Name: Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj tomografię fluorescencyjną do wykrywania zapalenia jelit u myszy poprzez obrazowanie infiltracji makrofagów. Ta metoda umożliwia nieinwazyjny, długotrwały monitoring aktywności choroby in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Sonji Dufentester, Pani Elke Weber i Pani Klaudii Niepagenkämper za doskonałą pomoc techniczną.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (Tierschutzgesetz).
1. Materiały i konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Opieka nad zwierzętami.
	<ol>
		<li>Użyj myszy dopasowanych pod względem płci i wieku dowolnego szczepu podatnego na DSS (np. C57BL/6) o masie ciała 20-25 g.</li>
		<li>Zaplanuj co najmniej pięć lub więcej myszy na grupę eksperymentalną i trzymaj myszy zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.</li>
		<li>Zapewnij standardową dietę dla gryzoni i autoklawowaną wodę pitną ad libitum.</li>
		<li>Usuń standardową karmę i zastąp ją karmą wolną od lucerny co najmniej trzy dni przed skanowaniem, aby zmniejszyć autofluorescencję endoluminalną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja ostrego zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS.
	<ol>
		<li>Rozpuść 2 g DSS (masa cząsteczkowa ~40 000 Da) w 100 ml autoklawowanej wody pitnej, aby uzyskać 2% (w/v roztwór).</li>
		<li>Napełnij zapas napojów myszy wyłącznie roztworem DSS i oszacuj 5 ml płynu na mysz dziennie. Dostarcz tę samą wodę pitną bez DSS myszom kontrolnym10. 
		UWAGA: Monitoruj myszy codziennie do końca eksperymentu. Poddaj eutanazji myszy, które tracą więcej niż 20% swojej początkowej masy ciała lub które stają się w stanie agonalnym (tj. uporczywie zgarbiona postawa, zmniejszony ruch, utrudnione oddychanie, wyraźnie wyprostowana sierść) zgodnie z lokalnymi obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tomografii fluorescencyjnej.
	<ol>
		<li>Oznaczyć pożądane przeciwciało (np. szczurze przeciwciało anty-mysie F4/80) barwnikiem fluorescencyjnym (np. cyjanina7,wzbudzenie λ: 750 nm,emisja λ: 776 nm) zgodnie z opisem w protokole producenta. Oczyszczone przeciwciało należy dializować w odpowiedniej membranie dializacyjnej (wielkość porów < 50-100 kDa) w stosunku do 1 l 0,15 M chlorku sodu przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
		<ol>
			<li>Przenieść przeciwciało do 1 l 0,1 MNaHCO3 i dializować przez co najmniej 2 godziny.</li>
			<li>Rozpuścić wymaganą ilość barwnika fluorescencyjnego w dimetylosulfotlenku (DMSO) (10,8 μl/mg przeciwciała) i dodać go do roztworu przeciwciała. Użyj barwnika fluorescencyjnego w 20-krotnym nadmiarze molowym, aby uzyskać stosunek barwnika do białka 1:3.</li>
			<li>Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Usunąć nieznakowane przeciwciało przez dializę przeciwko 1 litrowi 0,15 M sodu lub przy użyciu kolumny odsalającej PD-10 i rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stosowania in vivo.</li>
			<li>Określić końcowe stężenie przeciwciał i współczynnik znakowania za pomocą spektrofotometrii.</li>
			<li>Zmierz stężenie białka przy absorpcji 250-330 nm i rozważ dodatkowe wchłanianie przez barwnik. Skorygować maksymalną absorpcję przy 280 nm (białko) o 11% maksymalnej absorpcji przy 750 nm (następny krok) dla znakowania cyjaniną7.</li>
			<li>Zmierzyć rozcieńczenie związku (zwykle 1:10) przy 250-800 nm i wyekstrahować stężenie cyjaniny7 przy 750 nm.</li>
			<li>Określ stosunek barwnika do białka jako: barwnik/przeciwciało = maksymalna absorpcja przy 750 nm / 200 000 / (maksymalna absorpcja przy 280 nm - 0,11 x maksymalna absorpcja przy 750 nm) / 170 000.</li>
			<li>Roztwór przeciwciał należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem, aby uniknąć bielenia przed wstrzyknięciem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy umieścić niezbędną objętość roztworu przeciwciał w sterylnej strzykawce i chronić przed światłem do czasu jego użycia.</li>
		<li>Określ optymalny czas wstrzyknięcia sondy i procedury skanowania, w zależności od farmakokinetyki znacznika.</li>
		<li>Znieczulić myszy za pomocą 1,5 - 2,5% wziewnego izofluranu w tlenie lub umieścić je bezpiecznie w specjalnym ograniczniku do wstrzykiwania znakowanych przeciwciał do żyły ogonowej.</li>
		<li>W przypadku przeciwciał o pełnej długości należy wstrzyknąć znakowane przeciwciało co najmniej 24 godziny przed skanowaniem, na przykład w celu wizualizacji makrofagów F4/80 przeciwko mysim mięśniom w mysim zapaleniu jelita grubego. Wstrzyknąć myszom dożylnie (dożylnie) przez żyłę ogonową znakowane przeciwciało w ilości odpowiadającej 2,0 nmol barwnika.</li>
		<li>Stosować jednakowo znakowane nieswoiste przeciwciała (np. szczurzą IgG lub inny izotyp odpowiadający dziedzictwu przeciwciał pierwotnych) jako kontrolę izotypu w dawkach równoważnych dawkom specyficznej sondy. 
		UWAGA: Wyniki skanów in vivo po wstrzyknięciu związku kontrolnego mogą służyć jako odniesienie do interpretacji konkretnych danych obrazowania sondy.</li>
		<li>Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić sierść zwierzęcia w okolicy brzucha, aby zminimalizować odbicie i absorpcję światła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyposażenie techniczne
<ol>
	<li>Użyj weterynaryjnego urządzenia do tomografii fluorescencyjnej (FMT) do fluorescencji małych zwierząt ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Utwórz nowe badanie dla każdego projektu, klikając przycisk "nowe badanie" i dołącz do opisu badania odpowiednie znaczniki, w tym parametry obrazowania i dawki do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>W ramach tego badania należy utworzyć grupy badawcze zgodnie z odpowiednim projektem badania (np. dla specyficznego znacznika i kontroli izotypu niespecyficznego), klikając przycisk "nowa grupa badawcza". Wyposaż każdą badaną grupę w odpowiednią liczbę zwierząt.</li>
	<li>Skalibruj system dla konstrukcji znacznikowych.
	<ol>
		<li>Wykonaj kalibrację dla każdej partii znaczników, aby znormalizować różnice w etykietowaniu i umożliwić pomiar ilościowy na podstawie danych OI.</li>
		<li>Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta urządzenia dotyczącymi kalibracji każdego pojedynczego systemu; po wybraniu opcji "dodaj nowy znacznik" system zapewni przewodnik przez kolejne kroki. Podać rozcieńczenie zastosowanego roztworu przeciwciała i obliczone bezwzględne stężenie znacznika w sondzie.</li>
		<li>W przypadku FMT należy użyć fantomu naśladującego tkankę o określonej grubości i charakterystyce wchłaniania (przypominającego żywą tkankę) i wypełnić go określoną objętością użytego roztworu przeciwciała. Zmierz to na urządzeniu FMT. 
		UWAGA: System użyje pomiaru referencyjnego dostarczonej sondy wraz z podanym stężeniem do obliczenia bezwzględnych stężeń znaczników z przyszłych pomiarów in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj podgrzewanej kasety badawczej o temperaturze 42 °C. 
	UWAGA: Zapobiega to hipotermii myszy podczas badania.</li>
</ol>
3. Znieczulenie zwierząt
<ol>
	<li>Do znieczulenia myszy należy użyć ciągłego przepływu izofluranu o stężeniu 1,5 - 2% obj. ([2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan]) i 1,5 lO2/min. Używaj specjalnie zaprojektowanych systemów inhalacyjnych do znieczulenia gryzoni (parownik izofluranu), aby łatwo kontrolować głębokość znieczulenia i zminimalizować narażenie personelu.</li>
	<li>Umieść mysz w szczelnej komorze indukcyjnej i włącz parownik w celu dostarczenia izofluranu (100% (v/v), 5% obj. tlenu, 3 l/min). Monitoruj mysz, dopóki nie położy się i nie straci przytomności.</li>
	<li>Umieść go w kasecie z badaniem do tomografii, z ciągłą inhalacją izofluranu przez stożek nosowy w dawce 100% v/v, 1,5% obj. tlenu, 1,5 l/min, aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas badania. W przypadku zabiegów trwających dłużej niż 5 minut należy nałożyć maść na oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.</li>
	<li>Oceń głębokość znieczulenia, sprawdzając odruchy. Połóż mysz na plecach; Jeśli znieczulenie jest wystarczające, mysz nie powinna się odwracać. Delikatnie ściśnij mysz między palcami; Jeśli znieczulenie jest wystarczające, noga nie zostanie wycofana (etap tolerancji chirurgicznej).</li>
</ol>
4. Tomografia za pośrednictwem fluorescencji
UWAGA: Dostosuj następujące szczegóły, które są specyficzne dla systemu FMT użytego w tym badaniu (zobacz Tabelę materiałów) do alternatywnych urządzeń do obrazowania fluorescencji lub systemów FMT, zgodnie z potrzebami.
<ol>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na plecach w kasecie z badaniami.</li>
	<li>Wykonaj procedurę skanowania.
	<ol>
		<li>Włóż kasetę do systemu obrazowania i natychmiast ją zamknij, aby zapewnić ciągłe znieczulenie. Należy wybrać odpowiednią próbę z utworzonej wcześniej grupy analitycznej. Wybierz podany znacznik z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wartości stężenia znacznika są prawidłowo obliczone.</li>
		<li>Uzyskaj obraz odbicia fluorescencji o odpowiedniej długości fali (720 nm dla cyjaniny7) w celu zaplanowania skanowania i nakreśl pole skanowania, klikając przycisk "uzyskaj obraz".</li>
		<li>Sprawdź, czy pole skanowania pojawia się jako nakładka na obraz odbicia fluorescencji. Dopasuj go do interesującego Cię obszaru (np. okrężnicy lub brzucha), omijając powietrze lub obszary pozostałej sierści. W zależności od docelowego obrazu ustaw liczbę punktów danych obrazu w polu skanowania, wybierając rozdzielczość pola skanowania od zgrubnej do średniej i dokładnej w menu po prawej stronie. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że dokładne pole skanowania może oferować lepszą rozdzielczość przestrzenną kosztem znacznie dłuższego czasu skanowania.</li>
		<li>Rozpocznij akwizycję danych/obrazu na wybranej długości fali, klikając "skanuj" 
		UWAGA: Czas skanowania w przypadku średnio dokładnego skanu całego brzucha wyniesie około 5 minut; W tym czasie każdy punkt danych jest oddzielnie oświetlany przez laser wzbudzający, a uzyskana fluorescencja jest rejestrowana.</li>
		<li>Po zakończeniu skanowania wyjmij zwierzę z kasety obrazowej i pozwól zwierzęciu całkowicie dojść do siebie przed umieszczeniem go z powrotem w klatce.</li>
		<li>Powtórzyć FMT, jeśli uzna to za konieczne, w różnych punktach czasowych podczas eksperymentu (np. dni 0, 5 i 9 - 10 (koniec eksperymentu)), ale należy wziąć pod uwagę akumulację przeciwciał w organizmie, zwiększając w ten sposób sygnał fluorescencji tła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Po skanowaniu
<ol>
	<li>Umieść mysz w osobnej klatce na ręczniku papierowym pod podgrzewającą lampą z czerwonym światłem i monitoruj mysz pod kątem oznak dyskomfortu lub niepokoju, aż do pełnego wyzdrowienia. Umieść mysz z powrotem w odpowiedniej klatce, gdy jest w pełni obudzona.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji pod koniec eksperymentu poprzez dostarczenie CO2 do izolatora w dawce 100% (v/v), 100% obj. i 3 l/min. Nie napełniaj komory CO2 , ponieważ nagłe narażenie na wysokie stężenia CO2 może spowodować niepokój. Zweryfikuj śmierć po tym, jak mysz przestanie oddychać, poprzez późniejszy wtórny tryb eutanazji, taki jak szybkie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Usunąć okrężnicę przez laparotomię brzuszną i wykonać skan ex vivo eksplantowanej okrężnicy, jak wyjaśniono w krokach 4.2.1 - 4.2.4. Każdą okrężnicę należy otworzyć wzdłużnie za pomocą nożyczek chirurgicznych Metzenbaum i dokładnie spłukać roztworem soli fizjologicznej przed przygotowaniem jej do dalszej analizy.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wytnij 0,5-centymetrowy fragment z dystalnej części okrężnicy i natychmiast umieść go w 1,5 ml probówki kriogenicznej. Zamrozić go w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszego użycia (np. pomiary mieloperoksydazy (MPO)).</li>
	<li>Za pomocą drewnianego patyczka zwiń pozostałą podłużnie otwartą okrężnicę od dystalnego do bliższego końca, z błoną śluzową na zewnątrz ("technika szwajcarskiego rolla") do analiz histologicznych. Umieścić preparat w utrwalaczu (patrz Tabela Materiałów) i zamrozić w temperaturze -80 °C14.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja i interpretacja danych
<ol>
	<li>Użyj narzędzia do rekonstrukcji odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby utworzyć mapy 3D rozkładu fluorescencji na podstawie surowych danych obrazowych; skany są automatycznie dodawane do narzędzia do rekonstrukcji, gdy podczas skanowania wybrana jest funkcja "dodaj do kolejki rekonstrukcji".
	<ol>
		<li>W przeciwnym razie wybierz skany z menu rozwijanego pod odpowiednim badaniem i grupą badawczą, kliknij skan prawym przyciskiem myszy i wybierz "dodaj do rekonstrukcji".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu dalszej analizy załaduj zestaw danych do oprogramowania analitycznego. Z menu rozwijanego na górnym pasku wybierz odpowiednie badanie, a następnie wybierz grupę badawczą i pojedyncze zwierzę z menu po prawej stronie; Zostaną wyświetlone wszystkie skany wykonane dla tego zwierzęcia. Wybierz właściwe skanowanie i kliknij "załaduj." 
	UWAGA: Rekonstrukcja 3D rozkładu znacznika pojawi się po lewej stronie jako nakładka początkowo uzyskanego obrazu odbicia fluorescencji. Model można obracać i powiększać w celu łatwiejszej analizy.</li>
	<li>Zidentyfikuj ogniska akumulacji niespecyficznej etykiety (np. wątroba lub pęcherz moczowy) na zrekonstruowanych mapach 3D i odróżnij je od tkanek docelowych (np. jelita lub jelita).</li>
	<li>Na górnym pasku wybierz kształt ROI najbardziej odpowiedni dla celu. Oznacz tkankę docelową jako obszary zainteresowania (ROI), umieszczając odpowiednie narzędzia pomiarowe w oprogramowaniu analitycznym; oprogramowanie zapewni intensywność fluorescencji dla ROI, a także (piko-)molowe ilości znacznika, dla którego skan został skalibrowany.</li>
	<li>Wybierz całkowitą ilość znacznika w odpowiednim ROI, znormalizowaną dla wielkości ROI, jako najbardziej odpowiedni równoważnik do oceny aktywności choroby w korelacji z naciekiem zapalnym (histologia). 
	UWAGA: Inne cechy ROI można wybrać w razie potrzeby jako reprezentatywne dla konkretnego modelu.</li>
</ol>
7. Analizy ex vivo
<ol>
	<li>Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie immunofluorescencyjne.
	<ol>
		<li>Odparafinować skrawki, umieszczając je w 70% etanolu (EtOH) na 2 minuty, a następnie spłukać wodą destylowaną. Plamić roztworem hematoksyliny przez 5 minut, a następnie płukać ciepłą wodą z kranu przez 10 minut.</li>
		<li>Spłucz wodą destylowaną, zabarwij roztworem eozyny przez 2 minuty i ponownie spłucz wodą destylowaną.</li>
		<li>Umieść w 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH i ksylenie (2 razy) na 2 minuty każdy, aby odwodnić i oczyścić sekcje. Zamontuj za pomocą żywicznego medium montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne.
	<ol>
		<li>Do barwienia immunofluorescencyjnego należy wykorzystać uzyskane wcześniej skrawki tkanek ("szwajcarska rolka") i przygotować kriogeniczne skrawki o wielkości 7 μm.</li>
		<li>Zablokować utrwalone acetonem i zamrożone skrawki jelita grubego w 5,0% surowicy szczura na 10 minut i inkubować przez noc z rozcieńczonym (1/500 v/v) biotynylowanym pierwotnym przeciwciałem przeciw myszom szczurzym F4/80. Przemyć skrawki trzykrotnie w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) i inkubować ze Streptavidin-FITC (1:100 v/v) w PBS/BSA (0,1% w/v) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj skrawki w TBS i zabarwij 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI, 1:1000 v/v), aby uzyskać kontrast. Przeanalizuj obrazy fluorescencyjne pod mikroskopem konfokalnym (patrz tabela materiałów; powiększenie 40x; kostka filtra N2.1 z filtrem wzbudzenia 515 - 560) i policz komórki F4/80-dodatnie na pole dużej mocy. 
		UWAGA: Rozważ użycie przeciwciał o tym samym klonie i formacie podczas łączenia analiz histologicznych in vivo FMT i pośmiertnych, takich jak immunohistochemia lub barwienie immunofluorescencyjne, w zależności od zamierzonego celu. Do wykrywania makrofagów F4/80-dodatnich in vivo i ex vivo zastosowano różne formaty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary MPO w próbkach jelita grubego.
	<ol>
		<li>Do pomiarów MPO należy użyć świeżo uzyskanych, przepłukanych PBS próbek jelita grubego lub rozmrożonej próbki. Zważyć wszystkie próbki i homogenizować tkankę w buforze do lizy dostarczonym w zestawie ELISA (patrz tabela materiałów) w objętości 20 μl buforu do lizy na mg tkanki.</li>
		<li>Sonikować przez 15 s (częstotliwość sonikacji: 20 kHz, moc: 70 W) i odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Używaj dostępnego w handlu zestawu ELISA (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem producenta. Przeprowadź test w dwóch egzemplarzach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bruckner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+endoscopy+for+in+vivo+multimodal+imaging+of+carcinogenesis+and+assessment+of+intestinal+wound+healing+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+imaging.+current+technology+and+perspectives+for+oncological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging.</a> Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).</li>
<li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+18F-FDG+PET%2FCT+imaging+to+monitor+lesion+activity+in+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation.</a> J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).</li>
<li>Vowinkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-IV+inhibits+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis.</a> J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).</li>
<li>Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lipid+bilayer+phases+by+confocal+microscopy+and+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).</li>
<li>Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+tomography+resolves+protease+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo.</a> Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).</li>
<li>Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+with+near-infrared+light%3A+new+technological+advances+that+enable+in+vivo+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging.</a> Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).</li>
<li>Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tomographic+imaging+of+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes.</a> Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).</li>
<li>Ballou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+labeling+in+vivo+using+cyanine-conjugated+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies.</a> Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).</li>
<li>Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+advances+in+research+of+chemically+induced+experimental+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).</li>
<li>Nowacki, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5A+apolipoprotein+A-I+%28apoA-I%29+mimetic+peptide+ameliorates+experimental+colitis+by+regulating+monocyte+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration.</a> Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).</li>
<li>Hansch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+experimental+arthritis+with+near-infrared+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+Technique+for+Intestinal+Tissue+Preparation+for+Immunohistochemical+and+Immunofluorescent+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium-induced+colonic+histopathology%2C+but+not+altered+epithelial+ion+transport%2C+is+reduced+by+inhibition+of+phosphodiesterase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity.</a> Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+intestinal+inflammation+in+DSS-induced+model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.</a> J Vis Exp. (60), e3678(2012).</li>
<li>Dieleman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).</li>
<li>Kojouharoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+tumour+necrosis+factor+%28TNF%29+but+not+of+IL-1+reduces+inflammation+in+chronic+dextran+sulphate+sodium-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice.</a> Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).</li>
<li>Sunderkotter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+mouse+blood+monocytes+differ+in+maturation+stage+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response.</a> J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).</li>
<li>Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).</li>
<li>Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).</li>
<li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+deeper+than+microscopy%3A+the+optical+imaging+frontier+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).</li>
<li>Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+tomography%3A+principles+and+potential+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research.</a> Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).</li>
<li>Beziere, N., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoacoustic+imaging%3A+an+emerging+modality+for+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).</li>
<li>Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Trafficking+to+the+Small+Intestine+and+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon.</a> Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).</li>
<li>Ungar, B., Kopylov, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+development+of+new+biologics+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease.</a> Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).</li>
<li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li>
<li>Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Targeted+Therapies+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease.</a> Trends Pharmacol Sci. , (2016).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+addressin+cell+adhesion+molecule+antibody+PF-00547%2C659+in+ulcerative+colitis%3A+a+randomised+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study.</a> Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).</li>
<li>Terai, T., Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+fluorophores+and+fluorescent+probes+for+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging.</a> Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Measurement+of+Tumor+Vascular+Permeability+and+Perfusion+using+a+Hybrid+System+for+Simultaneous+Magnetic+Resonance+and+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging.</a> Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).</li>
<li>Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+background+subtraction+technique+for+hybrid+fluorescence+molecular+tomography%2Fx-ray+computed+tomography+imaging+of+a+mouse+model+of+early+stage+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer.</a> J Biomed Opt. 18 (5), 56006(2013).</li>
<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+antibodies%3A+successes%2C+limitations+and+hopes+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future.</a> Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
<li>Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+probes+and+their+potential+contribution+to+radiotracer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nuklearmedizin%22%5BJournal%5D)">Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development.</a> Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).</li>
<li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż techniki obrazowania medycznego szybko się rozwinęły w ostatnich latach, nadal mamy ograniczoną zdolność do wykrywania procesów zapalnych lub nowotworów, a także innych chorób w ich najwcześniejszych stadiach rozwoju. Ma to jednak kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu, inwazji lub rozwoju przerzutów guza i procesów komórkowych w rozwoju zaburzeń zapalnych oraz chorób zwyrodnieniowych, sercowo-naczyniowych i immunologicznych. Podczas gdy tradycyjne techniki obrazowania opierają się na parametrach fizycznych l...

Modele zwierzęce są szeroko stosowane w badaniach naukowych, a istnieje wiele nieinwazyjnych procedur monitorowania aktywności i witalności choroby, takich jak kwantyfikacja zmian masy ciała lub analiza krwi, moczu i kału. Są to jednak tylko pośrednie parametry zastępcze, które również podlegają zmienności międzyosobniczej. Muszą one być często uzupełniane analizami post mortem próbki tkanki, co uniemożliwia seryjną obserwację w powtarzających się punktach czasowych i bezpośrednią obserwację procesów fizjologicznych lub patologicznych in vivo. Pojawiły się wyrafinowane techniki obrazowania małych zwierząt, w tym obrazowanie przekrojowe, obrazowanie optyczne i endoskopia, które umożliwiają bezpośrednią wizualizację tych procesów, a także pozwalają na powtarzalne analizy tych samych zwierząt1,2,3. Dodatkowo, możliwość powtarzalnego monitorowania różnych stanów chorobowych u tego samego zwierzęcia może zmniejszyć liczbę potrzebnych zwierząt, co może być pożądane z punktu widzenia etyki zwierząt.
Istnieje kilka różnych technik obrazowania optycznego dla obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Pierwotnie, obrazowanie konfokalne było wykorzystywane do badania powierzchniowych i podpowierzchniowych zdarzeń fluorescencyjnych4,5. Ostatnio jednak opracowano systemy tomograficzne, które pozwalają na ilościową trójwymiarową ocenę tkanek6. Udało się to osiągnąć dzięki opracowaniu sond fluorescencyjnych, które emitują światło w widmie bliskiej podczerwieni (NIR), oferując niską absorpcję, czułe detektory i monochromatyczne źródła światła7. Podczas gdy tradycyjne techniki obrazowania przekrojowego, takie jak tomografia komputerowa (CT), rezonans magnetyczny (MRI) lub ultrasonografia (US), opierają się głównie na parametrach fizycznych i wizualizacji morfologii, obrazowanie optyczne może dostarczyć dodatkowych informacji na temat podstawowych procesów molekularnych przy użyciu endogennych lub egzogennych sond fluorescencyjnych8.
Postępy w biologii molekularnej ułatwiły tworzenie inteligentnych i ukierunkowanych fluorescencyjnych sond molekularnych dla coraz większej liczby celów. Na przykład wychwyt i dystrybucja za pośrednictwem receptora w danym obszarze docelowym może być wizualizowana za pomocą przeciwciał znakowanych pochodną karbocyjaniny9. Mnogość dostępnych przeciwciał, które można oznaczyć jako specyficzne znaczniki w inaczej niedostępnych obszarach ciała, zapewnia bezprecedensowy wgląd w procesy molekularne i komórkowe w modelach nowotworzenia oraz chorób neurodegeneracyjnych, sercowo-naczyniowych, immunologicznych i zapalnych7.
W tym badaniu opisujemy zastosowanie tomografii fluorescencyjnej w mysim modelu zapalenia jelita grubego. Zapalenie jelita grubego wywołane siarczanem sodu dekstranu (DSS) jest standardowym, chemicznie indukowanym mysim modelem zapalenia jelit, który przypomina nieswoiste zapalenie jelit (IBD)10. Jest to szczególnie przydatne do oceny udziału wrodzonego układu odpornościowego w rozwoju zapalenia jelit11. Ponieważ rekrutacja, aktywacja i infiltracja monocytów i makrofagów stanowią kluczowe etapy w patogenezie IBD, wizualizacja ich rekrutacji i kinetyka infiltracji są niezbędne do monitorowania, na przykład, wpływu potencjalnych substancji terapeutycznych w warunkach przedklinicznych12. Opisujemy indukcję zapalenia jelita grubego DSS i demonstrujemy charakterystykę nacieku makrofagów do błony śluzowej jelit za pośrednictwem tomografii za pomocą fluorescencyjnej tomografii molekularnej w celu specyficznej wizualizacji markera monocytów / makrofagów F4 / 8013. Dodatkowo ilustrujemy procedury pomocnicze i uzupełniające, takie jak znakowanie przeciwciałami; konfiguracja eksperymentalna; oraz analiza i interpretacja uzyskanych obrazów, w korelacji z konwencjonalnymi odczytami, takimi jak wskaźniki aktywności choroby, cytometria przepływowa i analiza histologiczna oraz immunohistochemia. Omówiono ograniczenia tej techniki i porównania z innymi metodami obrazowania.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dieta bez lucerny</td><td>Harlan Laboritories, Madison, USA</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu Bepanthen</td><td>Bayer, Leverkusen, Niemcy</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>Konsulat sodowy siarczanu dekstranu (DSS)</td><td>TdB, Uppsala, Szwecja</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Niemcy</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek compound&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Holandia</td><td>4583</td><td>utrwalacz do analiz histologicznych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgia</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu w proszku</td><td>Sigma Aldrich Deisenhofen, Niemcy</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Dieta standardowa</td><td>Altromin, Lage, Niemcy</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Holandia</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Hemoccult (test papierowy z gwajaku)</td><td>Beckmann Coulter, Niemcy</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna przeciwciało anty-mysie anty-F4/80</td><td>Serotec, Oxford, Wielka Brytania</td><td>MCA497B</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna szczuro-anty-myszy anty-GR-1&nbsp;</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy</td><td>553125</td><td></td></tr><tr>Sondy molekularne<td>Streptavidin-Alexa546</td><td>, Darmstadt, Niemcy</td> Maksymalne wzbudzenie/emisja <td>S-11225</td><td>:&nbsp; 556/573nm</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD11b przeciwko mysom TC</td><td>Calteg, Burlingame, USA</td><td>R2b06</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-mysie F4/80</td><td>BioLegend, Londyn, Wielka Brytania</td><td>123102</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ly6C przeciw myszy szczura sprzężone z FITC</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>bufor FACS</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Cy7 NHS Ester</td><td>GE Healthcare&nbsp; Europa, Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>PA17104</td><td></td></tr><tr><td>MPO ELISA</td><td>Immundiagnostik AG, Bensheim, Niemcy</td><td>K 6631B</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5 znakowane przeciwciało anty-mysie F4/80</td><td>BioLegend, Londyn, Wielka Brytania</td><td>123127</td><td>gotowe do użycia znakowane przeciwciała (alternatywa)</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyjanine5.5</td><td>eBioscience, Waltham, USA</td><td>45-4801-80</td><td>gotowe do użycia znakowane przeciwciała (alternatywa)</td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej buforowany Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>SRE0032</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS System cytometrii przepływowej Calibur</td><td>BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania in vivo FMT 2000</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazowania True Quant 3.1</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>zawarte w FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Leica DMLB</td><td>Leica,&nbsp; 35578 Wetzlar, Niemcy&nbsp;</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Bandelin Sonopuls HD 2070</td><td>Bandelin, 12207 Berlin, Niemcy</td><td>Homogenizator ultradźwiękowy</td><td>HD 2070</td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy Nr 10</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>Z692395-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum 14cm</td><td>Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Niemcy</td><td>22398330</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka luer lock 5ml</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>Z248010</td><td></td></tr><tr><td>igły strzykawkowe</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy</td><td>Z192368&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgia</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Mysie modele chorób są niezbędne do badań naukowych. Jednak wiele narzędzi diagnostycznych, takich jak endoskopia lub obrazowanie tomograficzne, nie jest rutynowo stosowanych w modelach zwierzęcych. Konwencjonalne odczyty eksperymentalne często opierają się na analizach post mortem i ex vivo, które uniemożliwiają przeprowadzanie wewnątrzindywidualnych badań kontrolnych i zwiększają liczbę potrzebnych badanych zwierząt. Tomografia fluorescencyjna umożliwia nieinwazyjną, powtarzalną, ilościową, trójwymiarową ocenę sond fluorescencyjnych. Jest bardzo czuły i pozwala na użycie generatorów molekularnych, co pozwala na specyficzne wykrywanie i charakteryzowanie różnych celów molekularnych. W szczególności sondy celowane stanowią innowacyjne narzędzie do analizy aktywacji genów i ekspresji białek w stanach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych, infekcjach, chorobach naczyniowych, migracji komórek, nowotworzeniu itp. W tym artykule przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące tej wyrafinowanej technologii obrazowania do wykrywania i charakteryzowania stanu zapalnego in vivo (tj. infiltracji makrofagów F4/80-dodatnich) w szeroko stosowanym mysim modelu zapalenia jelit. Technika ta może być również stosowana w innych obszarach badawczych, takich jak śledzenie komórek odpornościowych lub komórek macierzystych.

Ocena zapalenia jelita grubego:
 colitis indukowane DSS jest chemicznie wywołanym mysim modelem zapalenia jelit, który przypomina ludzką nieswoistą chorobę zapalną jelit (IBD) i prowadzi do utraty masy ciała, krwawień z odbytnicy, powierzchownych owrzodzeń oraz uszkodzeń błony śluzowej u podatnych myszy15. Jest on szczególnie przydatny do badania udziału wrodzonego układu odpornościowego ...

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Ogólnym celem tego specyficznego dla celu podejścia do obrazowania in vivo jest wizualizacja markerów molekularnych aktywności choroby w nieswoistych zapaleniach jelit. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nieswoistych zapaleń jelit oraz w powiązanych badaniach terapeutycznych dotyczących wpływu eksperymentalnych terapii lub specyficznych zdarzeń komórkowych na stan zapalny. Główną zaletą tej techniki jest możliwość longitudinalnego i nieinwazyjnego monitorowania aktywności choroby.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat zaburzeń zapalnych, można ją również zastosować do badania innych schorzeń, takich jak nowotwory czy choroby immunologiczne. Aby wywołać zapalenie jelita grubego, należy przygotować wodę pitną dla myszy doświadczalnych, rozpuszczając 2 g siarczanu sodu dekstranu (DSS) w 100 ml autoklawowanej wody pitnej, przyjmując szacunkowe spożycie 5 ml wody na mysz na dobę. Na 24 godziny przed skanowaniem należy pobrać wybrany koktajl przeciwciał do sterylnej strzykawki chronionej przed światłem i wstrzyknąć przeciwciała dożylnie do żył ogonowych zwierząt doświadczalnych.W dniu eksperymentu należy użyć golarki elektrycznej, aby ogolić sierść w okolicy brzucha zwierząt doświadczalnych w celu zminimalizowania odbicia i absorpcji światła. Używając fantoma imitującego tkankę o określonej grubości i charakterystyce absorpcji, należy wypełnić fantom konkretną objętością badanego roztworu przeciwciał i zmierzyć fluorescencję na urządzeniu FMT. Następnie, w urządzeniu do tomografii fluorescencyjnej (FMT) dla małych zwierząt, należy kliknąć Nowe badanie i wprowadzić do opisu badania odpowiednie znaczniki, w tym parametry obrazowania oraz dawki.Utworzyć grupy badawcze zgodnie z planem eksperymentalnym, przydzielając do każdej grupy odpowiednią liczbę zwierząt. Po skalibrowaniu systemu dla konstrukcji znaczników, umieścić pierwszą znieczuloną mysz w pozycji grzbietnej w podgrzewanej kasecie badawczej o temperaturze 42 degrees Celsius. Wsunąć kasetę do systemu obrazowania i wybrać odpowiednią próbkę z właściwej grupy badawczej.Wybierz podany znacznik, aby zapewnić prawidłowe obliczenie wartości stężenia znacznika, a następnie wykonaj obraz fluorescencyjnej refleksji przy odpowiedniej długości fali dla skanowania. Kliknij Acquire Image, aby zaznaczyć pole skanowania i potwierdzić, że pole skanowania pojawia się jako nałożenie na obraz fluorescencyjnej refleksji. Dostosuj pole skanowania tak, aby obejmowało obszar zainteresowania, uważając, aby uniknąć błędów lub obszarów z pozostałą sierścią.W zależności od celu obrazowania należy wybrać rozdzielczość pola skanowania, aby ustawić liczbę punktów danych obrazu w obrębie pola skanowania. Następnie należy kliknąć Scan, aby rozpocząć akwizycję obrazu przy wybranej długości fali. Po zakończeniu skanowania należy wyjąć zwierzę z kasety, aby umożliwić mu pełną rekonwalescję pod nadzorem przed powrotem do klatki.Procedurę FMT można następnie powtarzać w różnych odstępach czasu, zależnie od wymagań eksperymentalnych. Aby przeanalizować pozyskane obrazy, należy otworzyć odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazowania i wybrać surowe dane z pierwszego skanowania. Przy użyciu narzędzia do rekonstrukcji należy utworzyć trójwymiarowe mapy rozkładu fluorescencji.Po dodaniu wszystkich skanów do odpowiedniego zbioru danych do rekonstrukcji, otwórz pierwszy wybrany zbiór danych. Wyświetlone zostaną wszystkie skany wykonane dla wybranego zwierzęcia doświadczalnego. Wybierz odpowiedni skan i kliknij Load.Rekonstrukcja 3D rozkładu znacznika zostanie wyświetlona jako nakładka na początkowo uzyskany obraz fluorescencyjnej refleksji. Następnie należy zidentyfikować ogniska nieswoistej akumulacji znacznika na zrekonstruowanych mapach 3D i użyć narzędzia pomiarowego do zaznaczenia obszaru zainteresowania. Oprogramowanie wygeneruje następnie wartość intensywności fluorescencji dla obszaru zainteresowania, a także pomiary ilości znacznika w stężeniu pikomolarnym, dla którego przeprowadzono kalibrację skanu.W tym doświadczeniu zastosowano przeciwciało skoniugowane z fluoresceincją przeciwko mysiej białku F4/80 w celu bezpośredniej wizualizacji aktywowanych makrofagów. Za pomocą tomografii fluorescencyjnej zmierzono znacząco zwiększoną akumulację znacznika fluorescencyjnego w okrężnicach myszy z zapaleniem jelita grubego w porównaniu do zwierząt kontrolnych bez zapalenia, co wskazuje na wzrost infiltracji monocytów i ich różnicowania w aktywne makrofagi u zwierząt chorych. Z kolei zastosowanie nieswoistego przeciwciała IgG skoniugowanego z fluoresceincją nie wywołało wykrywalnej odpowiedzi fluorescencyjnej w jamie brzusznej ani w jelitach ani w grupie z zapaleniem, ani w grupie kontrolnej, co potwierdza swoistość oddziaływania sondy z celem w przypadku przeciwciała F4/80.Pomiary ex vivo akumulacji znacznika skierowanego przeciwko F4/80 w wyciętych okrężnicach dodatkowo potwierdzają okrężnicze pochodzenie sygnału akumulacji znacznika F4/80 wykrytego in vivo. Rzeczywiście, obliczone ilości związanego przeciwciała dobrze korelują z histologicznie określoną liczbą naciekających makrofagów, co potwierdza, że obrazowanie in vivo ze specyficznymi znacznikami może wskazywać na lokalną aktywność choroby. Po opanowaniu metody, może ona zostać przeprowadzona i przeanalizowana w ciągu kilku minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Etapy przygotowawcze, w tym wytwarzanie specyficznych znaczników opartych na przeciwciałach, zazwyczaj trwają od dwóch do trzech dni. Przy planowaniu takiej procedury eksperymentalnej ważne jest uwzględnienie odpowiednich i wiarygodnych kontroli, zarówno dla przeciwciała, jak i dla modelu choroby zwierzęcej. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak kolonoskopia lub cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania oraz zweryfikować i skwantyfikować uzyskane dane.

fluorescence-mediated-tomography-for-detection-quantification

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Ten film demonstruje technikę oceny infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego za pomocą tomografii fluorescencyjnej (FMT). Po wywołaniu zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą siarczanu sodu dekstranu (DSS), zwierzęciu wstrzykuje się przeciwciała, które rozpoznają marker glikoproteiny F4 / 80 na infiltrowanych makrofagach w okrężnicy. Mysz jest następnie obrazowana w urządzeniu FMT, w którym sygnały fluorescencji i odbicia są rekonstruowane w trójwymiarowy...

Wykorzystanie tomografii fluorescencyjnej do oceny zapalenia jelit myszy

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Opisujemy protokół obrazowania hybrydowego, łączący tomografię za pośrednictwem fluorescencji (FMT) z mikrotomografią komputerową (μCT). Po fuzji i rekonstrukcji przeprowadzamy interaktywną segmentację narządów w celu wyodrębnienia ilościowych pomiarów rozkładu fluorescencji.

Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Badanie to przedstawia metodę obrazowania 3D z wykorzystaniem tkanek jelitowych w całości oraz mikroskopii wielofotonowej do ilościowego określenia wydzielanego śluzu, umożliwiając precyzyjną analizę objętościową i wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na bodźce takie jak chlorek karbamoilocholiny.

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj tomografię fluorescencyjną do wykrywania zapalenia jelit u myszy poprzez obrazowanie infiltracji makrofagów. Ta metoda umożliwia nieinwazyjny, długotrwały monitoring aktywności choroby in vivo.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Przeglądaj więcej filmów