Name: Unieruchomienie wypławków, częściowe napromienianie i przeszczep tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę unieruchomienia, częściowego napromieniania i przeszczepu tkanek u wypławków do badania zachowań komórek macierzystych w czasie regeneracji. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę dynamiki komórek macierzystych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Chiyoko Kobayashi i Kiyokazu Agata za pomocne porady w zakresie transplantacji planariów, a także byłym i obecnym członkom laboratorium Sánchez za nieocenione dyskusje podczas opracowywania tych technik. Praca ta była wspierana przez grant szkoleniowy NIH (5T32 HD0791) dla OCG oraz grant NIH R37GM057260 dla ASA. ASA jest badaczem Howard Hughes Medical Institute.

Uwaga: niniejszy protokół sugeruje użycie potencjalnie niebezpiecznych materiałów (ołowiu i chloretonu). Należy pozyskać, przeczytać i stosować karty charakterystyki (MSDS) dla wszystkich potencjalnie niebezpiecznych materiałów.
1. Hodowla, selekcja i przygotowanie zwierząt
<ol>
 <li>Do hodowli i manipulacji zwierzętami należy używać wody do planariów (1X soli Montjuïc9) oraz plastikowych pipet transferowych.</li>
 <li>W warunkach laboratoryjnych przy zachowaniu standardowych warunków hodowli10 można wykorzystać biotyp płciowy Schmidtea mediterranea. Aby uzyskać osobniki bezpłciowe o wymaganej wielkości, S. mediterranea hodowane w temperaturze pokojowej w normalnych warunkach9 należy karmić z dwu- lub trzykrotną częstotliwością (2-3 razy w tygodniu) przez jeden do dwóch miesięcy przed użyciem. Alternatywnie, zwierzęta bezpłciowe karmione z normalną częstotliwością można przechowywać w temperaturze 10 stopni Celsjusza bezterminowo w celu zwiększenia ich średniej wielkości.</li>
 <li>Należy wybrać zwierzęta o długości od 1 do 2 cm i szerokości powyżej 2 mm, a następnie głodzić je przez 3-7 dni przed użyciem.</li>
 <li>Jeśli planowane są jakiekolwiek zabiegi farmakologiczne lub radiologiczne na przyszłych gospodarzach, dawcach lub zwierzętach częściowo napromieniowanych, należy przeprowadzić te zabiegi na tym etapie.</li>
 <li>Jeśli przeprowadzono zabiegi farmakologiczne wymagające karmienia zwierząt, należy głodzić je przez dodatkowe 3 do 7 dni przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów i materiałów
<ol>
 <li>Przygotować roztwór chloretonu, łagodnego znieczulenia miejscowego, rozpuszczając 0,1-0,2% w/v chloretonu w wodzie dla planariów i schładzając roztwór w lodzie.</li>
 <li>W przypadku przeprowadzania wyłącznie częściowego napromieniowania przejść do kroku 2.7. W przypadku transplantacji tkanek kontynuować od kroku 2.3.</li>
 <li>Za pomocą palnika Bunsena wygiąć pod kątem 90°, w odległości 1-2 cm od końców, rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 mm (używane do wycinania tkanki przeszczepu) oraz o średnicy zewnętrznej 0,7 mm (używane do tworzenia otworu w organizmie biorcy, który przyjmie przeszczep). Aby zaoszczędzić materiały, można wygiąć oba końce każdej rurki kapilarnej i przełamać je na pół, aby uzyskać dwa narzędzia. Należy uważać, aby nie opaliby samych końców rurek.</li>
 <li>Wyciąć z następujących papierów kawałki o wskazanych wymiarach:
 <ul>
 <li>Czarny papier filtracyjny (wyciąć prostokąty o wymiarach ok. 2,5 cm x 1,5 cm)</li>
 <li>Papier filtracyjny Whatman #3 (wyciąć prostokąty o wymiarach ok. 2 cm x 0,5 cm)</li>
 <li>Kimwipe (złożyć i wyciąć kawałki o wymiarach ok. 3 cm x 0,5 cm x 4 warstwy)</li>
 <li>Papier do skręcania papierosów (usunąć pasek z klejem i wyciąć prostokąty o wymiarach ok. 3 cm x 2 cm)</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Przygotować modyfikowany roztwór Holtfretera (3,5 g/L NaCl, 0,2 g/L NaHCO3, 0,05 g/L KCl, 0,2 g/L MgSO4, 0,1 g/L CaCl2, pH 7,0-7,5) oraz roztwór Holtfretera nasycony kazeiną i schłodzić oba do 4 °C.</li>
 <li>Przymocować złożony Kimwipe do kwadratu Parafilmu i umieścić na płytce chłodzącej Peltiera lub innym urządzeniu chłodzącym znajdującym się pod mikroskopem stereoskopowym. Nasycić Kimwipe schłodzonym roztworem Holtfretera i położyć na nim dwa prostokąty czarnego papieru filtracyjnego.</li>
 <li>Wyłożyć szalki Petriego papierem filtracyjnym Whatman #2. Zwilżyć papier filtracyjny roztworem Holtfretera i schłodzić szalki w lodzie. Do częściowego napromieniowania można użyć większej szalki i większego arkusza papieru filtracyjnego.</li>
</ol>
3. Znieczulenie i unieruchomienie
<ol>
 <li>Napełnić szalkę Petriego schłodzonym roztworem chloretone i przenieść pierścienice do szalki za pomocą pipety. W przypadku transplantacji należy znieczulać tylko jednego biorcę i jednego dawcę jednocześnie. W przypadku naświetlania częściowego można znieczulić wiele (n &gt; 10) zwierząt naraz.</li>
 <li>Pozostawić pierścienice w roztworze chloretone do momentu, aż przestaną się poruszać (5-10 min).</li>
 <li>Przepłukać pierścienice, przenosząc je pipetą do szalki wypełnionej schłodzonym roztworem Holtfretera.</li>
 <li>Unieruchomić zwierzęta, przenosząc je pipetą na czarny papier filtrujący nasączony schłodzonym roztworem Holtfretera, a następnie ułożyć je pęsetą stroną brzuszną do dołu. Jeśli zwierzęta są w stanie się poruszać, należy odsączyć nadmiar roztworu Holtfretera, nieznacznie obniżyć temperaturę elementu Peltiera lub płyty chłodzącej lub wydłużyć czas traktowania chloretone.</li>
</ol>
4. Naświetlanie częściowe
Uwaga: Należy postępować zgodnie z poniższymi krokami w celu przygotowania zwierząt do częściowego napromieniowania. W przypadku przeprowadzania transplantacji należy przejść do sekcji 5.
<ol>
 <li>Umieścić schłodzoną szalkę Petriego z kroku 2.7 na lodzie w pojemniku z lodem, który zmieści się wewnątrz naświetlacza rentgenowskiego z górnym źródłem.</li>
 <li>Ułożyć znieczulone zwierzęta w szalce Petriego, przesuwając czarny papier filtracyjny, na którym są one unieruchomione. Bezpośrednie przesuwanie znieczulonych nicieni za pomocą pęsety może doprowadzić do ich obrażeń.</li>
 <li>Przenieść ułożone zwierzęta do naświetlacza rentgenowskiego z górnym źródłem i ustawić pojemnik z lodem tak, aby zminimalizować odległość od lampy katodowej do zwierząt, maksymalizując w ten sposób efektywną szybkość dawki.</li>
 <li>Umieścić osłony ołowiane (Rycina 1) między zwierzętami a lampą katodową zgodnie z potrzebami. Osłony powinny mieć grubość od 4,5 do 6 mm, aby zapewnić tłumienie wiązki rentgenowskiej 325kV na poziomie od 97 do 99%11.</li>
 <li>Podać dawkę promieniowania rentgenowskiego. Jeśli pożądana jest całkowita ablacja komórek macierzystych z obszarów nieosłoniętych, należy podać dawkę 30 Gy lub większą przy użyciu naświetlacza rentgenowskiego. Dla odniesienia 30 Gy odpowiada 3,6 minutom przy 320 kilowoltach i 10 miliamperach w urządzeniu Precision X-Ray Inc. XRAD320 przy odległości od źródła do pola wynoszącej 30 centymetrów.</li>
 <li>Natychmiast po zakończeniu napromieniowania, trzymając nicienie za czarny papier filtracyjny, przenieść zwierzęta do schłodzonej wody dla planariów. Pozostawić wodę dla planariów do ogrzania się do temperatury pokojowej i pozwolić zwierzętom samodzielnie oddzielić się od czarnego papieru filtracyjnego. Procedura częściowego napromieniowania jest teraz zakończona.</li>
</ol>
5. Transplantacja tkanki
<ol>
 <li>Za pomocą pipety transferowej i pęsety ułożyć znieczulone dżdżownice gospodarza i dawcy na oddzielnych prostokątach czarnego papieru filtracyjnego na chusteczce Kimwipe, która została schłodzona na elemencie Peltiera lub płycie chłodzącej pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
 <li>Używając rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,75 mm, wyciąć fragment przeszczepu z dawcy i za pomocą pęsety umieścić go w nieużytkowej części ciała gospodarza. Jeśli materiał przeszczepu utknie w rurce kapilarnej, usunąć go pęsetą.</li>
 <li>Używając rurki kapilarnej o średnicy zewnętrznej 0,7 mm, usunąć fragment ciała gospodarza i za pomocą pęsety umieścić przeszczep w powstałym otworze.</li>
 <li>Przenieść przeszczepionego gospodarza wraz z prostokątem czarnego papieru filtracyjnego do szalki Petriego przygotowanej w kroku 2.7.</li>
 <li>Zwilżyć kawałek papieru skrętkowego roztworem Holtfretera nasyconym kazeiną i położyć go na przeszczepionym gospodarzu, zgodnie ze schematem na Ryc. 2A.</li>
 <li>Namoczyć cztery kawałki papieru filtracyjnego w roztworze Holtfretera nasyconym kazeiną i otoczyć nimi przeszczepionego gospodarza, zgodnie ze schematem na Ryc. 2B.</li>
 <li>Namoczyć cztery kuleczki pociętej chusteczki Kimwipe w roztworze Holtfretera nasyconym kazeiną i ułożyć je na papierze filtracyjnym z kroku 5.6 (Ryc. 2B). Nałożyć pokrywkę i umieścić szalkę Petriego w lodzie.</li>
 <li>Przenieść dżdżownicę dawcę do wody dla planariów, aby mogła dojść do regeneracji i zagojenia ran.</li>
 <li>Po zakończeniu wszystkich przeszczepów umieścić przeszczepione dżdżownice w inkubatorze w temperaturze 10 °C na noc.</li>
 <li>Następnego ranka, uważając, aby nie naruszyć przeszczepu, odsłonić dżdżownicę i przenieść ją (wraz z czarnym papierem filtracyjnym) do szalki Petriego wypełnionej wodą dla planariów.</li>
 <li>Pozostawić dżdżownicę do samodzielnego oddzielenia się od papieru filtracyjnego lub delikatnie usunąć ją pęsetą.</li>
 <li>Wymieniać wodę dla planariów raz na 2-3 dni.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Bezpośrednio po częściowym napromieniowaniu planaria będą wyglądać normalnie i nie będą wykazywać objawów uszkodzenia. W zależności od podanej dawki oraz geometrii zastosowanej osłony, napromieniowana tkanka może ulec regresji, a nawet dezintegracji7. Tkanka osłonięta powinna pozostać nienaruszona. Po regresji tkanki i utracie jej integralności utworzy się blastema, a brakujące struktury zostaną zregenerowane (Rycina 3A). Jeśli w częściowo napromieniowanym obszarze zostanie wykonana amputacja, tkanka napromieniowana zostanie uratowana (tj. zapobiegnie się jej regresji lub dezintegracji) (Rycina 3B). Zarówno w przypadku braku urazu, jak i po amputacji, regeneracja będzie opóźniona w porównaniu z amputowaną planarią nienapromieniowaną (Rycina 3C). Jeśli podano dawkę promieniowania rentgenowskiego 30 Gy i częściowo napromieniowane zwierzę nie zostało uszkodzone, pomyślną ablację komórek macierzystych w wzorze odpowiadającym zastosowanej osłonie ołowianej można potwierdzić od 2 do 3 dni po częściowym napromieniowaniu za pomocą hybrydyzacji in situ dla markera komórek macierzystych Smed-piwi-112 (znanego również jako smedwi-1) (Rycina 4).
Rankiem po transplantacji, pomyślny przeszczep tkanki powinien być wyraźnie widoczny w tkance gospodarza, przylegając do grzbietowej i brzusznej powierzchni organizmu biorcy (Rysunek 5A). Sporadycznie przeszczep przylega tylko do powierzchni brzusznej lub grzbietowej. Jeśli transplantacja całkowicie się nie powiodła, żadna oznaka przeszczepu nie będzie widoczna ani od strony grzbietowej, ani brzusznej gospodarza (Rysunek 5B). Wkrótce po pomyślnym przeszczepieniu nienapromieniowanej tkanki do gospodarza, u którego usunięto komórki macierzyste za pomocą dawki letalnej promieniowania13,14, hybrydyzacja in situ dla Smed-piwi-1 wykaże, że komórki macierzyste występują głównie w obrębie przeszczepu (Rysunek 5C). Ponadto pomyślne przeszczepy nienapromieniowanej tkanki do letalnie napromieniowanych gospodarzy doprowadzą do uratowania tkanki gospodarza i długoterminowego przeżycia organizmu biorcy15.
<img alt="Schemat naświetlania promieniami X; planaria w szalce Petriego; układ lampy katodowej z osłoną ołowianą do badań." src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny układ podstawowych elementów do naświetlania częściowego. W irradiatorze rentgenowskim z ułożonym u góry źródłem promieniowania X (lampą katodową) znieczulona planaria jest umieszczana bezpośrednio pod źródłem w polu naświetlania. Aby zmaksymalizować dawkę promieniowania, należy zminimalizować odległość między planarią a źródłem promieniowania X. Między lampą katodową a znieczulonym pierścienicą należy umieścić osłonę ołowianą, tak blisko zwierzęcia, jak to możliwe. Osłona ołowiana powinna być zaprojektowana, wykonana i ustawiona w taki sposób, aby chroniła pożądane tkanki, pozostawiając całkowicie odsłoniętą resztę organizmu. Wielu komercyjnych producentów wykona niestandardowe osłony ołowiane na podstawie prostego schematu projektowego; my z sukcesem korzystaliśmy z usług Alpha Systems Corp. (Bluffdale, UT). Ołów powinien być wystarczająco gruby, aby zapewnić pożądany stopień ekranowania. Na przykład, jeśli wymagane jest niemal całkowite ekranowanie wiązki promieniowania X o energii 320 kV, ołów powinien mieć grubość od 4,5 do 6 mm. Planaria i osłona są umieszczone w szalce Petriego wyłożonej papierem filtracyjnym nasączonym roztworem Holtfretera, która spoczywa w wiaderku z lodem. Przy wystarczająco dużym polu naświetlania i odpowiedniej liczbie identycznych osłon ołowianych, wiele okazów można naświetlać częściowo jednocześnie (brak na rysunku).
<img alt="Schemat przygotowania transplantacji tkanki z papierami filtracyjnymi, watkami Kimwipe i szalką Petriego do badania roślin." src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Budowa komory regeneracyjnej. (A) Widok rozstrzelony komory regeneracyjnej do transplantacji tkanek, przedstawiający wszystkie komponenty układane warstwowo po uprzednim namoczeniu w roztworze Holtfretera nasyconym kazeiną. (B) Prawie ukończona komora regeneracyjna, ilustrująca zazębiające się rozmieszczenie prostokątów z papieru filtracyjnego Whatman #3, które ściśle otaczają znieczulonego planariusa, zapobiegając jego poruszaniu się podczas gojenia. Staranna konstrukcja komory regeneracyjnej zapobiega przemieszczaniu się zwierzęcia oraz jego wysychaniu, co sprzyja szybkiemu gojeniu i zwiększa skuteczność transplantacji tkanek.
<img alt="Efekty częściowego napromieniowania i dekapitacji na wzrost; układ osłony ołowianej; schemat sekwencji czasowej." src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki prostej częściowej irradiacji tylnej. Zgodnie z opisem Dubois7, (A) gdy tylna połowa planariów została osłonięta ołowiem, a następnie poddana napromieniowaniu rentgenowskiemu, zaobserwowano regresję tkanki przedniej do granicy między tkanką napromieniowaną a osłoniętą, w którym punkcie utworzyły się niepigmentowane blastemy i zwierzęta zaczęły regenerację. (B) Z drugiej strony, gdy zwierzęta zostały poddane dekapitacji po tej samej częściowej irradiacji, co w punkcie (A), nie zaobserwowano regresji tkanki, a pozostała napromieniowana tkanka przednia została zachowana. Dekapitowane zwierzęta częściowo napromieniowane zregenerowały głowy (B), jednak regeneracja była znacznie opóźniona w porównaniu z nienapromieniowanymi kontrolami po dekapitacji (C).
<img alt="Eksperyment regeneracji płazińców, ilustrujący obszary osłonięte i napromieniowane, obraz mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywny wynik częściowej ablacji komórek macierzystych po częściowym napromieniowaniu. Hybrydyzacja In situ w całym organizmie (WISH) dla markera komórek macierzystych Smed-piwi-1 wykazuje, że u planariów typu dzikiego komórki macierzyste są rozmieszczone w całym ciele, z wyjątkiem tkanki przed fotoreceptorami (głowica strzałki) oraz samego gardła (gwiazdka)14. (A) WISH dla Smed-piwi-1 u planariów kontrolnych, które zostały napromieniowane, lecz w pełni osłonięte i utrwalone trzy dni po napromieniowaniu, pokazuje rozkład komórek macierzystych nieodróżnialny od planariów typu dzikiego. (B) Z kolei WISH dla Smed-piwi-1 u zwierząt, które były tylko częściowo osłonięte (pozostawiając odsłonięty przód i tył) i również utrwalone trzy dni po napromieniowaniu, wykazuje ablację komórek macierzystych w obszarach nieosłoniętych. Paski skali oznaczają 500 microns.
<img alt="Badanie transplantacji przeszczepów u planarii, schemat przedstawiający udane i nieudane przeszczepy z markerem Smed-piwi-1." src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przykłady udanej i nieudanej transplantacji tkanek. (A) Obrazy żywych osobników w widoku grzbietowym i brzusznym po udanej transplantacji planarii trzy dni po zabiegu. Przeszczep (wskazany) jest wyraźnie widoczny zarówno na powierzchni grzbietowej, jak i brzusznej, a w miejscu styku przeszczepu z biorcą otacza go charakterystyczna niepigmentowana tkanka. (B) W przypadku nieudanych transplantacji w miejscu przeszczepu (wskazanym) nie obserwuje się widocznej tkanki przeszczepionej, lecz zamiast tego widoczna jest zagojona, niepigmentowana rana boczna powstała w wyniku nieudanej transplantacji. Przeszczep, który przylega tylko do powierzchni grzbietowej lub tylko do brzusznej, może przypominać udaną transplantację (A) przy oglądaniu z jednej strony i nieudaną transplantację (B) przy oglądaniu z drugiej strony. (C) Gdy tkanka typu dzikiego (wt) zostanie przeszczepiona do napromieniowanego biorcy, u którego usunięto istniejące komórki macierzyste, a następnie, dwa dni po transplantacji, przeszczepione komórki macierzyste zostaną ujawnione za pomocą metody WISH dla Smed-piwi-1, sukces transplantacji jest wyraźnie widoczny dzięki specyficznej obecności komórek macierzystych wyłącznie w miejscu przeszczepu lub wokół niego (groty strzałek). Paski skali oznaczają 500 microns.

<ol><li>Morgan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Entw.+Mech.+Org%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 Forthcoming.</li>
<li>Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Randolph, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+the+tail+in+lumbriculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The regeneration of the tail in lumbriculus.</a> J. Morphol. 7, 317-344 Forthcoming.</li>
<li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li>
<li>Santos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transplantation+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Studies on transplantation in planaria.</a> Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).</li>
<li>Morgan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+grafted+pieces+of+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zo%C3%B6l%22%5BJournal%5D)">Regeneration of grafted pieces of planarians.</a> J. Exp. Zoöl. 3, 269-294 (1906).</li>
<li>Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+%C3%A1+l+%27%C3%A8tude+de+la+migration+des+cellules+de+r%C3%A8g%C3%A8n%C3%A8ration+chez+les+Planaires+dulcicoles%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Biol.+Fr.+Belg%22%5BJournal%5D)">Contribution á l 'ètude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles.</a> Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).</li>
<li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Cebria, F., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+homologs+of+netrin+and+netrin+receptor+are+required+for+proper+regeneration+of+the+central+nervous+system+and+the+maintenance+of+nervous+system+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture.</a> Development. , 132-3691 (2005).</li>
<li>Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+specifically+labels+the+regenerative+stem+cells+of+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians.</a> Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).</li>
<li>Miller, W., Kennedy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+attenuation+in+lead%2C+aluminum%2C+and+concrete+in+the+range+275+to+525+kilovolts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts.</a> Radiology. 65, 920-925 (1955).</li>
<li>Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li>
<li>Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+planarian+X-ray-sensitive+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).</li>
<li>Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMEDWI-2+is+a+PIWI-like+protein+that+regulates+planarian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells.</a> Science. 310, 1327-1330 (2005).</li>
<li>Stéphan-Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+de+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ration+chez+la+planaire+Dendrocoleum+lacteum%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+de+la+Soci%C3%A9t%C3%A9+Zooologique+de+France%22%5BJournal%5D)">Les cellules de régénération chez la planaire Dendrocoleum lacteum.</a> Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).</li>
<li>Gurley, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+secreted+Wnt+pathway+components+reveals+unexpected+complexity+of+the+planarian+amputation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response.</a> Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).</li>
<li>Salvetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cell+plasticity%3A+neoblast+repopulation+in+non-lethally+irradiated+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians.</a> Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Znaczenie unieruchomienia
Imobilizacja jest zdecydowanie najkrytyczniejszym etapem dla pomyślnego zakończenia każdego z tych procesów. Jeśli planaria nie zostaną prawidłowo unieruchomione przed częściowym napromieniowaniem, mogą przemieścić się pod osłonę ołowianą, co doprowadzi do niespójnych i mylących wyników. Ponadto, jeśli zwierzęta nie zostaną wystarczająco unieruchomione po transplantacji, robak gospodarz prawdopodobnie oddali się od tkanki przeszczepionej, co spowoduje nieprawidłowe zaroś...

<table><tbody><tr><td>Pipeta transferowa ogólnego przeznaczenia</td><td>Samco</td><td>691</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary (ID 0,75 mm)</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary (OD 0,7 mm)</td><td>FHC</td><td>30-50-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 34155</td><td>VWR</td><td>500029-891</td><td></td></tr><tr><td>Czarny papier filtracyjny</td><td>Schleicher Schuell</td><td>10310809</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman #2 1002-055</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-810B</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman #3 1003-185</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820E</td><td></td></tr><tr><td>Papier do skręcania papierosów</td><td>Zig-Zag, original</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta DUMONT, INOX #5</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Chloreton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112054</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3400</td><td></td></tr><tr><td>Osłony ołowiane</td><td>Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT</td><td>Custom design</td><td></td></tr><tr><td>Irradiator biologiczny XRAD-320</td><td>Precision X-Ray, North Branford, CT</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Planaria, słodkowodne płaskurki, okazały się potężnym systemem do badania regeneracji metazoa oraz biologii komórek macierzystych1,2. Regeneracja wszelkich brakujących lub uszkodzonych tkanek u planarii jest możliwa dzięki dorosłym komórkom macierzystym nazywanym neoblastami3. Chociaż jednoznacznie wykazano, że komórki macierzyste te są pluripotencjalne i jako jedyne zdolne do odtworzenia całego organizmu4, heterogeniczność w obrębie populacji komórek macierzystych oraz dynamika ich zachowań komórkowych pozostają w dużej mierze nierozwiązane. Ze względu na dużą liczbę i szeroki rozkład komórek macierzystych w całym planie budowy ciała planarii, konieczne są zaawansowane metody manipulowania subpopulacjami komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań molekularnych i funkcjonalnych in vivo.
Przeszczepianie tkanek oraz irradiation częściowa to dwie metody, za pomocą których można wyizolować subpopulację komórek macierzystych planarii do dalszych badań. Każda z tych technik posiada odrębne zalety. Przeszczepianie tkanek umożliwia wprowadzenie do naiwnego gospodarza komórek macierzystych, które są albo genetycznie odmienne, albo zostały wcześniej poddane działaniu farmakologicznemu. Z kolei irradiation częściowa pozwala na wyizolowanie komórek macierzystych wewnątrz gospodarza, w sąsiedztwie tkanki pozbawionej komórek macierzystych, bez konieczności wywoływania rany czy naruszania integralności tkanki. Wykorzystując te dwie metody, można badać czynniki autonomiczne i nieautonomiczne komórkowe, które kontrolują funkcje komórek macierzystych, takie jak proliferacja, różnicowanie i migracja.
Zarówno transplantacja tkanek5,6, jak i częściowe napromieniowanie7 były historycznie wykorzystywane do definiowania wielu kwestii dotyczących regeneracji planarii, które pozostają przedmiotem badań do dziś. Jednak techniki te były niedostatecznie wykorzystywane ze względu na pracochłonność i niespójność poprzednich metod. Protokoły zaprezentowane w niniejszej pracy stanowią znaczący krok naprzód w ograniczaniu czasu i wysiłku niezbędnego do powtarzalnego generowania dużych liczb zwierząt z przeszczepami lub częściowo napromieniowanych, z efektywnością sięgającą 100 procent. Opisujemy hodowlę dużych zwierząt, unieruchomienie, przygotowanie do częściowego napromieniowania, transplantację tkanek oraz optymalizację rekonwalescencji zwierząt. Co więcej, opisana tutaj praca przedstawia pierwsze zastosowanie metody częściowego napromieniowania w odniesieniu do najszerzej badanej planarii, Schmidtea mediterranea. Dodatkowo, efektywne przeszczepy tkanek u planarii otwierają drogę do funkcjonalnego testowania subpopulacji naiwnych lub traktowanych komórek macierzystych w testach repopulacji, które od dawna są złotym standardem oceny potencjału dorosłych komórek macierzystych u ssaków8. Powszechne przyjęcie tych technik bez wątpienia doprowadzi do lepszego zrozumienia zachowań komórkowych dorosłych komórek macierzystych podczas homeostazy i regeneracji tkanek.

Opisano skuteczną metodę przeszczepiania tkanek o określonym i powtarzalnym rozmiarze pomiędzy planariami. Uwzględniono również opis tego, w jaki sposób technikę unieruchamiania stosowaną podczas transplantacji można zaadaptować, przy użyciu osłon ołowianych, do częściowego napromieniowania żywych zwierząt.

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Planaria, słodkowodny płaziwiec, okazała się potężnym systemem do analizy regeneracji oraz biologii komórek macierzystych zwierząt wielokomórkowych1,2. Planaria ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest umieszczenie populacji zdrowych komórek macierzystych sąsiadująco z tkanką pozbawioną komórek macierzystych u planarii, aby przeanalizować zachowanie komórek macierzystych i ich potomstwa in vivo podczas regeneracji. Osiąga się to poprzez znieczulenie i unieruchomienie planarii nienaświetlanej lub naświetlonej promieniami X w celu dalszej manipulacji. Następnie unieruchomioną planarię nienaświetlaną częściowo osłania się ołowiem, a następnie naświetla promieniami X, co pozwala uzyskać nieuszkodzoną planarię z tkanką pozbawioną komórek macierzystych sąsiadującą z tkanką osłoniętą, która nadal zawiera komórki macierzyste.Alternatywnie, przeszczep tkanki pobranej od nienaświetlonego dawcy może zostać wszczepiony do wcześniej naświetlonego gospodarza, aby uzyskać organizm z izolowaną populacją komórek macierzystych. W przypadku gospodarza, w którym komórki macierzyste zostały usunięte, uzyskuje się wyniki wykazujące izolowane populacje komórek macierzystych sąsiadujące z tkankami pozbawionymi tych komórek, co potwierdzono za pomocą hybrydyzacji in situ RNA całego preparatu dla genów markerowych komórek macierzystych.Opisane tutaj metody mają n

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i przeszczep tkanki

W niniejszej pracy opisujemy procedurę ortotopowego przeszczepienia kończyny tylnej szczura, która wydaje się być złotym standardem modelu in vivo w badaniach nad allotransplantacją tkanek złożonych.

Ortotopowe przeszczepianie kończyny tylnej u szczurów

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Atrakcyjnym modelem do badania różnicowania się komórek macierzystych w żywym organizmie jest płaskonic z rzędu Planarioidea. Regenerację bada się za pomocą prostych eksperymentów z amputacją, które można łatwo przeprowadzić w podstawowym laboratorium i które poddaje się manipulacjom farmakologicznym oraz genetycznym (in vivo RNAi), zgodnie ze szczegółowymi protokołami zawartymi w niniejszym artykule.

Badania farmakologiczne i funkcjonalne badania genetyczne w celu manipulacji regeneracją planarii Dugesia japonica

Ten protokół pokazuje, jak konsekwentnie wycinać wypławki oczu (panewki wzrokowe) bez naruszania otaczających tkanek. Za pomocą igły insulinowej i strzykawki można dokonać ablacji jednego lub obu oczu, aby ułatwić badania nad mechanizmami regulującymi regenerację oczu, ewolucją regeneracji wzroku i neuronalnymi podstawami zachowań wywołanych światłem.

Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Badania nad strategiami leczenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych są ważne dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu opisujemy protokół, aby najpierw wygenerować potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy, a następnie selektywnie celować i leczyć te nowotwory in vivo za pomocą napromieniacza dla małych zwierząt.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

Unaczyniony kompozytowy przeszczep allogeniczny oferuje korzyści zmieniające życie biorcom przeszczepów, ale biologiczne przyczyny odrzucenia przeszczepu i waskulopatii pozostają słabo poznane. Przedstawiony tutaj model chirurgiczny gryzoni oferuje powtarzalny, klinicznie istotny model przeszczepu, umożliwiając naukowcom ocenę zdarzeń odrzucenia przeszczepu i potencjalnych strategii terapeutycznych zapobiegających ich wystąpieniu.

Zmodyfikowany heterotopowy model płata kostno-skórnego kończyn tylnych u szczura do translacyjnych badań nad allotransplantacją unaczynionych kompozytów

Ten protokół przedstawia solidny, powtarzalny model unaczynionego kompozytowego allotransplantu (VCA) nastawiony na jednoczesne badanie immunologii i funkcjonalnego odzyskiwania. Czas zainwestowany w skrupulatną technikę przeszczepu ortotopowego prawej kończyny tylnej w połowie uda z ręcznie szytymi zespoleniami naczyniowymi i koaaptacją neuronalną daje możliwość badania funkcjonalnej regeneracji.

Kolejny krok: ortotopowy model przeszczepu kończyn tylnych z koaaptacją neuronalną w celu maksymalizacji powrotu do sprawności u szczura

Ten artykuł przedstawia częściowy protokół heterotopowego przeszczepu płata kostno-skórnego u szczurów i jego potencjalne wyniki w obserwacji średnioterminowej.

Częściowy heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych u szczurów

Napady negatywnie wpływają na różne funkcje i jakość życia. Robaki Planaria były wystawione na działanie różnych stężeń chemoconvulsantów w celu oceny ich fenotypów napadowych i ruchliwości destrukcyjnej. W badaniu tym zaproponowano wykorzystanie robaków wypławkowych jako modelu ostrych napadów padaczkowych u ludzi i ma znaczenie w opracowywaniu leków na padaczkę.

Wypławka jako model zwierzęcy do eksperymentalnego ostrego napadu padaczkowego

Poznaj metodę unieruchomienia, częściowego napromieniania i przeszczepu tkanek u wypławków do badania zachowań komórek macierzystych w czasie regeneracji. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę dynamiki komórek macierzystych in vivo.

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Przeglądaj więcej filmów