Name: Ukierunkowane różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek iPS w limfocyty T na układzie OP9-DL1 in vitro i dojrzewanie in vivo w myszach rag-deficytowych. Technika umożliwia generowanie antygenowo specyficznych komórek T do immunoterapii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Shinyę Yamanakę (Kyoto University) za udostępnienie linii komórkowej iPS-MEF-Ng-20D-17, dr. Dario Vignaliemu (St. Jude Children's Research Hospital) za wsparcie w zakresie konstruktu OT1-2A•pMig II, dr. Juan Carlosowi Zuniga-Pfluckerowi (Department of Immunology, University of Toronto) za udostępnienie linii komórkowej OP9-DL1 oraz dr. Kentowi E. Vrannie (Department of Pharmacology, Penn State University College of Medicine) za pomoc w zaprojektowaniu niniejszego badania. Projekt ten jest finansowany z grantów o numerach K18CA151798 z National Cancer Institute, Barsumian Trust oraz Melanoma Research Foundation (J. Song).

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
<li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific%2C+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
<li>Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoztug%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W przypadku terapii opartych na ACT, optymalnym podejściem jest generowanie in vitro dużej liczby wysoce reaktywnych limfocytów T swoistych dla Ag w celu ponownego wprowadzenia ich in vivo. Chociaż nasza metoda in vitro pozwala na uzyskanie funkcjonalnych limfocytów T z komórek iPS, znaczna liczba komórek pochodzących z iPS obumiera w ciągu czterech tygodni, szczególnie w czwartym tygodniu. Wnioskujemy, że sygnały przeżycia z szlaku Notch pośredniczone przez DL1, a także IL-7 i FLt3L, są niewys...

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7-&lt;em&gt;Rag1&lt;sup&gt;tm1Mom&lt;/sup&gt;/J&lt;/em&gt;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002216</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD3 (2C11)</td><td>BD Biosciences</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD28 (37.51)</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD3 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD4 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD8 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD25 (3C7)</td><td>BioLegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD44 (1M7)</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD117 (2B8)</td><td>BioLegend</td><td>105812</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TCR-&amp;#946; (H57597)</td><td>BioLegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IL-2 (JES6-5H4)</td><td>BioLegend</td><td>503810</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IFN-&amp;#947; (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505822</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Integrated Sciences</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji DNA</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-236</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący ACK</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>PeproTech Inc</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>PeproTech Inc</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FITC-anty-OVA</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>200-4233</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do permeabilizacji</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,4 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórkowy Moflo</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Calibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restryktor dla myszy</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów t

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptywne przeniesienie komórek (ACT) antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) CD8+ stanowi obiecującą metodę leczenia wielu rodzajów nowotworów złośliwych 1. CTL mogą rozpoznawać komórki nowotworowe poprzez oddziaływanie antygenów guza z receptorami komórek T (TCR), a następnie uwalniać cytotoksyny oraz cytokiny w celu zniszczenia komórek nowotworowych. Wiadomo, że słabo zróżnicowane CTL o fenotypie podobnym do komórek pamięci centralnej (określane jako wysoce reaktywne) stanowią optymalną populację dla immunoterapii opartej na ACT, ponieważ posiadają one wysoki potencjał proliferacyjny, są mniej podatne na apoptozę niż komórki bardziej zróżnicowane i wykazują większą zdolność do odpowiedzi na cytokiny homeostatyczne 2-7. Jednak ze względu na trudności w uzyskaniu od pacjentów dużej liczby takich CTL, istnieje pilna potrzeba znalezienia nowego podejścia do generowania wysoce reaktywnych, Ag-swoistych CTL dla skutecznych terapii opartych na ACT.
Transdukcja TCR samoodnawiających się komórek macierzystych w celu rekonstrukcji immunologicznej wykazuje potencjał terapeutyczny w leczeniu chorób 8-10. Jednakże podejście polegające na pozyskiwaniu embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) od pacjentów nie jest wykonalne. Choć wykorzystanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) do celów terapeutycznych znajduje szerokie zastosowanie w klinice 11-13, HSCs charakteryzują się ograniczoną zdolnością do różnicowania i proliferacji, a ich namnażanie w hodowlach komórkowych in vitro jest utrudnione 14-16. Niedawno opracowana technologia komórek iPS oraz rozwój systemów in vitro do dostarczania genów umożliwiają generowanie komórek iPS od pacjentów bez konieczności stosowania metod chirurgicznych. Ponadto, podobnie jak ESCs, komórki iPS posiadają nieograniczoną zdolność do proliferacji in vitro oraz wykazują zdolność do różnicowania w komórki krwiotwórcze. W związku z tym komórki iPS mają większy potencjał do wykorzystania w immunoterapii opartej na ACT w porównaniu do ESCs lub HSCs.
W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania limfocytów T z komórek iPS in vitro oraz programowania in vivo swoistych dla antygenu CTL z komórek iPS w celu promowania immunologicznego nadzoru nad nowotworami. Stymulacja in vitro ligandem Notch indukuje różnicowanie komórek iPS w komórki T, a transdukcja genu TCR skutkuje różnicowaniem się komórek iPS w swoiste dla antygenu komórki T in vivo, co zapobiega wzrostowi guza. W ten sposób demonstrujemy swoiste dla antygenu różnicowanie komórek T z komórek iPS. Nasze badania zapewniają potencjalnie bardziej wydajne podejście do generowania swoistych dla antygenu CTL dla terapii opartych na ACT i ułatwiają opracowanie strategii terapeutycznych w leczeniu chorób.

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Adoptywny transfer komórek (ACT) antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) CD8+ jest obiecującą metodą leczenia wielu rodzajów nowotworów złośliwych 1. Limfocyty CTL mogą ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie i charakterystyka limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek IPS). Komórki IPS mogą być następnie różnicowane in vitro w systemie hodowlanym OP9 DL1, a następnie dojrzewać in vivo w myszy z niedoborem rag. Alternatywnie komórki mogą zostać zmodyfikowane genetycznie w celu nadekspresji TCR OT-I, a następnie przeniesione adoptywnie w celu rozwoju in vivo.Po sześciu tygodniach różnicowania in vivo myszy można poddać próbie poprzez dosytatyczne wstrzyknięcie komórek nowotworowych EEG seven, a następnie ocenić specyficzność antygenową limfocytów T pochodzących z iPS. Ostatecznie komórki iPS mogą różnicować się zarówno w konwencjonalne, jak i specyficzne antygenowo limfocyty T, z których te drugie są zdolne chronić zwierzęta przed wyzwaniem nowotworowym. Zastosowania tej techniki rozszerzają się w kierunku indywidualizowanej immunoterapii nowotworów.Metoda ta pozwala na generowanie dużej liczby reaktywnych przeciwko nowotworowi limfocytów T pochodzących z minimalnej ilości krwi pacjenta lub tkanki skóry. W dniu zerowym przenieść 5×10⁴ komórek iPS na 100-milimetrową płytkę hodowlaną zawierającą konfluentną monowarstwę komórek OP9-DL1 w pośrodku alpha-MEM z 20% FBS. W dniu piątym przeprowadzić trypsynizację. Następnie odwirować komórki po inkubacji na świeżej 100-milimetrowej płytce hodowlanej przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37°C. Wysiać 5×10⁵ zawiesinowych komórek w pośrodku alpha-MEM z 20% FBS i ligandem mouse flt3 na nową 100-milimetrową płytkę zawierającą monowarstwę komórek OP9-DL1. W dniu ósmym delikatnie pobrać pipetą słabo przytwierdzone komórki, odwirować je, a następnie przenieść do pojedynczego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej konfluentnymi komórkami OP9-DL1. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez kolejne dwa tygodnie. W dniu 22.Inkubować odseparowane komórki IPS w świeżej pożywce na nowej płytce hodowlanej w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następnie usunąć około połowy zawiesiny komórek i przepuścić ją przez nylonowe sito o oczkach 70 µm w celu wyeliminowania agregatów komórkowych, a otrzymaną zawiesinę pojedynczych komórek przemyć trzykrotnie zimnym PBS. Po trzecim przemyciu resuspender komórki w PBS do stężenia 1,5 × 10⁷ komórek/ml i przechowywać je w lodzie przed wstrzyknięciem dożylnym (IV).Umieść czterotygodniową mysz z niedoborem rag pod lampą podczerwienią, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26,5 G 200 µL zawiesiny komórkowej i przeprowadź transfer adopcyjny komórek poprzez rozszerzoną żyłę ogonową. Trzy tygodnie później, po potwierdzeniu eutanazji myszy poddanej transferowi adopcyjnemu, usuń węzły chłonne oraz śledzionę po mechanicznym rozdrobnieniu tkanek.Zliozyj zawiesinę pojedynczych komórek za pomocą buforu do lizy CK, a następnie dwukrotnie przemyj otrzymane monocyty zimnym PBS. Następnie, po barwieniu markerów powierzchniowych komórek, oceń komórki za pomocą analizy cytometrycznej w dniu zerowym; w dniu pierwszym użyj odczynnika do transfekcji genów JAMA, aby przeprowadzić nocną transfekcję wysianych komórek opakowujących plat E za pomocą OT one MIDR; w dniu drugim wysiej 1×10⁶ komórek iPS do jednej studni 24-dołkowej płytki uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną; pobierz pseudowirusy zawierające S natin z komórek plat E, a następnie przepuść je przez filtr 0,4 µm w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń po wirowaniu. Przeprowadź transdukcję komórek w obecności polybrenu przez jedną godzinę przy 330×g w temperaturze 32°C.Inkubować je przez noc w tej samej temperaturze po powtórzeniu procedury transdukcji. W czwartym dniu potraktować transdukowane komórki iPS trypsyną, a następnie po odwirowaniu zawiesić komórki w świeżej pożywce i wysiać je na uprzednio przygotowane napromieniowane komórki karmidła snl 7 6 7. Po osiągnięciu przez transdukowane komórki pełnej konfluencji, wyizolować komórki podwójnie dodatnie dla GFP i DS red za pomocą cytometrii przepływowej.Sześć tygodni po adopcyjnym transferze komórek IPS, w 50. dniu wyzwania nowotworowego, wstrzyknąć 50 µL komórek EEG seven thoma do jamy otrzewnowej tej samej myszy. Użyć zestawu Miltenyi Biotec do izolacji limfocytów T CD8+, aby wyizolować limfocyty T CD8+ ze śledziony i węzłów chłonnych zwierzęcia poddanego transferowi adopcyjnemu. Wymieszać wyizolowane limfocyty T CD8+ z napromieniowanymi komórkami SPOC z naiwnej myszy C57BL/6J w stosunku 1:10 i inkubować kokulturę z 0,5 µmol/ml OVA przez 40 godzin.Następnie dodaj felden A do komórek na kolejne cztery godziny. Na koniec oceń populacje komórek za pomocą analizy cytometrycznej. Po wyizolowaniu komórek SP z naiwnej myszy C 57 black six J, podziel zawiesinę komórkową na dwie grupy.Oznacz grupę CFSE high za pomocą 5 µM CFSE i inkubuj komórki z 10 µg/ml peptydu OVA przez jedną godzinę, natomiast grupę CFSE low oznacz 0,5 µM CFSE i nie inkubuj z peptydem. W PBS zmieszaj 2,5 × 10⁶ komórek CFSE high z 2,5 × 10⁶ komórek CFSE low. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji CFSE.16 godzin po transferze adopcyjnym do wybranej myszy. Aby policzyć komórki nowotworowe w jamie otrzewnej w 20. dniu wywołania nowotworu, należy użyć strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18,5 G oraz zimnego PBS do płukania jamy otrzewnej. Policz odzyskane komórki nowotworowe w celu zidentyfikowania komórek naciekających guz.Usunąć guz w późnej fazie wywołania nowotworu, a następnie podzielić go na trzy części. Pierwszą część guza umieścić w probówce kriogenicznej i postawić probówkę na suchym lodzie. Drugą część niezwłocznie utrwalić w formaldehydzie.Przechowuj trzeci fragment w kondycjonowanym medium RPMI 1640 po wysuszeniu na powietrzu kriokonserwowanych sekcji tkanek. Utrwal je w zimnym acetonie przez 15 minut, po wcześniejszym wysuszeniu na powietrzu utrwalonych sekcji przez kolejne 15 minut. Po tym etapie przemyj preparaty na szkiełkach przez pięć minut w PBS.Umieść preparaty w komorze wilgotnej i pokryj skrawki tkanek 30 µL 3%B, SA i PBS na 30 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Następnie usuń nadmiar buforu blokującego za pomocą papierowego ręcznika i inkubuj skrawki tkanek w komorze wilgotnej przez dwie godziny z 50 µL mieszaniną przeciwciała pe anti TCR RV alpha two oraz przeciwciała fitzy anti ova rozcieńczonych w 3%PSA w PBS. Po zakończeniu inkubacji przemyj preparaty trzy razy w zimnym PBS, a na koniec zamknij skrawki w wodnym medium montażowym przed badaniem w mikroskopie fluorescencyjnym w celu analizy cytometrycznej limfocytów T naciekających guz.Rozgnieć guza, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie przeanalizuj komórki pod kątem specyficznych markerów powierzchniowych. CD3 oraz TCR beta są wykorzystywane jako markery limfocytów T, aby ustalić, czy stymulacja komórek iPS ligandem Notch DL1 mogłaby przyczynić się do różnicowania w kierunku limfocytów T. Oceniono ekspresję powierzchniową CD4 i CD8 na komórkach pochodzących z iPS, które były dodatnie pod kątem CD3 i TCR beta.Należy zwrócić uwagę na wykres kropkowy po prawej stronie, który przedstawia dzień 22 dla pojedynczo pozytywnych limfocytów T (CD3+, TCRβ+, CD4-, CD8+), wygenerowanych in vitro z komórek iPS. Ponadto, pochodzące z komórek iPS komórki pojedynczo pozytywne z poprzedniej ryciny produkowały interleukinę 2 oraz interferon gamma po stymulacji in vitro za pomocą przeciwciał anty-CD3 naniesionych na płytkę oraz rozpuszczalnych przeciwciał anty-CD28, co potwierdza, że limfocyty T pochodzące z komórek iPS są funkcjonalne po transferze adoptywnym do myszy biorcy. Większość transdukowanych genem TCR komórek iPS uległa różnicowaniu w CTL CD8+, które zareagowały in vitro na stymulację peptydową poprzez wydzielanie interleukiny 2 i interferonu gamma, co przedstawiono na tych wykresach kropkowych z połączonych komórek węzłów chłonnych i śledziony.Komórki T CD8+ Vβ5+ zostały wygenerowane u myszy, którym adoptywnie przeniesiono iPS przekształcone TCR, a nie kontrolne iPS. Populacje CD8+ Vβ5+ wykazano jako dodatnie w barwieniu wewnątrzkomórkowym cytokin dla produkcji interleukiny 2 oraz interferonu gamma, co na tych histogramach przedstawiono za pomocą ciemnych linii w porównaniu z zacieniowanymi histogramami kontroli izotypowej, co wskazuje na funkcjonalność CTL pochodnych z iPS. Dane te przedstawiają komórki CFSE high stymulowane eptydem (piki po prawej stronie każdego wykresu) oraz kontrolne komórki CFSE low (piki po lewej stronie), które wstrzyknięto myszom 10 tygodni po transferze komórek iPS lub jeden dzień po transferze CTL OT-I.Antygenowo swoiste limfocyty CTL pochodzące z iPS odpowiedziały na stymulację antygenem i wykazały aktywność cytotoksyczną, co wskazuje brak komórek CFSE high w tym miejscu. Komórki iPS z przetransdukowanym genem TCR OT-1 zostały przeniesione adoptywnie do myszy C57BL/6, a następnie myszy zostały poddane wyzwaniu komórkami nowotworowymi EEG7; w 20. dniu policzono komórki nowotworowe w jamie otrzewnej. Zauważono znaczną redukcję liczby komórek nowotworowych u myszy, które otrzymały iPS z przetransdukowanym TCR, w porównaniu z grupami kontrolnymi.Co najważniejsze, adoptywny transfer komórek iPS przetransdukowanych TCR wywołał naciek nadreaktywnych komórek CTL do tkanek nowotworowych i chronił zwierzęta przed wyzwaniem nowotworowym, co widać na tym barwieniu H&amp;E tkanek nowotworowych pobranych od 30 do 35 dni po wyzwaniu nowotworowym; guzy pochodziły z myszy, którym adoptywnie transferowano komórki przetransdukowane TCR lub komórki OT-I CTL, ale nie z myszy poddanych iniekcji pozorowanej lub kontrolnej. Komórki przetransdukowane zostały nacieknięte przez komórki zapalne, co wskazują tutaj czerwone strzałki. Stwierdzono, że swoiste dla Ova komórki CTL dodatnie pod kątem Vα2 (zaznaczone na czerwono) naciekają tkanki nowotworowe wykazujące ekspresję Ova (zaznaczone na zielono).Podczas gdy guzy u myszy z grup kontrolnych wykazywały w tej postaci rzadsze występowanie lub całkowity brak komórek naciekających guz, zawiesiny pojedynczych komórek z tkanek nowotworowych poddano analizie ekspresji V alpha two oraz V beta five metodą cytometrii przepływowej po wyselekcjonowaniu populacji CD eight positive. Należy zauważyć, że tkanki nowotworowe od myszy, którym adoptywnie przeszczepiono komórki IPS po transdukcji TCR, wykazywały najwyższy poziom nacieku komórek do guza, natomiast guzy od myszy, które otrzymały kontrolne komórki IPS po transdukcji, nie wykazały nacieku swoistych dla ova komórek T CD eight positive.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak generować limfocyty T specyficzne dla antygenu z komórek iPS oraz jak oceniać funkcje limfocytów T pochodzących z komórek iPS.

directed-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-towards-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kierunkowa różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Film demonstruje test z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych CD8+ pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy. Te limfocyty T, zmodyfikowane za pomocą receptorów specyficznych dla HBV, są przenoszone do myszy transgenicznych. Kompetentne replikacyjnie plazmidy genomu HBV są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do wątroby, umożliwiając wychwyt DNA wirusa. Gdy antygeny wirusowe ulegną...

Hamowanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B za pomocą limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego

Ten film demonstruje test do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych CD8αβ+ pochodzących z indukowanych komórek macierzystych (iPSC) specyficznych dla antygenu nowotworowego. Specyficzne dla antygenu nowotworowego iPSC są hodowane na monowarstwie komórek zrębu i różnicowane w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC). HPC są różnicowane w podwójnie dodatnie limfocyty T CD4 + CD8 + przy użyciu pożywki różnicowej. Komórki te są następnie stymulowane do generowania...

Generowanie pojedynczych dodatnich limfocytów T CD8 z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Poznaj metodę różnicowania komórek iPS w limfocyty T na układzie OP9-DL1 in vitro i dojrzewanie in vivo w myszach rag-deficytowych. Technika umożliwia generowanie antygenowo specyficznych komórek T do immunoterapii nowotworowej.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Przeglądaj więcej filmów