Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Celem tej metodologii jest obróbka delikatnych tkanek roślin, lęgniowców i grzybów w celu ich optymalnej obserwacji pod skaningowym mikroskopem elektronowym (SEM). Ta metoda może nam pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące praktycznie wszystkich grzybów, drobnoustrojów, morfologii oraz tego, jak infekują, kolonizują i przyczepiają się do swojego gospodarza. Technika zastosowana w naszej ulepszonej metodologii polega na utrwalaniu próbek, w których występują mi-toh-min w ekosystemach wodnych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na wizualizację kluczowych aspektów infekcji przy użyciu drogich i łatwo dostępnych zasobów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki zostały znacznie zmodyfikowane w stosunku do tradycyjnych protokołów. A opublikowane metody opisują ogólne procedury bez szczegółów.

Na początek przygotuj formol i alkohol octowy lub utrwalacz FAA w dygestorium wyposażonym w filtr aldehydowy. Po 85 częściach 70% denaturowanego etanolu, 10 częściach 60% roztworu formaldehydu i pięciu częściach lodowatego kwasu octowego. Pod dygestoriami wlej zapas FAA do pojedynczych pojemników.

Wybierz merystemy kwiatowe lub wegetatywne do zamocowania, upewniając się, że nie zostaną uszkodzone przez owady, grzyby lub ekstremalne warunki pogodowe. Odetnij gałęzie, usuwając niechciany materiał, i natychmiast umieść próbkę w roztworze FAA. Po 72 do 96 godzinach wlej FAA do plastikowego pojemnika w celu usunięcia chemikaliów.

Natychmiast umyj próbki trzykrotnie świeżym 70% etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości FAA. Materiał stały może być przechowywany w nieskończoność w 70% etanolu. Rozciąć próbki na szalkę Petriego pokrytą etanolem, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.

Użyj szalki Petriego z podstawą pokrytą suchym, czarnym silikonem, aby lepiej zobaczyć kontrastującą białą tkankę. Przenieś tkankę do oddzielnych pojemników, a następnie zanurz je na szalce Petriego z 70% etanolem. Załóż pokrywki na pojemniki i umieść je w plastikowej probówce wirówkowej z dużą ilością 70% etanolu.

Przełóż wypreparowany materiał przez serię etanolu w hermetycznych słoikach lub probówkach wirówkowych. Pozostawić próbki w każdym roztworze na co najmniej jedną godzinę. Następnie przechowuj próbki przez noc w 100% roztworze etanolu.

Po serii etanolu przenieś pojemniki z materiałem do CPD. Wpisz numer identyfikacyjny próbki pod uchwytami na próbki SEM. Następnie przykryj górną część odcinków taśmą dwustronną.

Umieść kikuty w uchwycie na próbki. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie otworzyć pojemniki z młodymi i delikatnymi próbkami już wysuszonymi w CPD. Należy pamiętać, że po zabiegu CPD próbki stają się lżejsze i wrażliwe na elektrostatykę.

Po wyjęciu próbek należy zamknąć pojemniki, aby uniknąć kurzu lub zanieczyszczeń. Umieść próbki na lepkiej powierzchni klocków, planując z wyprzedzeniem żądaną pozycję. Gdy próbki dotkną powierzchni, bardzo trudno jest je usunąć.

W tym momencie nie próbuj przeprowadzać poważnej sekcji. Wystarczy usunąć niechcianą tkankę, którą łatwo zebrać. W przypadku badań palinologicznych należy wypreparować pylniki i otworzyć je, aby odsłonić pyłek na pniakach.

Przechowuj próbki chronione przez noc w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym, aby uniknąć ponownego nawodnienia. Próbki należy pokryć za pomocą urządzenia do powlekania i przenieść je do SEM zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przetestować zróżnicowany wzrost kolców torbieli na oddzielnych szalkach Petriego, umieść 0,5 mililitra wtórnej zawiesiny torbieli na różnych powierzchniach.

Powierzchnie mogą obejmować siatki transmisyjnej mikroskopii elektronowej węglowej, złotej i miedzianej. Wcześniej bielone łuski ryb łososia i morszczuka oraz szkiełka nakrywkowe. Wysiaduj cysty w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 70 minut, co sprzyja przyczepianiu się cyst do powierzchni.

Usuń płyn i dodaj 0,5 mililitra 2% aldehydu glutarowego do każdej powierzchni w celu utrwalenia torbieli. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej w dygestorium przez jedną godzinę. Usunąć aldehyd glutarowy i odwodnić próbki za pomocą serii etanolu, dodając po pięć mililitrów każdego z roztworów etanolu przez 15 minut.

Po znalezieniu ostatniego 100% roztworu etanolu próbka może być przechowywana przez okres do miesiąca na szczelnie zamkniętej szalce Petriego. Ostrożnie przenieść siatki i łuski z szalki Petriego do uchwytu odpowiedniego dla CPD, który utrzymuje próbki oddzielnie od siebie, takiego jak uchwyt siatki CPD lub uchwyt do układania próbek. Weź siatkę i wagę za pomocą pęsety, pamiętając, że torbiele powinny być przez cały czas skierowane do góry na siatkach.

Przystąp do suszenia materiału za pomocą CPD przed wykonaniem przygotowania próbki SEM oocytów, aby obserwować ich zachowanie na różnych powierzchniach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Owiń każdą próbkę ostrożnie bibułą filtracyjną, tworząc koperty ołówkiem o powierzchni około 0,5 do jednego centymetra kwadratowego. Należy uważać, aby nie zgnieść próbek.

Uszczelnij bibułę filtracyjną spinaczami do papieru. Następnie przenieś zapakowane próbki na szalkę Petriego i zanurz je w 10 mililitrach wody, aby ponownie nawodnić tkankę wokół zarodników. Natychmiast umieść próbki w kuchence mikrofalowej.

Usuń materiał, gdy woda zacznie parować i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej. Następnie przepuścić próbkę przez serię etanolu. W zależności od ilości próbki do tego etapu należy użyć zlewki lub probówki wirówkowej.

Pozostawić próbki na 15 minut w każdym roztworze. Następnie umieść próbki w CPD zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zamontować zarodniki do obserwacji SEM, otwórz koperty.

Następnie zbierz zarodniki lepką powierzchnią kikutów, uważając, aby ich nie zmiażdżyć. Na koniec wykonaj złoto na próbki i obserwację SEM, jak opisano w protokole tekstowym. Pokazano tutaj pąki kwiatowe anacyclus clavatus potraktowane tetratlenkiem osmu i przygotowane przy użyciu protokołu FAA CPD pokazanego na tym filmie.

Pokazane są również wysuszone próbki Phellorinia herculanea bez żadnej obróbki, a także zarodniki grzybów potraktowane tak, jak pokazano na tym filmie. Rysunek ten ilustruje wczesny, średni i późny rozwój kwiatów uchwycony w ramach SEM. To zdjęcie przedstawia widok z góry młodego reh-cima.

Pokazany tutaj jest pączek kwiatowy podczas różnicowania gynesium i kwiat w okresie kwitnienia. Niektóre struktury mogą być trudne do naprawienia i zachowania do obrazowania w ramach SEM. Przykładami są te pochodzące z wilgotnego środowiska, a także te z ornamentami i te z indumenta.

Pokazano tutaj zróżnicowane wzorce wzrostu kolców Saprolegnia parasitica na szkle, węglu, miedzi, złocie, łuskach morszczuka i łuskach łososia. To jest film pokazujący bezpłciowy cykl życiowy Saprolegnia parasitica. Bezpłciowy cykl życiowy jest ważny dla rozprzestrzeniania się tych organizmów w ich środowisku wodnym lub wilgotnym.

Co więcej, wytworzone w tym stadium świnie z ogrodów zoologicznych stanowią pierwotną jednostkę zakażenia u gatunków pasożytniczych z rzędu saprolegniali. Chociaż opanowanie tej techniki można wykonać w ciągu trzech do pięciu dni, jest ona wykonywana prawidłowo. Wykorzystaliśmy pieniądze na wykonanie terapii SEM, które w tym czasie zostały udostępnione do użytku zewnętrznego w Królewskim Ogrodzie Botanicznym w Madrycie.

Po obejrzeniu tego filmu naukowcy wiedzieliby, jak skutecznie zbierać i utrwalać delikatny materiał biologiczny do obserwacji SEM. Dzięki tej procedurze można łatwo przezwyciężyć zniszczenie komórek, zniekształcenie narządów lub złe zachowanie próbek z wilgotnego środowiska. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że obserwacja za pomocą SEM ogranicza się do badania powierzchni w dużym powiększeniu.

Również przed obróbką CPD uszczelki muszą być zabezpieczone przed gwałtownymi zmianami i bezpośrednim kontaktem z powietrzem. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fitologią do badania struktury zarodników podczas procesu zakaźnego, szczególnie u gatunków będących przedmiotem zainteresowania rybołówstwa. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia transmisyjna lub TM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wewnętrzna struktura składu komórkowego w określonych narządach lub komórkach lub pyłek.

Nie zapominaj, że manipulowanie formaliną i aldehydem glutarowym może być niezwykle niebezpieczne, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca pod dygestoriami oraz używanie masek, fartuchów laboratoryjnych i rękawiczek.