Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie fluorescencyjnych kropek kwantowych o zoptymalizowanej jasności i stabilności, a także zminimalizowanym rozmiarze i niespecyficznym wiązaniu do zastosowania w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw małych rdzeni kropek kwantowych selenku kadmu. Drugim krokiem jest stopienie tych rdzeni z rtęcią, aby przesunąć ich fluorescencję do czerwonego widma i zwiększyć ich jasność.

Następnie na nanokryształach hoduje się cienką powłokę ze stopu, aby ustabilizować ich emisję fluorescencji. Ostatnim krokiem jest przeniesienie tych cząstek z rozpuszczalników organicznych do wodnych za pomocą polimeru wielozębowego, który można modyfikować biologicznie obojętnym glikolem polietylenowym. Ostatecznie spektrometria fluorescencyjna, chromatografia żelowa i elektroforeza żelowa są wykorzystywane do wykazania, że cząstki te mają jasną fluorescencję, kompaktowy rozmiar hydrodynamiczny i neutralne atrybuty ładunku elektrostatycznego, dobrze nadające się do obrazowania fluorescencji pojedynczych cząsteczek w biologii.

Główną przewagą tych kropek kwantowych nad istniejącymi materiałami komercyjnymi jest to, że te nanocząstki mają znacznie zmniejszony rozmiar hydrodynamiczny. Chociaż na mniejsze kropki kwantowe negatywnie wpływa zmniejszona intensywność fluorescencji, zmniejszona stabilność fluorescencji i fluorescencja tylko w widmie niebieskim, zniwelowaliśmy te efekty za pomocą procesu wymiany kationów rtęci. Te nanokryształy mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biofizyki i sygnalizacji komórkowej, umożliwiając dynamiczne obrazowanie pojedynczych biomolekuł w zatłoczonych środowiskach biologicznych.

Na początek przygotuj 0,4 molowy roztwór selenu na górze, dodając selen do 50 mililitrów. Kolba z trzema szyjkami, opróżniająca kolbę pod wysoką próżnią i napełniająca argonem za pomocą przewodu z trzpieniem sch w warunkach bezpowietrznych. Dodaj 10 mililitrów wierzchu i podgrzej do 100 stopni Celsjusza, mieszając przez godzinę, aby uzyskać klarowny, bezbarwny roztwór.

Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i odłożyć kolbę na bok. Przygotować również roztwór tlenku kadmu, TDPA i ODE w kolbie z trzema szyjkami o pojemności 250 mililitrów, używając ilości wymienionych w pisemnym protokole. Dołączając ten film, opróżnij roztwór za pomocą linii trzpienia, mieszając.

Zwiększ temperaturę do 100 stopni Celsjusza i ewakuuj się na dodatkowe 15 minut. Aby usunąć zanieczyszczenia o niskiej temperaturze wrzenia pod gazem Argonne, podgrzej mieszaninę do 300 stopni Celsjusza przez godzinę, aby całkowicie rozpuścić tlenek kadmu. Roztwór zmieni kolor z czerwonawego na przezroczysty i bezbarwny, schłodzi roztwór do temperatury pokojowej.

Następnie dodaj HDA do roztworu kadmu, podgrzej do 70 stopni Celsjusza i ewakuuj. Po osiągnięciu stałego ciśnienia zwiększ temperaturę i refluksuj roztwór przez 30 minut. Przełącz zawór przewodowy schlink na gaz obojętny i włóż termoparę bezpośrednio do roztworu.

W warunkach bezpowietrznych dodaj DPP do roztworu kadmu i zwiększ temperaturę do 310 stopni Celsjusza. Teraz użyj jednorazowej plastikowej strzykawki przymocowanej do igły o rozmiarze 16, aby usunąć 7,5 mililitra 0,4 molowego roztworu selenu. Gdy temperatura zrównoważy się do 310 stopni Celsjusza, ustaw regulator temperatury na zero stopni Celsjusza i szybko wstrzyknij górny roztwór selenu bezpośrednio do roztworu kadmu.

Roztwór zmieni się z bezbarwnego na żółty, pomarańczowy, a temperatura szybko spadnie i ponownie wzrośnie do około 280 stopni Celsjusza. Najtrudniejszym krokiem w tej procedurze jest jak najszybsze wstrzyknięcie całej objętości strzykawki do roztworu kadmu. Zapewnia to, że cząstki jednorodnie zarodkują.

Po jednej minucie reakcji zdjąć kolbę z płaszcza grzewczego i szybko schłodzić strumieniem powietrza, aż temperatura spadnie poniżej 200 stopni Celsjusza. Gdy temperatura osiągnie około 40 stopni Celsjusza, rozcieńczyć 30 mililitrami heksanu, większość pozostałego prekursora kadmu opadnie z roztworu. Usunąć ten osad przez odwirowanie.

W każdej z sześciu 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych z polipropylenu rozcieńczyć 12 mililitrów otrzymanego surowego roztworu nanokrystalicznego. Za pomocą 40 mililitrów acetonu po odwirowaniu o tych samych parametrach ostrożnie zdekantować i wyrzucić supernatant. Następnie rozpuść granulki nano kryształu w heksanie.

Ekstrahować roztwór z równą objętością metanolu, zachowując górną fazę. Powtórz tę ekstrakcję jeszcze dwa razy dla trzeciej ekstrakcji. Objętość metanolu można dostosować do około 15 mililitrów, aby otrzymać stężony roztwór heksanu kropek kwantowych czystego selenku kadmu o temperaturze około 200 mikromolowych.

Typowa wydajność tej reakcji to trzy mikromolowe kryształy selenku kadmu o średnicy dwóch trzech nanometrów, określają średnicę i stężenie nanokryształu, mierząc widmo absorpcji światła widzialnego w ultrafiolecie, jak opisano w pisemnej procedurze, nanokryształy mogą być częściowo wymieniane z rtęcią do przesunięcia ku czerwieni, absorpcji i emisji fluorescencji. Aby to zrobić, w 20-mililitrowej szklanej fiolce z mieszadłem wymieszaj heksan i chloroform, a następnie dodaj roztwór kropek kwantowych selenku kadmu OLA i oktan rtęci naruszać. Po oczyszczeniu nanokryształów i określeniu ich stężenia zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, należy pozostawić nanokryształy do dojrzewania przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej w celu wzrostu skorupy.

Przygotować 0,1-molowe roztwory prekursorowe otoczki w 50 mililitrach, trzy kolby szyjkowe w próżniowych roztworach ciepła prekursora kadmu, prekursora i prekursora siarki do refluksu przez jedną godzinę w celu uzyskania klarownych roztworów, a następnie naładować argonem do kolby z trzema szyjkami. Dodaj topo ODE i przygotowane kropki kwantowe z rtęciowo-kadmowo-selenkowego. Usunąć heksynę w temperaturze pokojowej za pomocą linii bocznej.

Zwiększ temperaturę do 100 stopni Celsjusza i refluksuj przez 15 minut. Zmień zawór przewodowy na gaz Argonne i włóż termoparę do roztworu nano Krystal. Po podniesieniu temperatury do 120 stopni Celsjusza dodać 0,5 monowarstwy lub 140 mikrolitrów roztworu prekursora siarki i pozostawić reakcję do 15 minut.

Zwiększ temperaturę do 140 stopni Celsjusza. Dodać 0,5 monowarstwy lub 140 mikrolitrów roztworu prekursora kadmu i pozostawić reakcję na 15 minut. Następnie dodaj 500 mikrolitrów bezwodnego OLA do roztworu reakcyjnego.

Dodaj 160 stopni Celsjusza, dodaj 0,5 monowarstwy lub 220 mikrolitrów roztworu prekursora siarki, a następnie równą ilość roztworu prekursora w temperaturze 170 stopni Celsjusza z 15-minutową przerwą między każdym dodawaniem. Następnie w temperaturze 180 stopni Celsjusza dodaj 0,25 monowarstwy lub 150 mikrolitrów roztworu prekursora siarki i roztworu prekursora w odstępach 15-minutowych. Chłodny. Rozwiązanie problemu temperatury pokojowej i nowego współczynnika ekstynkcji dla tych cząstek.

Korzystając z widma UV/vis, zakładając, że liczba nanokryształów nie uległa zmianie, roztwór reakcyjny należy przechowywać jako surową mieszaninę w zamrażarce. Na tym etapie nanokryształy można scharakteryzować za pomocą mikroskopii elektronowej, spektroskopii absorpcyjnej UV/vis i spektroskopii fluorescencyjnej. Dodaj oczyszczone kropki kwantowe powłoki rdzenia do 50-mililitrowej kolby z trzema szyjkami i usuń heksynę w wysokiej próżni

Aby uzyskać suchy film, napełnij kolbę argonnem. Dodaj bezwodną purynę do folii nanocząstek i podgrzej zawiesinę do 80 stopni Celsjusza w ciągu jednej do dwóch godzin. Nanocząstki całkowicie się rozpuszczą.

Dodaj jeden mililitr jednego glicerolu FIO do roztworu i mieszaj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po schłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej dodaj 0,5 mililitra trietyloaminy, aby rozprotonować tioglicerolu i mieszaj przez 30 minut. Roztwór może stać się mętny po dodaniu trietyloaminy ze względu na słabą rozpuszczalność polarnych nanokryształów w tej mieszaninie rozpuszczalników.

Przenieś roztwór kropki kwantowej do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej zawierającej mieszaninę 20 mililitrów heksanu i 20 mililitrów acetonu i dobrze wymieszaj. Wyizolować wytrącone nanokryształy przez wirowanie, a następnie przepłukać granulki acetonem, rozpuścić osad z kropkami kwantowymi w pięciu mililitrach DMSO za pomocą sonikacji kąpielowej, a następnie odwirować. Aby usunąć ewentualne agregaty, należy określić stężenie nanocząstek z widma absorpcyjnego UV V.

Roztwór czystych kropek kwantowych należy zużyć w ciągu trzech godzin, ponieważ powierzchnia może powoli utleniać się w warunkach otoczenia w powietrzu. Rozcieńczyć roztwór kropki kwantowej do 10 mikromolów lub mniej za pomocą DMSO i przenieść do kolby o pojemności 50 mililitrów. Dodaj przygotowany roztwór rozszerzonego kwasu poliakrylowego o stężeniu pięciu miligramów na mililitr w DMSO, kroplami do roztworu kropek kwantowych, mieszając i odgazowując roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Oczyść roztwór polimeru z kropką kwantową Argonne i podgrzej do 80 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po schłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej dodać równą objętość 50 milimolowego pH sodu osiem kropli i mieszać przez 10 minut. Oczyść kropki kwantowe zgodnie z opisem w pisemnej procedurze i oznacz stężenie z widma absorpcyjnego UV/vis w czteromililitrowej szklanej fiolce z mieszadłem, wymieszaj jedną molową kropkę kwantową w buforze boranowym z 40 000-krotnym nadmiarem molowym 750 daltonowego glikolu monoaminopolietylenowego.

Instrukcje można znaleźć w pisemnej procedurze, w jaki sposób dodać określoną funkcjonalność chemiczną do nanokryształów. Szybko dodaj 25 000-krotny molowy nadmiar świeżo przygotowanego roztworu roztworu środka aktywującego do roztworu kropek kwantowych i mieszaj go w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz ten krok jeszcze cztery razy, aby nasycić powierzchnię nanokryształu PEG.

Na koniec dodaj 200 mikrolitrów jednego molowego buforu tris, aby wygasić reakcję przed oczyszczeniem nanokryształów Za pomocą filtrów odśrodkowych do dializy lub ultrawirowania, Powstały nano chrystal można analizować pod kątem dyspersji mono, wielkości hydrodynamicznej i ładunku powierzchniowego za pomocą chromatografii cieczowej, elektroforezy żelowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Pokazano tutaj reprezentatywne widma absorpcyjne i fluorescencyjne dla nanokryształów selenku kadmu, rtęci, kadmu, selenku, nanokryształów po wymianie kadjonowej oraz rdzenia rtęci i selenku kadmu, kadmu powłokowego, nanokryształów siarczku po wzroście powłoki. Rdzeniowe nanokryształy selenku kadmu mają kwantową wydajność fluorescencji bliską 15%Jednak wydajność ta spada do mniej niż 1% po wymianie rtęci, prawdopodobnie z powodu pułapek nośników ładunku wprowadzonych przez rozerwanie atomów powierzchniowych.

Wzrost cienkiej skorupy siarczku kadmu zwiększa tę wydajność do ponad 70%, która w dużej mierze utrzymuje się po przeniesieniu do wody. W przeciwieństwie do tego, rdzeniowy selenek kadmu, kadm otoczkowy, nanokryształy siarczku bez włączenia rtęci tracą znaczną część swojej wydajności kwantowej w wodzie, chyba że wyhoduje się grubą skorupę. Należy zauważyć, że przykrycie siarczkiem kadmu przesuwa widma na czerwone z powodu wycieku nośników ładunku elektronicznego do materiału powłoki.

Przesunięcie to wynosi około 20 do 30 nanometrów w przypadku rdzeni kadmowych i zwiększa się wraz ze wzrostem zawartości rtęci w rdzeniu. W ten sposób, poprzez włączenie rtęci do rdzenia nanokryształu, niewielki rozmiar nanokryształu może zostać utrzymany bez poświęcania jasności. Mały rozmiar pokazano na tym transmisyjnym mikrografie elektronowym i rozkładzie wielkości cząstek nanokryształów rtęci, kadmu, selenku, kadmu otoczkowego, siarczku o średniej średnicy 3,2 plus minus 0,6 nanometra.

Zastosowanie dwuetapowego transferu fazowego do wody ma kluczowe znaczenie dla uzyskania jednorodnej populacji nanokryształów, które nie wymagają dalszego sortowania wielkości w celu usunięcia klastrów i agregacji, wykluczenia wielkości. Przedstawiony tutaj chromatogram potwierdza, że rozmiar jest podobny do rozmiaru albuminy con. Przy 75 kilodaltonach i po modyfikacji 750 daltonowymi aminami PEG, rozmiar zwiększa się do zaledwie 12 nanometrów, podobnie jak w przypadku przeciwciała IgG.

Modyfikacja PEG neutralizuje ładunek powierzchniowy, co potwierdzono w przedstawionym tutaj eksperymencie elektroforezy żelowej aros, studnia jest oznaczona strzałką, a polaryzacja elektrod jest wskazana po prawej stronie, co pokazuje, że przed koniugacją nanokryształy migrują jako cząstki onowe i że pegylowane nanokryształy są elektrostatycznie obojętne. Pokazana tutaj jest mikrofotografia epifluorescencyjna tych nanokryształów osadzonych na szklanym szkiełku nakrywkowym i wzbudzonych światłem widzialnym o długości 545 nanometrów. Te nanokryształy można łatwo obserwować na poziomie pojedynczej cząsteczki z prędkością 30 klatek na sekundę za pomocą kamery CCD zwielokrotniającej elektrony.

Wykres ten pokazuje, że liczba cząstek fluorescencyjnych obserwowanych w każdej klatce zmienia się w czasie przy ciągłym wzbudzeniu. Wynika to z połączenia mrugania i degradacji zdjęć. Mruganie dominuje przez pierwsze siedem minut, zanim degradacja oksydacyjna powoli stanie się widoczna.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak chemicznie syntetyzować kropki kwantowe, jak przenosić je do wodnych i jak je modyfikować do zastosowań bioobrazowania. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami zawierającymi kadium i rtęć może być niezwykle niebezpieczna i należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, aby zapobiec osobistemu narażeniu.