Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Ogólnym celem tego specyficznego dla celu obrazowania in vivo jest wizualizacja molekularnych markerów aktywności choroby w nieswoistym zapaleniu jelit. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nieswoistych zapaleń jelit i związanych z nimi badań terapeutycznych dotyczących wpływu eksperymentalnych terapii lub określonych zdarzeń komórkowych na stan zapalny. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność choroby można monitorować podłużnie i nieinwazyjnie.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zaburzenia zapalne, może być również stosowana do badania innych chorób, takich jak rak lub choroby związane z odpornością. Aby wywołać zapalenie jelita grubego, napełnij zapas wody pitnej myszy eksperymentalnych dwoma gramami siarczanu sodu dekstranu lub DSS, rozpuszczonymi w 100 mililitrach autoklawowanej wody pitnej, co daje pięć mililitrów wody na mysz dziennie. Na 24 godziny przed skanowaniem należy załadować interesujący nas koktajl przeciwciał do sterylnej strzykawki zabezpieczonej przed światłem i wstrzyknąć przeciwciała dożylnie do żył ogonowych zwierząt doświadczalnych.

W dniu eksperymentu użyj elektrycznej maszynki do golenia sierści w okolicy brzucha zwierząt doświadczalnych, aby zminimalizować odbicie i absorpcję światła. Używając fantomu naśladującego tkankę o określonej grubości i charakterystyce absorpcji, napełnij fantom określoną objętością roztworu przeciwciała, który Cię interesuje, i zmierz fluorescencję na urządzeniu FMT. Następnie, w weterynaryjnej tomografii fluorescencyjnej lub urządzeniu FMT dla małych zwierząt, kliknij przycisk Nowe badanie i dołącz odpowiednie znaczniki w opisie badania, w tym parametry obrazowania i dawki.

Twórz grupy badawcze zgodnie z planem eksperymentu, wyposażając każdą grupę w odpowiednią liczbę zwierząt. Po skalibrowaniu systemu dla konstruktów znacznikowych, umieść pierwszą znieczuloną mysz w pozycji leżącej w kasecie do badań podgrzewanej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Włóż kasetę do systemu obrazowania i wybierz odpowiednią próbkę z odpowiedniej grupy badawczej.

Wybierz podany znacznik, aby upewnić się, że wartości stężenia znacznika są prawidłowo obliczone, i uzyskaj obraz odbicia fluorescencji o odpowiedniej długości fali dla skanowania. Kliknij przycisk Pobierz obraz, aby obrysować pole skanowania i potwierdzić, że pole skanowania pojawia się jako nakładka na obraz odbicia fluorescencji. Dostosuj pole skanowania tak, aby otaczało obszar zainteresowania, uważając, aby uniknąć błędu lub obszarów pozostałego futra.

W zależności od docelowego obrazu wybierz rozdzielczość pola skanowania, aby ustawić liczbę punktów danych obrazu w polu skanowania. Następnie kliknij Skanuj, aby rozpocząć akwizycję obrazu na wybranej długości fali. Pod koniec skanowania wyjmij zwierzę z kasety, aby zwierzę mogło w pełni wyzdrowieć dzięki monitorowaniu przed powrotem do klatki.

FMT można następnie powtórzyć w różnych punktach czasowych, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. Aby przeanalizować uzyskane obrazy, otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazowania i wybierz surowe dane do pierwszego skanowania. Korzystając z narzędzia do rekonstrukcji, utwórz mapy 3D rozkładu fluorescencji.

Gdy wszystkie skany zostaną dodane do odpowiedniego zestawu danych rekonstrukcji, otwórz pierwszy interesujący Cię zestaw danych. Pokazane zostaną wszystkie skany wykonane dla wybranego indywidualnego zwierzęcia doświadczalnego. Wybierz odpowiednie skanowanie i kliknij przycisk Załaduj.

Rekonstrukcja 3D rozkładu znaczników pojawi się jako nakładka na początkowo uzyskany obraz odbicia fluorescencji. Następnie zidentyfikuj ogniska akumulacji nieokreślonych etykiet na zrekonstruowanych mapach 3D i użyj narzędzia pomiarowego, aby wybrać obszar zainteresowania. Oprogramowanie następnie wygeneruje intensywność fluorescencji dla obszaru zainteresowania, a także pomiary ilości pikomolarnej znacznika, dla którego skan został skalibrowany.

W tym eksperymencie zastosowano fluorescencyjne sprzężone przeciwciało przeciwko mysiemu F4/80 do bezpośredniej wizualizacji aktywowanych makrofagów. Znacznie podwyższoną akumulację znacznika fluorescencyjnego mierzono za pomocą tomografii fluorescencyjnej w okrężnicy myszy z colikiem w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi bez kolity, co wskazuje na wzrost nacieku monocytów i różnicowania do aktywnych makrofagów u zwierząt z grupy coli. I odwrotnie, zastosowanie przeciwciała IgG sprzężonego z niespecyficzną fluorescencją nie wywołało wykrywalnej odpowiedzi fluorescencyjnej w jamie brzusznej lub jelicie ani w grupie kontrolnej z kolitem, ani bez kolity, co wskazuje na specyficzność interakcji sonda-cel przeciwciała F4 / 80.

Pomiary ex vivo akumulacji znacznika ukierunkowanego na F4/80 w eksplantowanych okrężnicach dodatkowo weryfikują pochodzenie okrężnicy wykrytej in vivo akumulacji sygnału znacznikowego F4/80. Rzeczywiście, obliczone ilości związanego przeciwciała dobrze korelują z histologicznie określoną liczbą naciekających makrofagów, potwierdzając, że obrazowanie in vivo ze specyficznymi znacznikami może wskazywać na miejscową aktywność choroby. Po opanowaniu można to wykonać i przeanalizować w ciągu kilku minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Etapy przygotowania, w tym produkcja specyficznych znaczników na bazie przeciwciał, trwają zwykle od dwóch do trzech dni. Planując procedurę doświadczalną, taką jak ta, ważne jest, aby uwzględnić odpowiednie i wiarygodne kontrole, zarówno w odniesieniu do przeciwciał, jak i modelu choroby zwierzęcej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak kolonoskopia lub cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania oraz zweryfikować i określić ilościowo dane.