Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

W dniu zerowym myszy otrzymują zastrzyk z azoksymetanem lub OM w kolejnym tygodniu. Ich wodę pitną zastępuje się roztworem zawierającym dekstran siarczan sodu lub DSS. W trzecim tygodniu myszom podaje się wodę przez kolejne dwa tygodnie.

Ten cykl podawania DSS powtarzano jeszcze dwukrotnie. Po drugim cyklu DSS u myszy można ocenić obecność guzów za pomocą endoskopii lustrzanej.

Po 10. tygodniu myszy są uśmiercane, a okrężnice pobierane. Okrężnice są płukane i rozcinane wzdłużnie. Następnie ocenia się wielkość oraz liczbę guzów w okrężnicach.

Przekrój podłużny okrężnicy podzielony na trzy części można zalać w parafinie i przekazać do analizy histologicznej. Za pomocą mikroskopii świetlnej można policzyć i sklasyfikować guzy. Prezentujemy protokół, w którym podano genotoksyczny czynnik OM, a następnie trzy cykle czynnika prozapalnego.

DSS szybko i spójnie indukuje guzy jelita grubego u myszy, które wykazują podobieństwa morfologiczne i molekularne do tych obserwowanych w ludzkim raku związanym z zapaleniem jelit. W dniu zerowym należy indywidualnie oznakować myszy za pomocą znaków na ogonie lub nacięć ucha, zapisać masę początkową każdej myszy w tabeli, a następnie wstrzyknąć każdej myszy roztwór OM w dawce 10 mg/kg. Należy zachować ostrożność podczas pracy z OM, ponieważ jest to czynnik genotoksyczny. W dniu siódmym myszy należy zaopatrzyć w 2,5% roztwór DSS w wodzie pitnej na kolejny tydzień. Aby przygotować ten roztwór, należy dodać proszek DSS do wody destylowanej i mieszać do całkowitego rozpuszczenia.

Roztwór jest gotowy po przepuszczeniu go przez filtr z octanu celulozy o porach 0,2 mikrona. Aby zapewnić ciągłe dostarczanie roztworu DSS przez siedem dni, należy wymieniać DSS co dwa do trzech dni.

Po tym okresie należy przywrócić myszom dostęp do wody na dwa tygodnie. Myszy należy ważyć dwa do trzech razy w tygodniu i obserwować pod kątem występowania krwawień z odbytnicy oraz biegunki. U myszy z dużymi guzami może przejściowo wystąpić wypadanie odbytnicy, choć zazwyczaj nie obniża to odsetka przeżywalności.

Utratę masy ciała w stosunku do poziomu wyjściowego stosuje się jako miarę zastępczą ciężkości zapalenia jelita grubego. W tygodniu następującym po pełnym cyklu podawania DSS można spodziewać się utraty masy ciała do 10% wraz z dwu- lub trzydniową biegunką i krwawieniem z odbytu. W celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem zwierząt można przeprowadzić drugi lub trzeci cykl podawania DSS.

Ponieważ model A-O-M-D-S-S jest dość niezawodny w indukowaniu guzów, ten krok jest zazwyczaj zbędny. Tą metodą należy ocenić tylko kilka myszy, ponieważ może ona doprowadzić do uszkodzenia guzów u myszy. Stanowisko pracy powinno zawierać zlewkę ze sterylną solą fosforanową w roztworze buforowanym (PBS) oraz pustą zlewkę.

Aby usunąć zużyty roztwór PBS, nabić od 8 do 10 ml PBS do strzykawki i podłączyć ją do endoskopu przed każdym użyciem. W celu wypłukania zawartości światła jelit, znieczulić każdą mysz za pomocą sedacji wziewnej lub wstrzykiwanej, a następnie unieruchomić mysz na płaskiej desce za pomocą taśmy na ogonie i klatce piersiowej; można również przycisnąć poduszeczki łap myszy. Aby upewnić się, że sedacja jest wystarczająca, użyć kciuka i palca wskazującego, aby uścisnąć dolną część brzucha myszy w celu odsłonięcia odbytu, a następnie wprowadzić endoskop muren do odbytnicy myszy.

Ostrożnie należy użyć PBS do nadmuchania i przepłukania, aby poprawić widoczność w świetle jelita i usunąć treść kałową. Kontynuuj powolne wprowadzanie endoskopu, obserwując monitor. W przypadku występowania dużych guzów, w 70. dniu każda mysz leczona w modelu A-O-M-D-S-S powinna mieć wiele guzów okrężnicy i być gotowa do oceny.

Stan ten można opóźnić o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. Przygotować strzykawkę wypełnioną PBS z podłączoną igłą do zgłębnika. Strzykawkę z 10% formaliną, podstawowe nożyczki chirurgiczne oraz nożyczki z zaokrąglonymi końcami.

Mała strzykawka wypełniona 1% roztworem błękitu Jan oraz precyzyjna pęseta. Należy również przygotować tace chłodzącej, naczynko z schłodzonym PBSA, nową żyletkę do sekcjonowania oraz naczynie do utrwalania wypełnione 10% formaliną. Każdą mysz należy uśmiercić za pomocą izofluranu i zwichnięcia stawów szyjnych lub innej metody zatwierdzonej przez instytucję. Można wówczas dokonać pomiaru masy końcowej oraz innych pomiarów.

W tym momencie ułóż mysz na desce sekcyjnej brzuchem do góry. Spryskaj brzuch 70% ethanolem, aby odsunąć włosy z obszaru sekcji. Za pomocą pęsety uchwyć linię środkową brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie skóry, aby odsłonić otrzewną.

Zastosuj delikatną trakcję, aby oddzielić skórę od otrzewnej i odsłonić całą jamę brzuszną. Wykonaj nacięcie otrzewnej i przedłuż je wzdłuż łuków żebrowych po obu stronach. Używając zamkniętych nożyczek, odsuń jelito cienkie oraz grubą jelita na bok.

Pozwoli to na odsłonięcie węzłów chłonnych krezkowych, które można opcjonalnie pobrać. W celu oceny należy przesunąć układ moczowo-płciowy w kierunku dolnym, aby odsłonić okrężnicę zstępującą oraz odbytnicę, a następnie wyciąć pęcherz i narządy rozrodcze w stopniu niezbędnym do dalszego odsłonięcia miednicy, uważając, aby nie uszkodzić sąsiednich tkanek.

Przetnij dolną i górną gałąź łonową, aby odsłonić połączenie odbytniczo-odbytnicze. Przetnij skórę wokół połączenia odbytniczo-odbytniczego, aby uwolnić okrężnicę, wywierając jednocześnie delikatny nacisk w górę. Za pomocą kleszczyków mezentalnych można wyciąć lub odsunąć przyczepy okrężnicy.

Ważne jest, aby pozostawić część skóry w obrębie przejścia odbytniczo-odbytniczego, ponieważ obszar ten często jest dotknięty dysplazją. Przetnij jelito grube od jelita cienkiego tuż przed kątnicą. Oddziel kątnicę od sąsiadującego okrężnicy, używając igły do zgłębnika o rozmiarze 18 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml.

Przepłucz okrężnicę lodowatym PBS, używając nożyczek z zaokrąglonymi końcami w taki sposób, aby płyn wypływał w kierunku fizjologicznym. Rozetnij okrężnicę wzdłuż jej krezki. Rozłóż rozciętą okrężnicę na zimnej tacy.

Upewnij się, że tacka jest wystarczająco rozmrożona, aby nie zamrozić tkanki. Za pomocą palca nanieś kilka kropel 1% Ian Blue, aby lepiej zwizualizować guzy. Oceń liczbę i rozmiar guzów za pomocą linijki lub wykonaj zdjęcia do analizy cyfrowej.

Na tym etapie można wyciąć niewielkie fragmenty guza wraz z sąsiadującą zdrową tkanką do późniejszej analizy metodami białkowymi RNA lub immunohistochemicznymi, pozostawiając część okrężnicy do oceny histologicznej. Za pomocą strzykawki lub palca nanieś 10% formalinę na pozostałą część okrężnicy znajdującą się na chłodnej tacy, pozwalając tkance na utrwalenie przez co najmniej 30 sekund. W ten sposób ułatwia się przeniesienie próbki do naczynia z utrwalaczem.

Należy upewnić się, że pozostałości formaliny zostały usunięte przed malowaniem nowego otwieranego jelita grubego na tej samej tacy. Przenieś jelito grube do kuwety wypełnionej 10% formaliną i przypnij je za brzegi. Po trzech godzinach utrwalania wylej formalinę i zastąp ją 70% etanolem.

Jejuna można przechowywać w 70% etanolu w nieskończoność. Przy użyciu niskiej temperatury należy przygotować 2% roztwór agaru, a następnie odłożyć czyste szkiełko na szklaną płytę. Utrwalone jelito grube należy przeciąć na trzy części, a niewykorzystane fragmenty zwrócić do naczynia z etanolem.

Przytnij fragmenty do jednolitego rozmiaru, używając dwóch żyletek. Osadź przekroje i warstwy jelita grubego w agarze na czystym szkiełku. Powtórz ten proces dla kolejnego fragmentu jelita.

Wyciąć segment, usunąć nadmiar agaru i umieścić zatopioną okalnicę w kasecie do dalszej obróbki i barwienia hematylo- i eozyną. Rycina 1 przedstawia protokół indukcji raka związanego z zapaleniem jelit. Rycina 2 przedstawia masę ciała myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania OM i DSS.

Należy zauważyć, że w tygodniu następującym po każdym cyklu DSS myszy tracą od 5 do 10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest markerem zastępczym dla stopnia nasilenia zapalenia jelita grubego. Rysunek 3 przedstawia widok guzów w dystalnej części jelita grubego podczas endoskopii mysiej w 50. dniu leczenia A-O-M-D-S-S.

Należy zwrócić uwagę na liczne masy polipowate zamykające światło dystalnego odcinka okrężnicy na panelach B i C w porównaniu z prawidłową okrężnicą. Na panelu a rysunek cztery przedstawia wzdłużnie rozciętą okrężnicę myszy, ilustrując makroskopowy wygląd guzów. Zauważalny jest większy stopień obciążenia guzami w dystalnym odcinku okrężnicy oraz charakterystyczna tekstura proksymalnego odcinka okrężnicy z niewielkim wzrostem guzów.

Rysunek pięć przedstawia guzy uwidocznione dzięki zastosowaniu barwnika lc and blue. Zwróć uwagę, jak barwnik podkreśla prawidłową strukturę jelita grubego, a także granice każdego poszczególnego guza. Takie barwienie może być pomocne przy precyzyjnym pomiarze obszarów guzów za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego.

Rysunek sześć przedstawia reprezentatywny rozkład średniej liczby guzów na mysz traktowaną OM i DSS. Należy zauważyć, że większość guzów znajduje się w końcowej części okrężnicy i mają one rozmiar mniejszy niż dwa milimetry. Rysunek siedem przedstawia zatopione w parafinie przekroje podłużne okrężnicy w kasecie oraz preparat barwiony H i E.

Należy zauważyć, że pozostałości S i barwnika niebieskiego nie zakłócają barwienia H&E. Na obrazie preparatu zaznaczono okręgiem duży guz. Oznaczenia dystalny, środkowy i proksymalny wynikają z podzielenia całego okrężnicy na trzy części pomiędzy kątnicą a odbytem.

Rycina osiem przedstawia reprezentatywny obraz histologiczny guza powstałego w wyniku podania OM i DSS w dystalnej części okrężnicy. Przedstawione mikrografie zostały zabarwione H i E-B-R-D-U oraz beta-kateniną i wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolakoraków okrężnicy. W tym filmie zaprezentowaliśmy protokół indukowania zapalnej kancerogenezy okrężnicy u myszy, wykorzystujący pojedyncze wstrzyknięcie OM, po którym nastąpiły trzy siedmiodniowe cykle podawania DSS.

W ciągu 10 tygodni model ten indukuje guzy z przebudową histologiczną i zmianami molekularnymi ściśle przypominającymi te występujące w ludzkim raku towarzyszącym zapaleniu jelita grubego, stanowiąc tym samym niezwykle cenny model do badania onkogenezy i chemoprewencji w tej chorobie.