Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja, wizualizacja i policzenie cytów z dzikich gąsienic. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie gąsienicy poprzez umieszczenie jej na lodzie, wstrzyknięcie jej roztworu buforowego zawierającego antykoagulant i powrót gąsienicy do lodu, aby umożliwić cytom He ponowne wejście do krążenia przed ekstrakcją. Drugim krokiem jest wykonanie płytkiego nacięcia na tylnym końcu gąsienicy za pomocą czystego skalpela.

Następnie gąsienicę delikatnie ściska się za pomocą miękkich kleszczy. Następnie roztwór buforowy mieszanki limfy hemologicznej jest odsysany za pomocą mikropipety i zbierany do mikroprobówki wirówkowej. Ostatnim krokiem jest delikatne wymieszanie roztworu limfy hemo z równą objętością roztworu buforowego i przeniesienie 10 mikrolitrów roztworu na hemocytometr w celu wizualizacji i policzenia liczby cytów.

Ostatecznie ta metoda ekstrakcji hemocytów może być stosowana jako szybka i skuteczna metoda liczenia cytów z różnych gatunków gąsienic i konserwacji jako narzędzie do badania fizjologicznych aspektów komórkowej odpowiedzi immunologicznej owadów. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować do ekstrakcji soczków hemo z gąsienic o bardzo zredukowanym prox. Inne modele gąsienic są odpowietrzane przez odcięcie jednego z plusów, bez konieczności ekstrakcji cytów z wypływającego płynu.

Ponadto technika ta może być stosowana do ekstrakcji hemotypu z innych gatunków owadów. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie eko immunologii, takie jak to, jak odpowiedź immunologiczna komórek owadów zmienia się w zależności od jakości diety, etapu rozwoju lub narażenia na różne patogeny. Aby rozpocząć tę procedurę, znieczul przedostatnie larwy w stadium rozwojowym, schładzając je na lodzie przez 20 minut przed ekstrakcją hemocytów.

Następnie włóż koniec czystej igły kapilarnej o rozmiarze 16 do rurki podłączonej do szklanej strzykawki o pojemności 20 mililitrów. Pozostawić probówkę zawierającą roztwór do pobierania otwartą na stole laboratoryjnym. Powoli napełnij kapilarę buforem o pojemności około 10 do 15 mikrolitrów.

Następnie oprzyj igłę na kulce gliny, którą umieszcza się obok mikroskopu preparacyjnego. Umieść gąsienicę na szalce Petriego. Owad powinien być ustawiony na boku tak, aby kuliste elementy były dobrze widoczne.

Podczas oglądania pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj gąsienicę na miejscu za pomocą kleszczy i umieść igłę blisko jednej z kulistych kulek, gdzie naskórek owada jest na ogół bardziej miękki. Następnie delikatnie dociśnij igłę kapilarną do ciała owada. Gdy igła wbije się w naskórek, wstrzyknąć całą objętość roztworu do gąsienicy.

Ciało gąsienicy puchnie po wstrzyknięciu, ale nie powinno pękać ani sączyć się. Włóż gąsienicę z powrotem na mrożoną szalkę Petriego. Ułóż owada grzbietowo, aby zapobiec wyciekaniu buforu z rany.

Powtórzyć wstrzyknięcia dla każdej gąsienicy używanej do ekstrakcji wiotkiej krwi. Następnie pozwól wszystkim owadom schłodzić się na lodzie przez 30 minut. Teraz umieść gąsienicę na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym

Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie o długości około dwóch do trzech milimetrów w tylnej części gąsienicy, używając sterylnego skalpela, nie uszkadzając jelit ani innych narządów wewnętrznych. Następnie delikatnie ściśnij gąsienicę za pomocą elastycznych plastikowych kleszczyków, zbierając około 10 do 20 mikrolitrów wiotkiej mieszanki hemo za pomocą 10-mikrolitrowej końcówki pipety. Ponownie uważaj, aby nie uszkodzić tkanek wewnętrznych.

Następnie wyrzuć resztki gąsienic. Zbierz wiotki hemo z każdej gąsienicy w osobnych, oznakowanych, silikonowanych, 0,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówek. Następnie dodać około 10 do 20 mikrolitrów roztworu inkubacyjnego do każdej próbki hemo wiotkiej pobranej z pojedynczej gąsienicy.

Na tym etapie należy przechowywać próbki hemolimfy na lodzie przez cały czas. Wymieszać próbkę hemolimfy i roztwór inkubacyjny bezpośrednio przed liczeniem. On cytuje.

Zabieg ten pozwala na prawidłowe rozdzielenie cytów i zapobiega ich zbrylaniu. Za pomocą czystej końcówki pipety przenieś 10 mikrolitrów próbki limfy hemowej zmieszanej z roztworem inkubacyjnym do hemocytometru. Następnie za pomocą mikroskopu złożonego policz i zapisz liczbę cytów w co najmniej 15 dużych kwadratach centralnej siatki hemocytometru.

Dodaj te wartości, aby uzyskać całkowitą sumę liczby hemocytów w 15 kwadratach. Następnie dokładnie wypłucz hemocytometr i jego szkiełko pokrywowe za pomocą butelki do mycia z wodą destylowaną i dejonizowaną. Następnie wytrzyj go do sucha chusteczkami Kim.

Powtórz procedury dla pozostałych próbek wiotkości hemo i oblicz średnią liczbę cytów na mililitr objętości wiotkości hemo dla każdej gąsienicy. Obraz z mikroskopii jasnego pola pokazuje wyekstrahowane cyty he z gąsienic jądra hin ai w 20-krotnym powiększeniu. Po tej procedurze zebrane hemocyty można wykorzystać do badania komórkowej odpowiedzi immunologicznej i skonfigurowania testów, takich jak fagocytoza i czapeczka, wybrana enkapsulacja i aktywność oksydazy pH.

Ponadto R-N-A-D-N-A i białko można pobrać w postaci niewykorzystanej do dalszych testów w celu zbadania odpowiedzi immunologicznej komórek u owadów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać gąsienice w celu ekstrakcji hemolimfy i jak zbierać hemolimfę zawierającą żywe hemocyty.