Ukierunkowane różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie i scharakteryzowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPS. Komórki IPS można następnie różnicować in vitro w systemie hodowli OP nine DL one, a następnie dojrzewać in vivo u myszy z niedoborem. Lub komórki mogą być genetycznie modyfikowane tak, aby nadmiernie eksprymować OT jeden TCR, a następnie adoptywnie przenoszone w celu rozwoju in vivo.

Po sześciu tygodniach różnicowania in vivo myszy można poddać prowokacji przez wstrzyknięcie dootrzewnowe siedmiu komórek nowotworowych EEG, a następnie można ocenić swoistość antygenową limfocytów T pochodzących z IPS. Ostatecznie komórki IPS mogą różnicować się zarówno w konwencjonalne, jak i specyficzne dla antygenu limfocyty T, z których te ostatnie są w stanie chronić zwierzęta przed prowokacją nowotworową. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zindywidualizowanej immunoterapii nowotworów.

Metoda pozwala na wytworzenie dużej liczby reaktywnych komórek T nowotworu pochodzących z minimalnej ilości krwi pacjenta lub tkanki skórnej W dniu zerowym przenieś pięć razy 10 do czwartych komórek IPS na 100-milimetrową szalkę hodowlaną zawierającą zbiegającą się OP dziewięć, DL jedną monowarstwę komórkową w 20% pożywce FBS alpha MEM w piątym dniu, oczy trypsyny. Następnie odwirować komórki po inkubacji na świeżej 100-milimetrowej naczyniu hodowlanym przez 30 minut i płytce inkubatora o temperaturze 37 stopni, pięć razy 10 do jednej piątej pływających komórek w 20% alfa FBS, pożywce MEM i mysim płaskim trójki ligandu na nowej 100-milimetrowej szalce zawierającej monowarstwę OP dziewięć. DL jedna komórka w ósmym dniu delikatnie pipetuje luźno połączone komórki, odwirować komórki, a następnie przenieść komórki do pojedynczego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej pokrytej zbiegającym się OP dziewięć komórek DL one inkubuje komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez kolejne dwa tygodnie w 22 dniu.

Inkubować odłączone komórki IPS w świeżej pożywce na nowej szalce hodowlanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie usuń około połowy pływających komórek i przepuść je przez nylonowe sitko o grubości 70 mikronów, aby wykluczyć grudki komórek i przemyj powstałą zawiesinę pojedynczej komórki trzykrotnie zimnym PBS. Po trzecim płukaniu ponownie zawieś komórki w PBS w ilości 1,5 razy 10 siódmej komórki na mililitr i utrzymuj komórki na lodzie przed wstrzyknięciem dożylnym.

Umieść czterotygodniową mysz z niedoborem pod światłem podczerwonym, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 26 i pół 200 mikrolitrów zawiesiny komórek i adoptywnie przenieś komórki przez rozszerzoną żyłę ogonową. Trzy tygodnie później po potwierdzeniu eutanazji adoptowanej myszy należy usunąć węzły chłonne i śledzionę po mechanicznym rozbiciu tkanek.

Zawiesinę pojedynczej komórki należy przepłukać buforem do lizy CK, a następnie dwukrotnie przepłukać powstałe cyty mononukleo w zimnym PBS. Następnie, po barwieniu pod kątem markerów powierzchniowych komórek, oceń komórki za pomocą analizy cytometrii przepływowej w dniu zero, użyj odczynnika do transfekcji genu JAMA do transfekcji komórek pakujących z platerowaną płytką E przez noc za pomocą OT jeden MIDR w pierwszym dniu nasiona razy 10 do sześciu komórek IPS do jednego dołka 0,1% wstępnie zakodowanej żelatyny 24-dołkowej w drugim dniu, zebrać pseudowirusa zawierającego S natin z komórek płytki E, a następnie przepuścić go przez filtr 0,4 mikrona, aby wykluczyć potencjalne zanieczyszczenia po odwirowaniu. Przenoszenie komórek w obecności poli mózgu przez jedną godzinę w temperaturze 330 razy G w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Inkubować je przez noc w tej samej temperaturze po powtórzeniu procedury transdukcji. Trypsyna obserwuje transdukowane komórki IPS w czwartym dniu, a następnie po granulowaniu komórki zawieszają komórki w świeżych pożywkach i umieszczają je na wstępnie zakodowanych, napromieniowanych komórkach zasilających snl 7 6 7. Gdy transdukowane komórki osiągną zbieżność, posortuj podwójnie dodatnie komórki GFP i DS czerwono dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Sześć tygodni po adoptywnym transferze komórek IPS wstrzyknij 50 mikrolitrów EEG, siedem komórek thoma do jamy otrzewnej tej samej myszy w 50 dniu prowokacji nowotworem. Użyj zestawu do izolacji ośmiu dodatnich limfocytów T z mil E biotech, aby posortować osiem dodatnich limfocytów T CD ze śledziony i węzłów chłonnych adoptowanego zwierzęcia. Wymieszaj wyizolowane CD osiem dodatnich limfocytów T z napromieniowaną wielkością SPOC od naiwnej czarnej myszy C 57 z sześcioma J, w stosunku 1 do 10 i pulsuj kokulturę z 0,5 mikromola na promil komórek jajowych przez 40 godzin.

Następnie dodaj felden A do komórek przez kolejne cztery godziny. Na koniec oceń populacje komórek za pomocą analizy cytometrii przepływowej Po wyizolowaniu cytów SP z naiwnej myszy C 57 black six J. Podziel zawiesinę komórek na dwie grupy.

Oznacz wysoką grupę CFSE pięcioma mikromolami na promil CFSE i pulsuj komórki 10 mikrogramami na promil peptydu jajowego przez jedną godzinę, znakuj niską grupę A-C-F-S-E 0,5 mikromoli na promil CFSE i nie pulsuj. Wymieszaj 2,5 razy 10 do szóstego, wysokie komórki CFSE z 2,5 razy 10 do szóstego, niskie komórki CFSE w PBS. Następnie przeanalizuj cyty za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji CFSE.

16 godzin po adoptywnym przeniesieniu do myszy będącej przedmiotem zainteresowania Aby policzyć komórki nowotworowe dootrzewnowe w 20 dniu wyzwania guza. Użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18 i pół i zimnym PBS, aby przepłukać jamę otrzewnej. Policz odzyskane komórki nowotworowe w celu identyfikacji komórek naciekających nowotwór.

Usuń guz w późnym stadium wyzwania guza, a następnie pokrój guz na trzy części. Umieść pierwszy fragment guza w fiolce kriogenicznej i umieść fiolkę na suchym lodzie. Natychmiast napraw drugi kawałek formaldehydu.

Trzecią część należy zakonserwować w kondycjonowanym pożywce RPMI 1640 po wysuszeniu na powietrzu kriokonserwowanych skrawków tkanek. Utrwal je w zimnym acetonie na 15 minut po wysuszeniu na powietrzu stałych sekcji przez kolejne 15 minut. Po umyciu myj szkiełka przez pięć minut w PBS.

Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i przykryj skrawki tkanek 30 mikrolitrami 3%B, SA i PBS na 30 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Następnie zestarć bufor blokujący i inkubować skrawki tkanki z 50 mikrolitrową mieszaniną przeciwciała pe anty TCR RV alfa dwa i przeciwciała fitzy anty ova rozcieńczonego w 3% PSA w PBS w wilgotnej komorze przez dwie godziny pod koniec inkubacji. Umyj szkiełka trzykrotnie w zimnym PBS, na koniec zamontuj skrawki za pomocą pożywki montażowej na bazie wody przed fluorescencyjnym badaniem mikroskopowym do analizy cytometrii przepływowej limfocytów T naciekających nowotwór.

Zmiażdż guz w zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie przeanalizuj komórki pod kątem określonych znaczników powierzchni. C, CD, trzy i TCR beta są używane jako markery limfocytów T w celu określenia, czy stymulacja komórek IPS ligandem o wycięciu DL jeden może przyczynić się do ekspresji powierzchni komórek T CD cztery i CD osiem na CD trzy dodatnie TCR r beta dodatnie komórki IPS.

Zwróć uwagę na wykres punktowy po prawej stronie, który pokazuje dzień 22: CD: trzy dodatnie TCR, R, beta dodatnie, CD, cztery ujemne CD, osiem dodatnich, pojedynczych dodatnich limfocytów T wygenerowanych z komórek IPS in vitro. Ponadto pojedyncze dodatnie komórki pochodzące z komórek IPS z poprzedniego rysunku wytwarzały interleukinę drugą i interferon gamma po stymulacji in vitro przez powlekane płytką przeciwciała anty CD three i rozpuszczalne przeciwciała anty CD 28, potwierdzające, że limfocyty T pochodzące z komórek IPS są funkcjonalne po adoptywnym transferze do myszy biorców. Większość komórek IPS transdukowanych genem TCR uległa różnicowaniu w CD eight dodatnie CTL, które odpowiedziały in vitro na stymulację peptydową poprzez wydzielanie interleukiny drugiej i interferonu gamma na tych wykresach kropkowych z połączonych komórek węzłów chłonnych i śledziony.

CD osiem dodatnich V beta pięć dodatnich limfocytów T wygenerowano u myszy adoptywnie przeniesionych za pomocą komórek IPS transdukowanych TCR, ale nie kontrolnych. Populacje CD osiem dodatnich V beta pięć były dodatnie pod względem wewnątrzkomórkowego barwienia cytokiny dla produkcji interleukiny drugiej i interferonu gamma reprezentowanego na tych histogramach przez ciemne linie w porównaniu z zacienionymi histogramami kontrolnymi izotypu, co wskazuje, że CTL pochodzące z IPS były funkcjonalne. Dane te pokazują, że wysokie komórki CFSE pulsowały z eptydem reprezentowanym przez piki po prawej stronie na każdym wykresie i niskimi komórkami kontrolnymi CFSE reprezentowanymi przez piki po lewej stronie, które wstrzyknięto myszom 10 tygodni po transferze komórek IPS lub jeden dzień po transferze O OT jeden CTL.

CTL pochodzące z IPS specyficzne dla antygenu reagowały na stymulację antygenową i wykazywały aktywność cytotoksyczną, na co wskazuje brak tutaj wysokich komórek CFSE. Komórki IPS transdukowane w genie TCR OT adoptywnie przeniesiono do sześciu czarnych myszy C 57, a następnie myszy poddano prowokacji EEG, w dniu 20 policzono komórki nowotworowe w jamie otrzewnej. Należy zwrócić uwagę na znaczne zmniejszenie liczby komórek nowotworowych u myszy, które otrzymały TCR TRANSDUCED IPS w porównaniu z grupami kontrolnymi.

Co najważniejsze, adoptywny transfer komórek IPS transdukowanych przez TCR spowodował infiltrację nadreaktywnych CTL do tkanek nowotworowych i chronił zwierzęta przed prowokacją nowotworową, jak widać w tym barwieniu h i e tkanek nowotworowych odzyskanych od 30 do 35 dni po guzach prowokacyjnych guza od myszy adoptywnie przeniesionych z komórkami transdukowanymi TCR lub CTL OT one, ale nie pozorowanymi wstrzyknięciami lub kontrolą. Transdukowane komórki były infiltrowane przez komórki zapalne, jak wskazują tutaj czerwone strzałki. Stwierdzono, że specyficzne dla komórek jajowych V alfa dwa dodatnie CTL w kolorze czerwonym naciekają komórki jajowe wyrażające tkanki nowotworowe w kolorze zielonym.

Podczas gdy guzy u myszy z grup kontrolnych miały mniej komórek naciekających guz lub nie miały ich wcale na tym rysunku, zawiesiny pojedynczych komórek z tkanek nowotworowych analizowano pod kątem ekspresji dodatniej V alfa dwa i dodatniej V beta pięć za pomocą cytometrii przepływowej po bramkowaniu w populacji CD 8 dodatniej. Należy zauważyć, że tkanki nowotworowe od myszy adoptywnie przenoszonych za pomocą komórek IPS transdukowanych TCR wykazywały najwyższy poziom komórek naciekających nowotwór, podczas gdy guzy od myszy, które otrzymały kontrolę. Transdukowane IPS nie wykazywały infiltracji przez specyficzne dla komórek jajowych CD osiem dodatnich limfocytów T.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować limfocyty T specyficzne dla antygenu z komórek IPS i jak oceniać funkcje komórek T pochodzących z IPS.