Ocena procedury wykonywania cystometrii w stanie czuwania w modelu mysim

Ogólnym celem tej procedury mikrosurgicalnej jest implantacja rurki wewnątrz pęcherza do pęcherza moczowego oraz rejestracja funkcji dolnych dróg moczowych u czuwającej myszy. Metoda ta może pomóc w pozyskiwaniu powtarzalnych danych eksperymentalnych z cystometrii u czuwających zwierząt oraz w badaniu funkcji pęcherza w zdrowych i chorych modelach mysich. Głównym celem tej techniki jest zapewnienie zstandaryzowanej metody, opartej na danych eksperymentalnych, do przeprowadzania cystometrii napełniania w modelu mysim.

Aby przygotować rurkę do implantacji, należy najpierw odciąć siedmiocentymetrowy odcinek rurki pe10, a następnie powoli zbliżyć jeden koniec do otwartego płomienia, aby utworzyć rozszerzenie, szybko wycofując rurkę natychmiast po jego powstaniu. Następnie, korzystając z niskiego ustawienia temperatury w pistoletcie do kleju, należy nanieść trzy krople uniwersalnego kleju na gorąco w odległości 4,5, 5 i 5,5 cm od rozszerzonego końca rurki. Za pomocą nożyczek należy odciąć nierówności z pęcherzyków kleju.

Nałóż klej na gorąco na jeden koniec igły o rozmiarze 30 G, która posłuży do zatkania rurki pe10 po jej implantacji. Następnie potwierdź brak reakcji na uciśnięcie palca stopy i nałóż maść do oczu zwierzęcia. Po wysterylizowaniu górnej części grzbietu i dolnej części brzucha alkoholem oraz betadyną, wykonaj nacięcie o długości 1,5 centymetra między łopatkami i umieść zwierzę w pozycji na plecach na macie grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, przykrytej sterylnymi obłożeniami, pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie wykonaj cięcie skóry brzucha o długości 1,5 centymetra w dolnej linii pośrodkowej. Następnie wykonaj odpowiadające mu cięcie przez powięź wzdłuż linea alba oraz mięśnie, aby odsłonić kopułę i górną połowę pęcherza moczowego. Utrzymując narządy jamy brzusznej w stanie wilgotnym za pomocą ciepłej soli fizjologicznej, obróć zwierzę na bok, aby uzyskać dostęp do nacięcia w karku.

Wprowadź wąską kleszczykową hemostatykę podskórnie przez nacięcie, aby utworzyć kanał podskórny na grzbiecie, a następnie kontynuuj jego prowadzenie wzdłuż boku zwierzęcia. Gdy końcówka narzędzia dotrze do dolnej krawędzi klatki piersiowej, skieruj ją w stronę linii środkowej wewnątrz jamy brzusznej i przesuwaj hemostatykę dalej, aż jej końcówka pojawi się w nacięciu brzusznym pod warstwą mięśniową. Po wprowadzeniu końcówki hemostatyki do nacięcia, uchwyć skórę powyżej łopatki i pociągnij ją, aby pomóc w stabilizacji zwierzęcia, aż do momentu, gdy końcówka narzędzia będzie widoczna w nacięciu brzusznym.

Następnie należy użyć kleszczyków hemostatycznych, aby uchwycić nierozszerzony koniec cewki i powoli wycofać kleszczyki, wyciągając koniec rurki przez nacięcie z tyłu szyi i ustawiając rozszerzony koniec cewki tak, aby znajdował się bezpośrednio nad kopułą pęcherza. Pęcherz należy ustabilizować, stosując niewielki zwój tkaniny beztkaninowej. Na szczycie kopuły pęcherza należy założyć luźno zawiązany, niewchłanialny szew monofilamentowy 6-O.

Używając niedominującej ręki oraz zakrzywionej mikropincety Dumont nr 7, chwyć kopułę pęcherza i za pomocą igły 21G w dominującej ręce wykonaj cystotomię w wierzchołku kopuły. Delikatnie zbadaj miejsce cystotomii zamkniętą parą zakrzywionych mikropincet nr 5, aby upewnić się, że cewnik może swobodnie przejść przez otwór, a następnie wprowadź rozszerzony koniec cewnika pe10 do pęcherza, dociskając rozszerzenie do szyjki pęcherza, aby nie wysunęło się podczas zabezpieczania. Umieszczając wiązanie monofilamentowe przed rurką, zaciśnij szew 6-O wokół kopuły pęcherza i rurki tak wysoko, jak to możliwe, aby uniknąć sztucznego zmniejszenia pojemności pęcherza.

Alternatywnie można nałożyć luźny szew purse-string na kopułę pęcherza moczowego, wykonać cystotomię w sposób zaprezentowany przed chwilą i wprowadzić rozszerzony koniec cewnika w miejsce nakłucia. Następnie zawiązać szew wokół kopuły i rurki, analogicznie do zaprezentowanego szwu płaskiego. W obu przypadkach należy zadbać o stabilne zamocowanie rurki, unikając przy tym rozległego uszkodzenia ściany pęcherza.

Jeśli pobrano zbyt dużo tkanki, pojemność pęcherza zostanie zmniejszona. Jeśli pobrano zbyt mało, połączenie będzie nieszczelne. Aby sprawdzić szczelność i położenie rurki w pęcherzu, należy podłączyć strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 ml z igłą 30G do dystalnego końca rurki i powoli napełniać pęcherz 0,1 do 0,2 ml 0,9% NaCl, aż w ujściu cewki moczowej pojawi się kropla.

Jeśli uszczelnienie jest niepełne, owiń końce szwów wokół pęcherza i zawiąż je ponownie. Następnie opróżnij pęcherz poprzez aspirację. Jeśli w okolicy kopuły nie wystąpią wycieki, unieruchom pęcherz za pomocą zakrzywionej mikropincety i delikatnie pociągnij za rurkę, aż rozszerzenie oprze się o wewnętrzną stronę kopuły pęcherza.

Ponownie sprawdź szczelność, stosując wcześniej opisaną metodę. Przytnij końce szwu, usuń zwiniętą tkankę i przywróć pęcherz do jego normalnego położenia. Następnie użyj szwu ciągłego 6-O, aby zamknąć ścianę brzuszną w dwóch warstwach.

Następnie delikatnie obróć zwierzę na brzuch. Wprowadź podskórną część metalowej kotwicy do nacięcia międzyłopatkowego i za pomocą nici monofilamentowej 6-O przymocuj rurkę oraz kotwicę szwem materacowym pionowym. Upewnij się, że nad i pod skórą pozostała bańka kleju, aby zapobiec wysunięciu się rurki, a następnie odetnij rurkę około dwóch centymetrów powyżej poziomu skóry.

Następnie ostrożnie wprowadź korek o rozmiarze 30 G do końca rurki, aby zapobiec wyciekowi moczu. Przed wykonaniem pomiaru użyj drenu PE50, aby połączyć pompę infuzyjną, przetwornik ciśnienia oraz obrotkę o rozmiarze 22 G. Następnie umieść zanestetyzowane zwierzę doświadczalne w pozycji brzusznej i usuń korek o rozmiarze 30 G.

Połącz uwięź z kotwicą, wsuń cewnik pęcherza do końca rurki pe50 i użyj kleju na gorąco, aby utworzyć wodoszczelną uszczelkę. Umieść mysz na drucianej podłodze i rozpocznij rejestrację.

Następnie, gdy zwierzę wybudzi się z narkozy, a ciśnienie w pęcherzu się ustabilizuje, należy rozpocząć infuzję 0,9% sodium chloride z prędkością 0,6 milliliters per hour. Typowo, w drugim dniu po wprowadzeniu cewnika, rozwija się silny obrzęk podśluzówkowy zajmujący połowę przekroju poprzecznego pęcherza, co prowadzi do niedrożności światła. W piątym dniu obrzęk całkowicie ustępuje, pozostawiając obszary podśluzówkowe nacieknięte komórkami zapalnymi, które częściowo naciekły warstwę mięśniową.

Największy stopień obrzęku tkanki zaobserwowany w drugim i trzecim dniu koreluje z odpowiadającymi mu zaburzeniami mikcji, przy czym zwierzęta wykazują w tych punktach czasowych znacząco upośledzoną funkcję pęcherza. Zgodnie z danymi histologicznymi, częstotliwość mikcji normalizuje się do piątego dnia po operacji. Ciśnienie wewnątrz pęcherza u budzącego się, swobodnie poruszającego się zwierzęcia przy minimalnych artefaktach ruchowych charakteryzuje się ciśnieniem bazowym od 10 do 15 cm H₂O, które może pozostać niezmienione lub stopniowo wzrosnąć o nie więcej niż 10 cm H₂O podczas cyklu napełniania.

Następnie należy zastosować gwałtowny, pulsacyjny wzrost i spadek ciśnienia podczas opróżniania. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zostać ukończona w ciągu 30 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować uszkodzenia pęcherza w celu zachowania fizjologii tkanki.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak cystometria z napełnianiem jednocyklowym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalnej pojemności pęcherza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat mikrochirurgicznej implantacji rurki do pęcherza moczowego oraz wykorzystania cystometrii napełnianiem u zwierząt w stanie czuwania do oceny funkcji dolnych dróg moczowych u myszy.