Name: Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząstek talku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę dostosowywania morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząstek talku w bioreaktorze. Technika ta umożliwia korelację morfologii grzybni z produktywnością enzymatyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy wyrażają wdzięczność za wsparcie finansowe udzielone przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w ramach centrum wspólnych badań SFB 578 „Od genu do produktu” na Uniwersytecie Technicznym w Braunschweigu (Technische Universität Braunschweig), Niemcy.

1. Konfiguracja reaktora i rozpoczęcie hodowli
Przeprowadzono łącznie 4 hodowle w bioreaktorach.
<ol>
 <li>Do hodowli A. niger SKAn1015 należy użyć bioreaktora z mieszadłem o pojemności 3 L i objętości roboczej 2,2 L.</li>
 <li>Do reaktora należy wsypać 72,6 g monohydratu glukozy i uzupełnić go 1,9 L wody dejonizowanej.</li>
 <li>Należy zainstalować wyposażenie reaktora, takie jak 3 przegrody, dwa sześciołopatkowe mieszadła turbinowe, elektrodę pH, wlot gazu z filtrem powietrza, palec chłodzący, chłodnicę powietrza wylotowego z filtrem powietrza, rurkę zanurzeniową do sterylnego pobierania próbek z filtrem powietrza oraz węże wlotowe dla pożywki, inokulum, kwasu i zasady.</li>
 <li>Reaktor należy autoklawować w temperaturze 121 °C przez 20 min.</li>
 <li>Należy połączyć reaktor z zasobnikami kwasu i zasady (2 M HCl, 2 M NaOH) oraz odpowiednimi pompami i ustawić wartość pH na 5,0 ± 0,05 za pomocą jednostki sterowania pH.</li>
 <li>Należy połączyć reaktor z systemem wody chłodzącej i założyć płaszcz grzejny wokół naczynia reaktora.</li>
 <li>Należy zainstalować czujnik temperatury z odpowiednią jednostką sterującą i ustawić temperaturę 37 ± 0,1 °C na sterowniku temperatury.</li>
 <li>Na górze reaktora należy zamontować silnik mieszadła i uruchomić go z prędkością mieszania 200 min-1.</li>
 <li>Przez jeden z jałowych węży wlotowych należy dodać sterylną minimalną pożywkę wzrostową11 (250 mL). Do przygotowania pożywki wszystkie składniki zostały autoklawowane w 121 °C przez 20 min, a następnie zmieszane. W przypadku trzech hodowli składniki obejmowały proszek talkowy (3MgO•4SiO2•H2O) w stężeniach 1 g/L (reaktor 2), 3 g/L (reaktor 3) i 10 g/L (reaktor 4). Przed użyciem mikrocząsteczki należy resuspendować w 50 mM buforze octanu sodu (pH 6,5) i dodać do sterylnej pożywki. W kulturach kontrolnych (bez cząsteczek) zawiesinę mikrocząsteczek należy zastąpić 50 mM buforem octanu sodu (pH 6,5).</li>
 <li>Przez jeden z jałowych węży wlotowych należy dodać zawiesinę zarodników (inokulum) przygotowaną zgodnie z metodą Wucherpfennig et. al (2011)11 (50 mL), tak aby stężenie zarodników wynosiło 1X106 mL-1. Inokulacja wyznacza moment rozpoczęcia hodowli (h = 0 h).</li>
 <li>Należy rozpocząć napowietrzanie z przepływem 1,0 L min-1.</li>
</ol>
2. Sterylne pobieranie próbek po 24, 48 i 72 h hodowli
<ol>
 <li>Przenieś 50 mL sterylnej pożywki hodowlanej do probówki typu flacon.</li>
 <li>Wykorzystaj próbkę do oznaczenia suchej masy biomasy, aktywności β-fruktofuranozydazy oraz analizy mikroskopowej.</li>
</ol>
3. Oznaczenie suchej masy biomasy po 24, 48 i 72 h hodowli
<ol>
 <li>Próbki biomasy należy pobierać co najmniej w dubletach.</li>
 <li>Zważyć filtr celulozowy za pomocą mikro wagi po wysuszeniu w eksyكاتهorze, a następnie umieścić filtr w lejku Büchnera podłączonym do pompy próżniowej z pompką wodną.</li>
 <li>Przefiltrować określoną objętość próbki (np. 10 mL) i przepłukać filtr 10 mL wody dejonizowanej, aby usunąć związki pożywki z biomasy.</li>
 <li>Złożyć filtr raz na pół, umieścić go w szklanej szalce Petriego i włożyć do suszarki komorowej do osiągnięcia stałej masy (co najmniej 24 h).</li>
 <li>Ostudzić filtr w eksykatorze i zmierzyć jego masę.</li>
 <li>Obliczyć suchą masę biomasy jako różnicę między masą filtra z wysuszoną biomasą a masą filtra bez niej, podzieloną przez użytą objętość próbki.</li>
</ol>
4. Oznaczanie zewnątrzkomórkowej aktywności enzymatycznej β-fruktofuranozydazy za pomocą testu GOD/POD po 24, 48 i 72 h hodowli
Próbki należy stale przechowywać w lodzie podczas pracy z nimi.
<ol>
 <li>Przefiltruj 1,5 mL zawiesiny hodowlanej przez filtr z octanu celulozy, przeciskając zawiesinę strzykawką przez filtr do probówki reakcyjnej. Przechowuj probówkę reakcyjną w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Do przygotowania mieszaniny reakcyjnej użyj 20 μL próbki i dodaj 200 μL 1,65 M sacharozy rozpuszczonej w 0,05 M buforze fosforanowym (pH 5,4), aby zainicjować reakcję rozkładu sacharozy do glukozy. Przeprowadź reakcję co najmniej w dwóch powtórzeniach.</li>
 <li>Inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 40 °C przez 20 min w bloku grzejnym. Zatrzymaj reakcję poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 min w bloku grzejnym. Schłodź mieszaninę reakcyjną, przechowując ją na lodzie, a następnie odwiruj skroploną wodę w wirówce przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Aby uwzględnić zależny od pH i temperatury rozkład sacharozy do glukozy, wyznacz wartość tła (próbę blank), stosując 20 μL wody dejonizowanej zamiast 20 μL próbki.</li>
 <li>Aby uwzględnić pozostałą glukozę w pożywce hodowlanej, przeprowadź kontrolę negatywną dla każdej próbki. W tym celu użyj 20 μL próbki i dezaktywuj β-fruktofuranozydazę przez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 10 min przed dodaniem sacharozy, a następnie inkubuj zgodnie z opisem w kroku 4.3.</li>
 <li>Rozcieńcz próbki w taki sposób, aby zmierzona absorbancja mieściła się w zakresie kalibracji.</li>
 <li>Wszystkie testy enzymatyczne przeprowadź w trzech powtórzeniach. Nałóż 2 μL rozcieńczonej próbki do dołka płytki mikrotitracyjnej. W celu kalibracji nałóż na płytkę mikrotitracyjną szereg wzorców, używając po 2 μL dziesięciu roztworów glukozy o dziesięciu różnych znanych stężeniach (od 1 mM do 15 mM) zamiast 2 μL próbki. Do kalibracji punktu zerowego użyj 2 μL wody dejonizowanej zamiast 2 μL próbki.</li>
 <li>Dodaj 200 μL roztworu odczynnika do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
 <li>Inkubuj mieszaninę przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przechowuj płytkę mikrotitracyjną w temperaturze 6 °C do momentu pomiaru (maksymalnie przez kilka godzin).</li>
 <li>Zmierz absorbancję przy 450 nm, korzystając z czytnika mikropłytek Sunrise 96-dołkowego oraz oprogramowania do analizy danych Magellan. Ustaw czas mieszania na 5 s oraz czas przerwy na 1 s.</li>
 <li>Otwórz tabelę wyników w arkuszu kalkulacyjnym i wyznacz linię kalibracyjną na podstawie szeregu wzorców: 
 stężenie glukozy = a X absorbancja + b </li>
 <li>Oblicz aktywność: 
 aktywność = (absorbancja X czynnik rozcieńczenia - wartość tła) X a + b </li>
 <li>Wyznacz aktywność β-fruktofuranozydazy, obliczając różnicę między aktywnościami próbki a odpowiednią kontrolą negatywną.</li>
 <li>Oblicz produktywność właściwą do dalszego wykorzystania, biorąc pod uwagę suchą masę biomasy oraz aktywność β-fruktofuranozydazy 11.</li>
</ol>
5. Mikroskopia i zautomatyzowana analiza obrazu po 72 h hodowli
<ol>
 <li>Nalej około 3 mL zawiesiny hodowlanej do plastikowej szalki Petriego i rozcieńcz ją fizjologicznym roztworem chlorku sodu, aż struktury morfologiczne zostaną oddzielone.</li>
 <li>Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem wyposażonym w zintegrowaną lub podłączoną kamerę. Wykonaj i zapisz około 100 zdjęć (Rysunek 2) struktur morfologicznych dla każdej próbki. Dopilnuj, aby na każdym zdjęciu co najmniej jeden obiekt był widoczny w całości.</li>
 <li>Otwórz wszystkie zdjęcia z tej samej próbki w programie do przetwarzania obrazów ImageJ12. Konwertuj obrazy na czarno-białe za pomocą narzędzia procesowego „Make Binary” (Rysunek 2). Aby zastosować to polecenie do całej serii zdjęć, użyj następującego kodu makra: run(,,Make Binary") 
 </li>
 <li>Ponownie otwórz przetworzone obrazy binarne w programie ImageJ. Oblicz wskaźniki kształtu: średnicę Fereta, powierzchnię rzutu, obwód, kołowość, współczynnik kształtu (aspect ratio), zaokrąglenie oraz zwartość (solidity) dla każdego obrazu za pomocą narzędzia analizy „Set Measurement”. Aby zastosować to polecenie do serii obrazów, użyj następującego kodu makra: 
 run("8-bit"); 
 run("Make Binary"); 
 run("Set Scale...", "distance=X known=1000 pixel=1 unit=μm global"); 
 run("Set Measurements...", "area perimeter shape feret's limit display redirect=None decimal=3"); 
 run("Analyze Particles...", "size=10000-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Outlines display"); 
 Wyznacz wartość X jako liczbę pikseli odpowiadającą 1000 μm, rysując linię prostą wzdłuż paska skali. Powiąż liczbę pikseli linii prostej z długością paska skali w μm.</li>
 <li>Otwórz tabelę wyników zawierającą wartości wskaźników kształtu dla każdego obrazu w arkuszu kalkulacyjnym. Oblicz liczbę morfologiczną (Morphology number) dla każdego obrazu zgodnie z poniższym wzorem: 
 <img alt="Wzór na liczbę morfologiczną z wykorzystaniem powierzchni, zwartości, średnicy Fereta i współczynnika kształtu na schemacie fizycznym." src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
 <li>Oblicz wartość średnią i odchylenie standardowe dla liczby morfologicznej, uwzględniając wszystkie zdjęcia z jednej próbki.</li>
 <li>Użyj programu do tworzenia wykresów i analizy danych w celu graficznej korelacji liczby morfologicznej z wydajnością specyficzną i określ zależność matematyczną za pomocą regresji matematycznej.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Poprzez dodatek mikrocząsteczek talku morfologia A. niger SKAn 1015 zmienia się z właściwej morfologii granulkowatej na morfologię rozproszoną lub nawet grzybniową. Podczas gdy w warunkach standardowych występuje morfologia granulkowata, suplementacja pożywki mikrocząsteczkami talku w stężeniu 10 g/L prowadzi do powstania morfologii grzybniowej (Rycina 4.). Jednocześnie aktywność β-fruktofuranozydazy wzrasta około 3-krotnie 3-5. Suplementacja proszkiem talkowym w stężeniu 1 lub 3 g/L prowadzi do powstania morfologii rozproszonej przy dwukrotnym wzroście aktywności fruktofuranozydazy (Rycina 4.).
Morfologię zależną od mikrocząstek można kompleksowo opisać za pomocą wskaźnika morfologii (Morphology number), który można obliczyć, wykorzystując parametry określone podczas automatycznej analizy obrazu. Idealnie okrągłe i gładkie granulki będą w obrazach mikroskopowych widoczne jako idealne okręgi. Dla takich cząstek wskaźnik morfologii przyjmuje wartość 1. Najmniejszy fragment morfologii grzybni można uprościć do postaci linii jednowymiarowej, co daje wskaźnik morfologii równy 0. Wszystkie pośrednie formy morfologiczne, takie jak wydłużone, nieregularne granulki lub grudki, będą zatem miały wartości między 0 a 1. Dość duże cząstki będą skutkować wysokim, natomiast cząstki grzybowe o dużej powierzchni lub cząstki wydłużone dość niskim wskaźnikiem morfologii 11.
W warunkach standardowych morfologia w reaktorze 1 wykazuje liczbę morfologii (Morphology number) wynoszącą około 0,8. Morfologia w reaktorze 4 z dodatkiem 10 g/L proszku talkowego charakteryzuje się Mn wynoszącą około 0,1. Liczba morfologii dla reaktorów 2 i 3, przy stężeniach proszku talkowego wynoszących odpowiednio 1 i 3 g/L, mieści się pomiędzy tymi wartościami ekstremalnymi, co wskazuje na morfologię rozproszoną. Ponieważ morfologia zależna od mikrocząsteczek jest ściśle powiązana z wydajnością β-fruktofuranozydazy, uzyskano korelację matematyczną między liczbą morfologii a wydajnością, analogiczną do przedstawionej na Ryc. 5.
<img alt="Schemat procesu w bioreaktorze; masa sucha, aktywność enzymatyczna, mikroskopia; punkty czasowe 24-72h." src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat projektu eksperymentalnego i procedury analitycznej. A. niger jest hodowany (z mikrocząsteczkami lub bez nich) w bioreaktorze z mieszadłem o pojemności 3 L przez 72 h. Po 24, 48 i 72 h pobierana jest próbka do oznaczenia masy suchej biomasy oraz aktywności β-fruktofuranozydazy, które następnie służą do obliczenia wydajności specyficznej. Po 48 h morfologia grzyba jest badana pod mikroskopem i charakteryzowana za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Istotne parametry analizy obrazu są łączone w liczbę morfologiczną (Morphology number), która jest matematycznie skorelowana z wydajnością specyficzną.
<img alt="Schemat procesu przetwarzania obrazów: akwizycja, ulepszanie, binaryzacja, analiza z użyciem programu ImageJ." src="/files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Etapy przetwarzania obrazów mikroskopowych struktur morfologicznych A. niger. Krok 1: akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu. Krok 2: ulepszanie obrazu, jeśli jest to konieczne. Krok 3: binaryzacja obrazu, generowanie obrazu czarno-białego (binarnego) w programie ImageJ. Krok 4: przetwarzanie obrazu binarnego i usuwanie niepożądanych obiektów. Krok 5: analiza morfologiczna przeprowadzana za pomocą funkcji „Analyze particles” w programie open source ImageJ.
<img alt="Wpływ mikrocząsteczek talku na próbki; mikroskopia optyczna; cząsteczki 6 μm; analiza morfologiczna." src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Różne formy morfologiczne A. niger w zależności od stężenia dodanych mikrocząsteczek. Wraz ze wzrostem stężenia dodanych mikrocząsteczek wielkość granulek może być precyzyjnie redukowana do małych granulek typu rdzeń-otoczka, małych kłaczków, a nawet swobodnie rozproszonej grzybni. Inżynieria morfologiczna Aspergillus niger SKAn1015 poprzez suplementację mikrocząsteczkami w kulturze zanurzonej. Bez mikrocząsteczek (A), 10 mg/L (B), 0.1 g/L (C), 0.2 g/L (D), 0.3 g/L (E), 0.6 g/L (F), 1.0 g/L (G), 1.5 g/L (H), 2.0 g/L (I), 2.5 g/L (J), 3.0 g/L (K), 3.5 g/L (L), 4.0 g/L (M), 4.5 g/L (N), 5.0 g/L (O), 10 g/L (P), 15 g/L (Q), 20 g/L (R), 30 g/L (S) oraz 40-50 g/L (T). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej po 72 h inkubacji.
<img alt="Wykres słupkowy aktywności fruktofuranosydazy w zależności od stężenia talku, wykazujący zwiększoną aktywność enzymatyczną." src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Aktywność fruktofuranosydazy w zależności od stężenia mikrocząsteczek talku 1 g/L (reaktor 2), 3 g/L (reaktor 3) i 10 g/L (reaktor 4). Reaktor 1 nie został wzbogacony o mikrocząsteczki; w tym przypadku hodowla prowadzona jest w warunkach standardowych.
<img alt="Wykres wydajności specyficznej w funkcji liczby morfologicznej; A. niger SKAn 1015; dopasowanie do zaniku wykładniczego." src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywna dobra korelacja (R2 = 0,91) między liczbą morfologiczną a wydajnością specyficzną. Liczbę morfologiczną naniesiono na oś odciętych (abscysę), a wydajność specyficzną na oś rzędnych (ordynatę). Regresja nieliniowa wykazała korelację wykładniczą.

<ol><li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWucherpfennig%2C+T+%22Advances+in+Applied+Microbiology%22">Advances in Applied Microbiology</a>. 72, Academic Press. 89-136 (2010).</li>
<li>Driouch, H., Hänsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger%3A+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li>
<li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li>
<li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fungi+in+good+shape%3A+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered+Bugs%22%5BJournal%5D)">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li>
<li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li>
<li>Kaup, B. -A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms%3A+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li>
<li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li>
<li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li>
<li>Zuccaro, A., GÃ¶tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li>
<li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+glucose+oxidase%2C+peroxidase%2C+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li>
<li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5(2006).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Modyfikacja morfologii grzybów jest przedmiotem zainteresowania biotechnologii od wielu dziesięcioleci. W różnych badaniach próbowano zmieniać wybrane parametry procesu, takie jak wartość pH, doprowadzenie energii, temperaturę, składniki odżywcze pożywki lub stężenie inokulum 1, jednak działania te obarczone są dość niedokładną i niepełną kontrolą morfologii, wysokimi kosztami energetycznymi, efektami inhibicji lub niestabilnością produktu. W przeciwieństwie do tego, suplementacja mikrocząsteczek pozwala na precyzyjne kształtowanie morfologii grzybów poprzez dokładną regulację wielkości i stężenia cząsteczek. Otwiera to nowe możliwości wykorzystania mikrocząsteczek do optymalizacji i projektowania dedykowanej, wysokowydajnej morfologii w produkcji biotechnologicznej z wykorzystaniem A. niger oraz innych mikroorganizmów nitkowatych.
Cyfrowa analiza obrazu jest łatwą i powtarzalną metodą charakteryzacji makromorfologii grzybów. Jednakże różnorodność parametrów dotyczących rozmiaru, kształtu i charakterystyki powierzchni struktur morfologicznych opisanych w literaturze sprawia, że szybka ocena morfologii grzybów jest skomplikowana. Przedstawiona liczba morfologiczna, będąca kombinacją istotnych parametrów, eliminuje ten brak i może być wykorzystywana nie tylko do kompleksowej charakteryzacji struktur morfologicznych, ale również do bezpośredniej korelacji matematycznej z wydajnością. Umożliwia to ponownie szacowanie wydajności na podstawie danej morfologii, a w konsekwencji dostosowanie morfologii do potrzeb procesu.
Wykorzystując liczbę morfologii (Morphology number), możliwe jest rozróżnienie pomiędzy różnymi morfologiami pelletów i aglomeratów 4,5. W celu dalszego rozwoju liczby morfologii obiecujące wydaje się uwzględnienie wymiaru fraktalnego. Wymiar fraktalny pozwala na pomiar złożoności i właściwości wypełniania masy obiektu 13, a zatem jest predestynowany do holistycznej charakterystyki morfologii grzybni.
Tworzenie morfologii grzybni o wysokiej wydajności może jednak prowadzić do problemów z efektywnością procesu, szczególnie w uprawie na dużą skalę, ponieważ wcześniej wykazano, że taka forma wzrostu grzybni wiąże się z znacznie większą lepkością cieczy fermentacyjnej 2. Prowadzi to do problemów z przekazywaniem ciepła i masy oraz do powstawania zastygłych stref niemieszanych, co wymaga większego nakładu energii i zwiększa koszty prowadzenia uprawy1. W związku z tym podczas zmiany morfologii należy uwzględnić zależność między morfologią grzyba a lepkością cieczy fermentacyjnej i włączyć ją do dalszych modeli.

dostosowanie morfologii aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Niciakowaty grzyb A. niger jest szczepem szeroko stosowanym w szerokim zakresie procesów przemysłowych, od przemysłu spożywczego po farmaceutyczny. Jedną z najbardziej intrygujących i często niekontrolowalnych cech tego organizmu nitkowatego jest jego złożona morfologia. Przybiera ona formy od gęstych sferycznych granulek po lepkie grzybnie (Rysunek 1). Znane jest, że różne parametry procesu i składniki wpływają na morfologię grzyba 1. Ponieważ optymalna wydajność jest silnie skorelowana z konkretną formą morfologiczną, morfologia grzyba często stanowi wąskie gardło wydajności w produkcji przemysłowej.
Prostym i eleganckim sposobem na precyzyjną kontrolę kształtu morfologicznego jest dodanie do pożywki nieorganicznych nierozpuszczalnych mikrocząsteczek (takich jak wodny krzemian magnezu, tlenek glinu lub tlenek krzemianu tytanu), co przyczynia się do zwiększenia produkcji enzymów 2-6. Ponieważ istnieje wyraźna korelacja między morfologią zależną od mikrocząsteczek a produkcją enzymów, pożądanym jest matematyczne powiązanie produktywności z wyglądem morfologicznym. Z tego względu celem jest opracowanie ilościowego, precyzyjnego i holistycznego opisu morfologicznego.
W związku z tym przedstawiamy metodę generowania i charakteryzacji struktur morfologicznych zależnych od mikrocząsteczek oraz korelacji morfologii grzybów z wydajnością (Rysunek 1), co może przyczynić się do lepszego zrozumienia morfogenezy mikroorganizmów nitkowatych.
Rekombinowany szczep A. niger SKAn1015 jest hodowany przez 72 h w 3 L bioreaktorze z mieszadłem. Poprzez dodanie mikrocząstek talku w stężeniach 1 g/L, 3 g/L oraz 10 g/L przed inokulacją, w sposób powtarzalny generowane są różnorodne struktury morfologiczne. Próbki sterylne pobierane są po 24, 48 i 72 godzinach w celu oznaczenia postępu wzrostu oraz aktywności produkowanego enzymu. Produktem jest wysokowartościowy enzym β-fruktofuranozydaza, ważny biokatalizator w syntezie nowych cukrów w przemyśle spożywczym lub farmaceutycznym, który katalizuje między innymi reakcję sacharozy do glukozy 7-9. Zatem oznaczenie ilości glukozy po dodaniu sacharozy pozwala określić ilość wyprodukowanej β-fruktofuranozydazy. Ilościowe oznaczenie glukozy wykonuje się za pomocą testu GOD/POD 10, który został zmodyfikowany pod kątem analiz wysokoprzepustowych w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.
Morfologię grzybów po 72 godzinach badano pod mikroskopem i scharakteryzowano za pomocą cyfrowej analizy obrazu. W tym celu, przy użyciu programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym ImageJ, obliczono wskaźniki kształtu cząstek dla makromorfologii grzybów, takie jak średnica Fereta, powierzchnia rzutu, obwód, kolistość, współczynnik kształtu, zaokrąglenie oraz zwartość. Odpowiednie parametry połączono w bezwymiarową liczbę morfologiczną (Mn) 11, która umożliwia kompleksową charakterystykę morfologii grzybów. Bliską korelację między liczbą morfologiczną a produktywnością wykazano za pomocą regresji matematycznej.

Opisano metodę precyzyjnego generowania i kompleksowej charakterystyki morfologicznej grzyba nitkowatego Aspergillus niger, która pozwala na matematyczną korelację wyglądu morfologicznego z produktywnością.

Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Grzyb nitkowaty A. niger jest szczepem szeroko stosowanym w szerokim zakresie procesów przemysłowych, od przemysłu spożywczego po farmaceutyczny. Jednym z naj...

Metoda ta służy do generowania i charakteryzowania struktur morfologicznych grzyba nitkowatego Aspergillus niger zależnych od mikrocząsteczek, aby powiązać morfologię grzyba z wydajnością. Hodowlę A. niger prowadzi się z dodatkiem lub bez dodatku mikrocząsteczek w trzymilitrowym bioreaktorze z mieszadłem przez 72 h w celu obliczenia wydajności właściwej. Próbki pobiera się w określonych punktach czasowych, a następnie określa masę suchą biomasy oraz aktywność betaglukuronidazy.Po 72 godzinach należy zbadać morfologię grzyba za pomocą mikroskopii i scharakteryzować ją poprzez cyfrową analizę obrazu. Następnie odpowiednie parametry analizy obrazu należy połączyć w liczbę morfologiczną, która jest matematycznie skorelowana z wydajnością specyficzną. Ostatecznie metoda ta pozwala na precyzyjne generowanie i kompleksową charakterystykę morfologii aspergillus Niger w celu lepszego zrozumienia morfogenezy mikroorganizmów nitkowatych.Aspergillus niger jest od wielu dziesięcioleci ważnym organizmem przemysłowym wykorzystywanym w biotechnologii. Jedną z najbardziej intrygujących i często niekontrolowanych cech Aspergillus niger oraz gatunków pokrewnych jest ich złożona morfologia, która w zależności od warunków hodowli przybiera formę od gęstych sferycznych granulek po lepkie grzybnie. Główną zaletą naszej procedury jest to, że dzięki dodaniu mikrocząsteczek jesteśmy teraz w stanie dostosować morfologię grzyba konkretnie do potrzeb procesu.Do tej pory nie opisano żadnej innej metody umożliwiającej taką modyfikację morfologii grzybów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące hodowli mikroorganizmów nitkowatych. W zastosowaniach przemysłowych kluczowe jest bowiem kontrolowanie morfologii grzybów, a także rozróżnianie morfologii o wysokiej i niskiej wydajności produkcji.Nasz protokół umożliwia pożądaną modyfikację i charakterystykę morfologii grzybów. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat morfologii Aspergillus niger, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów nitkowatych, takich jak szczepy Penicillium lub Streptomyces. Przygotuj cztery bioreaktory do hodowli sterylnych zgodnie ze szczegółami zawartymi w towarzyszącym protokole.Tekst oparty na dodawaniu mikrocząsteczek, hodowli Aspergillus niger o różnej morfologii. Po 72 godzinach przenieść 50 ml próbek cieczy hodowlanej do probówki typu Falcon.Próbki biomasy należy pobrać co najmniej w dwóch powtórzeniach. Po wysuszeniu w deskrykatorze należy zważyć filtr celulozowy za pomocą wagi analitycznej. Filtr umieścić w lejku Buchnera podłączonym do pompy próżniowej z odnośnikiem wodnym. Przefiltrować 10 mililitrów próbki, a następnie 10 mililitrów wody dejonizowanej w celu usunięcia składników pożywki z biomasy. Filtr należy raz złożyć na pół.Umieścić próbkę w szklanej szalce Petri i włożyć do suszarki komorowej aż do uzyskania stałej masy. Przenieść filtr do eksykatora i pozostawić do wystygnięcia. Następnie zmierzyć masę.Oblicz suchą masę biomasy na litr poprzez wyznaczenie masy, obliczenie różnicy wag filtrów i następujące dzielenie przez objętość próbki dla analiz enzymatycznych oksydazy glukozowej i peroksydazy. Próbki przechowuj w lodzie, korzystając ze strzykawki o pojemności 1,5 ml. Zawiesinę hodowlaną przepuść przez filtr z octanu celulozy do probówki reakcyjnej w celu wykonania analizy beta-frukto SASE.Aby zapewnić dokładność i statystyczną istotność wyników, analizę przeprowadzamy w dwóch powtórzeniach trzykrotnych. W celu rozpoczęcia testu, do probówki dodaje się 20 µL próbki; aby kontrolować zależny od pH i temperatury rozkład sacharozy do glukozy, zamiast 20 µL próbki należy użyć 20 µL wody dejonizowanej. Ponadto dla każdej próbki należy przygotować kontrolę negatywną w celu oznaczenia pozostałej glukozy w pożywce hodowlanej.20 µL próbki inaktywowanej termicznie. Aby zainicjować reakcję przekształcenia sacharozy w glukozę, dodać 200 µL 1,65 M roztworu sacharozy. Przy pH 5,4 do 20 µL próbki inkubować wszystkie probówki z reakcją w bloku grzewczym o temperaturze 40 °C przez 20 minut. Przerwać reakcję poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 10 minut, po uprzednim schłodzeniu probówek na lodzie.W razie potrzeby odwiruj próbki, a następnie rozcieńcz je przed analizą tak, aby zmierzona absorbancja mieściła się w zakresie wartości kalibracyjnych. Następnie do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej dodaj 2 µL próbki. Pomiary próbek wykonaj w trzech powtórzeniach.Należy również przygotować krzywą wzorcową dla 10 roztworów glukozy o stężeniach od 1 mM do 15 mM. W celu kalibracji punktu zero należy użyć 2 µL wody dejonizowanej. Następnie do każdej próbki należy dodać 200 µL roztworu odczynnika.Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmierzyć absorbancję przy 450 nanometrach, używając czytnika mikropłytek Sunrise 96-dołkowego oraz oprogramowania do pobierania danych Magellan. Otworzyć wykres wyników w arkuszu kalkulacyjnym i wyznaczyć krzywą kalibracyjną standardu.Oblicz aktywność dla każdej próbki. Następnie wyznacz aktywność beta-fruktozydazy, odejmując wartości odpowiedniej kontroli negatywnej od aktywności próbki. Na koniec oblicz specyficzną produktywność, uwzględniając suchą masę biomasy oraz aktywność beta-fruktozydazy.Należy przenieść 3 mL zawiesiny hodowlanej do plastikowej szalki Petriego i rozcieńczyć ją fizjologicznym roztworem chlorku sodu, aby oddzielić od siebie struktury morfologiczne. Jakość zdjęć mikroskopowych ma wyjątkowe znaczenie. Ze względu na późniejszą analizę obrazu, podczas etapu rozcieńczania należy zachować szczególną staranność.Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem wyposażonym w zintegrowaną kamerę. Należy wykonać i zapisać około 100 obrazów struktur morfologicznych dla każdej próbki, dbając o to, aby na każdym zdjęciu przynajmniej jeden obiekt był widoczny w całości. Postępuj w ten sam sposób z szalkami zawierającymi próbki z różnych reaktorów, wykonując nowe zdjęcia dla każdego z nich.Zwróć uwagę na różnice w morfologii wzrostu próbek z różnych reaktorów, hodowanych z różną ilością dodanego proszku talkowego. Następnie otwórz wszystkie obrazy tej samej próbki w programie do przetwarzania obrazów Image J. Używając narzędzia procesu, przekształć obrazy w binaryjne.Konwertuj obrazy na czarno-białe, aby zastosować tę operację do całej serii zdjęć. Następnie użyj kodu makra i otwórz jedno z obrazów zawierających pasek skali. Poprowadź linię prostą wzdłuż paska skali, aby określić liczbę pikseli odpowiadającą 2000 mikronów.Wybierz narzędzie analizy, ustaw pomiar i wybierz czynniki kształtu: wymiary ferreta, średnicę, pole oraz obwód. Użyj makra do przetworzenia serii obrazów. Następnie otwórz arkusz kalkulacyjny zawierający zestawienie wyników wartości czynników kształtu.Dla każdego obrazu, obejmującego wszystkie obrazy jednej próbki, oblicz wartość parametru morfologicznego. Oblicz średnią wartość parametru morfologicznego. Użyj programu do tworzenia wykresów i analizy danych, aby nanieść parametr morfologiczny w funkcji specyficznej wydajności.Wyznacz zależność matematyczną za pomocą regresji matematycznej poprzez dodawanie rosnących stężeń mikrocząsteczek talku. Osiem Niger SKAN 10 15. Morfologia zmienia się z typowej morfologii granulatu na morfologię rozproszoną lub nawet grzybkową, podczas gdy w warunkach standardowych występuje oczekiwana morfologia granulatu.Interesujące jest to, że morfologia grzybni jest kształtowana poprzez suplementację pożywki mikrocząsteczkami talku w stężeniu 10 g/l. Jednocześnie aktywność Beto Fructotazy wzrasta około trzykrotnie; suplementacja proszkiem talkowym w stężeniu jednego lub trzech g/l prowadzi do uzyskania morfologii rozproszonej z dwukrotnie wyższą aktywnością fruktozową, przy zastosowaniu parametrów określonych w automatycznej analizie obrazu. Morfologia zależna od mikrocząsteczek może zostać kompleksowo opisana za pomocą morfologii.Należy zauważyć, że idealnie okrągłe, gładkie granulki na obrazach mikroskopowych będą wyglądać jak idealne koła dla takich cząstek. Liczba morfologiczna w warunkach standardowych przyjmuje wartość zbliżoną do jedności. Morfologia w reaktorze pierwszym wykazuje liczbę morfologiczną w okolicy 0,8.Morfologia w reaktorze czwartym przy stężeniu 10 g/L. Proszek talkowy charakteryzuje się liczbą morfologii wynoszącą około 0,1. Liczba morfologii dla reaktorów drugiego i trzeciego przy stężeniach proszku talkowego wynoszących odpowiednio 1 i 3 g/L mieści się pomiędzy tymi wartościami ekstremalnymi, co wskazuje na morfologię rozproszoną.Ponieważ morfologia zależna od mikrocząsteczek jest ściśle powiązana z produktywnością beta-fruktozylanów, istnieje dobra korelacja matematyczna między morfologią, liczbą a produktywnością po jej rozwoju. Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie biotechnologii drogę do dalszego zgłębiania morfologii grzybów, a w szczególności jej związku z produktywnością. Dzięki zastosowaniu tej procedury szczegółowego tworzenia specyficznych morfologicznych krzyżówek grzybów można badać inne istotne aspekty hodowli mikroorganizmów nitkowatych.Wiadomo na przykład, że morfologia grzybni jest znacznie bardziej lepka niż morfologia podniebienna. W konsekwencji ogólna wydajność procesu jest ograniczona przez problemy z oczyszczaniem pożądanego produktu. Nasza liczba morfologiczna pomoże w opracowaniu modeli dotyczących hodowli i protokołów oraz pogłębi nasze zrozumienie morfologii grzybów w ujęciu ogólnym.

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Modyfikacja morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikro cząstek talku

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

System edycji genomu CRISPR-Cas9 to łatwy w użyciu edytor genomu, który był używany w gatunkach modelowych i niemodelowych. Tutaj prezentujemy białkową wersję tego systemu, która została wykorzystana do wprowadzenia przedwczesnego kodonu stop do genu kojarzenia niemodelowego nitkowatego grzyba workowca.

Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 u nitkowatego workowca Huntiella omanensis

Prezentujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego do przechwytywania obrazów, analizy i ilościowego określania kinetyki wzrostu nitkowatego grzyba A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w podłożach stałych. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną.

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Tutaj opisujemy prostą i tanią technikę inokulacji i obserwacji arbuskularnych grzybów mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych opartych na polimerach.

Inokulacja i obserwacja arbuskularnych kultur mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych na bazie polimerów

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę dostosowywania morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząstek talku w bioreaktorze. Technika ta umożliwia korelację morfologii grzybni z produktywnością enzymatyczną.

Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Przeglądaj więcej filmów