Unieruchomienie wypławków, częściowe napromienianie i przeszczep tkanek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest umieszczenie populacji zdrowych komórek macierzystych w sąsiedztwie tkanki poddanej ablacji komórek macierzystych w obrębie parianu w celu analizy zachowań komórek macierzystych i potomstwa in vivo podczas regeneracji. Osiąga się to poprzez znieczulenie i unieruchomienie nienapromieniowanego lub napromieniowanego liściastego pariana w celu dalszej manipulacji. Następnie, unieruchomiony, nienapromieniowany parian jest częściowo osłonięty ołowiem, a następnie napromieniowany promieniowaniem rentgenowskim, w wyniku czego powstaje nieuszkodzony parian z tkanką poddaną ablacji komórek macierzystych w zestawieniu z osłoniętą tkanką, która pozostaje obciążona komórkami macierzystymi.

Alternatywnie, przeszczep tkankowy pobrany od dawcy, który nie został poddany napromienieniu, może zostać przeszczepiony do wcześniej napromieniowanego gospodarza w celu wytworzenia parianu z izolowaną populacją komórek macierzystych. Fałszywie obecny w komórce macierzystej, która w przeciwnym razie by się nie sprawdziła. Uzyskuje się wyniki ablacji gospodarza, które pokazują izolowane populacje komórek macierzystych sąsiadujące z tkankami poddanymi ablacji komórek macierzystych przez całą hybrydyzację RNA in situ dla genów markera komórek macierzystych.

Tak więc opisane tutaj metody mają na celu lepsze zrozumienie wypławków regeneracyjnych poprzez badanie zachowania komórek macierzystych zarówno w paradygmacie transplantacji, jak i paradygmacie częściowego napromieniowania, co pozwala nam sprawdzić, czy otaczające tkanki i lokalne środowiska, w których te komórki macierzyste przebywają, wpływają lub wpływają na zachowanie tych neo blastów lub komórek macierzystych. Podczas procesu regeneracji, na miesiąc do dwóch przed eksperymentem, nakarm plin zgodnie z dołączonym rękopisem. Aby uzyskać pożądany rozmiar w tej demonstracji, wybiera się pliny o długości od jednego do dwóch centymetrów i szersze niż dwa milimetry.

Następnie są głodzone na trzy do siedmiu dni przed użyciem. Następnie przygotuj roztwór Chloro tone, łagodny środek znieczulający miejscowo, rozpuszczając 0,1 do 0,2% wagowo na objętość cleonu w wodzie parian. Następnie schłodzić roztwór na lodzie do przeszczepu tkanek za pomocą palnika Bunsena, zegnij rurkę kapilarną o średnicy wewnętrznej 0,75 milimetra w odległości od jednego do dwóch centymetrów od końca pod kątem 90 stopni w celu przecięcia przeszczepionej tkanki.

Następnie zegnij kolejną rurkę kapilarną o średnicy zewnętrznej 0,7 milimetra od jednego do dwóch centymetrów od końca pod kątem 90 stopni, aby utworzyć otwór w żywicielu, aby otrzymać przeszczep. Następnie wytnij czarną bibułę filtracyjną watmana. Po trzecie, bibuła filtracyjna, chusteczka Kim i bibułka do skręcania papierosów zgodnie z rozmiarami wskazanymi w dołączonym rękopisie.

Następnie przygotuj zmodyfikowany roztwór Holt Fers i nasycony Caine roztwór Holta Frettera. Schłodzić oba do czterech stopni Celsjusza. Następnie przymocuj złożoną chusteczkę Kim do kwadratu Paraform.

Umieść go na płycie chłodzącej Peltiera lub innym urządzeniu chłodzącym pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie nasącz chusteczkę Kim schłodzonym roztworem Holt Fretter. Następnie umieść dwa prostokąty z czarnej bibuły filtracyjnej na chusteczce Kim.

Teraz umieść kawałek bibuły filtracyjnej Watmana numer dwa na szalce Petriego. Zwilżyć bibułę filtracyjną roztworem Holt Fretter. Następnie schłodzić naczynie na lodzie w celu częściowego napromieniowania.

Umieść większą papierową wkładkę w większym naczyniu, podobnie jak w przypadku przeszczepu tkanki. Zwilżyć bibułę filtracyjną roztworem Holt Fretter. Następnie schłodzić danie na lodzie.

W tej procedurze napełnij szalkę Petriego schłodzonym roztworem cleonu. Odpipetuj Planarię do naczynia w celu przeszczepu. Znieczulaj tylko jednego gospodarza i jednego dawcę na raz.

W przypadku częściowego napromieniowania można znieczulić wiele zwierząt jednocześnie. Następnie pozwól pariom zanurzyć się w roztworze cleone przez pięć do 10 minut, aż staną się nieruchome. Opłucz paria, pipetując je do naczynia wypełnionego schłodzonym roztworem Holt Fretter.

Następnie unieruchamić obszar plin, pipetując je na czarną bibułę filtracyjną nasączoną schłodzonym roztworem progów Holta. Następnie ustaw je brzusznie do dołu za pomocą kleszczy. Teraz umieść schłodzoną szalkę Petriego przygotowaną wcześniej w wiaderku z lodem, które zmieści się w promienniku rentgenowskim z górnym źródłem promieniowania.

Ułóż znieczulony obszar na szalce Petriego, przesuwając czarne bibuły filtracyjne. Następnie przenieś je do górnego źródła promieniowania rentgenowskiego, umieść wiadro z lodem tak, aby odległość od lampy katodowej do paria była zminimalizowana. W ten sposób maksymalizuje się skuteczną moc dawki.

Następnie umieść ekrany ołowiane między parią a lampą katodową dla dawki promieniowania rentgenowskiego. Jeśli pożądana jest całkowita ablacja komórek macierzystych z obszarów nieosłoniętych, należy dostarczyć 30 grejów lub więcej. Natychmiast po emisji promieniowania rentgenowskiego przenieś parian do schłodzonej wody parian.

Następnie pozwól wodzie parian ogrzać się do temperatury pokojowej, a zwierzęta usuną się z czarnej bibuły filtracyjnej. Procedura częściowego napromieniania została zakończona. Aby rozpocząć tę procedurę pod mikroskopem preparacyjnym, ułóż znieczulony obszar puli gospodarza i dawcy na oddzielnych prostokątnych czarnych filtrach na chusteczce Kim, która została już schłodzona na płytce Peltiera lub chłodnicy.

Użyj rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,75 milimetra, aby wyciąć czop przeszczepu od dawcy. Następnie użyj kleszczy, aby umieścić go na niewidocznej części żywiciela. Następnie użyj rurki kapilarnej o średnicy zewnętrznej 0,7 milimetra, aby usunąć korek z hosta.

Następnie umieść przeszczep w otworze. Przenieś przeszczepionego żywiciela na prostokątnej czarnej bibule filtracyjnej na przygotowaną wcześniej szalkę Petriego. Zwilż kawałek bibułki roztworem Frettera Holta nasyconego Caine'em.

Następnie umieść go na przeszczepionym żywicielu. Następnie namocz cztery kawałki bibuły filtracyjnej otaczającej nasycony roztwór Holtera, a w przypadku, gdy przeszczepiony gospodarz następnie namocz cztery zwitki cięcia, Kim przetrzyj nasączony nasyconym roztworem Holt Fretter. Połóż je na bibułach filtracyjnych.

Następnie zamknij pokrywę. Umieść szalkę Petriego na lodzie. Następnie przenieś parian dawcy do wody parian w celu odzyskania i regeneracji.

Po zakończeniu wszystkich przeszczepów umieść przeszczepionego pariana w inkubatorze o temperaturze 10 stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka przenieś go na szalkę Petriego wypełnioną wodą parian. Pozwól parianowi wysunąć się z bibuły filtracyjnej lub delikatnie usuń go kleszczami, a następnie zmieniaj wodę parian raz na dwa do trzech dni.

Hybrydyzacja in situ w napromieniowanym, ale w pełni osłoniętym parianie kontrolnym utrwalona trzy dni po napromieniowaniu pokazuje rozkład komórek macierzystych, który jest nie do odróżnienia od rozkładu u parianów typu dzikiego. Z drugiej strony, w przypadku parianu, który był tylko częściowo ekranowany, pozostawiając przednią i tylną część odsłoniętą komórki macierzyste wydają się być ablatowane z obszarów nieosłoniętych. Tutaj pokazuje widoki grzbietowe i brzuszne pomyślnie przeszczepionego pariana.

Trzy dni po przeszczepie przeszczep jest wyraźnie widoczny zarówno na powierzchni grzbietowej, jak i brzusznej i jest otoczony charakterystyczną niepigmentowaną tkanką na granicy faz przeszczepu z gospodarzem. Jednak nieudany przeszczep nie wykazuje widocznej tkanki przeszczepu w miejscu przeszczepu. Hybrydyzacja całego mount in situ ujawniła obecność komórek macierzystych tylko w miejscu przeszczepu lub wokół niego, co wskazuje na powodzenie przeszczepu po opanowaniu.

Przeszczepy można wykonać w ciągu zaledwie pięciu minut każdy. Przy wskaźnikach powodzenia zbliżających się do 90 do 100% i częściowym napromienianiu można znacznie zwiększyć skalę. Zakładając, że rozmiar pola twojego promiennika jest wystarczająco duży.