Name: Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego za pomocą azoksymetanu (AOM) i siarczanu dekstranu sodu (DSS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj protokół indukcji raka jelita grubego u myszy za pomocą azoksymetanu i siarczanu dekstranu sodu. Model ten pozwala badać nowotworzenie związane z zapaleniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została częściowo sfinansowana z grantów DK089016 i L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) oraz P30-DK52574 (dla Washington University Digestive Diseases Research Core). A.I.T. był stypendystą badawczym w ramach programu Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellow.

1. Indukcja raka związanego z zapaleniem jelita grubego
<ol>
 <li>Osobno przygotować klatki z myszami w wieku 6–8 tygodni, o tej samej płci i wieku, do wykorzystania w grupach eksperymentalnej i kontrolnej. Myszy można oznakować indywidualnie za pomocą markerów na ogonie lub nacięć ucha.</li>
 <li>W dniu 0. należy zapisać masę ciała wyjściową i wstrzyknąć każdej myszy dojamowo (IP) 10 mg/kg roztworu roboczego AOM (1 mg/ml w soli fizjologicznej, rozcieńczonego z roztworu stokowego 10 mg/ml w dH2O przechowywanego w temperaturze -20 deg C). W zależności od doświadczenia dawkę tę można dostosować w zakresie 7–14 mg/kg i/lub powtórzyć na wczesnym etapie eksperymentu.</li>
</ol>
Uwaga: AOM jest lotną substancją genotoksyczną i należy z nią obchodzić się ostrożnie zgodnie z dołączoną kartą charakterystyki substancji (MSDS). Roztwory należy przygotowywać w dygestorium, przechowywać w lodzie i utylizować zgodnie z protokołami obowiązującymi w danej instytucji.
<ol start="3">
 <li>Przygotować 2,5% (2,5 g/100 ml) roztwór DSS w wodzie destylowanej i przefiltrować go próżniowo przez filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 μm. Dawkę tę można dostosować w zakresie od 1-3,5% w zależności od szczepu myszy i warunków środowiskowych. Po przygotowaniu roztwór DSS można przechowywać w lodówce do 1 tygodnia. </li>
 <li>W dniu 7. podać myszom roztwór DSS jako wodę pitną. Przy maksymalnej liczbie 5 myszy w klatce, przy każdej wymianie roztworu DSS potrzeba będzie około 250 ml/klatkę; są to jednak jedynie wartości szacunkowe, które mogą się różnić w zależności od rodzaju butelek do wody stosowanych w danej pracowni zwierzęcej. </li>
 <li>Aby zapewnić ciągłość podawania DSS przez siedem dni, roztwór DSS w czystych butelkach należy wymieniać trzy razy (co 2-3 dni) w tym okresie. Niektórzy badacze przed wymianą na nowy roztwór mierzą ilość spożytego DSS jako wskaźnik ekspozycji. </li>
 <li>W dniu 14. przywrócić myszom w klatkach standardową wodę pitną na dwa tygodnie.</li>
 <li>Powtórzyć kroki (1.4) - (1.6) w dniach 28. i 49., aby przeprowadzić drugi i trzeci cykl podawania DSS. „Cykl” DSS składa się z jednego tygodnia podawania DSS w wodzie pitnej, po którym następują 2 tygodnie podawania zwykłej (autoklawowanej) wody. </li>
</ol>
2. Ocena kliniczna zapalenia jelita grubego i progresji guza
<ol>
 <li>Myszy należy ważyć i obserwować 2-3 razy w tygodniu. Procentowy ubytek masy ciała w stosunku do wartości wyjściowej służy jako miara zastępcza ciężkości zapalenia jelita grubego. W zależności od celów eksperymentalnych można przeprowadzać regularne oceny krwawień z odbytu, biegunki lub wypadania odbytnicy i raportować je zgodnie z różnymi systemami punktowymi.9, 10 </li>
 <li>W tygodniu następującym po pełnym cyklu podawania DSS można spodziewać się ubytku masy ciała do 10% wraz z 2-3 dniami biegunki i krwawień z odbytu (podczas tego bezpośredniego okresu po DSS pomocna może być codzienna obserwacja). </li>
</ol>
Istnieje możliwość, że niektóre myszy nie wyzdrowieją; myszy, które utratą więcej niż 20% masy ciała, mają mniejsze szanse na przeżycie i mogą wymagać przedwczesnej eutanazji. Pojedyncza injekcja IP 0,5 - 1,0 ml soli fizjologicznej u takich myszy może być użytecznym środkiem wspomagającym w celu uzupełnienia objętości płynów utraconych w wyniku biegunki.
3. Endoskopia myszy (opcjonalnie)
<ol>
 <li>Endoskopię po drugim lub trzecim cyklu DSS można przeprowadzić w celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem zwierząt. Ponieważ model AOM/DSS jest bardzo wiarygodny w indukowaniu guzów, ten krok zazwyczaj nie jest konieczny. Metodą tą należy ocenić tylko kilka myszy, ponieważ może ona doprowadzić do uszkodzenia guzów.11 </li>
 <li>Zanurzyć mysz w znieczuleniu poprzez inhalację lub wstrzyknięcie środka sedatywnego. </li>
 <li>Po znieczuleniu myszy należy przymocować ją taśmą za ogon i klatkę piersiową do płaskiej deski. </li>
 <li>Ostrożnie wprowadzić endoskop do odbytnicy myszy, używając soli fizjologicznej do nadmuchiwania i płukania, aby poprawić widoczność wewnątrzświatową i usunąć treść kałową. (Należy zauważyć, że endoskopię można również przeprowadzić za pomocą insuflacji powietrzem jako alternatywy dla soli fizjologicznej, co może zapewnić lepszą wizualizację guza.12) </li>
</ol>
4. Uśmiercanie myszy i pobieranie okrężnicy
<ol>
 <li>W 70. dniu u każdej myszy traktowanej AOM/DSS powinny znajdować się liczne guzy jelita grubego, gotowe do oceny. Termin ten można przesunąć o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. (Należy zauważyć, że myszy z ciężkim wypadnięciem odbytnicy mogą wymagać wcześniejszej eutanazji, aby uniknąć nadmiernego dyskomfortu zwierząt, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnych komisji ds. opieki nad zwierzętami).</li>
 <li>Przed nekropsją każdą mysz należy poddać eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia stawów szyjnych (lub innej zatwierdzonej przez instytucję metody). W tym czasie można dokonać pomiaru masy końcowej oraz innych parametrów.</li>
 <li>Położyć mysz brzuchem do góry na desce do krojenia. Brzuch należy pokryć 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawartości jamy brzusznej włosami podczas wycinania jelita grubego.</li>
 <li>Za pomocą pęsety uchwycić linię środkową brzucha i wykonać niewielkie nacięcie, aby odsłonić otrzewną.</li>
 <li>Rozszerzyć nacięcie po obu stronach brzucha wzdłuż łuku żebrowego.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek przeciąć miednicę, aby możliwe było pobranie jelita grubego aż do połączenia odbytowo-odbytniczego. Jest to istotne, ponieważ uszkodzenia wywołane zapaleniem jelit indukowanym DSS są największe w dystalnej części odbytnicy i odpowiednio w tym regionie obserwuje się największy rozwój guzów.</li>
 <li>W tym czasie można pobrać również dodatkowe tkanki, takie jak węzły chłonne krezkowe.</li>
</ol>
5. Przygotowanie jelita grubego do analizy makroskopowej
<ol>
 <li>Używając igły do zgłębnika 18G przymocowanej do strzykawki 5 ml, przepłucz jelito grube lodowatym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w taki sposób, aby płyn wypływał w kierunku fizjologicznym. Jeśli tkanka jelita grubego będzie wykorzystywana do analizy RNA lub białek, można ją utrzymać w niskiej temperaturze, stosując wcześniej schłodzone tace robocze.</li>
 <li>Rozetnij przepłukane jelito grube wzdłużnie wzdłuż krezki i rozłóż je na zimnej tace. Guzy są łatwiejsze do zlokalizowania, gdy jelito grube zostanie umieszczone na ciemnej powierzchni. Alternatywnie można zastosować 1% barwnik błękit Alciana, aby uwydatnić guzy. Ocen liczbę i rozmiar guzów za pomocą linijki lub suwmiarki cyfrowej.</li>
 <li>Na tym etapie można wyciąć małe fragmenty guza oraz przyległej prawidłowej tkanki do późniejszej analizy metodami RNA, białkowymi lub immunohistochemicznymi (IHC), pozostawiając część pozostałego jelita grubego do oceny histologicznej.</li>
</ol>
Cyfrowa fotografia makroskopowych preparatów okrężnicy bezpośrednio po kroku 5.2 może być pomocna w precyzyjnej analizie obciążenia nowotworowego, zwłaszcza jeśli znaczne fragmenty okrężnicy zostaną wycięte do innych form analizy opisanych powyżej. Obciążenie nowotworowe (%) można obliczyć jako stosunek powierzchni guza do całkowitej powierzchni okrężnicy, korzystając z darmowego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
6. Przygotowanie okrężnicy do oceny histologicznej
<ol>
 <li>Nanieś 10% formalinę na pozostałą część okrężnicy na zimnej tacy za pomocą strzykawki lub palca. Pozostawienie tkanki do utrwalenia w ten sposób przez co najmniej 30 sec ułatwia przeniesienie do naczynia z utrwalaczem. Przed nałożeniem nowej otwartej okrężnicy na tę samą tacę należy wytrzeć pozostałości formaliny.</li>
 <li>Przenieś okrężnice do naczynia wypełnionego 10% formaliną i przypnij je za krawędzie.</li>
 <li>Po 3 hr utrwalania przenieś okrężnice do 70% etanolu. Okrężnice mogą być przechowywane w 70% etanolu w nieskończoność.</li>
 <li>Trzy przekroje podłużne okrężnicy (proksymalny, środkowy, dystalny/odbytnica) można ustabilizować w 2% agarze i przekazać do zatopienia w parafinie. Należy upewnić się, że okrężnica proksymalna oraz okrężnica dystalna/odbytnica są zorientowane w jednolity sposób dla każdej myszy.</li>
 <li>Dysplazję, uszkodzenia krypt oraz stan zapalny może opisać i ocenić doświadczona osoba zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.10, 13-15 Myszy można uśmiercić przed 70 dniem, jeśli eksperymentator jest zainteresowany wykryciem wczesnych zdarzeń dysplastycznych.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Opisany tutaj model AOM/DSS pozwala badaczowi na niezawodne generowanie guzów okrężnicy u myszy. Wzrost guza w tym modelu jest bezpośrednio uwarunkowany towarzyszącym procesem zapalnym. Ciężkość zapalenia jelita grubego należy monitorować klinicznie, śledząc ubytek masy ciała oraz występowanie biegunki/hematochezji (Rycina 2). Objawy te aktywności choroby mają tendencję do pojawiania się do 5. dnia cyklu DSS i utrzymywania się przez cztery lub więcej dni po odstawieniu DSS. Rzadko u myszy z dużym obciążeniem guzami odbytnicy może dojść do wypadnięcia odbytnicy. Po drugim lub trzecim cyklu DSS biegunka może stać się uporczywa. Zazwyczaj guzy są obecne i możliwe do zidentyfikowania podczas kolonoskopii myszy przed trzecim cyklem DSS (Rycina 3). Dodatkowy czas i trzecia seria DSS skutkują powstaniem większych guzów w momencie pobrania tkanek (Rycina 4). Do uwydatnienia guzów można zastosować miejscowe barwienie błękitem Alcianem (Rycina 5). Fotografie guzów okrężnicy pomogą w wyznaczeniu wymiarów guza, co może zostać wykorzystane do ilościowego porównania liczby i wielkości guzów między grupami eksperymentalnymi (Rycina 6). Utrwalone i zatopione w parafinie preparaty okrężnicy mogą następnie zostać poddane ocenie histologicznej lub barwieniu immunohistochemicznemu (Rycina 7 i 8).
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="Schemat harmonogramu eksperymentalnego; traktowanie AOM/DSS w tygodniach; proces badań nad stanem zapalnym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat podawania AOM i DSS. AOM (10 mg/kg) jest wstrzykiwany w dniu 0. Na początku drugiego tygodnia (dzień 7) myszom podaje się 2,5% roztwór DSS w wodzie pitnej. Po siedmiu dniach podawania DSS następują dwa tygodnie podawania wody autoklawowanej. Przed ubojem wykonuje się dwa dodatkowe cykle podawania DSS. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="Wykres przedstawiający względną zmianę masy ciała w ciągu 56 dni; analiza danych w badaniach biologicznych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Masa ciała myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania AOM i DSS. Należy zauważyć, że w tygodniu następującym po każdym cyklu DSS myszy tracą 5-10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest markerem zastępczym dla nasilenia zapalenia jelita grubego. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="Obrazy endoskopowe przedstawiające struktury anatomiczne; etykiety wskazują obszary 1, 2 i 3 do badania." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Widok guzów w dystalnej części okrężnicy podczas endoskopii mysiej w 50. dniu leczenia AOM/DSS. Zauważalne są liczne masy polipowate zamykające światło dystalnej części okrężnicy (b, c) w porównaniu do prawidłowej okrężnicy (a).
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="Schemat morfologii tkanki; obszary dystalne, środkowe i proksymalne; analiza mikroskopowa; badanie biologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Podłużnie otwarte jelito grube myszy ilustrujące wygląd makroskopowy guzów. Zwrócić uwagę na większą liczbę guzów w dystalnej części jelita grubego/odbytnicy (górny obraz po lewej) oraz charakterystyczną pofałdowaną strukturę proksymalnej części jelita grubego (górny obraz po prawej) z niewielkim wzrostem guzów. Powiększenie dystalnej części jelita grubego pokazuje liczne guzy o różnych rozmiarach (poniżej). 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="Struktura jelita, sekcja; schemat anatomii układu pokarmowego; badanie ludzkiego przewodu pokarmowego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Guzy wyróżnione poprzez zastosowanie barwienia błękitem Alcianem. Należy zwrócić uwagę, jak barwnik podkreśla normalną strukturę okrężnicy, a także granice każdego poszczególnego guza. Takie barwienie może być pomocne w precyzyjnym pomiarze obszarów guzów za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="Wykres słupkowy rozkładu guzów; lokalizacja w okrężnicy; porównanie średnicy; analiza badawcza." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywny rozkład średniej liczby guzów na mysz leczoną AOM/DSS. Należy zauważyć, że większość guzów znajduje się w dystalnej części okrężnicy i ma rozmiar &lt;2 mm. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="Przekrój histologiczny sekcji okrężnicy myszy, z opisami regionów i lokalizacji anatomicznych, schemat." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 7. Podłużne przekroje okrężnicy zatopione w parafinie w kasecie (powyżej) oraz na szkiełku po barwieniu H&amp;E (poniżej). Należy zauważyć, że pozostałości barwienia błękitem Alciana nie zakłócają barwienia H&amp;E. Na obrazie szkiełka zaznaczono okręgiem duży guz (określony okręgiem). Oznaczenia „dystalny”, „środkowy” i „proksymalny” wynikają z podziału całej okrężnicy na trzy części między kątnicą a odbytnicą.
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="Schemat analizy histologicznej: przekroje tkanek barwione H&amp;E, BrdU, β-catenin przy powiększeniu 50x, 400x." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Reprezentatywna histologia guza powstałego w wyniku podania AOM/DSS w dystalnej części okrężnicy. Preparaty barwione H&amp;E, BrdU oraz β-catenin przy powiększeniu 50X (panel górny) i 400X (panel dolny) odpowiednio wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolaków okrężnicy.

<ol><li>Ekbom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis+and+colorectal+cancer.+A+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study.</a> N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).</li>
<li>Terzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and colon cancer.</a> Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).</li>
<li>Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal inflammation and cancer.</a> Gastroenterology. 140, 1807-1816 (2011).</li>
<li>Okayasu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysplasia+and+carcinoma+development+in+a+repeated+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Dysplasia and carcinoma development in a repeated dextran sulfate sodium-induced colitis model.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 1078-1083 (2002).</li>
<li>Kanneganti, M., Mino-Kenudson, M., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+colitis-associated+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of colitis-associated carcinogenesis.</a> J. Biomed. Biotechnol. 342637, (2011).</li>
<li>Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+mouse+model+of+colon+carcinogenesis+for+the+analysis+of+sporadic+and+inflammation-driven+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression.</a> Nat. Protoc. 2, 1998-2004 (2007).</li>
<li>Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94, 965-973 (2003).</li>
<li>De Robertis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AOM%2FDSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%3A+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J. Carcinog. 10, 9(2011).</li>
<li>Wirtz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Cooper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathologic+study+of+dextran+sulfate+sodium+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis.</a> Lab Invest. 69, 238-249 (1993).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nat. Protoc. 1, 2900-2904 (2006).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Wirtz, S., Nikolaev, A., Kiesslich, R., Lehr, H. A., Galle, P. R., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+colitis+and+colon+cancer+development+in+mice+using+high+resolution+chromoendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy.</a> Gut. 54, 950-954 (2005).</li>
<li>Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> J. Clin. Invest. 120, 2081-2093 (2010).</li>
<li>Boivin, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+mouse+models+of+intestinal+cancer%3A+consensus+report+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathology of mouse models of intestinal cancer: consensus report and recommendations.</a> Gastroenterology. 124, 762-777 (2003).</li>
<li>Cooper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysplasia+and+cancer+in+the+dextran+sulfate+sodium+mouse+colitis+model.+Relevance+to+colitis-associated+neoplasia+in+the+human%3A+a+study+of+histopathology%2C+B-catenin+and+p53+expression+and+the+role+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Dysplasia and cancer in the dextran sulfate sodium mouse colitis model. Relevance to colitis-associated neoplasia in the human: a study of histopathology, B-catenin and p53 expression and the role of inflammation.</a> Carcinogenesis. 21, 757-768 (2000).</li>
<li>Yoshida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+box+M1+transcription+factor+contributes+to+the+development+and+growth+of+mouse+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 132, 1420-1431 (2007).</li>
<li>Suzuki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+the+susceptibility+to+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate-induced+colon+carcinogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice.</a> Carcinogenesis. 27, 162-169 (2006).</li>
<li>Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am. J. Physiol. 274, 544-551 (1998).</li>
<li>Nambiar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+analysis+of+azoxymethane+induced+colon+tumors+in+inbred+mice+commonly+used+as+transgenic%2Fknockout+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors.</a> Int. J. Oncol. 22, 145-150 (2003).</li>
<li>Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinogenesis%3A+Review+of+human+and+experimental+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental animal studies.</a> J Carcinog. 8, (2009).</li>
<li>Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IDO-1+by+immunostimulatory+DNA+limits+severity+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of IDO-1 by immunostimulatory DNA limits severity of experimental colitis.</a> J. Immunol. 184, 3907-3916 (2010).</li>
<li>Kerr, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulfate+inhibition+of+real-time+polymerase+chain+reaction+amplification%3A+A+poly-A+purification+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: A poly-A purification solution.</a> Inflamm. Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((is+required+for+resection-induced+changes+in+apoptosis%2C+proliferation%2C+and+members+of+the+extrinsic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">is required for resection-induced changes in apoptosis, proliferation, and members of the extrinsic cell death pathways.</a> Gastroenterology. 126, 220-230 (2004).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Leczenie myszy AOM i DSS szybko i skutecznie modeluje ludzkiego raka związanego z zapaleniem jelita grubego. Hipotezy dotyczące dziedzicznych czynników przyczyniających się do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego można łatwo badać z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie.13, 16 Alternatywnie, wpływ celów farmakologicznych w raku związanym z zapaleniem jelita grubego można badać, stosując myszy typu dzikiego.
Mimo że model ten jest wysoko ceniony przez badaczy z...

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Azoksymetana (AOM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5486-100MG</td><td>&lt;strong&gt;Roztwór zapasowy:&lt;/strong&gt; rozcieńczyć do 10 mg/ml w wodzie destylowanej, przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C w aliquotach 0,5 – 1 ml. &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Roztwór roboczy:&lt;/strong&gt; rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 1 mg/ml w izotonicznym (0,9%) roztworze soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Deksyran siarczan sodu (DSS)</td><td>TdB Consultancy</td><td>DB001</td><td>MW 40 kDa (akceptowalne są preparaty 36-50 kDa z innych źródeł; do jednego eksperymentu należy użyć tej samej partii)&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>System miniendoskopowy Coloview</td><td>Karl Storz</td><td>Wiele</td><td>Szczegółny opis sprzętu i konfiguracji znajduje się u Beckera &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Butelka-filtr TPP Rapid FILTERMAX 500 ml, 0,22 &amp;mu;m PES</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP99500</td><td>Akceptowalny jest każdy standardowy filtr do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 Proof ASC/USP</td><td>Pharmaco-AAPER (lub inny)</td><td>11ACS200</td><td>Rozcieńczyć do 70% w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>4029405</td><td>Umieścić mysz w szklanym słoiku z gazą lub małą szmatką nasączoną środkiem anestetycznym</td></tr><tr><td>Prosta igła do zgłębnikowania 18G</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-008</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Rozcieńczyć do 1X (0,01 M) w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Taca chłodząca (Tissue Tek II Cold Plate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491941</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH (bezpłatne pobieranie)</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot; target=&quot;_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td>Rozcieńczyć do 10% w PBS</td></tr><tr><td>Agar BD Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>Użyć płyty grzejnej do przygotowania 2% roztworu w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Pinceta okulistyczna Miltex Eye Dressing</td><td>MedPlus Inc.</td><td>18-780</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne Miltex</td><td>MedPlus Inc.</td><td>18-1430</td><td>Zakrzywione końce zapobiegają uszkodzeniu jelita grubego podczas otwierania.</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX (proszek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5268</td><td>Dodać 1 g proszku do 100 ml 3% kwasu octowego (3 ml octanu lodowatego + 97 ml wody destylowanej)</td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa 1 mL z dołączoną igłą śródskórną 26 G x 3/8 cala</td><td>BD</td><td>305946</td><td>Do wstrzykiwania AOM</td></tr></tbody></table>

modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (aom) i dekstranu siarczanowego sodu (dss)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Osoby z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), są bardziej narażone na rozwój raka jelita grubego (CRC) niż osoby zdrowe. Ryzyko to jest proporcjonalne do czasu trwania i zasięgu choroby, a skumulowana zapadalność może sięgać 30% u osób z wieloletnim UC z rozległym zajęciem okrężnicy.1 Przyjmuje się, że dysplazja okrężnicy w IBD oraz rak związany z zapaleniem jelita grubego (CAC) rozwijają się w wyniku powtarzających się cykli uszkadzania i naprawy komórek nabłonkowych, podczas gdy komórki te są wystawione na działanie przewlekłego środowiska cytokin zapalnych.2 Choć nowotwory spontaniczne i związane z zapaleniem jelita grubego mają wspólną cechę w postaci bycia gruczolakorakami, uważa się, że sekwencja leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych jest inna.3 Ta różnica uzasadnia potrzebę stosowania specyficznych modeli zwierzęcych CAC.
Obecnie istnieje kilka modeli mysich do badania CAC. Dekstran siarczan sodu (DSS), związek o bezpośrednim działaniu toksycznym na nabłonek okrężnicy, może być podawany myszom w wodzie pitnej w wielu cyklach w celu wywołania stanu przewlekłego zapalenia. Przy odpowiednio długim czasie trwania u niektórych z tych myszy rozwijają się guzy.4 Rozwój guzów w tym modelu jest przyspieszony, jeśli substancja jest podawana w warunkach prokarcynogennych. Obejmują one myszy z mutacjami genetycznymi w szlakach tumorigenzy (APC, p53, Msh2), a także myszy poddane wcześniejszemu leczeniu czynnikami genotoksycznymi (azoksymetan [AOM], 1,2-dimetylohydrazyna [DMH]).5
Połączenie DSS z AOM jako model raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelit zyskało popularność ze względu na swoją powtarzalność, skuteczność, niską cenę i łatwość zastosowania. Chociaż oba związki mają wspólny mechanizm działania, stwierdzono, że AOM jest bardziej aktywny i stabilny w roztworze niż DMH. Podczas gdy rozwój guzów w innych modelach zazwyczaj wymaga kilku miesięcy, u myszy poddanych iniekcji AOM, a następnie traktowanych DSS, odpowiednie guzy rozwijają się już w ciągu 7–10 tygodni.6, 7 Ponadto AOM i DSS można podawać myszom o dowolnym podłożu genetycznym (knock out, transgeniczne itp.) bez konieczności krzyżowania ze specyficzną linią nowotworową. W niniejszej pracy prezentujemy protokół indukowania nowotworzenia w okrężnicy wywołanego zapaleniem u myszy, wykorzystujący pojedynczą iniekcję AOM, po której następują trzy siedmiodniowe cykle podawania DSS w okresie 10 tygodni. Model ten indukuje guzy z zmianami histologicznymi i molekularnymi ściśle przypominającymi te występujące w ludzkim CAC, stanowiąc tym samym niezwykle wartościowy model do badania onkogenezy i chemoprewencji w tej chorobie.8

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Osoby z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), są bardziej narażone na rozwój raka jelita grubego...

W dniu zerowym myszy wstrzyknięto azoksymetanu lub OM w następnym tygodniu. Ich wodę pitną zastąpiono roztworem zawierającym siarczan dekstranu sodu lub DSS. W trzecim tygodniu myszy otrzymywały wodę przez kolejne dwa tygodnie.Ten cykl podawania DSS w wodzie jest powtarzany jeszcze dwukrotnie. Po drugim cyklu DSS myszy można zbadać pod kątem obecności guzów za pomocą endoskopii lustrzanej.Po 10. tygodniu myszy są uśpione, a ich okrężnice pobierane. Okrężnice są płukane i rozcinane wzdłużnie. Następnie ocenia się wielkość oraz liczbę guzów w obrębie okrężnic.Przekrój podłużny okrężnicy, podzielony na trzy części, można zalać w parafinie i przekazać do analizy histologicznej. Za pomocą mikroskopii świetlnej można policzyć i sklasyfikować guzy. Prezentujemy protokół, w którym podaje się genotoksyczny czynnik OM, a następnie trzy cykle czynnika prozapalnego.DSS szybko i konsekwentnie wywołuje guzy jelita grubego u myszy, wykazujące podobieństwa morfologiczne i molekularne do tych obserwowanych w przebiegu raka jelita grubego związanego z zapaleniem colitis u ludzi. W dniu zerowym należy indywidualnie oznaczyć myszy za pomocą znaczników ogonowych lub wycięć usznych, zapisać masę początk

modeling-colitis-associated-cancer-with-azoxymethane-aom-dextran

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z użyciem azoksymetanu (AOM) i siarczanu dekstrany sodu (DSS)

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Ten film opisuje protokół generowania mysiego modelu ortotopowego ksenoprzeszczepu jelita grubego pochodzącego od pacjenta do badania progresji komórek raka jelita grubego u myszy bez otyłości z cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID). Ten mysi model pomaga w zrozumieniu wzorca wzrostu guza pierwotnego i przerzutów.

Generowanie mysiego modelu raka jelita grubego PDOX: badanie progresji raka jelita grubego w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę generowania chemicznie wywołanego mysiego modelu zapalenia jelita grubego - choroby zapalnej jelit. Mysz może spożywać roztwór siarczanu sodu dekstranu (DSS) przez odpowiedni czas. Po spożyciu DSS uszkadza barierę warstwy śluzu i nabłonka w okrężnicy, umożliwiając drobnoustrojom jelitowym przedostanie się do leżącej poniżej tkanki – gdzie są wyczuwane przez rezydujące komórki odpornościowe, aby pośredniczyć w przesadnej odpowiedzi immunologicznej, powodując stan...

Technika generowania mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem sodu

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Prezentowany protokół opisuje łatwe chirurgiczne usunięcie wyrostka robaczkowego (łaty kątniczej) u myszy, a następnie indukcję raka jelita grubego związanego z chorobą jelit grubego. Ten mysi model wyrostka robaczkowego umożliwia badanie biologicznej roli wyrostka robaczkowego w patogenezie chorób przewodu pokarmowego u ludzi.

Mysi model wycięcia wyrostka robaczkowego przewlekłego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego poprzez precyzyjną lokalizację łaty kątniczej

Ten protokół dostarcza mysi model wrzodziejącego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego wywołanego przez azmetan w połączeniu z siarczanem dekstranu sodu. Model został wykorzystany do oceny skuteczności związków tradycyjnej medycyny chińskiej w profilaktyce i leczeniu raka jelita grubego.

Opracowanie modelu raka jelita grubego u myszy i ocena efektu terapeutycznego medycyny chińskiej

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Poznaj protokół indukcji raka jelita grubego u myszy za pomocą azoksymetanu i siarczanu dekstranu sodu. Model ten pozwala badać nowotworzenie związane z zapaleniem.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Przeglądaj więcej filmów