Name: Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego za pomocą azoksymetanu (AOM) i siarczanu dekstranu sodu (DSS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj protokół indukcji raka jelita grubego u myszy za pomocą azoksymetanu i siarczanu dekstranu sodu. Model ten pozwala badać nowotworzenie związane z zapaleniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została częściowo sfinansowana z grantów DK089016 i L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) oraz P30-DK52574 (dla Washington University Digestive Diseases Research Core). A.I.T. był stypendystą badawczym w ramach programu Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellow.

1. Indukcja raka związanego z zapaleniem jelita grubego
<ol>
 <li>Osobno przygotować klatki z myszami w wieku 6–8 tygodni, o tej samej płci i wieku, do wykorzystania w grupach eksperymentalnej i kontrolnej. Myszy można oznakować indywidualnie za pomocą markerów na ogonie lub nacięć ucha.</li>
 <li>W dniu 0. należy zapisać masę ciała wyjściową i wstrzyknąć każdej myszy dojamowo (IP) 10 mg/kg roztworu roboczego AOM (1 mg/ml w soli fizjologicznej, rozcieńczonego z roztworu stokowego 10 mg/ml w dH2O przechowywanego w temperaturze -20 deg C). W zależności od doświadczenia dawkę tę można dostosować w zakresie 7–14 mg/kg i/lub powtórzyć na wczesnym etapie eksperymentu.</li>
</ol>
Uwaga: AOM jest lotną substancją genotoksyczną i należy z nią obchodzić się ostrożnie zgodnie z dołączoną kartą charakterystyki substancji (MSDS). Roztwory należy przygotowywać w dygestorium, przechowywać w lodzie i utylizować zgodnie z protokołami obowiązującymi w danej instytucji.
<ol start="3">
 <li>Przygotować 2,5% (2,5 g/100 ml) roztwór DSS w wodzie destylowanej i przefiltrować go próżniowo przez filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 μm. Dawkę tę można dostosować w zakresie od 1-3,5% w zależności od szczepu myszy i warunków środowiskowych. Po przygotowaniu roztwór DSS można przechowywać w lodówce do 1 tygodnia. </li>
 <li>W dniu 7. podać myszom roztwór DSS jako wodę pitną. Przy maksymalnej liczbie 5 myszy w klatce, przy każdej wymianie roztworu DSS potrzeba będzie około 250 ml/klatkę; są to jednak jedynie wartości szacunkowe, które mogą się różnić w zależności od rodzaju butelek do wody stosowanych w danej pracowni zwierzęcej. </li>
 <li>Aby zapewnić ciągłość podawania DSS przez siedem dni, roztwór DSS w czystych butelkach należy wymieniać trzy razy (co 2-3 dni) w tym okresie. Niektórzy badacze przed wymianą na nowy roztwór mierzą ilość spożytego DSS jako wskaźnik ekspozycji. </li>
 <li>W dniu 14. przywrócić myszom w klatkach standardową wodę pitną na dwa tygodnie.</li>
 <li>Powtórzyć kroki (1.4) - (1.6) w dniach 28. i 49., aby przeprowadzić drugi i trzeci cykl podawania DSS. „Cykl” DSS składa się z jednego tygodnia podawania DSS w wodzie pitnej, po którym następują 2 tygodnie podawania zwykłej (autoklawowanej) wody. </li>
</ol>
2. Ocena kliniczna zapalenia jelita grubego i progresji guza
<ol>
 <li>Myszy należy ważyć i obserwować 2-3 razy w tygodniu. Procentowy ubytek masy ciała w stosunku do wartości wyjściowej służy jako miara zastępcza ciężkości zapalenia jelita grubego. W zależności od celów eksperymentalnych można przeprowadzać regularne oceny krwawień z odbytu, biegunki lub wypadania odbytnicy i raportować je zgodnie z różnymi systemami punktowymi.9, 10 </li>
 <li>W tygodniu następującym po pełnym cyklu podawania DSS można spodziewać się ubytku masy ciała do 10% wraz z 2-3 dniami biegunki i krwawień z odbytu (podczas tego bezpośredniego okresu po DSS pomocna może być codzienna obserwacja). </li>
</ol>
Istnieje możliwość, że niektóre myszy nie wyzdrowieją; myszy, które utratą więcej niż 20% masy ciała, mają mniejsze szanse na przeżycie i mogą wymagać przedwczesnej eutanazji. Pojedyncza injekcja IP 0,5 - 1,0 ml soli fizjologicznej u takich myszy może być użytecznym środkiem wspomagającym w celu uzupełnienia objętości płynów utraconych w wyniku biegunki.
3. Endoskopia myszy (opcjonalnie)
<ol>
 <li>Endoskopię po drugim lub trzecim cyklu DSS można przeprowadzić w celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem zwierząt. Ponieważ model AOM/DSS jest bardzo wiarygodny w indukowaniu guzów, ten krok zazwyczaj nie jest konieczny. Metodą tą należy ocenić tylko kilka myszy, ponieważ może ona doprowadzić do uszkodzenia guzów.11 </li>
 <li>Zanurzyć mysz w znieczuleniu poprzez inhalację lub wstrzyknięcie środka sedatywnego. </li>
 <li>Po znieczuleniu myszy należy przymocować ją taśmą za ogon i klatkę piersiową do płaskiej deski. </li>
 <li>Ostrożnie wprowadzić endoskop do odbytnicy myszy, używając soli fizjologicznej do nadmuchiwania i płukania, aby poprawić widoczność wewnątrzświatową i usunąć treść kałową. (Należy zauważyć, że endoskopię można również przeprowadzić za pomocą insuflacji powietrzem jako alternatywy dla soli fizjologicznej, co może zapewnić lepszą wizualizację guza.12) </li>
</ol>
4. Uśmiercanie myszy i pobieranie okrężnicy
<ol>
 <li>W 70. dniu u każdej myszy traktowanej AOM/DSS powinny znajdować się liczne guzy jelita grubego, gotowe do oceny. Termin ten można przesunąć o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. (Należy zauważyć, że myszy z ciężkim wypadnięciem odbytnicy mogą wymagać wcześniejszej eutanazji, aby uniknąć nadmiernego dyskomfortu zwierząt, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnych komisji ds. opieki nad zwierzętami).</li>
 <li>Przed nekropsją każdą mysz należy poddać eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia stawów szyjnych (lub innej zatwierdzonej przez instytucję metody). W tym czasie można dokonać pomiaru masy końcowej oraz innych parametrów.</li>
 <li>Położyć mysz brzuchem do góry na desce do krojenia. Brzuch należy pokryć 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawartości jamy brzusznej włosami podczas wycinania jelita grubego.</li>
 <li>Za pomocą pęsety uchwycić linię środkową brzucha i wykonać niewielkie nacięcie, aby odsłonić otrzewną.</li>
 <li>Rozszerzyć nacięcie po obu stronach brzucha wzdłuż łuku żebrowego.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek przeciąć miednicę, aby możliwe było pobranie jelita grubego aż do połączenia odbytowo-odbytniczego. Jest to istotne, ponieważ uszkodzenia wywołane zapaleniem jelit indukowanym DSS są największe w dystalnej części odbytnicy i odpowiednio w tym regionie obserwuje się największy rozwój guzów.</li>
 <li>W tym czasie można pobrać również dodatkowe tkanki, takie jak węzły chłonne krezkowe.</li>
</ol>
5. Przygotowanie jelita grubego do analizy makroskopowej
<ol>
 <li>Używając igły do zgłębnika 18G przymocowanej do strzykawki 5 ml, przepłucz jelito grube lodowatym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w taki sposób, aby płyn wypływał w kierunku fizjologicznym. Jeśli tkanka jelita grubego będzie wykorzystywana do analizy RNA lub białek, można ją utrzymać w niskiej temperaturze, stosując wcześniej schłodzone tace robocze.</li>
 <li>Rozetnij przepłukane jelito grube wzdłużnie wzdłuż krezki i rozłóż je na zimnej tace. Guzy są łatwiejsze do zlokalizowania, gdy jelito grube zostanie umieszczone na ciemnej powierzchni. Alternatywnie można zastosować 1% barwnik błękit Alciana, aby uwydatnić guzy. Ocen liczbę i rozmiar guzów za pomocą linijki lub suwmiarki cyfrowej.</li>
 <li>Na tym etapie można wyciąć małe fragmenty guza oraz przyległej prawidłowej tkanki do późniejszej analizy metodami RNA, białkowymi lub immunohistochemicznymi (IHC), pozostawiając część pozostałego jelita grubego do oceny histologicznej.</li>
</ol>
Cyfrowa fotografia makroskopowych preparatów okrężnicy bezpośrednio po kroku 5.2 może być pomocna w precyzyjnej analizie obciążenia nowotworowego, zwłaszcza jeśli znaczne fragmenty okrężnicy zostaną wycięte do innych form analizy opisanych powyżej. Obciążenie nowotworowe (%) można obliczyć jako stosunek powierzchni guza do całkowitej powierzchni okrężnicy, korzystając z darmowego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
6. Przygotowanie okrężnicy do oceny histologicznej
<ol>
 <li>Nanieś 10% formalinę na pozostałą część okrężnicy na zimnej tacy za pomocą strzykawki lub palca. Pozostawienie tkanki do utrwalenia w ten sposób przez co najmniej 30 sec ułatwia przeniesienie do naczynia z utrwalaczem. Przed nałożeniem nowej otwartej okrężnicy na tę samą tacę należy wytrzeć pozostałości formaliny.</li>
 <li>Przenieś okrężnice do naczynia wypełnionego 10% formaliną i przypnij je za krawędzie.</li>
 <li>Po 3 hr utrwalania przenieś okrężnice do 70% etanolu. Okrężnice mogą być przechowywane w 70% etanolu w nieskończoność.</li>
 <li>Trzy przekroje podłużne okrężnicy (proksymalny, środkowy, dystalny/odbytnica) można ustabilizować w 2% agarze i przekazać do zatopienia w parafinie. Należy upewnić się, że okrężnica proksymalna oraz okrężnica dystalna/odbytnica są zorientowane w jednolity sposób dla każdej myszy.</li>
 <li>Dysplazję, uszkodzenia krypt oraz stan zapalny może opisać i ocenić doświadczona osoba zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.10, 13-15 Myszy można uśmiercić przed 70 dniem, jeśli eksperymentator jest zainteresowany wykryciem wczesnych zdarzeń dysplastycznych.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Opisany tutaj model AOM/DSS pozwala badaczowi na niezawodne generowanie guzów okrężnicy u myszy. Wzrost guza w tym modelu jest bezpośrednio uwarunkowany towarzyszącym procesem zapalnym. Ciężkość zapalenia jelita grubego należy monitorować klinicznie, śledząc ubytek masy ciała oraz występowanie biegunki/hematochezji (Rycina 2). Objawy te aktywności choroby mają tendencję do pojawiania się do 5. dnia cyklu DSS i utrzymywania się przez cztery lub więcej dni po odstawieniu DSS. Rzadko u myszy z dużym obciążeniem guzami odbytnicy może dojść do wypadnięcia odbytnicy. Po drugim lub trzecim cyklu DSS biegunka może stać się uporczywa. Zazwyczaj guzy są obecne i możliwe do zidentyfikowania podczas kolonoskopii myszy przed trzecim cyklem DSS (Rycina 3). Dodatkowy czas i trzecia seria DSS skutkują powstaniem większych guzów w momencie pobrania tkanek (Rycina 4). Do uwydatnienia guzów można zastosować miejscowe barwienie błękitem Alcianem (Rycina 5). Fotografie guzów okrężnicy pomogą w wyznaczeniu wymiarów guza, co może zostać wykorzystane do ilościowego porównania liczby i wielkości guzów między grupami eksperymentalnymi (Rycina 6). Utrwalone i zatopione w parafinie preparaty okrężnicy mogą następnie zostać poddane ocenie histologicznej lub barwieniu immunohistochemicznemu (Rycina 7 i 8).
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="Schemat harmonogramu eksperymentalnego; traktowanie AOM/DSS w tygodniach; proces badań nad stanem zapalnym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat podawania AOM i DSS. AOM (10 mg/kg) jest wstrzykiwany w dniu 0. Na początku drugiego tygodnia (dzień 7) myszom podaje się 2,5% roztwór DSS w wodzie pitnej. Po siedmiu dniach podawania DSS następują dwa tygodnie podawania wody autoklawowanej. Przed ubojem wykonuje się dwa dodatkowe cykle podawania DSS. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="Wykres przedstawiający względną zmianę masy ciała w ciągu 56 dni; analiza danych w badaniach biologicznych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Masa ciała myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania AOM i DSS. Należy zauważyć, że w tygodniu następującym po każdym cyklu DSS myszy tracą 5-10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest markerem zastępczym dla nasilenia zapalenia jelita grubego. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="Obrazy endoskopowe przedstawiające struktury anatomiczne; etykiety wskazują obszary 1, 2 i 3 do badania." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Widok guzów w dystalnej części okrężnicy podczas endoskopii mysiej w 50. dniu leczenia AOM/DSS. Zauważalne są liczne masy polipowate zamykające światło dystalnej części okrężnicy (b, c) w porównaniu do prawidłowej okrężnicy (a).
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="Schemat morfologii tkanki; obszary dystalne, środkowe i proksymalne; analiza mikroskopowa; badanie biologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Podłużnie otwarte jelito grube myszy ilustrujące wygląd makroskopowy guzów. Zwrócić uwagę na większą liczbę guzów w dystalnej części jelita grubego/odbytnicy (górny obraz po lewej) oraz charakterystyczną pofałdowaną strukturę proksymalnej części jelita grubego (górny obraz po prawej) z niewielkim wzrostem guzów. Powiększenie dystalnej części jelita grubego pokazuje liczne guzy o różnych rozmiarach (poniżej). 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="Struktura jelita, sekcja; schemat anatomii układu pokarmowego; badanie ludzkiego przewodu pokarmowego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Guzy wyróżnione poprzez zastosowanie barwienia błękitem Alcianem. Należy zwrócić uwagę, jak barwnik podkreśla normalną strukturę okrężnicy, a także granice każdego poszczególnego guza. Takie barwienie może być pomocne w precyzyjnym pomiarze obszarów guzów za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="Wykres słupkowy rozkładu guzów; lokalizacja w okrężnicy; porównanie średnicy; analiza badawcza." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywny rozkład średniej liczby guzów na mysz leczoną AOM/DSS. Należy zauważyć, że większość guzów znajduje się w dystalnej części okrężnicy i ma rozmiar &lt;2 mm. 
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="Przekrój histologiczny sekcji okrężnicy myszy, z opisami regionów i lokalizacji anatomicznych, schemat." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 7. Podłużne przekroje okrężnicy zatopione w parafinie w kasecie (powyżej) oraz na szkiełku po barwieniu H&amp;E (poniżej). Należy zauważyć, że pozostałości barwienia błękitem Alciana nie zakłócają barwienia H&amp;E. Na obrazie szkiełka zaznaczono okręgiem duży guz (określony okręgiem). Oznaczenia „dystalny”, „środkowy” i „proksymalny” wynikają z podziału całej okrężnicy na trzy części między kątnicą a odbytnicą.
<img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="Schemat analizy histologicznej: przekroje tkanek barwione H&amp;E, BrdU, β-catenin przy powiększeniu 50x, 400x." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Reprezentatywna histologia guza powstałego w wyniku podania AOM/DSS w dystalnej części okrężnicy. Preparaty barwione H&amp;E, BrdU oraz β-catenin przy powiększeniu 50X (panel górny) i 400X (panel dolny) odpowiednio wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolaków okrężnicy.

<ol><li>Ekbom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis+and+colorectal+cancer.+A+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study.</a> N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).</li>
<li>Terzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and colon cancer.</a> Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).</li>
<li>Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal inflammation and cancer.</a> Gastroenterology. 140, 1807-1816 (2011).</li>
<li>Okayasu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysplasia+and+carcinoma+development+in+a+repeated+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Dysplasia and carcinoma development in a repeated dextran sulfate sodium-induced colitis model.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 1078-1083 (2002).</li>
<li>Kanneganti, M., Mino-Kenudson, M., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+colitis-associated+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of colitis-associated carcinogenesis.</a> J. Biomed. Biotechnol. 342637, (2011).</li>
<li>Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+mouse+model+of+colon+carcinogenesis+for+the+analysis+of+sporadic+and+inflammation-driven+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression.</a> Nat. Protoc. 2, 1998-2004 (2007).</li>
<li>Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94, 965-973 (2003).</li>
<li>De Robertis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AOM%2FDSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%3A+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J. Carcinog. 10, 9(2011).</li>
<li>Wirtz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Cooper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathologic+study+of+dextran+sulfate+sodium+experimental+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis.</a> Lab Invest. 69, 238-249 (1993).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nat. Protoc. 1, 2900-2904 (2006).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Wirtz, S., Nikolaev, A., Kiesslich, R., Lehr, H. A., Galle, P. R., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+colitis+and+colon+cancer+development+in+mice+using+high+resolution+chromoendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy.</a> Gut. 54, 950-954 (2005).</li>
<li>Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> J. Clin. Invest. 120, 2081-2093 (2010).</li>
<li>Boivin, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+mouse+models+of+intestinal+cancer%3A+consensus+report+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathology of mouse models of intestinal cancer: consensus report and recommendations.</a> Gastroenterology. 124, 762-777 (2003).</li>
<li>Cooper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysplasia+and+cancer+in+the+dextran+sulfate+sodium+mouse+colitis+model.+Relevance+to+colitis-associated+neoplasia+in+the+human%3A+a+study+of+histopathology%2C+B-catenin+and+p53+expression+and+the+role+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Dysplasia and cancer in the dextran sulfate sodium mouse colitis model. Relevance to colitis-associated neoplasia in the human: a study of histopathology, B-catenin and p53 expression and the role of inflammation.</a> Carcinogenesis. 21, 757-768 (2000).</li>
<li>Yoshida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+box+M1+transcription+factor+contributes+to+the+development+and+growth+of+mouse+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 132, 1420-1431 (2007).</li>
<li>Suzuki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+the+susceptibility+to+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate-induced+colon+carcinogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice.</a> Carcinogenesis. 27, 162-169 (2006).</li>
<li>Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am. J. Physiol. 274, 544-551 (1998).</li>
<li>Nambiar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+analysis+of+azoxymethane+induced+colon+tumors+in+inbred+mice+commonly+used+as+transgenic%2Fknockout+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors.</a> Int. J. Oncol. 22, 145-150 (2003).</li>
<li>Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinogenesis%3A+Review+of+human+and+experimental+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental animal studies.</a> J Carcinog. 8, (2009).</li>
<li>Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IDO-1+by+immunostimulatory+DNA+limits+severity+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of IDO-1 by immunostimulatory DNA limits severity of experimental colitis.</a> J. Immunol. 184, 3907-3916 (2010).</li>
<li>Kerr, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulfate+inhibition+of+real-time+polymerase+chain+reaction+amplification%3A+A+poly-A+purification+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: A poly-A purification solution.</a> Inflamm. Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((is+required+for+resection-induced+changes+in+apoptosis%2C+proliferation%2C+and+members+of+the+extrinsic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">is required for resection-induced changes in apoptosis, proliferation, and members of the extrinsic cell death pathways.</a> Gastroenterology. 126, 220-230 (2004).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Leczenie myszy AOM i DSS szybko i skutecznie modeluje ludzkiego raka związanego z zapaleniem jelita grubego. Hipotezy dotyczące dziedzicznych czynników przyczyniających się do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego można łatwo badać z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie.13, 16 Alternatywnie, wpływ celów farmakologicznych w raku związanym z zapaleniem jelita grubego można badać, stosując myszy typu dzikiego.
Mimo że model ten jest wysoko ceniony przez badaczy z...

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Azoksymetana (AOM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5486-100MG</td><td>&lt;strong&gt;Roztwór zapasowy:&lt;/strong&gt; rozcieńczyć do 10 mg/ml w wodzie destylowanej, przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C w aliquotach 0,5 – 1 ml. &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Roztwór roboczy:&lt;/strong&gt; rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 1 mg/ml w izotonicznym (0,9%) roztworze soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Deksyran siarczan sodu (DSS)</td><td>TdB Consultancy</td><td>DB001</td><td>MW 40 kDa (akceptowalne są preparaty 36-50 kDa z innych źródeł; do jednego eksperymentu należy użyć tej samej partii)&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>System miniendoskopowy Coloview</td><td>Karl Storz</td><td>Wiele</td><td>Szczegółny opis sprzętu i konfiguracji znajduje się u Beckera &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Butelka-filtr TPP Rapid FILTERMAX 500 ml, 0,22 &amp;mu;m PES</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP99500</td><td>Akceptowalny jest każdy standardowy filtr do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 Proof ASC/USP</td><td>Pharmaco-AAPER (lub inny)</td><td>11ACS200</td><td>Rozcieńczyć do 70% w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>4029405</td><td>Umieścić mysz w szklanym słoiku z gazą lub małą szmatką nasączoną środkiem anestetycznym</td></tr><tr><td>Prosta igła do zgłębnikowania 18G</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-008</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Rozcieńczyć do 1X (0,01 M) w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Taca chłodząca (Tissue Tek II Cold Plate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491941</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH (bezpłatne pobieranie)</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot; target=&quot;_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td>Rozcieńczyć do 10% w PBS</td></tr><tr><td>Agar BD Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>Użyć płyty grzejnej do przygotowania 2% roztworu w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Pinceta okulistyczna Miltex Eye Dressing</td><td>MedPlus Inc.</td><td>18-780</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne Miltex</td><td>MedPlus Inc.</td><td>18-1430</td><td>Zakrzywione końce zapobiegają uszkodzeniu jelita grubego podczas otwierania.</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX (proszek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5268</td><td>Dodać 1 g proszku do 100 ml 3% kwasu octowego (3 ml octanu lodowatego + 97 ml wody destylowanej)</td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa 1 mL z dołączoną igłą śródskórną 26 G x 3/8 cala</td><td>BD</td><td>305946</td><td>Do wstrzykiwania AOM</td></tr></tbody></table>

modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (aom) i dekstranu siarczanowego sodu (dss)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Osoby z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), są bardziej narażone na rozwój raka jelita grubego (CRC) niż osoby zdrowe. Ryzyko to jest proporcjonalne do czasu trwania i zasięgu choroby, a skumulowana zapadalność może sięgać 30% u osób z wieloletnim UC z rozległym zajęciem okrężnicy.1 Przyjmuje się, że dysplazja okrężnicy w IBD oraz rak związany z zapaleniem jelita grubego (CAC) rozwijają się w wyniku powtarzających się cykli uszkadzania i naprawy komórek nabłonkowych, podczas gdy komórki te są wystawione na działanie przewlekłego środowiska cytokin zapalnych.2 Choć nowotwory spontaniczne i związane z zapaleniem jelita grubego mają wspólną cechę w postaci bycia gruczolakorakami, uważa się, że sekwencja leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych jest inna.3 Ta różnica uzasadnia potrzebę stosowania specyficznych modeli zwierzęcych CAC.
Obecnie istnieje kilka modeli mysich do badania CAC. Dekstran siarczan sodu (DSS), związek o bezpośrednim działaniu toksycznym na nabłonek okrężnicy, może być podawany myszom w wodzie pitnej w wielu cyklach w celu wywołania stanu przewlekłego zapalenia. Przy odpowiednio długim czasie trwania u niektórych z tych myszy rozwijają się guzy.4 Rozwój guzów w tym modelu jest przyspieszony, jeśli substancja jest podawana w warunkach prokarcynogennych. Obejmują one myszy z mutacjami genetycznymi w szlakach tumorigenzy (APC, p53, Msh2), a także myszy poddane wcześniejszemu leczeniu czynnikami genotoksycznymi (azoksymetan [AOM], 1,2-dimetylohydrazyna [DMH]).5
Połączenie DSS z AOM jako model raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelit zyskało popularność ze względu na swoją powtarzalność, skuteczność, niską cenę i łatwość zastosowania. Chociaż oba związki mają wspólny mechanizm działania, stwierdzono, że AOM jest bardziej aktywny i stabilny w roztworze niż DMH. Podczas gdy rozwój guzów w innych modelach zazwyczaj wymaga kilku miesięcy, u myszy poddanych iniekcji AOM, a następnie traktowanych DSS, odpowiednie guzy rozwijają się już w ciągu 7–10 tygodni.6, 7 Ponadto AOM i DSS można podawać myszom o dowolnym podłożu genetycznym (knock out, transgeniczne itp.) bez konieczności krzyżowania ze specyficzną linią nowotworową. W niniejszej pracy prezentujemy protokół indukowania nowotworzenia w okrężnicy wywołanego zapaleniem u myszy, wykorzystujący pojedynczą iniekcję AOM, po której następują trzy siedmiodniowe cykle podawania DSS w okresie 10 tygodni. Model ten indukuje guzy z zmianami histologicznymi i molekularnymi ściśle przypominającymi te występujące w ludzkim CAC, stanowiąc tym samym niezwykle wartościowy model do badania onkogenezy i chemoprewencji w tej chorobie.8

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Osoby z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), są bardziej narażone na rozwój raka jelita grubego...

W dniu zerowym myszy wstrzyknięto azoksymetanu lub OM w następnym tygodniu. Ich wodę pitną zastąpiono roztworem zawierającym siarczan dekstranu sodu lub DSS. W trzecim tygodniu myszy otrzymywały wodę przez kolejne dwa tygodnie.Ten cykl podawania DSS w wodzie jest powtarzany jeszcze dwukrotnie. Po drugim cyklu DSS myszy można zbadać pod kątem obecności guzów za pomocą endoskopii lustrzanej.Po 10. tygodniu myszy są uśpione, a ich okrężnice pobierane. Okrężnice są płukane i rozcinane wzdłużnie. Następnie ocenia się wielkość oraz liczbę guzów w obrębie okrężnic.Przekrój podłużny okrężnicy, podzielony na trzy części, można zalać w parafinie i przekazać do analizy histologicznej. Za pomocą mikroskopii świetlnej można policzyć i sklasyfikować guzy. Prezentujemy protokół, w którym podaje się genotoksyczny czynnik OM, a następnie trzy cykle czynnika prozapalnego.DSS szybko i konsekwentnie wywołuje guzy jelita grubego u myszy, wykazujące podobieństwa morfologiczne i molekularne do tych obserwowanych w przebiegu raka jelita grubego związanego z zapaleniem colitis u ludzi. W dniu zerowym należy indywidualnie oznaczyć myszy za pomocą znaczników ogonowych lub wycięć usznych, zapisać masę początkową każdej myszy w tabeli, a następnie wstrzyknąć każdej myszy roztwór OM w dawce 10 mg/kg. Należy zachować ostrożność podczas pracy z OM, ponieważ jest to czynnik genotoksyczny. W siódmym dniu myszy otrzymują 2,5% roztwór DSS w wodzie pitnej przez następny tydzień. Aby przygotować ten roztwór, należy dodać proszek DSS do wody destylowanej i mieszać do momentu rozpuszczenia.Roztwór jest gotowy po przepuszczeniu go przez filtr z octanu celulozy o porach 0,2 mikrona. Aby zapewnić ciągłe dostarczanie roztworu DSS przez siedem dni, należy wymieniać DSS co dwa do trzech dni.Po tym okresie przenieść myszy z powrotem do klatek z wodą na dwa tygodnie. Ważyć myszy dwa do trzech razy w tygodniu i obserwować pod kątem krwawienia z odbytu oraz biegunki. U myszy z dużymi guzami może tymczasowo wystąpić wypadanie odbytu, choć zazwyczaj nie obniża to odsetka przeżywalności.Utratę masy ciała w stosunku do wartości bazowej wykorzystuje się jako miarę zastępczą stopnia ciężkości zapalenia jelita grubego. W tygodniu następującym po pełnym cyklu podawania DSS można spodziewać się utraty masy ciała do 10% wraz z dwu- lub trzydniową biegunką i krwawieniem z odbytu. W celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem zwierząt można przeprowadzić drugi lub trzeci cykl podawania DSS.Ponieważ model A-O-M-D-S-S jest bardzo wiarygodny w indukowaniu nowotworów, ten etap jest zazwyczaj zbędny. Tą metodą należy ocenić tylko kilka myszy, ponieważ może ona doprowadzić do uszkodzenia guzów. Stanowisko pracy powinno zawierać zlewkę ze sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) oraz pustą zlewkę.Aby usunąć zużyty PBS, nabierz od 8 do 10 ml PBS do strzykawki i podłącz ją do endoskopu przed każdym użyciem. W celu wypłukania treści wewnątrzświatowej znieczul każdą mysz za pomocą sedacji wziewnej lub wstrzykiwanej i przymocuj zwierzę do płaskiej deski taśmą w obrębie ogona i klatki piersiowej; można również unieruchomić poduszki łap myszy. Aby upewnić się, że sedacja jest wystarczająca, użyj kciuka i palca wskazującego, aby ucisnąć dolną część brzucha myszy w celu odsłonięcia odbytu, a następnie wprowadź endoskop Muren do odbytnicy myszy.Delikatnie użyć PBS do nadmuchania i przemycia, aby poprawić widoczność wewnątrz światła jelita i usunąć zawartość kałową. Kontynuować powolne wprowadzanie endoskopu, obserwując monitor. W przypadku obecności dużych guzów w 70. dniu każda mysz leczona A-O-M-D-S-S powinna wykazywać liczne guzy okalnicze i być gotowa do oceny.Ten etap można opóźnić o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. Przygotować strzykawkę wypełnioną PBS z przymocowaną igłą do zgłębnikowania. Strzykawka z 10% formaliną, podstawowe nożyczki chirurgiczne, nożyczki z zaokrąglonymi końcówkami.Mała strzykawka wypełniona 1% roztworem błękitu Evansa oraz precyzyjna pęseta. Należy również przygotować chłodną tacę, naczynko z schłodzonym PBSA, nową żyletkę do sekcjonowania oraz naczynie do fiksacji wypełnione 10% formaliną. Każdą mysz należy poddać eutanazji za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjnego lub innej zatwierdzonej przez instytucję metody. Można dokonać pomiaru masy końcowej oraz innych pomiarów.W tym momencie ułóż mysz na desce sekcyjnej brzuchem do góry. Spryskaj brzuch 70%etanolem, aby usunąć włosy z obszaru sekcji. Za pomocą pęsety uchwyć linię środkową brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie skóry, aby odsłonić otrzewną.Zastosuj delikatną trakcję, aby oddzielić skórę od otrzewnej i odsłonić całą jamę brzuszną. Wykonaj nacięcie otrzewnej i przedłuż je wzdłuż łuków żebrowych po obu stronach. Używając zamkniętych nożyczek, odsuń jelito cienkie i grubą jelitę na bok.Umożliwi to odsłonięcie węzłów chłonnych krezkowych, które można opcjonalnie pobrać. W celu oceny należy odsunąć układ moczowo-płciowy w dół, aby odsłonić zstępnicę oraz odbytnicę, a następnie wyciąć pęcherz moczowy i organy rozrodcze w stopniu niezbędnym do dalszego odsłonięcia miednicy, uważając, aby nie uszkodzić sąsiednich tkanek.Przetnij dolną i górną gałąź kości łonowej, aby odsłonić miejsce połączenia odbytnicy z kanałem odbytowym. Przetnij skórę wokół połączenia odbytnicy z kanałem odbytowym, aby uwolnić okrężnicę, wywierając jednocześnie delikatny nacisk w kierunku górnym. Za pomocą kleszczyków naczyniowych (mesenteric) można wyciąć lub odsunąć przyczepy okrężnicy.Ważne jest, aby zachować fragment skóry w miejscu połączenia odbytu z odbytnicą, ponieważ obszar ten jest często dotknięty dysplazją. Przetnij jelito grube od jelita cienkiego bezpośrednio proksymalnie w stosunku do kątnicy. Oddziel kątnicę od przyległego okaltnika, używając igły do gavage o rozmiarze 18 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml.Przepłucz okrężnicę lodowatym PBS w taki sposób, aby płyn wypływał w kierunku fizjologicznym, używając nożyczek z zaokrąglonymi końcami. Rozetnij okrężnicę wzdłuż krezówki. Rozprostuj otwartą okrężnicę na zimnej tacy.Upewnij się, że tacka została wystarczająco rozmrożona, aby nie zamrozić tkanki. Nanieś palcem kilka kropel 1% Ian Blue w celu lepszej wizualizacji guzów. Oceń liczbę i rozmiar guzów za pomocą linijki lub wykonaj zdjęcia do analizy cyfrowej.Na tym etapie można wyciąć niewielkie fragmenty guza wraz z przyległą prawidłową tkanką do późniejszej analizy metodami białkowymi RNA lub immunohistochemicznymi, pozostawiając część okrężnicy do oceny histologicznej. Należy nanieść 10% formalinę na pozostałą część okrężnicy na tacy chłodzącej za pomocą strzykawki lub palca, pozwalając tkance na utrwalenie przez co najmniej 30 sekund. W ten sposób ułatwia się przeniesienie preparatu do naczynia z utrwalaczem.Przed malowaniem nowej, otwartej okładziny jelita grubego na tej samej tacy należy upewnić się, że resztki formaliny zostały wytarte. Przenieś okładzinę do kuwety wypełnionej 10% formaliną i przypnij jej brzegi. Po trzech godzinach utrwalania wylej formalinę i zastąp ją 70% etanolem.Jejuny można przechowywać w 70% etanolu w nieskończoność. W niskiej temperaturze należy przygotować 2% roztwór agaru, a następnie odłożyć czysty szkiełko na szklaną płytkę. Utrwalony odcinek jelita grubego należy przeciąć na trzy części, a nieużyte fragmenty zwrócić do naczynia z etanolem.Przytnij fragmenty do jednolitej wielkości, używając dwóch żyletki. Osadź przekroje i warstwy jelita grubego w agarze na czystym szkiełku. Powtórz ten proces dla kolejnego fragmentu jelita grubego.Wyciąć fragment, usunąć nadmiar agaru i umieścić zatopioną okolicę jelita grubego w kasecie w celu przetworzenia i barwienia hematoksyliną i eozyną. Rysunek 1 przedstawia protokół indukcji raka związanego z zapaleniem jelit. Rysunek 2 przedstawia masę ciała myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania OM i DSS.Należy zauważyć, że w tygodniu następującym po każdym cyklu DSS myszy tracą od 5% do 10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest markerem zastępczym dla stopnia ciężkości zapalenia jelita grubego. Rysunek 3 przedstawia widok guzów w dalszej części jelita grubego podczas endoskopii muren w 50. dniu leczenia A-O-M-D-S-S.Należy zwrócić uwagę na liczne masy polipowate zamykające światło okrężnicy dystalnej na panelach B i C w porównaniu z normalną okrężnicą. Panel a na rysunku cztery przedstawia podłużnie rozciętą okrężnicę myszy, ilustrując makroskopowy wygląd guzów. Zauważalne jest większe obciążenie nowotworowe w okrężnicy dystalnej oraz charakterystyczna tekstura okrężnicy proksymalnej z niewielkim wzrostem guza.Rysunek pięć przedstawia guzy wyróżnione poprzez zastosowanie barwnika lc and blue. Zauważmy, w jaki sposób barwnik podkreśla naturalną strukturę jelita grubego, a także granice każdego poszczególnego guza. Takie barwienie może być pomocne przy precyzyjnym pomiarze obszarów guzów za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego.Rysunek sześć przedstawia reprezentatywny rozkład średniej liczby guzów na mysz traktowaną OM i DSS. Należy zauważyć, że większość guzów znajduje się w końcowej części okrężnicy i ma rozmiar mniejszy niż dwa milimetry. Rysunek siedem przedstawia zatopione w parafinie przekroje podłużne okrężnicy w kasecie oraz preparat barwiony H i E.Należy zauważyć, że resztki barwnika S oraz barwienia niebieskiego nie kolidują z barwieniem H&amp;E. Na obrazie preparatu zaznaczono okręgiem duży guz. Oznaczenia dystalny, środkowy i proksymalny wynikają z podzielenia całego okrężnicy na trzy części między kątnicą a odbytem.Rysunek osiem przedstawia reprezentatywną histologię guza powstałego w wyniku podania OM i DSS w końcowym odcinku okrężnicy. Przedstawione mikrofotografie są barwione H i E-B-R-D-U oraz beta-kateniną i wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolaków okrężnicy. W tym filmie zaprezentowaliśmy protokół indukowania stanu zapalnego prowadzącego do nowotworzenia w okrężnicy myszy, z wykorzystaniem pojedynczego wstrzyknięcia OM, po którym następowały trzy siedmiodniowe cykle podawania DSS.W okresie 10 tygodni model ten indukuje guzy z cechami histologicznymi i molekularnymi ściśle przypominającymi zmiany występujące w przebiegu raka jelita grubego powiązanego z zapaleniem colitis u ludzi, stanowiąc niezwykle cenny model do badania onkogenezy oraz chemoprewencji w tej chorobie.

modeling-colitis-associated-cancer-with-azoxymethane-aom-dextran

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z użyciem azoksymetanu (AOM) i siarczanu dekstrany sodu (DSS)

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Ten film demonstruje technikę generowania chemicznie wywołanego mysiego modelu zapalenia jelita grubego - choroby zapalnej jelit. Mysz może spożywać roztwór siarczanu sodu dekstranu (DSS) przez odpowiedni czas. Po spożyciu DSS uszkadza barierę warstwy śluzu i nabłonka w okrężnicy, umożliwiając drobnoustrojom jelitowym przedostanie się do leżącej poniżej tkanki – gdzie są wyczuwane przez rezydujące komórki odpornościowe, aby pośredniczyć w przesadnej odpowiedzi immunologicznej, powodując stan...

Technika generowania mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem sodu

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Prezentowany protokół opisuje łatwe chirurgiczne usunięcie wyrostka robaczkowego (łaty kątniczej) u myszy, a następnie indukcję raka jelita grubego związanego z chorobą jelit grubego. Ten mysi model wyrostka robaczkowego umożliwia badanie biologicznej roli wyrostka robaczkowego w patogenezie chorób przewodu pokarmowego u ludzi.

Mysi model wycięcia wyrostka robaczkowego przewlekłego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego poprzez precyzyjną lokalizację łaty kątniczej

Ten protokół dostarcza mysi model wrzodziejącego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego wywołanego przez azmetan w połączeniu z siarczanem dekstranu sodu. Model został wykorzystany do oceny skuteczności związków tradycyjnej medycyny chińskiej w profilaktyce i leczeniu raka jelita grubego.

Opracowanie modelu raka jelita grubego u myszy i ocena efektu terapeutycznego medycyny chińskiej

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Poznaj protokół indukcji raka jelita grubego u myszy za pomocą azoksymetanu i siarczanu dekstranu sodu. Model ten pozwala badać nowotworzenie związane z zapaleniem.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Przeglądaj więcej filmów