i przywróć pęcherz do normalnej pozycji. Następnie użyj biegnącego szwu 6-O, aby zamknąć ścianę brzucha w dwóch warstwach.
I delikatnie obróć zwierzę na jego brzuch. Włóż podskórną część metalowej kotwicy do nacięcia śródskopowego i użyj żyłki 6-O, aby zabezpieczyć rurkę i zakotwiczyć za pomocą pionowego szwu materaca. Upewnij się, że pęcherzyk kleju pozostaje nad i pod skórą, aby zapobiec wysunięciu się rurki i przeciąć rurkę około dwóch centymetrów nad skórą.
Następnie delikatnie włóż zatyczkę o rozmiarze 30 do końca rurki, aby zapobiec wyciekaniu moczu. Przed wykonaniem odczytu użyj rurki pe50 do podłączenia pompy infuzyjnej, przetwornika ciśnienia i krętlika manometru 22. Następnie umieść znieczulone zwierzę doświadczalne w pozycji leżącej i wyjmij zatyczkę o rozmiarze 30.
Podłącz linkę do kotwicy, wsuń cewnik pęcherza moczowego do końca pe50 i użyj gorącego kleju, aby utworzyć wodoszczelne uszczelnienie. Umieść mysz na drucianej podłodze. I rozpocznij nagrywanie.
Następnie, gdy zwierzę dojdzie do siebie po znieczuleniu, a ciśnienie w pęcherzu ustabilizuje się, zacznij podawać 0,9% chlorku sodu w tempie 0,6 mililitra na godzinę. Zazwyczaj w drugiej dobie po wprowadzeniu cewnika rozwija się silny obrzęk podśluzówkowy, który zajmuje połowę przekroju poprzecznego pęcherza moczowego, co prowadzi do niedrożności światła. W piątym dniu obrzęk ustępuje całkowicie, pozostawiając obszary podśluzówkowe naciekane komórkami zapalnymi, które częściowo zaatakowały mięśnie.
Największy zakres obrzęku tkanek obserwowany w drugim i trzecim dniu koreluje z odpowiadającym mu behawioralnym oddawaniem moczu przez zwierzęta wykazujące znacznie upośledzoną funkcję pęcherza moczowego w tych punktach czasowych. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z danych histologicznych, częstotliwość mikcji normalizuje się do piątego dnia po operacji. Ciśnienie dopęcherzowe u obudzonego, swobodnie poruszającego się zwierzęcia z minimalnymi artefaktami ruchowymi charakteryzuje się ciśnieniem podstawowym wynoszącym od 10 do 15 centymetrów wody, które może pozostać niezmienione lub może stopniowo wzrastać o nie więcej niż 10 centymetrów wody podczas cyklu napełniania.
Po nim następuje nagły wzrost i spadek ciśnienia w stylu pulsacyjnym podczas mikcji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zminimalizowaniu uszkodzenia pęcherza moczowego, aby zachować fizjologię tkanki.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cystometria napełniania w jednym cyklu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalnej pojemności pęcherza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mikrochirurgicznie wszczepić rurkę do pęcherza moczowego i jak używać cystomety wypełniającej w stanie czuwania do oceny funkcji dolnych dróg moczowych u myszy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
To badanie opisuje procedurę mikrochirurgiczną polegającą na implantacji rurki dopęcherzowej do pęcherza moczowego czujnego myszy. Metoda ta ma na celu standaryzację pozyskiwania powtarzalnych danych eksperymentalnych dla czujnej cystometrii.
Standardized microsurgical techniques for awake cystometry in mouse models enable reproducible assessment of lower urinary tract function, supporting target validation in urology drug discovery. By minimizing movement artifacts and establishing post-operative recovery timelines, this method improves predictive confidence in bladder physiology studies. It facilitates mechanistic de-risking of therapeutic candidates affecting urinary continence, bladder capacity, or voiding patterns in preclinical pipelines.
This method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, particularly for urological indications where bladder function is a key biomarker.