Name: Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Naucz się ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic w celu badania immunologii owadów. Ta metoda umożliwia wizualizację i kwantyfikację komórek krwi, rozszerzając wiedzę o funkcjach immunologicznych poza modele genetyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TMS otrzymał wsparcie w ramach stypendium Harlan Trust Fellowship (GWU) podczas niniejszego badania. Finansowanie zbiorów terenowych oraz hodowli L. fasciola i E. delphinii zostało zapewnione z grantu NSF DEB 0642438 przyznanego JTL.

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotować igły (końcówka 1-2 μm i zwężenie 3-4 mm) przy użyciu kapilar z borokrzemowego szkła oraz mikropipetowego wyciągacza. Ustawienia urządzenia: ramp: 561; velocity: 20; heat: 560; delay: 1; pull: 100; pressure: 500.</li>
	<li>Przygotować roztwór do zbierania: 60% pożywki Grace'a (GM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 20% buforu przeciwkrzepliwego (98 mM NaOH, 186 mM NaCI, 1.7 mM EDTA oraz 41 mM kwasu cytrynowego, pH 4.5). Powyższy roztwór należy przygotować na świeżo w warunkach sterylnych i przez cały czas przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforu inkubacyjnego: 90% GM uzupełnionej o 10% FBS. Ten roztwór również należy przygotować na świeżo i przez cały czas przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Przygotować łącznie co najmniej 15 μl × liczbę owadów zarówno dla roztworu do zbierania, jak i roztworu inkubacyjnego.</li>
</ol>
2. Iniekcja gąsienic roztworem do pobierania
<ol>
	<li>Zanurz larwy w ostatnim stadium przed poczwarkowaniem w lodzie na 20 min w celu znieczulenia przed ekstrakcją hemocytów.</li>
	<li>Włóż tępy koniec czystej igły kapilarnej (rozmiar 16G) do rurki połączonej ze szklaną strzykawką o pojemności 20 ml (Rysunek 2). Pozostaw probówkę z roztworem do zbierania otwartą na blacie laboratoryjnym i powoli napełnij kapilarę buforem. Kapilara jest zazwyczaj napełniana około 10-15 μl roztworu do zbierania, w zależności od wielkości gąsienicy (około 1 μl roztworu na 10 mg całkowitej masy ciała gąsienicy = 0,01% całkowitej masy ciała). Oprzyj igłę o grudkę gliny umieszczoną obok mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Umieść gąsienicę w szalce Petriego. Owad powinien być ułożony na boku tak, aby przetchlinki były wyraźnie widoczne (Rysunek 3).</li>
	<li>Obserwując pod mikroskopem stereoskopowym, unieruchom gąsienicę pęsetą i umieść igłę blisko jednej z przetchlinek, gdzie kutykula owada jest zazwyczaj miększa. Delikatnie dociśnij igłę kapilarną do ciała owada. Po przebiciu kutykuli wstrzyknij całą objętość roztworu do gąsienicy (Rysunek 3). Ważne jest, aby uniknąć wstrzyknięcia pęcherzyków powietrza do gąsienicy. Ciało gąsienicy spuchnie (np. zwiększy objętość o 20%) po iniekcji, ale nie powinno pęknąć ani przeciekać.</li>
	<li>Przenieś gąsienicę z powrotem na lód, układając owada grzbietem do góry, aby zapobiec wyciekaniu buforu z miejsca nakłucia (Rysunek 3).</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.4 dla każdej gąsienicy wykorzystywanej do ekstrakcji hemolimfy. Na tym etapie pozwól wszystkim owadom chłodzić się na lodzie przez 30 min przed kontynuacją procedury.</li>
</ol>
3. Izolacja hemocytów
<ol>
	<li>Umieść gąsienicę w szalce Petri pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Wykonaj płytkie nacięcie (o długości 2-3 mm) w tylnej części ciała gąsienicy za pomocą sterylnego skalpela (Rycina 3). Należy uważać, aby nie uszkodzić jelita ani innych organów wewnętrznych; celem jest ostrożne przebicie kutykuli i pobranie mieszaniny buforu z hemolimfą zawierającej hemocyty od poszczególnych owadów.</li>
	<li>Delikatnie uciśnij gąsienicę za pomocą giętkich plastikowych pęsety, pobierając mieszaninę hemolimfy (około 10-20 μl) końcówką pipety o pojemności 10 μl, ponownie dbając o to, aby nie uszkodzić tkanek wewnętrznych (Rycina 3). Hemolimfę pobiera się z kropli wyciśniętej z ciała gąsienicy. Pozostałości gąsienicy należy wyrzucić.</li>
	<li>Pobierz hemolimfę od każdej gąsienicy do oddzielnych, oznakowanych, silikonizowanych probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Do każdej próbki hemolimfy pobranej od pojedynczej gąsienicy dodaj taką samą objętość roztworu inkubacyjnego (około 10-20 μl). Próbki hemolimfy należy przez cały czas przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.5 dla każdej gąsienicy wykorzystanej w eksperymencie.</li>
</ol>
4. Ilościowe oznaczanie hemocytów
<ol>
	<li>Wymieszaj próbkę hemolimfy z roztworem inkubacyjnym bezpośrednio przed zliczeniem hemocytów. Zabieg ten umożliwia prawidłowe rozdzielenie hemocytów i zapobiega ich zlepianiu się.</li>
	<li>Za pomocą czystego końcówki do pipety przenieś 10 μl próbki hemolimfy wymieszanej z roztworem inkubacyjnym na hemocytometr.</li>
	<li>Używając mikroskopu złożonego, zlicz i zapisz liczbę hemocytów w co najmniej 15 dużych polach (powierzchnia jednego pola: 0,04 mm2, głębokość: 0,1 mm) środkowej siatki hemocytometru (Rysunek 3). Zsumuj te wartości, aby uzyskać całkowitą liczbę hemocytów w 15 polach.</li>
	<li>Między każdą próbką dokładnie wypłucz hemocytometr oraz szkiełko nakrywkowe, używając butelki z wodą destylowaną i dejonizowaną, a następnie wytrzyj do sucha za pomocą chusteczek Kimwipes (Kimberly-Clark).</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1–4.4 dla każdej próbki hemolimfy.</li>
	<li>Oblicz średnią liczbę hemocytów na ml objętości hemolimfy dla każdej gąsienicy w następujący sposób:</li>
</ol>
Całkowita objętość każdego kwadratu siatki komory countingowej: (pole 0.04 mm2) × (głębokość 0.1 mm) = 0.004 mm3 × 15 kwadratów = 0.06 mm3 = całkowita objętość wszystkich 15 przeliczonych kwadratów.
(Suma całkowitej liczby hemocytów w policzonych 15 polach / całkowita objętość wszystkich 15 policzonych pól) x 2 czynnik rozcieńczenia = liczba hemocytów/mm3 x 1 000 = liczba hemocytów/ml hemolimfy.

<ol><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).</li>
<li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes%3A+masters+of+multitasking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542(2007).</li>
<li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+cellular+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15 (1), 1(2008).</li>
<li>Fauvarque, M. O., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+cellular+immunity%3A+a+story+of+migration+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion.</a> J. Cell Sci. 124 (9), 1373(2011).</li>
<li>Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743(2011).</li>
<li>Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+phagocytosis+-+still+many+unknowns+under+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface.</a> APMIS. 119 (10), 651(2011).</li>
<li>Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+hemocyte+migration%3A+an+in+vivo+assay+for+directional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 769, 249(2011).</li>
<li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mosquito immunity.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218(2010).</li>
<li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891(2006).</li>
<li>Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+in+lepidopteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunity in lepidopteran insects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181(2010).</li>
<li>Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmatocyte-spreading+peptide+%28PSP%29+plays+a+central+role+in+insect+cellular+immune+defenses+against+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection.</a> J. Exp. Biol. 212 (12), 1840(2009).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehélin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+what+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: what type of cell is that.</a> J. Insect Physiol. 52 (5), 417(2006).</li>
<li>Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+larval+and+pupal+hemocytes+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%2C+determined+by+monoclonal+antibodies+and+density+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation.</a> J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).</li>
<li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695(2010).</li>
<li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Metody izolacji hemocytów z owadów o znaczeniu medycznym oraz modelowych owadów z rzędu motyli (Lepidoptera) były raportowane wcześniej 9, 14. Metody ekstrakcji hemocytów są dostosowywane do gatunku owada, jego stadium rozwojowego oraz cech morfologicznych. Na przykład izolację hemolimfy z larw Manduca można łatwo przeprowadzić poprzez odcięcie zakrzywionego rogu w pobliżu końca odwłoka 15. Ponieważ gąsienice z rodziny Limacodidae nie posiadają tej struktury odwłokowej, opracowaliśmy odrębn...

<table><tbody><tr><td>Wytciągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki borokrzemowe</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-50-10</td><td>OD: 1.0, ID: 0.50 mm</td></tr><tr><td>Pożywka Grace'a</td><td>Sigma</td><td>G8142</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3007102</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine science tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr Neubauera</td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Przewody plastikowe</td><td>Tri-Tech</td><td>TT-3-32OD</td><td>OD: 3/32'', ID: 1/32'</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka medyczna</td><td>Fortuna Optima</td><td>D-97877</td><td>Objętość 50 ml</td></tr><tr><td>Igła stromo zakończona</td><td>Small Parts</td><td>NE-162PL-25</td><td>16 Gauge x 1&quot; długości</td></tr></tbody></table>

prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Hemocyty owadów (odpowiedniki białych krwinek u ssaków) odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych w całym cyklu życiowym owada 1. W stadiach larwalnych owadów należących do rzędów Lepidoptera (motyle i ćma) oraz Diptera (muchówki), hemocyty powstają w gruczole limfy (wyspecjalizowanym organie hematopoetycznym) lub z komórek embrionalnych i mogą być zachowane aż do stadium imago. Embrionalne hemocyty biorą udział w migracji komórek podczas rozwoju oraz w regulacji chemotaksji w czasie stanu zapalnego. Uczestniczą one również w apoptozie komórkowej i są niezbędne dla embriogenezy 2. Hemocyty pośredniczą w komórkowym ramieniu wrodzonej odpowiedzi odpornościowej owadów, która obejmuje szereg funkcji, takich jak rozprzestrzenianie się komórek, agregacja komórek, tworzenie guzków, fagocytoza i enkapsulacja obcych intruzów 3. Odpowiadają one także za koordynację swoistych humoralnych mechanizmów obronnych owadów podczas infekcji, takich jak produkcja peptydów przeciwdrobnoustrojowych i innych cząsteczek efektorowych 4, 5. Morfologię i funkcję hemocytów badano głównie na genetycznych lub fizjologicznych modelach owadów, w tym na muszce owocówce, Drosophila melanogaster 6, 7, komarach Aedes aegypti i Anopheles gambiae 8, 9 oraz omacnicy tytoniowej, Manduca sexta 10, 11. Obecnie jednak dysponujemy niewielką ilością informacji na temat różnorodności, klasyfikacji, morfologii i funkcji hemocytów u gatunków owadów niemodelowych, szczególnie tych pobranych z natury 12.
W niniejszym opracowaniu opisujemy prosty i wydajny protokół izolacji hemocytów z dzikich gąsienic. Wykorzystujemy gąsienice przedostatniego stadium larwalnego Lithacodes fasciola (mola żółtoramiennego) (Rysunek 1) oraz Euclea delphinii (mola dębowego) (Lepidoptera: Limacodidae) i wykazujemy, że z poszczególnych larw można wyizolować wystarczające objętości hemolimfy (krwi owadziej) i przeprowadzić zliczenie liczby hemocytów. Metoda ta może być wykorzystana do efektywnego badania typów hemocytów u tych gatunków, jak i u innych spokrewnionych gąsienic motyli zebranych w terenie, lub może zostać łatwo połączona z testami immunologicznymi zaprojektowanymi do badania funkcji hemocytów po zakażeniu organizmami mikrobiologicznymi lub pasożytniczymi 13.

Opisany tutaj protokół umożliwia pobranie minimalnej objętości 10-20 μl hemolimfy owadziej od poszczególnych gąsienic. Hemocyty pobrane tą metodą są wolne od zlepiania się komórek, wad melanizacji, resztek tkankowych lub innych zanieczyszczeń. Dzięki temu hemocyty można łatwo obserwować i liczyć pod mikroskopem, a w ciągu kilku godzin można zbadać wiele osobników. Zaobserwowaliśmy, że większość hemocytów w naszych próbkach stanowiły plazmatocyty 3 (hemocyty rozprzestrzeniające się asymetrycznie) (Rysun...

Hemocyty owadów pełnią wiele istotnych funkcji, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, na wszystkich etapach rozwoju owada. Nasza obecna wiedza na temat typów i funkcji hemocytów pochodzi z badań nad genetycznymi modelami owadów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę izolacji, kwantyfikacji i wizualizacji hemocytów z dzikich gąsienic.

Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

Hemocyty owadów (odpowiedniki białych krwinek u ssaków) odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych w trakcie cyklu życiowego owada ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie, wizualizacja i policzenie hemocytów z dzikich gąsienic. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie gąsienicy poprzez umieszczenie jej na lodzie, wstrzyknięcie roztworu buforowego zawierającego przeciwzakrzep oraz ponowne umieszczenie gąsienicy na lodzie, aby umożliwić hemocytom powrót do krążenia przed ekstrakcją. Drugim krokiem jest wykonanie płytkiego nacięcia na tylnym końcu gąsienicy za pomocą czystego skalpela.Następnie gąsienicę delikatnie ściska się za pomocą miękkich pęsety. Potem mieszaninę hemolimfy z roztworem buforowym aspiruje się za pomocą mikropipety i zbiera do probówki do mikrocentryfugi. Ostatnim krokiem jest delikatne zmieszanie roztworu hemolimfy z równą objętością roztworu buforowego i przeniesienie 10 µL roztworu na hemocytometr w celu wizualizacji i zliczenia liczby hemocytów.W rezultacie ta metoda ekstrakcji hemocytów może być wykorzystywana jako szybki i skuteczny sposób zliczania hemocytów u różnych gatunków gąsienic oraz służyć jako narzędzie do badania fizjologicznych aspektów komórkowej odpowiedzi odpornościowej owadów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość ekstrakcji hemolimfy z gąsienic o bardzo zredukowanym przełyku. Inne modele gąsienic są upuszczane poprzez odcięcie jednego z odnóży, a następnie ekstrakcję hemocytów z wypływającej cieczy.Ponadto technikę tę można wykorzystać do pozyskiwania hemolimfy od innych gatunków owadów. Metoda ta może posłużyć do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekoimmunologii, takie jak wpływ jakości diety, stopnia rozwoju lub ekspozycji na różne patogeny na komórkową odpowiedź odpornościową owadów. Aby rozpocząć tę procedurę, znieczul larwy w przedostatnim stadium rozwojowym, chłodząc je na lodzie przez 20 minut przed ekstrakcją hemocytów.Następnie wsuń tępy koniec czystej igły kapilarnej o rozmiarze 16 G do rurki połączonej z 20 mililitrową szklaną strzykawką. Pozostaw probówkę zawierającą roztwór zbierający na blacie laboratoryjnym. Powoli napełnij kapilarę około 10 do 15 µL buforu.Następnie oprzyj igłę na kulce gliny umieszczonej obok mikroskopu stereoskopowego. Umieść gąsienicę w szalce Petriego. Owad powinien być ułożony na boku w taki sposób, aby sferule były wyraźnie widoczne.Podczas obserwacji pod stereomikroskopem, unieruchom gąsienicę za pomocą pęsety i umieść igłę blisko jednego z segmentów sferycznych, gdzie kutykula owada jest zazwyczaj bardziej miękka. Następnie delikatnie dociśnij igłę kapilarną do ciała owada. Po przebiciu kutykuli wstrzyknij do gąsienicy całą objętość roztworu.Ciało gąsienicy spuchnie po wstrzyknięciu, ale nie powinno pęknąć ani przeciekać. Umieść gąsienicę z powrotem w schłodzonej płytce Petriego. Ułóż owada grzbietem do góry, aby zapobiec wyciekowi buforu z miejsca wkłucia.Powtórz iniekcje dla każdej gąsienicy wykorzystywanej do ekstrakcji hemolimfy. Następnie pozostaw wszystkie owady do schłodzenia na lodzie przez 30 minut. Teraz umieść gąsienicę w szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.Uważnie wykonaj płytkie nacięcie o długości około dwóch do trzech milimetrów w tylnej części gąsienicy, używając sterylnego skalpela, tak aby nie uszkodzić jelit ani innych narządów wewnętrznych. Następnie delikatnie ściśnij gąsienicę za pomocą elastycznych plastikowych pęset, pobierając około 10 do 20 µL hemolimfy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 µL. Ponownie należy uważać, aby nie uszkodzić tkanek wewnętrznych.Następnie usunąć szczątki gąsienic. Hemolimfę z każdej gąsienicy zebrać do osobnych, oznakowanych, silikonizowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mililitra. Następnie do każdej próbki hemolimfy pobranej od poszczególnych gąsienic dodać około 10 do 20 µL roztworu inkubacyjnego.Na tym etapie próbki hemolimfy należy cały czas przechowywać w lodzie. Próbkę hemolimfy i roztwór inkubacyjny wymieszaj bezpośrednio przed zliczeniem hemocytów.Obróbka ta pozwala na prawidłowe rozdzielenie hemocytów i zapobiega ich zlepianiu się. Za pomocą czystego końcówki do pipety przenieś 10 µL próbki hemolimfy zmieszanej z roztworem inkubacyjnym na hemocytometr. Następnie, używając mikroskopu złożonego, policz i zapisz liczbę hemocytów w co najmniej 15 dużych kwadratach centralnej siatki hemocytometru.Zsumuj te wartości, aby uzyskać całkowitą liczbę hemocytów w 15 polach. Następnie dokładnie wypłucz hemocytometr oraz jego szkiełko nakrywkę, używając butelki z wodą destylowaną i dejonizowaną. Następnie wytrzyj je do sucha chusteczkami Kim wipes.Powtórz procedury dla pozostałych próbek hemolimfy i oblicz średnią liczbę hemocytów na mililitr objętości hemolimfy dla każdej gąsienicy. Obraz z mikroskopii w świetle przechodzącym przedstawia wyizolowane hemocyty z gąsienic nucle hin ai przy 20-krotnym powiększeniu. Po przeprowadzeniu tej procedury zebrane hemocyty można wykorzystać do badania komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz do przeprowadzenia testów, takich jak fagocytoza, enkapsulacja oraz aktywność oksydazy pH.Dodatkowo, niezużyte RNA, DNA i białka mogą zostać pobrane do dalszych analiz w celu zbadania tych komórkowych odpowiedzi immunologicznych u owadów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić iniekcję gąsienic w celu ekstrakcji hemolimfy oraz jak pobrać hemolimfę zawierającą żywe hemocyty.

a-simple-protocol-for-extracting-hemocytes-from-wild-caterpillars

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pozyskiwania hemocytów (komórek krwi) z hawajskiej mątwy, Euprymna scolopes, do wykorzystania w badaniach biologii komórki oraz testach adhezji bakteryjnej. Hemocyty zostaną zabarwione barwnikiem fluorescencyjnym i poddane działaniu bakterii znakowanych GFP.

Pozyskiwanie hemocytów z hawajskiej mątwy Euprymna scolopes i obserwacja ich przylegania do bakterii symbiotycznych i niesymbiotycznych

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Ten film opisuje gruczoł limfatyczny Drosophila - główne miejsce hematopoezy u larw muchy - i pokazuje przykładowy protokół do preparowania i montowania narządu do immunohistochemii i obrazowania fluorescencyjnego.

Rozwarstwienie gruczołów limfatycznych larw: izolowanie narządu wytwarzającego hemocyty Drosophila

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Ten film demonstruje test zaburzeń hemocytów, oceniając ponowne przyleganie hemocytów do kieszeni krwiotwórczych larw Drosophila. Zakłócenia mechaniczne uwalniają rezydujące hemocyty, podnosząc liczbę krążących hemocytów. Po wyzdrowieniu potwierdza się ponowne przyleganie rezydentnych hemocytów, co ilustruje odwracalność.

Test zaburzeń hemocytów w celu oceny readhezji hemocytów do kieszonek krwiotwórczych

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Tutaj prezentujemy protokoły dotyczące 1) laboratoryjnego rozmnażania zagrożonego wyginięciem motyla niebieskiego motyla z Miami (Cyclargus thomasi bethunebakeri) oraz 2) oceny podstawowych informacji o historii życia, takich jak czas niedojrzałego rozwoju i liczba stadiów larwalnych. Obie metody mogą być dostosowane do stosowania z innymi programami ochrony ex situ.

Programy rozmnażania zagrożonych motyli w niewoli w celu poszerzenia wiedzy na temat historii życia i skutecznych technik ochrony ex situ

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Naucz się ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic w celu badania immunologii owadów. Ta metoda umożliwia wizualizację i kwantyfikację komórek krwi, rozszerzając wiedzę o funkcjach immunologicznych poza modele genetyczne.

Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

Przeglądaj więcej filmów