Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego za pomocą azoksymetanu (AOM) i siarczanu dekstranu sodu (DSS)

W dniu zero, Myer wstrzyknął sobie azoksymetan lub OM w następnym tygodniu. Ich wodę pitną zastępuje się roztworem zawierającym siarczan dekstranu, sodu lub DSS. W trzecim tygodniu myszom podaje się wodę przez kolejne dwa tygodnie.

Ten cykl wodny DSS jest powtarzany jeszcze dwa razy. Po drugim cyklu DSS. Myszy można ocenić pod kątem nowotworów za pomocą endoskopii.

Po 10 tygodniu myszy są uśmiercane, a okrężnice zbierane. Okrężnice są płukane i otwierane podłużnie. Okrężnice są oceniane pod kątem wielkości guza i liczby guza.

Podłużny przekrój okrężnicy w trzech częściach może zostać osadzony i przesłany do analizy histologicznej. Za pomocą mikroskopii świetlnej guzy można policzyć i sklasyfikować. Pokazujemy protokół, w którym podawanie czynnika genotoksycznego OM, a następnie trzy cykle środka prozapalnego.

DSS szybko i konsekwentnie generuje guzy jelita grubego u myszy o morfologicznych i molekularnych podobieństwach do tych obserwowanych u myszy związanych z ludzkim zapaleniem jelita grubego, indywidualnie znakowanych myszy ze śladami ogona lub klipsami na uszy w dniu zero, zapisz wyjściową wagę każdej myszy na tabeli, a następnie wstrzyknij każdej myszy roztwór 10 miligramów na kilogram ćwiczenia OM. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z OM, ponieważ jest to czynnik genotoksyczny w siódmym dniu, skąpiec zaopatrzony w 2,5% roztwór DSS jako wodę pitną na następny tydzień. Aby przygotować ten roztwór, dodaj proszek DSS do wody destylowanej i mieszaj aż do rozpuszczenia.

Roztwór jest gotowy po przepuszczeniu przez filtr z octanu celulozy o grubości 0,2 mikrona. Zapewnienie ciągłości dostaw roztworu DSS przez siedem dni. Wymieniaj DSS co dwa do trzech dni.

Po tym okresie zmień klatki z powrotem na wodę na dwa tygodnie. Waż myszy dwa do trzech razy w tygodniu i obserwuj krwawienie z odbytu i biegunkę. Myszy z dużymi guzami mogą tymczasowo rozwinąć wypadanie odbytnicy, chociaż na ogół nie zmniejsza to procentu przeżycia.

Utrata masy ciała w stosunku do wartości wyjściowej jest stosowana jako zastępcza miara nasilenia zapalenia jelita grubego. Utrata masy ciała do 10% wraz z dwu- lub trzydniową biegunką i krwawieniem z odbytu można spodziewać się w ciągu tygodnia następującego po pełnym cyklu endoskopii DSS. Następujący. Drugi lub trzeci cykl DSS można wykonać w celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem.

Ponieważ model A-O-M-D-S-S jest dość niezawodny w wytwarzaniu guzów, ten krok na ogół nie jest konieczny. Tylko kilka myszy powinno być ocenianych przy użyciu tej metody, ponieważ może ona zakłócić działanie nowotworów myszy. W obszarze roboczym powinna znajdować się zlewka ze sterylnym fosforanem, buforowaną solą fizjologiczną lub PBS, a także pusta zlewka.

Aby wyrzucić zużyty PBS, należy pobrać od ośmiu do 10 mililitrów PBS do strzykawki i przymocować do endoskopu przy każdym użyciu. Podczas spłukiwania zawartości śródświetlnej znieczulij każdą mysz sedacją wziewną lub iniekcyjną i przymocuj mysz do płaskiej deski Za pomocą taśmy na ogonie i klatce piersiowej można uszczypnąć podkładki pod stopy myszy. Aby zapewnić odpowiednią sedację, użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć dolną część brzucha myszy, aby odsłonić odbyt, przesuń endoskop Muren do odbytnicy myszy.

Delikatnie użyj PBS do nadmuchiwania i nawadniania, aby poprawić widoczność śródświateł i usunąć zawartość kału. Kontynuuj powolne przesuwanie endoskopu, obserwując monitor. W przypadku obecności dużych guzów w 70 dniu każda mysz leczona A-O-M-D-S-S powinna mieć wiele guzów jelita grubego i być gotowa do oceny.

Ten stan może być opóźniony o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. Przygotować strzykawkę wypełnioną PBS przymocowaną do igły do zgłębnika. Strzykawka wypełniona podstawowymi nożyczkami chirurgicznymi 10% formaliny, nożyczkami z zaokrąglonymi końcówkami.

Mała strzykawka wypełniona 1% roztworem Ian Blue i cienkimi kleszkami. Rozłóż również zimną tacę, łódź z łodzią zawierającą schłodzoną nową maszynkę do golenia PBSA do cięcia i miskę do utrwalania wypełnioną 10% formaliną, poddaj każdą mysz eutanazji za pomocą izofu, fluoru i zwichnięcia szyjki macicy lub innej instytucjonalnie zatwierdzonej metody. Można dokonać ostatecznej wagi i innych pomiarów.

W tym czasie połóż mysz z odsłoniętą brzuszną stroną na desce do krojenia. Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby włosy były wolne od obszaru rozwarstwienia. Użyj kleszczy, aby chwycić linię środkową brzucha i wykonaj małe nacięcie przez skórę, aby odsłonić otrzewną.

Użyj delikatnej trakcji, aby oddzielić skórę od otrzewnej i odsłonić całą jamę brzuszną. Wykonaj nacięcie w otrzewnej i rozciągnij to nacięcie wzdłuż brzegu żebrowego obustronnie. Użyj zamkniętych nożyczek, aby zamiatać jelito cienkie i okrężnicę na bok.

Spowoduje to odsłonięcie krezkowych węzłów chłonnych, które można opcjonalnie pobrać. W celu oceny należy przeczesać drogi moczowe narządów płciowych niżej, aby odsłonić zstępującą okrężnicę i odbytnicę, w razie potrzeby wyciąć pęcherz moczowy i narządy rozrodcze, aby jeszcze bardziej odsłonić miednicę. Uważając, aby nie zakłócić sąsiednich tkanek.

Przeciąć dolną i górną rami łonową, aby odsłonić połączenie odbytnicze. Przetnij skórę wokół połączenia odbytniczo-odbytniczego, aby uwolnić okrężnicę, zapewniając jednocześnie delikatną przyczepność w górę. W przypadku kleszczy krezkowych przyczepy okrężnicy można wyciąć lub drażnić.

Ważne jest, aby zachować część skóry na skrzyżowaniu odbytnicy, ponieważ obszar ten jest często dotknięty dysplazją. Przeciąć jelito grube od jelita cienkiego tuż proksymalnie do jelita ślepego. Oddziel sekum od sąsiedniej okrężnicy za pomocą igły do zgłębnika o rozmiarze 18 przymocowanej do pięciomililitrowej strzykawki.

Przepłucz okrężnicę lodowatym PBS, aby płyn wydostał się w kierunku fizjologicznym za pomocą nożyczek o zaokrąglonych krawędziach. Otwórz okrężnicę wzdłuż krezki. Pomaluj otwartą okrężnicę na zimnej tacy.

Upewnij się, że tacka jest wystarczająco rozmrożona, aby nie zamrozić tkanki. Nałóż palcem kilka kropli 1%Ian Blue, aby lepiej uwidocznić guzy. Oceń liczbę i rozmiar guza za pomocą linijki lub zrób zdjęcia do analizy cyfrowej.

Małe fragmenty guza w sąsiedniej normalnej tkance można w tym momencie wyciąć do przyszłej analizy za pomocą białka RNA lub metod immunohistochemicznych, pozostawiając pewną część okrężnicy do oceny histologicznej. Nałóż 10% formal na pozostałą okrężnicę na zimnej tacy za pomocą strzykawki lub palca, pozwalając tkance utrwalić się przez co najmniej 30 sekund. W ten sposób ułatwia przenoszenie do miski mocującej.

Upewnij się, że resztki forminy zostały wytarte przed pomalowaniem nowo otwartej okrężnicy na tej samej tacy. Przenieś okrężnicę do miski wypełnionej 10% forminą i przygwożdżonej na krawędziach. Po trzech godzinach utrwalenia wyrzuć forminę i zastąp ją 70% etanolem.

Okrężnicy mogą być konserwowane w 70% etanolu w nieskończoność. Użyj małego ognia, aby przygotować roztwór 2% agaru i odłóż czyste szkiełko na szklaną płytkę. Pokrój nieruchomą okrężnicę na trzy części i włóż niewykorzystane kawałki do miski na etanol.

Przytnij sekcje do jednolitego rozmiaru za pomocą dwóch maszynek do golenia. Osadź skrawki jelita grubego i warstwy w agarze na czystym szkiełku. Powtórz ten proces dla następnego dwukropka.

Odciąć na segmenty, nadmiar agaru i umieścić osadzoną okrężnicę w kasecie w celu przetworzenia i barwienia hematyną i eoiną. Rysunek pierwszy przedstawia protokół indukcji raka związanego z zapaleniem jelita grubego. Rysunek drugi przedstawia masę myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania OM i DSS.

Należy pamiętać, że w ciągu tygodnia następującego po każdym cyklu DSS myszy tracą od pięciu do 10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest zastępczym markerem nasilenia zapalenia jelita grubego. Rycina trzecia przedstawia widok guzów w dystalnej części jelita grubego za pomocą endoskopii Murena w 50 dniu leczenia A-O-M-D-S-S.

Należy zauważyć, że wiele mas polipowatycznych blokujących światło dystalnej okrężnicy w panelach B i C w porównaniu z normalną okrężnicą. Na panelu rysunek czwarty pokazuje podłużnie otwartą okrężnicę myszy, ilustrującą ogólny wygląd guzów. Zwróć uwagę na większą masę guza w dalszej części okrężnicy i charakterystyczną teksturę proksymalnej okrężnicy z niewielkim wzrostem guza.

Rycina piąta przedstawia guzy uwydatnione przez zastosowanie lc i niebieskiego zabarwienia. Zwróć uwagę, jak barwnik podkreśla normalną teksturę okrężnicy, a także granice każdego pojedynczego guza. Takie barwienie może być pomocne w precyzyjnym pomiarze obszarów guza za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego.

Rycina szósta przedstawia reprezentatywny rozkład średniej liczby nowotworów na mysz leczoną OM i DSS. Należy pamiętać, że większość guzów znajduje się w dystalnej części okrężnicy i ma mniej niż dwa milimetry. Rysunek siódmy przedstawia podłużne odcinki okrężnicy zatopione w parafinie w kasecie oraz szkiełku barwiącym h i E.

Należy pamiętać, że resztkowa plama S i niebieska nie koliduje z barwieniem h i e. Na obrazie slajdu zakreślony jest duży guz. Dystalne, środkowe i proksymalne oznaczenie wynika z przecięcia całej okrężnicy na trzy części między jelitem ślepym a odbytem.

Rycina ósma przedstawia reprezentatywną histologię guza powstałego w wyniku podania OM i DSS w dystalnej części okrężnicy. Pokazane mikrofotografie są barwione H i E-B-R-D-U oraz beta-kateniną i wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolakoraka jelita grubego. W tym filmie pokazaliśmy protokół nowotwórczego jelita grubego wywołanego stanem zapalnym u myszy, wykorzystujący pojedyncze wstrzyknięcie OM, a następnie trzy siedmiodniowe cykle DSS.

W ciągu 10 tygodni model ten indukuje nowotwory ze zmianami histologicznymi i molekularnymi bardzo podobnymi do tych występujących w nowotworach związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi i stanowi bardzo cenny model do badania onkogenezy i chemioprofilaktyki w tej chorobie.