Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząstek talku

Metoda ta generuje i charakteryzuje zależne od mikrocząstek struktury morfologiczne grzyba nitkowatego, aspergillus, Niger, w celu skorelowania morfologii grzybów z produktywnością. Hoduj osiem Nigru z mikrocząstkami lub bez w trzylitrowym zbiorniku z mieszadłem, bioreaktorze przez 72 godziny, aby obliczyć określoną wydajność. Pobieraj próbki w określonych punktach czasowych i określaj biomasę, suchą masę i aktywność weta fruktosazy.

Po 72 godzinach zbadaj morfologię grzyba pod mikroskopem i scharakteryzuj za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Następnie połącz odpowiednie parametry analizy obrazu z liczbą morfologiczną, która jest matematycznie skorelowana z określoną produktywnością. Ostatecznie metoda ta może precyzyjnie wygenerować i kompleksowo scharakteryzować morfologię aspergillus Niger, aby lepiej zrozumieć morfogenezę mikroorganizmów nitkowatych.

Aspergillus Nigel jest ważnym przemysłowym koniem roboczym w biotechnologii od wielu dziesięcioleci. Jedną z najbardziej intrygujących i często niekontrolowanych cech aspers, Nigela i gatunków pokrewnych jest złożona morfologia, od gęstych kulistych granulek do lepkiej grzybni, w zależności od warunków hodowli. Główną zaletą naszej procedury jest to, że dzięki dodaniu mikrocząsteczek jesteśmy teraz w stanie dostosować morfologię grzybów specjalnie do potrzeb procesu.

Do tej pory nie opisano żadnej innej metody takiego dostosowywania morfologii grzybów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące hodowli mikroorganizmów nitkowatych. Ponieważ w zastosowaniach przemysłowych kluczowe znaczenie ma kontrola morfologii grzybów, a także rozróżnienie między morfologią grzybów dobrze i słabo produkujących.

Nasz protokół zapewnia środki do pożądanego dostosowania i scharakteryzowania morfologii grzybów. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w morfologię aspergillus Nigel, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów nitkowatych, takich jak penicillium lub szczepy paciorkowców. Ustawić cztery bioreaktory do sterylnych kultur, jak wyszczególniono w dołączonym protokole.

Tekst oparty na dodawaniu mikrocząstek, uprawiaj aspergillus Niger o różnej morfologii. Po 72 godzinach przenieś 50 mililitrów. Próbki bulionu hodowlanego do probówki Falcon.

Próbki biomasy należy pobrać co najmniej dwukrotnie, po wysuszeniu w osuszaczu, zważyć filtr celulozowy za pomocą mikrowagi. Umieść filtr w lejku buchnera z podłączoną pompą próżniową strumienia wody, filtruj 10 mililitrów próbki, a następnie 10 mililitrów. Woda dejonizowana w celu usunięcia związków pośrednich z biomasy zmarszcz filtr raz w środku.

Umieść go w szklanej szalce Petriego i w suszarce komorowej, aż do uzyskania stałej wagi. Przenieś filtr do wysuszonego miejsca i pozwól mu ostygnąć. Następnie zmierz wagę.

Obliczyć suchą masę biomasy na litr, obliczając wagę, różnicę filtrów, a następnie dzieląc przez objętość próbki do testów enzymatycznych oksydazy glukozowej i peroksydazy. Przechowuj próbki na lodzie za pomocą strzykawki, 1,5 mililitra. Zawiesina hodowli przez filtr octanu celulozy do probówki reakcyjnej Przeprowadza test beta frukto SASE.

Skrupulatnie zapewniamy sukces dzięki dwóm potrójnym próbom, aby zapewnić stabilność statystyczną. Aby rozpocząć test, dodaj próbkę o objętości 20 mikrolitrów do probówki, aby kontrolować zależny od pH i temperatury rozkład sacharozy na glukozę, użyj 20 mikrolitrów wody dejonizowanej zamiast próbki o pojemności 20 mikrolitrów. Ponadto dla każdej próbki należy przygotować kontrolę ujemną dla pozostałości glukozy w bulionie hodowlanym za pomocą testu.

20 mikrolitrów próbki inaktywowanej termicznie Aby zainicjować reakcję z sacharozy na glukozę, dodaj 200 mikrolitrów 1,65-molowego roztworu sacharozy. Przy pH próbki od 5,4 do 20 mikrolitrów inkubować wszystkie probówki reakcyjne w bloku grzewczym o temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 20 minut. Zatrzymaj reakcję, podgrzewając w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut po schłodzeniu probówek na lodzie.

W razie potrzeby odwirować próbki, rozcieńczyć próbki do oznaczenia w taki sposób, aby zmierzona absorpcja mieściła się w skalibrowanym zakresie wartości. Teraz dla każdej reakcji dodaj dwa mikrolitry próbki do płytki do mikromiareczkowania. Dobrze wykonaj pomiary próbki w trzech egzemplarzach.

Przygotuj również krzywą wzorcową dla 10 roztworów glukozy w zakresie od jednego milimola do 15 milimolów. Do kalibracji punktu zerowego użyj dwóch mikrolitrów wody dejonizowanej. Następnie dodaj do każdego 200 mikrolitrów roztworu odczynnika.

Dobrze inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmierz absorpcję przy 450 nanometrach za pomocą 96-dołkowego czytnika mikropłytek o wschodzie słońca i oprogramowania do wyszukiwania danych Magellan. Otwórz wykres wyników za pomocą arkusza kalkulacyjnego i skonstruuj standardową linię kalibracji krzywej.

Obliczyć aktywność dla każdej próbki. Następnie należy obliczyć aktywność beta frukto-tazy, odejmując wartości odpowiedniej kontroli ujemnej od aktywności próbki. Na koniec należy obliczyć produktywność właściwą, biorąc pod uwagę suchą masę biomasy i aktywność beta fruktosazy.

Umieścić trzy mililitry zawiesiny hodowli na plastikowej szalce Petriego i rozcieńczyć fizjologicznym roztworem chlorku sodu w celu rozdzielenia struktur morfologicznych. Jakość zdjęć mikroskopowych ma wyjątkowe znaczenie. W celu późniejszej analizy obrazu należy zachować ostrożność na etapie rozcieńczania.

Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem, który jest wyposażony w zintegrowaną kamerę. Zdobądź i zapisz około 100 obrazów struktur morfologicznych na próbkę, upewniając się, że co najmniej jeden obiekt jest w pełni zobrazowany na każdym obrazie. Kontynuuj w ten sam sposób z szalkami zawierającymi próbki z różnych reaktorów, uzyskując za każdym razem nowe obrazy.

Zwróć uwagę na różną morfologiczną formę wzrostu próbek z różnych reaktorów wyhodowanych z różnymi ilościami dodanego talku w proszku. Następnie otwórz wszystkie obrazy tej samej próbki w programie do przetwarzania obrazu. Obraz J.Korzystając z narzędzia procesu, utwórz plik binarny.

Konwertuj obrazy na czarno-białe, aby zastosować polecenie do całej serii obrazów. Użyj kodu makra Następnie otwórz jeden z obrazów zawierających podziałkę liniową. Skonstruuj linię prostą w poprzek podziałki liniowej, aby określić liczbę pikseli odpowiadających 2000 mikronom.

Wybierz narzędzie do analizy, ustaw pomiar i wybierz współczynniki kształtu, fretki, obszar średnicy i obwód. Użyj kodu makra, aby przetworzyć serię obrazów. Teraz otwórz arkusz kalkulacyjny, który przedstawia wyniki wartości współczynników kształtu.

Dla każdego obrazu oblicz liczbę morfologiczną dla każdego obrazu ze wszystkimi obrazami jednej próbki. Obliczyć średnią wartość liczby morfologicznej. Użyj programu do tworzenia wykresów i analizy danych, aby wykreślić liczbę morfologiczną z określoną wydajnością.

Określ zależność matematyczną za pomocą regresji matematycznej poprzez dodanie rosnących stężeń mikrocząstek talku. Osiem Niger SKAN 10 15. Morfologia została zmieniona z prawdziwej morfologii wysiewu na rozproszoną lub nawet moją morfologię, ponieważ oczekiwana morfologia wypluwki jest wykazywana w standardowych warunkach.

Co ciekawe, morfologia grzybni powstaje poprzez suplementację pożywki 10 gramami na litr mikrocząsteczek talku. Jednocześnie aktywność Beto Fructo tase wzrasta około trzykrotnie, suplementacja jednego lub trzech gramów na litr talku w proszku prowadzi do rozproszonej morfologii z podwojoną aktywnością fruktozy przy użyciu parametrów określonych przez automatyczną analizę obrazu. Morfologia zależna od mikrocząstek może być kompleksowo opisana przez morfologię.

Uwaga liczbowa, idealnie okrągłe w gładkich granulkach będą na obrazach mikroskopowych wyglądać jak idealne okręgi dla takich cząstek. Liczba morfologiczna ma wartość zbliżoną do jednej w warunkach standardowych. Morfologia w pierwszym reaktorze wykazuje liczbę morfologiczną około 0,8.

Morfologia w czwartym reaktorze z 10 gramami na litr. Talk w proszku ma liczbę morfologiczną około 0,1. Liczba morfologiczna dla reaktorów drugiego i trzeciego o stężeniu talku w proszku wynoszącym od jednego do trzech gramów na litr mieści się pomiędzy tymi skrajnościami, wykazując rozproszoną morfologię.

Ponieważ morfologia zależna od mikrocząstek jest ściśle związana z produktywnością cytów beta fruktozy, istnieje dobra matematyczna korelacja morfologii, liczby i produktywności po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biotechnologii do dalszego badania morfologii grzybów, a zwłaszcza jej związku z produktywnością. Podążając za tą procedurą szczegółowego tworzenia określonych morfologicznych typów krzyżówek grzybów, można zbadać inne ważne aspekty hodowli mikroorganizmów nitkowatych.

Na przykład morfologia grzybni jest znana z tego, że jest znacznie bardziej lepka niż morfologia podniebienia. W związku z tym ogólna wydajność procesu jest osłabiona przez problemy i oczyszczanie pożądanego produktu. Nasz numer morfologiczny pomoże w ustaleniu modeli dotyczących kultury, proteologii i pogłębi nasze zrozumienie morfologii grzybów w ogóle.