Name: Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kompaktowych kropek kwantowych do obrazowania pojedynczych cząsteczek. Technika ta wykorzystuje rdzenie selenku kadmu z domieszką rtęci, zapewniając wysoką jasność fluorescencji i stabilność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Hong Yi z Emory University Integrated Microscopy Core za wykonanie obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej. Praca ta była sponsorowana z grantów NIH (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 oraz 1K99CA154006-01).

Poniższe procedury syntezy wymagają zastosowania standardowych technik bezdostępnych dla powietrza oraz użycia linii próżniowo-gazowej; szczegółową metodologię można znaleźć w referencjach 10 i 11. Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki (MSDS) wszystkich potencjalnie toksycznych i łatwopalnych substancji, a wszystkie związki łatwopalne i/lub wrażliwe na działanie powietrza powinny zostać podzielone na alikwoty w fiolkach z septami w komorze rękawicowej lub worku rękawicowym.
1. Synteza rdzeni kropek kwantowych selenku rtęci i kadru (HgxCd1-xSe)
<ol>
 <li>Przygotować 0,4 M roztwór selenu w trioktylofosfinie (TOP). Dodać selen (0,316 g, 4 mmol) do kolby trójszyjnej o pojemności 50 ml, następnie odessać powietrze i napełnić argonem za pomocą linii Schlenka. W warunkach beztlenowych (atmosfera suchego azotu lub argonu) dodać 10 ml TOP i podgrzewać do 100 °C przy mieszaniu przez 1 h, aż powstanie klarowny, bezbarwny roztwór. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i odstawić kolbę.</li>
 <li>Do kolby trójszyjnej o pojemności 250 ml dodać tlenek kadmu (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), kwas tetradecylfosfonowy (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) oraz oktadecen (ODE, 27,6 ml), a następnie odessać powietrze z roztworu za pomocą linii Schlenka podczas mieszania. Podnieść temperaturę do 100 °C i odsysać powietrze przez kolejne 15 min w celu usunięcia zanieczyszczeń o niskiej temperaturze wrzenia.</li>
 <li>W atmosferze argonu lub azotu podgrzewać mieszaninę do 300 °C przez 1 h, aby całkowicie rozpuścić CdO. Roztwór zmieni kolor z czerwonawo-brązowego na klarowny i bezbarwny. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Do roztworu kadmu dodać heksadecylaminę (HDA, 7,0 g), podgrzać do 70 °C i odessać powietrze. Po osiągnięciu stałego ciśnienia podnieść temperaturę do 100-110 °C i gotować roztwór z chłodnicą zwrotną przez 30 min. Przełączyć zawór linii Schlenka na gaz obojętny i wprowadzić termoparę bezpośrednio do roztworu.</li>
 <li>W warunkach beztlenowych dodać do roztworu difenylofosfinę (DPP, 100 μl) i zwiększyć temperaturę do 310 °C. Pobrać 7,5 ml 0,4 M roztworu TOP-Se (3 mmol selenu) do jednorazowej plastikowej strzykawki z igłą o rozmiarze 16 gauge.</li>
 <li>Po ustabilizowaniu temperatury na poziomie 310 °C ustawić kontroler temperatury na 0 °C i szybko wstrzyknąć roztwór TOP-Se bezpośrednio do roztworu kadmu. Roztwór zmieni kolor z bezbarwnego na żółto-pomarańczowy, a temperatura gwałtownie spadnie, a następnie wzrośnie ponownie do ok. 280 °C. Po 1 min reakcji wyjąć kolbę z płaszcza grzejnego i szybko schłodzić strumieniem powietrza, aż temperatura spadnie poniżej 200 °C.</li>
 <li>Gdy temperatura osiągnie ok. 40 °C, rozcieńczyć roztwór 30 ml heksanu; większość pozostałego prekursora kadmu wytrąci się z roztworu. Usunąć ten osad poprzez wirowanie (5 000 x g, 10 min).</li>
 <li>W każdej z sześciu stożkowych probówek wirówkowych z polipropylenu o pojemności 50 ml rozcieńczyć 12 ml surowego roztworu nanokryształów 40 ml acetonu, wirować (5 000 x g przez 10 min), a następnie ostrożnie zdekantować i usunąć nadsącz.</li>
 <li>Rozpuścić osady nanokryształów w heksanie (całkowita objętość 25 ml). Ekstrahować ten roztwór 3 razy równą objętością metanolu, zachowując górną fazę. Przy trzeciej ekstrakcji objętość metanolu można dostosować do ok. 15 ml, aby uzyskać stężony heksanowy roztwór czystych kropek kwantowych (QD) CdSe o stężeniu około 200 μM. Typowa wydajność tej reakcji to 3 μmol nanokryształów CdSe o średnicy 2,3 nm (wydajność reakcji 50-60%).</li>
 <li>Wyznaczyć średnicę i stężenie nanokryształów poprzez pomiar widma absorpcji UV-Vis i skorzystanie z wykresu dopasowania rozmiaru opracowanego przez Mulvaneya i współpracowników 12 oraz korelacji ekstynkcji Bawendiego i współpracowników 13. Szczegóły znajdują się w aneksie.</li>
 <li>Wymiana kationów na rtęć: nanokryształy mogą zostać częściowo poddane wymianie na rtęć w celu przesunięcia absorpcji i emisji fluorescencji w stronę czerwieni. Wymieszać następujące składniki w podanej kolejności w szklanej fiolce o pojemności 20 ml z mieszadłem magnetycznym (skalę tej reakcji można dowolnie zmieniać): 3 ml heksanu, 2 ml chloroformu, 1 ml 200 μM roztworu QD CdSe (200 nmol), 15 μl oleylaminy (OLA) oraz 500 μl 0,1 M roztworu Hg(OT)2 w chloroformie. Oktanotiolet rtęci (HgOT2) można przygotować poprzez reakcję octanu rtęci i oktanotiolu w metanolu (patrz aneks). W miarę postępu reakcji wymiany kationów stopień przesunięcia w stronę czerwieni można monitorować za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej UV-Vis. Po osiągnięciu pożądanego pasma absorpcji zmierzyć absorpcję roztworu nanokryształów przy 350 nm i wyznaczyć nowy współczynnik ekstynkcji, zakładając, że stężenie nanokryształów nie uległo zmianie (30,7 μM w tym przykładzie). Przerwać reakcję poprzez usunięcie nieprzereagowanej rtęci: dodać 5 ml dekanu, 10 ml heksanu i 7 ml metanolu, a następnie przeprowadzić ekstrakcję roztworu, zachowując górną fazę zawierającą nanokryształy. Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie za pomocą heksanu i metanolu, dostosowując objętość metanolu tak, aby górna faza miała ok. 7 ml. Jeśli fazy rozdzielają się powoli, roztwór można wirować (5 000 x g, 10 min). Do nanokryształów dodać 100 μl TOP, 100 μl OLA oraz 100 μl kwasu oleinowego, a następnie 40 ml acetonu w celu wywołania wytrącenia. Zebrać nanokryształy poprzez wirowanie i zdyspergować w 3 ml heksanu. Wirować ponownie, aby usunąć nierozpuszczalne składniki i ponownie wyznaczyć stężenie nanokryształów, korzystając z nowego współczynnika ekstynkcji przy 350 nm. Pozostawić roztwór nanokryształów do dojrzewania przez co najmniej 24 h w temperaturze pokojowej przed przejściem do następnego kroku.</li>
</ol>
2. Wzrost powłoki z siarczku kadmu i cynku (CdyZn1-yS)
<ol>
 <li>Przygotować 0,1 M roztwory prekursorów otoczki w 50 ml kolbach trójszyjnych. Prekursor kadru: wodny octan kadru (230,5 mg, 1 mmol) i 10 ml oleilaminy (OLA). Prekursor cynku: octan cynku (183,5 mg, 1 mmol) i 10 ml OLA. Prekursor siarki: siarka (32,1 mg, 1 mmol) i 10 ml ODE. W próżni podgrzewać każdy roztwór do temperatury wrzenia przez 1 h, aż powstaną klarowne roztwory, a następnie napełnić argonem. Roztwór siarki można schłodzić do temperatury pokojowej, natomiast prekursory kadru i cynku należy utrzymać w temperaturze około 50 °C. Obliczenia ilości prekursorów otoczki znajdują się w odniesieniu 14.</li>
 <li>Do kolby trójszyjnej dodać: kropki kwantowe (QDs) HgxCd1-xSe (120 nmol, średnica 2,3 nm), ODE (2 ml) oraz tlenek trioktylofosfiny (TOPO, 250 mg). Usunąć heksan w temperaturze pokojowej za pomocą linii Schlenka. Podnieść temperaturę do 100 °C i gotować z powrotem przez 15 min. Przełączyć zawór linii Schlenka na gaz argon lub azot i umieścić termoparę w roztworze nanokryształów.</li>
 <li>Podnieść temperaturę do 120 °C, dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora siarki (140 μl) i pozostawić reakcję na 15 min. Małe alikwoty (&lt;50 μl) można pobierać za pomocą szklanej strzykawki, aby monitorować postęp reakcji za pomocą spektrometrii fluorescencyjnej i/lub absorpcyjnej UV-Vis. Podnieść temperaturę do 140 °C, dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora kadru (140 μl) i pozostawić reakcję na 15 min. Do roztworu reakcyjnego dodać 500 μl bezwodnej OLA.</li>
 <li>W temperaturze 160 °C dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora siarki (220 μl), a następnie taką samą ilość roztworu prekursora cynku w 170 °C, z odstępem 15 min między kolejnymi dodaniami. Następnie w 180 °C dodać 0,25 monowarstwy roztworu prekursora siarki (150 μl) oraz roztwór prekursora cynku w odstępach 15 min.</li>
 <li>Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i ponownie obliczyć nowy współczynnik ekstynkcji dla tych cząstek za pomocą widma UV-Vis, zakładając, że liczba nanokryształów nie uległa zmianie (120 nmol w 3,8 ml roztworu reakcyjnego). Przechowywać roztwór reakcyjny jako surową mieszaninę w zamrażarce; nanokryształy można rozmrażać i oczyszczać w razie potrzeby, stosując metodę opisaną w sekcjach 1.8 i 1.9.</li>
 <li>Nanokryształy można scharakteryzować za pomocą mikroskopii elektronowej, spektroskopii absorpcyjnej UV-Vis oraz spektroskopii fluorescencyjnej. Wydajność kwantową można obliczyć absolutnie przy użyciu sfery całkującej lub względnie w porównaniu do znanego wzorca, stosując metody z odniesienia 15.</li>
</ol>
3. Transfer fazowy
<ol>
 <li>Do kolby trójszyjnej o pojemności 50 ml dodać oczyszczone kropki kwantowe (QDs) typu rdzeń/powłoka HgxCd1-xSe/CdyZn1-yS (5 ml, 20 μM) i odparować heksan w wysokiej próżni do uzyskania suchego filmu. Napełnić kolbę argonem, dodać do filmu z nanocząsteczek bezwodną pirydynę (3 ml) i podgrzać zawiesinę do 80 °C. W ciągu 1-2 h nanocząsteczki ulegną całkowitemu rozpuszczeniu.</li>
 <li>Do roztworu dodać 1-tioglicerynę (1 ml) i mieszać w temperaturze 80 °C przez 2 h. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i dodać trietyloaminę (0,5 ml), aby zdeprotonować tioglicerynę. Mieszać przez 30 min. Po dodaniu trietyloaminy roztwór może stać się mętny ze względu na słabą rozpuszczalność polarnych nanokryształów w tej mieszaninie rozpuszczalników.</li>
 <li>Przenieść roztwór QDs do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej mieszaninę 20 ml heksanu i 20 ml acetonu, a następnie dokładnie wymieszać. Wyizolować wytrącone nanokryształy poprzez wirowanie (5 000 x g, 10 min) i przemyć osad acetonem.</li>
 <li>Osad QDs rozpuścić w DMSO (5 ml) w kąpieli ultradźwiękowej, a następnie wirować (7 000 x g, 10 min) w celu usunięcia ewentualnych agregatów. Stężenie nanocząsteczek określić na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis. Ten roztwór czystych QDs należy wykorzystać w ciągu 3 h, ponieważ tiole powierzchniowe mogą powoli utleniać się w warunkach otoczenia w powietrzu.</li>
 <li>Rozcieńczyć roztwór QDs do stężenia 10 μM lub mniejszego za pomocą DMSO i przenieść do kolby o pojemności 50 ml. Przygotować roztwór tiolowanego kwasu poliakrylowego (synteza opisana w aneksie) w DMSO o stężeniu 5 mg/ml. Roztwór polimeru (0,15 mg polimeru na nmol QDs) dodawać kroplami do roztworu QDs podczas mieszania, a następnie odgazować roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
 <li>Przepłukać roztwór QDs/polimer argonem i podgrzewać do 80 °C przez 90 min. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i kroplami dodać taką samą objętość 50 mM boranu sodu, pH 8. Mieszać przez 10 min.</li>
 <li>Oczyścić QDs poprzez dializę (cutoff 20 kDa) w 50 mM boranie sodu, pH 8, a następnie zagęścić cząsteczki za pomocą filtra wirówkowego (cutoff 10 kDa). Stężenie określić na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis.</li>
</ol>
4. Powlekanie PEG
<ol>
 <li>W szklanej fiolce o pojemności 4 ml z mieszadłem magnetycznym wymieszać 1 nmol QDs w buforze boranowym z 40 000-krotną nadwyżką molową monoamino-glikolu polietylenowego o masie 750 Da (30 mg, 40 μmol). Jeśli do nanokryształów ma zostać dodana konkretna funkcjonalność chemiczna (np. hydrazyd lub maleimid), można ją wprowadzić, zastępując część amino-PEG heterobifunkcyjnym amino-PEG (zazwyczaj dobrze sprawdza się 30% ułamka molowego). Rozcieńczyć roztwór nanokryształów buforem boranowym do stężenia 1 μM. Reakcję tę można skalować według uznania.</li>
 <li>Przygotować świeży roztwór DMTMM (20 mg, 72 μmol) w DMSO (144 μl). Roztwór ten można krótko podgrzać pod strumieniem ciepłej wody z kranu lub umieścić w myjce ultradźwiękowej, aby całkowicie rozpuścić DMTMM. Szybko dodać 25 000-krotną nadwyżkę molową tego 0,5 M roztworu DMTMM (50 μl) do roztworu QD i mieszać w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
 <li>Powtórzyć krok 4.2 jeszcze cztery razy, aby nasycić powierzchnię nanokryształów PEG. Na koniec dodać 200 μl 1 M buforu Tris, aby zatrzymać reakcję, a następnie oczyścić nanokryształy za pomocą dializy, filtrów wirowych lub ultrawirowania.</li>
 <li>Nanokryształy można analizować pod kątem monodyspersyjności, rozmiaru hydrodynamicznego i ładunku powierzchniowego przy użyciu chromatografii cieczowej, elektroforezy w żelu agarozowym oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Aby określić rozmiar hydrodynamiczny i rozkład rozmiarów za pomocą zautomatyzowanego systemu chromatografii cieczowej (GE AKTAprime Plus), należy użyć kolumny Superose 6, przepływu 0,5 ml/min z eluentem w postaci buforu PBS oraz detekcji absorbancji przy 260 lub 280 nm. Czasy elucji nanocząsteczek należy porównać z czasami elucji wzorców masy cząsteczkowej. W przypadku elektroforezy w żelu agarozowym przygotować 0,5% żel agarozowy w 50 mM buforze boranu sodu (pH 8,5) lub 50 mM buforze fosforanowym sodu (pH 7,4), wymieszać próbki o stężeniu 1 μM z 10% glicerolem, nanieść do studzienek i prowadzić prąd o napięciu 100 V przez 30 min. Nanokryształy w żelu należy obrazować za pomocą lampy UV lub transiluminatora UV w celu wzbudzenia fluorescencji. Aby obrazować nanokryształy na poziomie pojedynczych cząsteczek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, rozcieńczyć cząstki do stężenia 0,2 nM w 10 mM buforze fosforanowym, nanieść 2,5 μl roztworu na szklaną laminkę i ostrożnie położyć drugą laminkę na kropli cieczy, aby stworzyć film między laminkami. Cząstki związane z powierzchnią należy obrazować przy użyciu obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (idealnie co najmniej 1,40) w trybie epifluorescencji lub TIRF, przy wzbudzeniu długościami falami między 400-580 nm i z użyciem kamery CCD z mnożeniem elektronów. Dokładne parametry obrazowania będą się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu.</li>
</ol>

<ol><li>Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+tools+for+watching+nanometer-scale+conformational+changes+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+single+molecule+fluorescence+methods+for+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nat. Method. 7, 275-285 (2010).</li>
<li>Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+cellular+events+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemist%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic cellular events with quantum dots.</a> Biochemist. 32, 12-17 (2010).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugated+quantum+dots+for+in+vivo+molecular+and+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Next-generation quantum dots.</a> Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).</li>
<li>Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+hydrodynamic+size+of+quantum+dots+with+multifunctional+multidentate+polymer+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+compact+alloyed+quantum+dots+with+broadly+tunable+near-infrared+absorption+and+fluorescence+spectra+through+mercury+cation+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).</li>
<li>Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShriver%2C+DF+%22The+Manipulation+of+Air-Sensitive+Compounds%22">The Manipulation of Air-Sensitive Compounds</a>. , 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).</li>
<li>Errington, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErrington%2C+RJ+%22Advanced+Practical+Inorganic+and+Metalorganic+Chemistry%22">Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry</a>. , Blackie. (1997).</li>
<li>Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+of+the+size-dependent+absorption+properties+of+CdSe+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots.</a> J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).</li>
<li>Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+absorption+cross+section+of+CdSe+nanocrystal+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).</li>
<li>Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+optical+and+electronic+properties+of+colloidal+nanocrystals+by+lattice+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain.</a> Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).</li>
<li>Demas, J. N., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+photoluminescence+quantum+yields.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The measurement of photoluminescence quantum yields. A review.</a> J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).</li>
<li>Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+optical+properties+of+CdSe%2FCdS+heterostructure+nanocrystals%3A+the+effects+of+core+size+and+shell+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+examination+of+surface+coatings+on+the+optical+and+chemical+properties+of+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+functionalization+of+aqueous+CdSe%2FZnS+nanocrystals+using+small-molecule+chemical+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators.</a> Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).</li>
<li>Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+and+mercury+toxicity+in+a+human+fetal+hepatic+cell+line+%28WRL-68+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells).</a> Toxicol. 102, 285-299 (1995).</li>
<li>Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+cytotoxicity+of+cadmium+and+mercury+in+a+human+bronchial+epithelial+cell+line+%28BEAS-2B%29+and+its+role+in+oxidative+stress+and+induction+of+heat+shock+protein+70%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70.</a> J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).</li>
<li>Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+the+toxicity+of+mercury%2C+cadmium%2C+and+copper+toward+the+isolated+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver.</a> J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W porównaniu do konwencjonalnych kropek kwantowych CdSe, nanokryształy trójskładnikowego stopu HgxCd1-xSe mogą być dostrajane pod względem rozmiaru i długości fali fluorescencji niezależnie od siebie. Rozmiar jest wybierany w pierwszej kolejności podczas syntezy rdzeni nanokryształów CdSe, natomiast długość fali fluorescencji jest ustalana w drugim etapie wymiany kationów rtęci, który nie zmienia znacząco rozmiaru nanokryształów 9. Ważne jest, aby oczyszczone nanokryształy HgxC...

<table><tbody><tr><td>Selen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-octylofosfina</td><td>Strem</td><td>15-6655</td><td>czystość 97%, niestabilny w powietrzu</td></tr><tr><td>Tlenek kadmu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202894</td><td>Wysoce toksyczne: zachować ostrożność </td></tr><tr><td>Kwas tetradecylfosfonowy</td><td>Synteza PCI</td><td>4671-75-4</td><td></td></tr><tr><td>Oktadecen</td><td>Alfa Aesar</td><td>L11004</td><td>Klasa techniczna</td></tr><tr><td>Heksadecyloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7408</td><td></td></tr><tr><td>Dyfenylofosfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252964</td><td>Piroforyczny</td></tr><tr><td>Octan rtęci</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>456012</td><td>Wysoko toksyczne: zachować ostrożność</td></tr><tr><td>1-oktanotiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471836</td><td>Silny zapach</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W281506</td><td></td></tr><tr><td>Octan cynku </td><td>Alfa Aesar</td><td>35792</td><td></td></tr><tr><td>Octan kadru uwodniony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229490</td><td>Wysoka toksyczność: zachować ostrożność</td></tr><tr><td>oleilamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12954</td><td>Niestabilny w powietrzu</td></tr><tr><td>Siarka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>344621</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek trioktylofosfiny</td><td>Strem</td><td>15-6661</td><td>99%</td></tr><tr><td>Pyridyna</td><td>VWR</td><td>EM-PX2012-6</td><td>Bezwodny</td></tr><tr><td>Tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753</td><td>Silny zapach</td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>Bezwodny</td></tr><tr><td>Membrana dializacyjna</td><td>Spectrum Labs</td><td>131342</td><td>próg odcięcia 20 kDa</td></tr><tr><td>Filtr wirówkowy</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>próg odcięcia 10 kDa</td></tr><tr><td>Monoamino-PEG</td><td>Polimery Rapp</td><td>12 750-2</td><td>750 Da</td></tr><tr><td>DMTMM, hydrat chlorku 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyn-2-ylo)-4-metylmorfolinium</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26333</td><td></td></tr><tr><td>System chromatograficzny AKTAprime Plus</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolumna chromatograficzna Superose 6 10/300 GL</td><td>GE HealthCare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, OmniPur</td><td>VWR</td><td>EM-2120</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Aneks&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;em&gt;Synteza oktanotiolanu rtęci&lt;/em&gt;Powoli dodaj do mieszanego roztworu 1-oktanotiolu (3 eq.) i wodorotlenku potasu (3 eq.) w metanolu, w temperaturze pokojowej, roztwór octanu rtęci w metanolu (1 eq.). Wyizoluj osad oktanotiolanu rtęci(II) poprzez filtrację, przemyj go dwukrotnie metanolem i raz eterem, a następnie wysusz w próżni.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;em&gt;Synteza polimeru wielodentatnego&lt;/em&gt;Rozpuścić kwas poliakrylowy (1 g, 1,773 Da) w 25 ml dimetyloformamidu (DMF) w kolbie trójszyjnej o pojemności 150 ml i przepłukiwać argonem przez 30 min. Dodać bezwodny roztwór cysteaminy (374 mg, 4,87 mmol) w 10 ml DMF. W temperaturze pokojowej, przy intensywnym mieszaniu, powoli dodawać bezwodny diizopropylokarbodiimid (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) w ciągu 30 min, a następnie trietyloaminę (170 &amp;mu;l, 1,22 mmol) i pozostawić reakcję na 72 h w temperaturze 60 &amp;deg;C. Dodaj merkaptan&amp;#8211;metanol (501 mg, 6,41 mmol) w celu zatrzymania reakcji, a następnie mieszać przez 2 h w temperaturze pokojowej. DMF usunąć za pomocą odparowania rotacyjnego, a polimer wyizolować poprzez dodanie mieszaniny lodowatego acetonu i chloroformu w stosunku 2:1, a następnie zastosować wirowanie. Polimer rozpuścić w ok. 5 ml bezwodnego DMF, przefiltrować, ponownie wytrącić za pomocą eteru dietylowego i powtórzyć czynność. Produkt wysuszyć w próżni i przechowywać w atmosferze argonu.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy przetłumaczyć Państwa materiały na język polski, zachowując rygorystyczne standardy akademickie, precyzję terminologiczną oraz naturalny styl protokołów badawczych.&quot;&gt;&lt;em&gt;Oznaczanie średnicy rdzenia CdSe&lt;/em&gt;Na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis wyznacz długość fali pierwszego piku ekscytonowego (&amp;#955;, w nm), który jest pikiem o najdłuższej długości fali (&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; około 498 nm dla CdSe w &lt;silny&gt;Rycina 2a&lt;/strong&gt;), a następnie należy zastosować krzywą kalibracji rozmiaru opracowaną przez Mulvaneya i współpracowników &lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Prosimy o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/4236/4236eq1.jpg&quot; alt=&quot;Równanie 1&quot;/&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do przetłumaczenia. Czekam na treść z JoVE, aby przygotować profesjonalne tłumaczenie na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi.&quot;&gt;&lt;em&gt;Oznaczanie stężenia nanokryształów CdSe&lt;/em&gt;Na podstawie widma UV-Vis z odjętym tłem dla optycznie klarownego roztworu nanokryształów CdSe wyznacz absorbancję przy długości fali 350 nm. W celu ustalenia, czy absorbancja optyczna mieści się w zakresie liniowym prawa Lamberta-Beera, można zastosować rozcieńczenia seryjne. Stężenie nanokryształów (&lt;em&gt;kropka kwantowa&lt;/em&gt;, w M) można wyznaczyć, podstawiając średnicę nanokryształu (&lt;em&gt;D&lt;/em&gt;, w nm), wartość absorpcji optycznej (&lt;em&gt;A&lt;sub&gt;3sa&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;), oraz długość drogi optycznej kuwety (&lt;em&gt;l&lt;/em&gt;, w cm) do następującego równania wynikającego z korelacji empirycznej Bawendiego i współpracowników &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać treść źródłową do tłumaczenia. Wprowadź tekst z materiałów JoVE, który mam przełożyć na język polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru naukowego i precyzji terminologicznej.&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/4236/4236eq2.jpg&quot; alt=&quot;Równanie 2&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek jest ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów funkcji biomolekularnych oraz wizualizacji przestrzennej i czasowej heterogeniczności zachowań molekularnych, które leżą u podstaw biologii komórki 1-4. Aby obrazować pojedynczą cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, zazwyczaj sprzęga się ją z markerem fluorescencyjnym (barwnikiem, białkiem, koralikiem lub kropką kwantową) i obserwuje za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Choć barwniki i białka fluorescencyjne od dekad stanowią podstawę obrazowania fluorescencyjnego, ich fluorescencja jest niestabilna przy wysokich strumieniach fotonów niezbędnych do obserwacji pojedynczych cząsteczek, co pozwala na zaledwie kilka sekund obserwacji przed całkowitą utratą sygnału. Koraliki lateksowe i koraliki znakowane barwnikiem zapewniają lepszą stabilność sygnału, ale odbywa się to kosztem drastycznie większego rozmiaru hydrodynamicznego, co może niekorzystnie wpływać na dyfuzję i zachowanie badanej cząsteczki.
Kropki kwantowe (QDs) stanowią kompromis pomiędzy tymi dwoma problematycznymi obszarami. Nanocząsteczki te składają się z materiałów półprzewodnikowych i mogą być projektowane tak, aby posiadały kompaktowy rozmiar hydrodynamiczny oraz wyjątkową odporność na fotodegradację 5. Dzięki temu w ostatnich latach QDs odegrały kluczową rolę w umożliwieniu długoterminowej obserwacji złożonych zachowań makromolekularnych na poziomie pojedynczych cząsteczek. Stwierdzono jednak, że cząsteczki te nadal wykazują upośledzoną dyfuzję w zatłoczonych środowiskach molekularnych, takich jak cytoplazma komórkowa czy neuronalna szczelina synaptyczna, gdzie ich rozmiary są wciąż zbyt duże 4,6,7.
Opracowaliśmy niedawno rdzenie i powłoki powierzchniowe kropek kwantowych (QD) w celu zminimalizowania ich rozmiaru hydrodynamicznego, równoważąc jednocześnie wpływ na stabilność koloidalną, fotostabilność, jasność oraz wiązanie nieswoiste, które w przeszłości ograniczały użyteczność kompaktowych QD 8,9. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie syntezy, modyfikacji i charakterystyki tych zoptymalizowanych nanokryształów, składających się ze stopowego rdzenia HgxCd1-xSe pokrytego izolującą powłoką CdyZn1-yS, a następnie wielodentatowym ligandem polimerowym zmodyfikowanym krótkimi łańcuchami glikolu polietylenowego (PEG) (Rycina 1). W porównaniu z konwencjonalnymi nanokryształami CdSe, stopy HgxCd1-xSe oferują wyższe wydajności kwantowe fluorescencji, emisję w zakresie czerwieni i bliskiej podczerwieni dla lepszego stosunku sygnału do szumu w komórkach oraz wzbudzanie przy nietoksycznych dla komórek długościach fal widzialnych. Wielodentatowe powłoki polimerowe wiążą się z powierzchnią nanokryształu w zamkniętej i płaskiej konformacji, aby zminimalizować rozmiar hydrodynamiczny, a PEG neutralizuje ładunek powierzchniowy, minimalizując nieswoiste wiązanie z komórkami i biomolekułami. Końcowym wynikiem jest silnie fluorescencyjny nanokryształ z emisją w zakresie 550-800 nm i całkowitym rozmiarem hydrodynamicznym wynoszącym około 12 nm. Jest to zakres wielkości zbliżony do wielu rozpuszczalnych białek globularnych w komórkach i znacznie mniejszy niż w przypadku konwencjonalnych pegylowanych QD (25-35 nm).

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne widma absorpcyjne i fluorescencyjne nanokryształów CdSe, nanokryształów HgxCd1-xSe po wymianie kationów oraz nanokryształów HgxCd1-xSe/CdyZn1-yS po wzroście powłoki. Nanokryształy rdzenia CdSe mają wydajność kwantową fluorescencji bliską 15% (wliczając emisję z głębokich pułapek przy długich falach), lecz sprawność ta spada do poniżej 1% po wymianie rtęci, co prawdopodobnie wynika z wprowadzenia pułape...

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, nanocząstki te mają rozmiar zbliżony do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczych cząsteczek, stabilności przeciwko fotodegradacji oraz odporności na nieswoiste wiązanie z białkami i komórkami.

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek jest istotnym narzędziem służącym do zrozumienia mechanizmów funkcji biomolekularnych oraz do wizualizacji przestrzennej i czasowej ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie fluorescencyjnych kropek kwantowych o zoptymalizowanej jasności i stabilności, a także zminimalizowanym rozmiarze i niespecyficznym wiązaniu, do zastosowania w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności małych rdzeni kropek kwantowych z selenku kadmu. Drugim krokiem jest stopowanie tych rdzeni z rtęcią w celu przesunięcia ich fluorescencji w stronę widma czerwonego oraz zwiększenia ich jasności.Następnie na nanokryształach hoduje się cienką powłokę stopową w celu stabilizacji ich emisji fluorescencyjnej. Ostatnim etapem jest przeniesienie tych cząsteczek z rozpuszczalników organicznych do buforów wodnych przy użyciu polimeru wielokrotnego, który może zostać zmodyfikowany biologicznie obojętnym glikolem polietylenowym. W końcowej fazie wykorzystuje się spektrometrię fluorescencyjną, chromatografię żelową oraz elektroforezę żelową, aby wykazać, że cząsteczki te charakteryzują się silną fluorescencją, niewielkim rozmiarem hydrodynamicznym i neutralnym ładunkiem elektrostatycznym – cechami, które są odpowiednie do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek w biologii.Główną zaletą tych kropek kwantowych w porównaniu z istniejącymi materiałami komercyjnymi jest znacznie mniejszy rozmiar hydrodynamiczny tych nanocząstek. Chociaż mniejsze kropki kwantowe charakteryzują się mniejszą intensywnością fluorescencji, niższą stabilnością fluorescencji oraz emisją wyłącznie w spektrum niebieskim, zniwelowaliśmy te efekty, stosując proces wymiany kationów rtęci. Te nanokryształy mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biofizyki i sygnalizacji komórkowej, umożliwiając dynamiczne obrazowanie pojedynczych biomolekuł w zatłoczonych środowiskach biologicznych.W celu rozpoczęcia należy przygotować 0,4 M roztwór selenu w top, dodając selen do kolby trójszyjnej o pojemności 50 ml, odsysając powietrze z kolby za pomocą wysokiej próżni i napełniając ją argonem za pomocą linii Schlenka w warunkach beztlenowych. Należy dodać 10 ml top i podgrzać do 100 °C przy mieszaniu przez jedną godzinę, aż do uzyskania klarownego, bezbarwnego roztworu.Ostudzić roztwór do temperatury pokojowej i odstawić kolbę. Przygotować również roztwór tlenku kadmu, TDPA i ODE w kolbie trójszyjnej o pojemności 250 ml, stosując ilości podane w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Odpowietrzyć roztwór za pomocą linii próżniowej podczas mieszania.Zwiększyć temperaturę do 100 °C i odessać powietrze przez kolejne 15 minut. Aby usunąć zanieczyszczenia o niskiej temperaturze wrzenia w atmosferze argonu, podgrzać mieszaninę do 300 °C przez jedną godzinę, aby całkowicie rozpuścić tlenek kadmu. Roztwór zmieni kolor z czerwonawego na przejrzysty i bezbarwny; schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.Następnie dodaj HDA do roztworu kadru, podgrzej do 70 °C i odessij powietrze. Po osiągnięciu stałego ciśnienia zwiększ temperaturę i prowadź cofanie roztworu przez 30 minut. Przełącz zawór linii Schlenka na gaz obojętny i wprowadź termoparę bezpośrednio do roztworu.W warunkach beztlenowych należy dodać DPP do roztworu kadmu i zwiększyć temperaturę do 310 °C. Następnie, używając jednorazowej plastikowej strzykawki z igłą o rozmiarze 16 G, należy pobrać 7,5 mL 0,4 M roztworu selenu. Po ustabilizowaniu temperatury na poziomie 310 °C, należy ustawić kontroler temperatury na 0 °C i szybko wstrzyknąć roztwór selenu bezpośrednio do roztworu kadmu.Roztwór zmieni kolor z bezbarwnego na żółty, a następnie pomarańczowy, a temperatura szybko spadnie i ponownie wzrośnie do około 280 stopni Celsjusza. Najtrudniejszym krokiem w tej procedurze jest jak najszybsze wstrzyknięcie całej objętości strzykawki do roztworu kadmu. Zapewnia to jednorodną nukleację cząsteczek.Po jednej minucie reakcji należy wyjąć kolbę z płaszcza grzewczego i szybko schłodzić strumieniem powietrza, aż temperatura spadnie poniżej 200 °C. Gdy temperatura osiągnie około 40 °C, roztwór należy rozcieńczyć 30 ml heksanu, co spowoduje wytrącenie większości pozostałego prekursora kadru. Osad ten należy usunąć poprzez wirowanie.W sześciu 50 ml polipropylowych stożkowych probówkach wirówkowych rozcieńczyć 12 ml otrzymanego surowego roztworu nano Krystal. Po odwirowaniu przy zastosowaniu tych samych parametrów, ostrożnie zlać i usunąć nadsącz, dodając 40 ml acetonu. Następnie rozpuścić osad nano krysttal w heksanie.Wykonaj ekstrakcję roztworu równą objętością metanolu, zachowując górną fazę. Powtórz tę ekstrakcję jeszcze dwukrotnie, aby przeprowadzić trzecią ekstrakcję. Objętość metanolu można dostosować do około 15 mililitrów, aby uzyskać skoncentrowany roztwór kropel kwantowych selenku kadmu w heksanie o stężeniu około 200 micromolar.Typowa wydajność tej reakcji to trzy mikromolowe kryształy selenku kadmu o średnicy od dwóch do trzech nanometrów. Wyznacz średnicę i stężenie nanokryształów poprzez pomiar widma absorpcyjnego w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. Nanokryształy można częściowo wymienić na rtęć, aby przesunąć absorpcję i emisję fluorescencji w stronę czerwieni. W tym celu w szklanej fiolce o pojemności 20 mililitrów z mieszadłem zmieszaj heksan i chloroform, a następnie dodaj roztwór kropek kwantowych selenku kadmu w OLA oraz octan rtęci. Po oczyszczeniu nanokryształów i wyznaczeniu ich stężenia zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, pozostaw nanokryształy na co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej w celu wzrostu otoczki.Przygotować 0,1 M roztwory prekursorów powłoki w 50 ml kolbach trójszyjnych; w warunkach próżni podgrzewać roztwory prekursora kadru, prekursora cynku i prekursora siarki do temperatury wrzenia przez jedną godzinę w celu otrzymania klarownych roztworów, a następnie przenieść je do kolby trójszyjnej i napełnić argonem. Dodać TOPO, ODE oraz przygotowane kropki kwantowe selenku kadmu i rtęci. Odparować heksan w temperaturze pokojowej przy użyciu linii próżniowej.Zwiększ temperaturę do 100 °C i prowadź reflux przez 15 minut. Przełącz zawór linii na gaz argonowy i wprowadź termoparę do roztworu nano-kryształów. Po zwiększeniu temperatury do 120 °C dodaj 0,5 monowarstwy lub 140 µL roztworu prekursora siarki i pozwól reakcji przebiegać przez 15 minut.Zwiększ temperaturę do 140 °C. Dodaj 0,5 monowarstw lub 140 µL roztworu prekursora kadru i pozwól reakcji przebiegać przez 15 minut. Następnie dodaj 500 µL bezwodnego OLA do roztworu reakcyjnego.W temperaturze 160 °C dodaj 0,5 monowarstwy, czyli 220 µL roztworu prekursora siarki, a następnie równą ilość roztworu prekursora cynku w temperaturze 170 °C, zachowując 15 minut odstępu między każdym dodaniem. Następnie w temperaturze 180 °C dodaj 0,25 monowarstwy, czyli 150 µL roztworu prekursora siarki oraz roztworu prekursora cynku w odstępach 15-minutowych. Schłodź roztwór do temperatury pokojowej i wyznacz nowy współczynnik ekstynkcji dla tych cząstek.Wykorzystując widmo UV-vis i zakładając, że liczba nanokryształów nie uległa zmianie, należy przechowywać roztwór poreakcyjny jako mieszaninę nieoczyszczoną w zamrażarce. Na tym etapie nanokryształy można scharakteryzować za pomocą mikroskopii elektronowej, spektroskopii absorpcyjnej UV-vis oraz spektroskopii fluorescencyjnej. Do kolby trójszyjnej o pojemności 50 mililitrów należy dodać oczyszczone kropki kwantowe typu core-shell i usunąć heksan w wysokiej próżni.Aby uzyskać suchy film, napełnić kolbę argonem. Dodać bezwodną purynę do filmu z nanocząsteczek i podgrzewać zawiesinę do 80 °C w ciągu jednej lub dwóch godzin. Nanocząsteczki ulegną całkowitemu rozpuszczeniu.Do roztworu należy dodać 1 mL 1 FIO glicerolu i mieszać w temperaturze 80 °C przez dwie godziny. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej należy dodać 0,5 mL trietyloaminy w celu deprotonacji tioglicerolu i mieszać przez 30 minut. Po dodaniu trietyloaminy roztwór może stać się mętny ze względu na słabą rozpuszczalność polarnych nanokryształów w tej mieszaninie rozpuszczalników.Przenieś roztwór kropek kwantowych do stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej mieszaninę 20 ml heksanu i 20 ml acetonu, a następnie dokładnie wymieszaj. Wyizoluj wytrącone nanokryształy poprzez wirowanie, po czym przemyj osad acetonem, rozpuść osad z kropek kwantowych w pięciu ml DMSO w kąpieli ultradźwiękowej i ponownie poddaj wirowaniu. W ten sposób usuń ewentualne agregaty, a następnie wyznacz stężenie nanocząstek na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis.Roztwór czystych kropek kwantowych należy wykorzystać w ciągu trzech godzin, ponieważ ich powierzchnia może powoli utleniać się w warunkach otoczenia w powietrzu. Rozcieńczyć roztwór kropek kwantowych do stężenia 10 µM lub mniej za pomocą DMSO i przenieść do kolby o pojemności 50 ml. Do roztworu kropek kwantowych, podczas mieszania, dodawać kroplami przygotowany roztwór rozcieńczonego kwasu poliakrylowego w DMSO o stężeniu 5 mg/ml, a następnie odgazować roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Przepłucz roztwór polimeru z kropkami kwantowymi argonem i podgrzewaj w temperaturze 80 °C przez 90 minut. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej dodaj kroplami równą objętość 50 mM octanu sodu o pH 8 i mieszaj przez 10 minut. Oczyść kropki kwantowe zgodnie z opisem w procedurze pisemnej i wyznacz stężenie na podstawie widma absorpcyjnego UV-vis. W szklanej fiolce o pojemności 4 mL z mieszadłem magnetycznym wymieszaj 1 mol kropek kwantowych w buforze boratowym z 40 000-krotnym nadmiałem molowym monoaminopolietylenoglikolu o masie 750 Dalton.Instrukcje dotyczące dodawania specyficznych funkcjonalności chemicznych do nanokryształów znajdują się w pisemnej procedurze. Do roztworu kropek kwantowych szybko dodaj 25 000-krotną nadwyżkę molową świeżo przygotowanego roztworu czynnika aktywującego i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz ten krok jeszcze cztery razy, aby nasycić powierzchnię nanokryształów PEG.Na koniec, aby przerwać reakcję, dodaj 200 µL 1 M buforu TRIS przed oczyszczeniem nanokryształów za pomocą wirnikowych filtrów do dializy lub ultrawirowania. Otrzymane nanokryształy można poddać analizie pod kątem monodyspersyjności, rozmiaru hydrodynamicznego i ładunku powierzchniowego, wykorzystując chromatografię cieczową, elektroforezę w żelu oraz mikroskopię fluorescencyjną. Przedstawione tutaj są reprezentatywne widma absorpcyjne i fluorescencyjne dla nanokryształów selenku kadmu, nanokryształów selenku rtęci i kadmu po wymianie kationowej oraz nanokryształów z rdzeniem z selenku rtęci i kadmu i powłoką z siarczku kadmu i cynku po wzroście powłoki. Nanokryształy z rdzeniem z selenku kadmu mają wydajność kwantową fluorescencji bliską 15%. Jednakże wydajność ta spada do poziomu poniżej 1% po wymianie rtęci, prawdopodobnie z powodu pułapek nośników ładunku wprowadzonych poprzez zaburzenia atomów powierzchniowych.Wzrost cienkiej powłoki siarczku kadmu i cynku zwiększa tę wydajność do ponad 70%, co jest w dużej mierze utrzymywane po przeniesieniu do wody. W przeciwieństwie do nich, nanokryształy z rdzeniem z selenku kadmu i powłoką z siarczku kadmu i cynku, bez wbudowania rtęci, tracą znaczną część swojej wydajności kwantowej w wodzie, chyba że zostanie wyhodowana gruba powłoka. Należy zauważyć, że powlekanie siarczkiem kadmu i cynku przesuwa widma w stronę czerwieni ze względu na wyciek nośników ładunku elektronowego do materiału powłoki.Przesunięcie to wynosi około 20 do 30 nanometrów dla rdzeni kadmowych i zwiększa się wraz ze wzrostem zawartości rtęci w rdzeniu. Dzięki wbudowaniu rtęci w nanokryształ rdzenia można zatem zachować niewielki rozmiar nanokryształu bez utraty jasności. Mały rozmiar został wykazany na tym mikrografie transmisyjnym oraz w rozkładzie wielkości cząstek nanokryształów z rdzeniem z selenku rtęci i kadmu oraz otoczką z siarczku kadmu i cynku, wykazując średnicę średnią 3,2 ± 0,6 nanometrów.Zastosowanie dwuetapowego przeniesienia fazowego do wody jest kluczowe dla uzyskania homogennej populacji nanokryształów, które nie wymagają dalszego sortowania pod względem wielkości w celu usunięcia klastrów i agregatów za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego. Przedstawiony tutaj chromatogram potwierdza, że wielkość jest zbliżona do wielkości konalbuminy. Przy 75 kilodaltonach i po modyfikacji aminowym PEG o masie 750 Daltonów, rozmiar zwiększa się do zaledwie 12 nanometrów, co jest zbliżone do wielkości przeciwciała IgG.Modyfikacja PEG neutralizuje ładunek powierzchniowy, co potwierdzono w przedstawionym tutaj eksperymencie elektroforezy w żelu agarozowym; dołek zaznaczono strzałką, a polaryzację elektrod wskazano po prawej stronie, co pokazuje, że przed koniugacją nanokryształy migrują jako cząstki naładowane, natomiast nanokryształy pegylowane są neutralne elektrostatycznie. Przedstawiony tutaj mikrograf epifluorescencyjny ukazuje nanokryształy osadzone na szkiełku podstawkowym i wzbudzone widzialnym światłem o długości fali 545 nanometrów. Nanokryształy te są łatwo obserwowalne na poziomie pojedynczych cząsteczek przy 30 klatkach na sekundę przy użyciu kamery CCD z mnożeniem elektronów.Wykres ten pokazuje, że liczba cząstek fluorescencyjnych obserwowanych w każdej klatce fluktuuje w czasie przy ciągłym wzbudzeniu. Jest to spowodowane kombinacją migotania oraz fotodegradacji. Przez pierwsze siedem minut dominuje migotanie, zanim powoli zacznie ujawniać się oksydacyjna fotodegradacja.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak chemicznie syntetyzować kropki kwantowe, jak przenosić je do buforów wodnych oraz jak modyfikować je na potrzeby zastosowań w obrazowaniu biologicznym. Proszę pamiętać, że praca z odczynnikami zawierającymi kadm i rtęć może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec ekspozycji personelu.

compact-quantum-dots-for-single-molecule-imaging

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Dostarczamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania monowalentnych docelowych kropek kwantowych (mQD) z fosforoazotanu DNA o określonej długości. Owijanie DNA odbywa się z dużą wydajnością, dlatego produkty nie wymagają oczyszczania. Demonstrujemy zastosowanie znacznika SNAP do kierowania mQD do receptorów na powierzchni komórki w zastosowaniach obrazowania żywych komórek.

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

W tym protokole synteza bezcdowych kropek kwantowych InP/ZnS (QD) jest szczegółowa. Płyny QD na bazie InP zyskują na popularności ze względu na toksyczność jonów Cd2+, które mogą być uwalniane w wyniku degradacji nanocząstek. Po syntezie QD są rozpuszczane w wodzie przy użyciu amfifilowego polimeru do zastosowań biomedycznych.

Synteza bezkadgingowych kropek kwantowych InP/ZnS odpowiednich do zastosowań biomedycznych

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Rezonansowe wzbudzenie pojedynczej, samodzielnie złożonej kropki kwantowej można osiągnąć za pomocą trybu wzbudzenia prostopadłego do trybu zbierania fluorescencji. Demonstrujemy metodę wykorzystującą falowody i mody Fabry'ego-Perota płaskiej mikrownęki otaczającej kropki kwantowe. Metoda pozwala na pełną dowolność w polaryzacji detekcji.

Fluorescencja rezonansowa kropki kwantowej InGaAs we wnęce płaskiej przy użyciu ortogonalnego wzbudzenia i detekcji

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Obecny protokół opisuje metodę immunoznakowania białka w skrawkach tkanki serca za pomocą kropek kwantowych. Technika ta stanowi użyteczne narzędzie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i ekspresji dowolnego białka na poziomie ultrastrukturalnym.

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Poznaj metodę przygotowania kompaktowych kropek kwantowych do obrazowania pojedynczych cząsteczek. Technika ta wykorzystuje rdzenie selenku kadmu z domieszką rtęci, zapewniając wysoką jasność fluorescencji i stabilność.

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów