Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami
15 grudnia 2017
Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.
Ogólnym celem tego specyficznego dla celu obrazowania in vivo jest wizualizacja molekularnych markerów aktywności choroby w nieswoistym zapaleniu jelit. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nieswoistych zapaleń jelit i związanych z nimi badań terapeutycznych dotyczących wpływu eksperymentalnych terapii lub określonych zdarzeń komórkowych na stan zapalny. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność choroby można monitorować podłużnie i nieinwazyjnie.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zaburzenia zapalne, może być również stosowana do badania innych chorób, takich jak rak lub choroby związane z odpornością. Aby wywołać zapalenie jelita grubego, napełnij zapas wody pitnej myszy eksperymentalnych dwoma gramami siarczanu sodu dekstranu lub DSS, rozpuszczonymi w 100 mililitrach autoklawowanej wody pitnej, co daje pięć mililitrów wody na mysz dziennie. Na 24 godziny przed skanowaniem należy załadować interesujący nas koktajl przeciwciał do sterylnej strzykawki zabezpieczonej przed światłem i wstrzyknąć przeciwciała dożylnie do żył ogonowych zwierząt doświadczalnych.
W dniu eksperymentu użyj elektrycznej maszynki do golenia sierści w okolicy brzucha zwierząt doświadczalnych, aby zminimalizować odbicie i absorpcję światła. Używając fantomu naśladującego tkankę o określonej grubości i charakterystyce absorpcji, napełnij fantom określoną objętością roztworu przeciwciała, który Cię interesuje, i zmierz fluorescencję na urządzeniu FMT. Następnie, w weterynaryjnej tomografii fluorescencyjnej lub urządzeniu FMT dla małych zwierząt, kliknij przycisk Nowe badanie i dołącz odpowiednie znaczniki w opisie badania, w tym parametry obrazowania i dawki.
Twórz grupy badawcze zgodnie z planem eksperymentu, wyposażając każdą grupę w odpowiednią liczbę zwierząt. Po skalibrowaniu systemu dla konstruktów znacznikowych, umieść pierwszą znieczuloną mysz w pozycji leżącej w kasecie do badań podgrzewanej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Włóż kasetę do systemu obrazowania i wybierz odpowiednią próbkę z odpowiedniej grupy badawczej.
Wybierz podany znacznik, aby upewnić się, że wartości stężenia znacznika są prawidłowo obliczone, i uzyskaj obraz odbicia fluorescencji o odpowiedniej długości fali dla skanowania. Kliknij przycisk Pobierz obraz, aby obrysować pole skanowania i potwierdzić, że pole skanowania pojawia się jako nakładka na obraz odbicia fluorescencji. Dostosuj pole skanowania tak, aby otaczało obszar zainteresowania, uważając, aby uniknąć błędu lub obszarów pozostałego futra.
W zależności od docelowego obrazu wybierz rozdzielczość pola skanowania, aby ustawić liczbę punktów danych obrazu w polu skanowania. Następnie kliknij Skanuj, aby rozpocząć akwizycję obrazu na wybranej długości fali. Pod koniec skanowania wyjmij zwierzę z kasety, aby zwierzę mogło w pełni wyzdrowieć dzięki monitorowaniu przed powrotem do klatki.
FMT można następnie powtórzyć w różnych punktach czasowych, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. Aby przeanalizować uzyskane obrazy, otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazowania i wybierz surowe dane do pierwszego skanowania. Korzystając z narzędzia do rekonstrukcji, utwórz mapy 3D rozkładu fluorescencji.
Gdy wszystkie skany zostaną dodane do odpowiedniego zestawu danych rekonstrukcji, otwórz pierwszy interesujący Cię zestaw danych. Pokazane zostaną wszystkie skany wykonane dla wybranego indywidualnego zwierzęcia doświadczalnego. Wybierz odpowiednie skanowanie i kliknij przycisk Załaduj.
Rekonstrukcja 3D rozkładu znaczników pojawi się jako nakładka na początkowo uzyskany obraz odbicia fluorescencji. Następnie zidentyfikuj ogniska akumulacji nieokreślonych etykiet na zrekonstruowanych mapach 3D i użyj narzędzia pomiarowego, aby wybrać obszar zainteresowania. Oprogramowanie następnie wygeneruje intensywność fluorescencji dla obszaru zainteresowania, a także pomiary ilości pikomolarnej znacznika, dla którego skan został skalibrowany.
W tym eksperymencie zastosowano fluorescencyjne sprzężone przeciwciało przeciwko mysiemu F4/80 do bezpośredniej wizualizacji aktywowanych makrofagów. Znacznie podwyższoną akumulację znacznika fluorescencyjnego mierzono za pomocą tomografii fluorescencyjnej w okrężnicy myszy z colikiem w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi bez kolity, co wskazuje na wzrost nacieku monocytów i różnicowania do aktywnych makrofagów u zwierząt z grupy coli. I odwrotnie, zastosowanie przeciwciała IgG sprzężonego z niespecyficzną fluorescencją nie wywołało wykrywalnej odpowiedzi fluorescencyjnej w jamie brzusznej lub jelicie ani w grupie kontrolnej z kolitem, ani bez kolity, co wskazuje na specyficzność interakcji sonda-cel przeciwciała F4 / 80.
Pomiary ex vivo akumulacji znacznika ukierunkowanego na F4/80 w eksplantowanych okrężnicach dodatkowo weryfikują pochodzenie okrężnicy wykrytej in vivo akumulacji sygnału znacznikowego F4/80. Rzeczywiście, obliczone ilości związanego przeciwciała dobrze korelują z histologicznie określoną liczbą naciekających makrofagów, potwierdzając, że obrazowanie in vivo ze specyficznymi znacznikami może wskazywać na miejscową aktywność choroby. Po opanowaniu można to wykonać i przeanalizować w ciągu kilku minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.
Etapy przygotowania, w tym produkcja specyficznych znaczników na bazie przeciwciał, trwają zwykle od dwóch do trzech dni. Planując procedurę doświadczalną, taką jak ta, ważne jest, aby uwzględnić odpowiednie i wiarygodne kontrole, zarówno w odniesieniu do przeciwciał, jak i modelu choroby zwierzęcej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak kolonoskopia lub cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania oraz zweryfikować i określić ilościowo dane.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia docelowej podejście do obrazowania in vivo, aby wizualizować molekularne markery aktywności choroby w zapalnych chorobach jelit. Wykorzystując ilościową trójwymiarową tomografię, badanie koncentruje się na infiltracji makrofagów w jelitach w mysim modelu zapalenia jelita grubego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Zapalne choroby jelit
Tło
- Docelowe sondy to innowacyjne narzędzia do analizy mechanizmów molekularnych.
- Mogą być stosowane do badania ekspresji białek w różnych chorobach.
- Ta metoda pozwala na długotrwałe i nieinwazyjne monitorowanie aktywności choroby.
- Może być stosowana do chorób zapalnych, raka i chorób związanych z układem odpornościowym.
Cel badania
- Aby wizualizować molekularne markery aktywności choroby w zapalnych chorobach jelit.
- Aby odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach terapeutycznych dotyczących zapalenia.
- Aby ocenić wpływ eksperymentalnych terapii na zapalenie.
Stosowane metody
- Indukcja zapalenia jelita grubego za pomocą siarczanu dekstrany (DSS).
- Podawanie koktajlu przeciwciał dożylnie do eksperymentalnych myszy.
- Tomografia fluorescencyjna do obrazowania infiltracji makrofagów.
- Długotrwałe monitorowanie aktywności choroby in vivo.
Główne wyniki
- Skuteczne wizualizowanie infiltracji makrofagów w jelitach.
- Wykazanie zdolności do nieinwazyjnego monitorowania aktywności choroby.
- Dostarczenie informacji o dynamice zapalenia w zapaleniu jelita grubego.
- Zidentyfikowano potencjalne zastosowania do badania innych chorób.
Wnioski
- Docelowe podejście do obrazowania jest skuteczne w badaniu zapalnych chorób jelit.
- Ta metoda może poprawić rozumienie mechanizmów choroby i efektów terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie na inne choroby zapalne i związane z układem odpornościowym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
