Name: Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj technikę FIONA do lokalizacji pojedynczych fluoroforów z dokładnością nanometryczną. Metoda pozwala badać dynamikę silników molekularnych, takich jak miozyna, i ma szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH Grants 068625, NSF Grants 1063188 oraz Center of the Physics of Living Cells 0822613. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Mariny Marjanovic z Beckman Institute for Advanced Science and Technology za dar w postaci oczu królika.

Oświadczenie etyczne: Tkanka rogówki królików została pobrana zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use University of Illinois.
1. Konfiguracja TIRFM
UWAGA: Przez cały czas należy nosić gogle ochronne do laserów.
<ol>
	<li>Należy upewnić się, że wszystkie niezbędne komponenty optyczne wymienione w Liście Materiałów są dostępne i gotowe do wyrównania. W razie potrzeby należy zastosować zamienniki o równoważnych funkcjach innych firm. Należy upewnić się, że lustra i soczewki posiadają powłoki antyrefleksyjne (AR) dopasowane do używanego lasera.</li>
	<li>Należy ustawić wysokość wszystkich komponentów optycznych na poziomie centrum tylnego portu mikroskopu.</li>
	<li>Należy zamontować laser, migawkę laserową oraz filtr(y) ND. Należy użyć filtrów ND, aby osłabić moc lasera do możliwie najniższej wartości, przy której wiązka pozostaje widoczna. Śruby należy dokręcić odpowiednimi kluczami imbusowymi.</li>
	<li>Należy zaplanować tor wiązki i zaznaczyć go taśmą lub markerem na stole optycznym (niebieskie linie przerywane na Rysunku 1). Dla ułatwienia należy zachować proste odcinki wzdłuż linii otworów na stole optycznym.</li>
	<li>Należy umieścić lustro M1 (Rysunek 1) w miejscu pierwszego zakrętu kątowego. Dwie przysłony należy umieścić wzdłuż drugiego prostego odcinka zaplanowanego toru wiązki. Należy dostosować położenie i nachylenie M1 tak, aby wiązka lasera przechodziła przez przysłony.</li>
	<li>Należy umieścić lustro M2 (Rysunek 1) w miejscu drugiego zakrętu kątowego. Rozszerzacz wiązki 10X (L1 i L2, Rysunek 1) należy umieścić wzdłuż trzeciego prostego odcinka toru. Należy dostosować jego nachylenie tak, aby rozszerzacz wiązki był równoległy zarówno do stołu optycznego, jak i zaplanowanego toru wiązki.
	<ol>
		<li>Należy iteracyjnie regulować M1 i M2 tak, aby laser przechodził prosto przez centra obu soczewek rozszerzacza wiązki. Krok ten należy powtarzać do momentu, aż profil rozszerzonej wiązki będzie miał postać nieobciętego rozkładu Gaussa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy iteracyjnie regulować M1, aby wycentrować wiązkę na L1 (Rysunek 1), oraz M2, aby wycentrować wiązkę na L2 (Rysunek 1). Zły profil wiązki zazwyczaj oznacza, że wiązka lasera jest obcinana; aby sprawdzić profil wiązki wzrokowo, należy zablokować ją za rozszerzaczem za pomocą kawałka białego papieru. Do precyzyjnej analizy należy użyć optycznego profilometru wiązki.</li>
	<li>Należy dostosować odległość między L1 a L2 tak, aby wiązka była skolimowana. W razie potrzeby należy powtórzyć kroki 1.8 i 1.9. 
	UWAGA: Gdy rozmiar wiązki nie zmienia się wraz z odległością, wiązka jest wystarczająco skolimowana dla układu TIRFM. Aby dalej poprawić kolimację wiązki, można użyć narzędzi takich jak interferometr ścinający. Typowy rozmiar wiązki po rozszerzeniu wynosi ~20 mm.</li>
	<li>Należy zamknąć migawkę lasera. Należy wykręcić obiektyw mikroskopu i wkręcić fluorescencyjny cel wyrównawczy. Lustra M3 i M4 (Rysunek 1) należy ustawić tak, aby skierować rozszerzoną wiązkę do portu mikroskopu i na lustro dichroiczne wewnątrz rewolweru. Należy upewnić się, że wiązka lasera odbija się od lustra dichroicznego w stronę sufitu.</li>
	<li>Należy wyregulować M3, aby wycentrować najjaśniejszą część wiązki na celu fluorescencyjnym, oraz M4, aby ustawić nachylenie wiązki w pionie.</li>
	<li>Należy zamknąć migawkę lasera i ponownie wkręcić obiektyw. Jeśli wyrównanie w poprzednim kroku zostało wykonane prawidłowo, z obiektywu powinna wyjść symetryczna plamka. Należy precyzyjnie dostroić nachylenie M3 i M4, aby zoptymalizować moc lasera i profil wiązki wychodzącej z obiektywu.</li>
	<li>Należy zamontować kamerę EMCCD do mikroskopu i podłączyć ją do komputera. Następnie należy uruchomić oprogramowanie kamery.</li>
	<li>Należy umieścić fluorescencyjną próbkę (roztwór fluoroforów) w mikroskopie. Należy obserwować jasną fluorescencyjną plamkę na obrazie z kamery. Należy sprawdzić, czy plamka nie przesuwa się na ekranie podczas zmiany ostrości.</li>
	<li>Soczewkę TIR (L3, Rysunek 1) należy umieścić na stole translacyjnym XYZ w odległości od tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu równej ogniskowej L3 (~30 cm). Położenie L3 należy dostosować tak, aby laser przechodził przez środek soczewki.</li>
	<li>Należy przesuwać L3 wzdłuż toru wiązki, aby dostosować jej kolimację. Należy upewnić się, że wiązka jest nadal wycentrowana na monitorze i ma symetryczny kształt. 
	UWAGA: Obszar oświetlenia w płaszczyźnie próbki zwiększa się wraz ze zmniejszaniem ogniskowej soczewki TIR. Zasadniczo należy używać najkrótszej ogniskowej, która zmieści się w układzie.</li>
	<li>Należy przesuwać L3 prostopadle do toru wiązki, aby pochylić wiązkę wychodzącą z obiektywu. Soczewkę TIR należy przesuwać do momentu uzyskania całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR). Należy obserwować próbkę kuleczek fluorescencyjnych za pomocą kamery EMCCD i precyzyjnie dostroić L3, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu (SNR).</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu optycznego do rozszerzania wiązki laserowej i ogniskowania na próbce za pomocą obiektywu." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Konfiguracja optyczna dla mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).
2. FIONA na Cy3-DNA
<ol>
	<li>Czyszczenie szkiełek przedmiotowych i nakrywek: wypłukanie szkiełek przedmiotowych i nakrywek w ddH2O oraz izopropanolu, a następnie osuszenie ich strumieniem azotu; umieszczenie szkiełek i nakrywek w oczyszczaczu plazmowym na 5 min w plazmie argonowej.</li>
	<li>Konstrukcja komór z próbką (zgodnie ze schematem na Rysunku 2).
	<ol>
		<li>Umieszczenie chusteczki na blacie, a następnie położenie na niej kawałka papieru do soczewek. Położenie szkiełka na papierze do soczewek. Należy upewnić się, że czysta strona szkiełka jest skierowana do góry.</li>
		<li>Naklejenie dwóch pasków taśmy dwustronnej na szkiełko wzdłuż dłuższych krawędzi, pozostawiając przerwę 3-5 mm w środku. Umieszczenie oczyszczonej nakrywki na szkiełku. Należy upewnić się, że czysta strona nakrywki przylega do szkiełka.</li>
		<li>Użycie końcówki pipety do dociśnięcia taśmy dwustronnej. Usunięcie nadmiaru taśmy ze szkiełka za pomocą żyletki w taki sposób, aby taśma pozostała jedynie pod nakrywką. 
		UWAGA: Otwarte końce komory pozostają odsłonięte i służą jako wlot oraz wylot. Objętość komory wynosi kilka mikrolitrów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat przygotowania szkiełka mikroskopowego; układ szkiełka nakrywkowego, przedmiotu i taśmy w mikroskopii." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat typowej komory z próbką. (a) Widok z góry; (b) Widok z boku od prawej strony; (c) Widok z boku od przodu.
<ol start="3">
	<li>Immobilizacja Cy3-DNA na wewnętrznych powierzchniach komór z próbką.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor T-50 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl). Przygotować BSA-biotynę w buforze T-50 o stężeniu końcowym 1 mg/ml. Przygotować bufor T50-BSA poprzez rozpuszczenie BSA w buforze T-50 do stężenia końcowego 10 mg/ml.</li>
		<li>Przygotować neutrawidynę w stężeniu 0,5 mg/ml w buforze T50-BSA. Przygotować biotynilowany DNA znakowany Cy3 (Cy3-DNA) w buforze T50-BSA o stężeniu końcowym 5-10 pM.</li>
		<li>Pipetować 10 µl BSA-biotyny (1 mg/ml) do komory z próbką. Odczekać 5 min.</li>
		<li>Przemyć komorę 40 µl buforu T50-BSA. Pipetować 10 µl neutrawidyny (0,5 mg/ml) do komory z próbką. Inkubować przez 5 min.</li>
		<li>Przemyć komorę 40 µl buforu T50-BSA. Pipetować 20 µl Cy3-DNA do komory z próbką. Inkubować przez 5 min, a następnie przemyć komorę 80 µl buforu T50-BSA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek Cy3-DNA przy użyciu TIRFM.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor obrazujący (100 µl), mieszając 1 µl protokatechuanu-3,4-dioksygenazy (PCD, 5 µM), 4 µl kwasu protokatechowego (PCA, 62,5 mM), 50 µl kwasu 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylchromanu-2-karboksylowego (Trolox, 2 mM w buforze T-50) oraz 45 µl buforu T50-BSA.</li>
		<li>Pipetować 30 µl buforu obrazującego i odczekać 8-10 min.</li>
		<li>Zamontować próbkę do obrazowania na mikroskopie TIRFM wyposażonym w zielony laser (532 nm), obiektyw imersyjny olejowy 100X (1,45 NA) oraz kamerę EMCCD.</li>
		<li>Ustawić czas ekspozycji od 100 do 500 msec oraz wzmocnienie EM od 25 do 100. Nagrać film z próbki obejmujący 1000 klatek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzenie analizy danych FIONA na zarejestrowanych obrazach Cy3-DNA.
	<ol>
		<li>Wyznaczyć efektywny rozmiar piksela (tj. współczynnik konwersji z pikseli na nanometry), dzieląc fizyczny rozmiar piksela (odczytany z karty specyfikacji kamery EMCCD) przez całkowite powiększenie (powiększenie obiektywu mikroskopu pomnożone przez wszelkie dodatkowe powiększenia).</li>
		<li>Wyznaczyć współczynnik konwersji intensywności pikseli na liczbę fotonów, dzieląc czułość CCD (tj. liczbę elektronów na zliczenie A/D, odczytaną z karty specyfikacji kamery CCD) przez wzmocnienie mnożnika elektronów (EM) użyte podczas akwizycji obrazu.</li>
		<li>Skompilować i uruchomić program FIONA.pro do analizy FIONA. Użyć tego programu IDL do importu zarejestrowanego obrazu, wprowadzenia efektywnego rozmiaru piksela (z kroku 2.5.1) oraz współczynnika konwersji intensywności na liczbę fotonów (z kroku 2.5.2), a także do wybrania obszarów do analizy FIONA. 
		UWAGA: Na koniec program wyświetli wyniki dopasowania funkcjami Gaussa 2D, a także całkowitą liczbę fotonów i precyzję lokalizacji. Typowy wynik przedstawiono w sekcji wyników reprezentatywnych oraz na rycinach 4c-4d.</li>
		<li>Skompilować i uruchomić program phcount.pro w celu określenia liczby fotonów. Użyć tego programu IDL do pomiaru średniej liczby fotonów emitowanych przez fluorofor przed fotowyblaknięciem, do importu zarejestrowanego obrazu oraz do wprowadzenia współczynnika konwersji intensywności na liczbę fotonów (z kroku 2.5.2). 
		UWAGA: Program automatycznie wykryje plamy fluorescencyjne (opcjonalnie dostępny jest wybór ręczny), obliczy liczbę fotonów w funkcji numeru klatki i wyświetli ślady liczby fotonów.
		<ol>
			<li>Odrzucić błędne ślady i określić zakresy klatek po fotowyblaknięciu do korekcji linii bazowej. Na koniec program wyświetli listę całkowitych liczb fotonów dla wszystkich punktów, które nie zostały odrzucone. Następnie narysować rozkład liczb fotonów i dopasować do rozkładu zanik wykładniczy, aby uzyskać średnią liczbę fotonów. Typowy wynik przedstawiono w sekcji wyników reprezentatywnych oraz na rycinach 4e-4f.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zastosowanie FIONA do ilościowego określenia dynamiki silników molekularnych (np. miozyny na aktynie) w skali nanometrycznej
<ol>
	<li>Polimeryzację aktyny (t.j. przygotowanie F-aktyny) przeprowadź na jeden dzień przed eksperymentem FIONA.
	<ol>
		<li>Rekonstytuuj G-aktynę (monomer) oraz biotynylaną G-aktynę (monomer) do stężenia 10 mg/ml w ogólnym buforze do aktyny. Mieszaj, aby upewnić się, że obie substancje są całkowicie rozpuszczone, i przechowuj obie na lodzie.</li>
		<li>W probówce mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml wymieszaj 10 µl G-aktyny (monomeru) z 1,7 µl biotynylaną G-aktyną. Dodaj 100 µl lodowatego buforu do polimeryzacji aktyny.</li>
		<li>Pozostaw mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C (do utworzenia F-aktyny), a następnie dodaj ddH2O do całkowitej objętości 1 ml.</li>
		<li>Przechowuj filamenty aktynowe (F-aktynę) w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia w eksperymentach. 
		UWAGA: Filamenty z czasem ulegają dezintegracji i skracaniu, ale mogą być używane przez co najmniej dwa tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbkę do obrazowania.
	<ol>
		<li>Przygotuj komorę do próbki (zgodnie z opisem w Protokole 2.1 i 2.2). Pipetuj 20 µl biotynilowanego BSA o stężeniu 1 mg/ml w ddH2O. Inkubuj przez 10 min. Przepłucz 30 µl ddH2O. 
		UWAGA: Służy to zablokowaniu powierzchni szkła i naniesieniu biotyny w celu wiązania filamentów aktynowych. Podobną funkcję może pełnić biotynilowana poli-L-lizyna – glikol polietylenowy (PLL-PEG).</li>
		<li>Pipetuj 0,5 mg/ml neutrawidyny. Inkubuj przez 2 min, a następnie przemyj komorę 30 µl buforu M5.</li>
		<li>Pipetuj przygotowaną F-aktynę rozcieńczoną 25-krotnie w ogólnym buforze do aktyny, do stężenia końcowego ~0,004 mg/ml. Odczekaj 10 min, przepłucz komorę 30 µl buforu.</li>
		<li>Rozcieńcz miozynę Va z tagami FLAG 30-krotnie w buforze M5 (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) do stężenia końcowego 250 nM. Wymieszaj 1 µl miozyny z 1 µl Anti-FLAG-Qdot705 (~1 µM, sprzężonego z przeciwciał Anti-FLAG i Qdot705 przy użyciu zestawu Qdot705 Antibody Conjugation Kit zgodnie z instrukcją producenta). Dodaj 8 μl M5, aby dopełnić objętość do 10 µl. Pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Inkubuj przez 10 min na lodzie. 
		UWAGA: W ten sposób uzyskuje się mieszaninę w stosunku 1 motor na 4 kropki kwantowe, przy stężeniu miozyny ~25 nM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie ruchu miozyny po aktynie.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor do obrazowania (100 µl), mieszając 84 µl M5-BSA (bufor M5 z 1 mg/ml BSA), 1 µl ATP (50 µM w ddH2O), 2 µl DTT (500 mM w ddH2O), 1 µl CK (500 U/ml), 5 µl CP (200 mM), 1 µl PCD, 4 µl PCA, 1 µl miozyny-qdot po ponownym 10-krotnym rozcieńczeniu do stężenia miozyny 2,5 nM oraz 1 µl BME.</li>
		<li>Pipetuj 20 µl buforu do obrazowania do komory z próbką i inkubuj przez 8-10 min.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie próbki na mikroskopie TIRF przy czasie ekspozycji 30 msec. Pozyskaj co najmniej 1000 klatek. W razie potrzeby skoryguj objętość miozyny-qdot w kroku 3.3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizę danych i wyznacz długość kroku ruchu miozyny.
	<ol>
		<li>Otwórz plik wideo w programie ImageJ17 i przytnij wideo wokół poruszającej się plamki. Wytnij obszar wystarczająco duży, aby plamka nigdy nie zbliżyła się na odległość mniejszą niż 20 pikseli do krawędzi, i upewnij się, że w wideo nie ma innych plamek. Upewnij się, że plamka porusza się po linii prostej.</li>
		<li>Śledź plamkę w wideo, aby wygenerować współrzędne x i y w funkcji czasu, w pikselach, stosując analizę FIONA (krok 2.5.3) do każdej klatki wideo.</li>
		<li>Przelicz piksele na nanometry, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.</li>
		<li>Oblicz przemieszczenie z pozycji początkowej jako funkcję czasu.</li>
		<li>Przeprowadź test t dla przemieszczenia, aby wyznaczyć kroki ruchu miozyny. 
		UWAGA: Program dostarczony do testu t (step_t_test.zip) jest napisany w języku IDL i składa się z 14 podprogramów w folderze.
		<ol>
			<li>Otwórz wszystkie podprogramy w IDL i skompiluj je dwukrotnie. Następnie uruchom mtltyanalysis_ttest.pro i wybierz plik tekstowy zawierający wyłącznie dane o odległości w jednej kolumnie. Zostanie wygenerowany plik wynikowy w formacie Excel, zawierający surowe dane, dopasowanie i długość kroku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń wszystkie wartości zero z kolumny długości kroku. Przedstaw rozkład długości kroków za pomocą programu Origin lub MATLAB. Dopasuj rozkład Gaussa do histogramu. 
		UWAGA: Wartości zerowe długości kroku muszą zostać usunięte, ponieważ krok o wartości zero oznacza, że między poprzednią a obecną klatką nie nastąpiło przemieszczenie. Dopasowanie daje szczyt w okolicy 36 nm (jak pokazano na Ryc. 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie grubych próbek do metody FIONA
<ol>
	<li>Przygotowanie kropek kwantowych zamkniętych w matrycy sol-gel.
	<ol>
		<li>Wymieszać 4,5 ml TMOS, 1 ml ddH2O oraz 100 µl HCl (120 mM). Sonicować mieszaninę w lodzie przez 30 min w myjce ultradźwiękowej określonej w Liście Materiałów (częstotliwość = 40 kHz, grzanie = wyłączone). Mieszać roztwór co 10 min.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1,5 µl Qdot605 w 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Wymieszać roztwór z 1,5 ml TMOS z poprzedniego kroku.</li>
		<li>Wlać mieszaninę do szalki z szklanym dnem. Uszczelnić szalkę Parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 ºC przez 1,5 h.</li>
		<li>Dodać 2 ml 1% BME w PBS do szalki z próbką i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki rogówki barwionej kropkami kwantowymi. 
	UWAGA: Oczy królika zostały przekazane przez dr Marinę Marjanovic.
	<ol>
		<li>Oddzielić rogówkę od oczu i pociąć ją na kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1 µl Qdot 605-streptawidyny w 1 ml PBS. Inkubować tkankę rogówki z 1 nM roztworem Qdots w temperaturze 4 ºC przez 1 h. Przepłukać tkankę PBS.</li>
		<li>Przygotować czyste szkiełko podstawne i lamellkę nr 1,5. Nanieść 4 warstwy taśmy dwustronnej na szkiełko wzdłuż dłuższej krawędzi, a następnie nałożyć kolejne 4 warstwy taśmy dwustronnej równolegle do poprzednich, pozostawiając między nimi kanał o szerokości około 1 cm. Umieścić tkankę z poprzedniego kroku na środku kanału i przykryć ją lamellką.</li>
		<li>Delikatnie docisnąć boki lamellki, aby przylgnęła do taśm. Nawilżyć kanał 50 µl PBS przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie kropek kwantowych w sol-gel i rogówce.
	<ol>
		<li>Do obrazowania FIONA w grubych próbkach należy użyć obiektywu imersyjnego wodnego 60X z odległością roboczą 0,27 mm lub obiektywu imersyjnego wodnego 60X z odległością roboczą 0,28 mm.</li>
		<li>Zamontować próbkę w mikroskopie. Ustawić soczewkę TIRF tak, aby osiągnęła tryb epi-fluorescencji (tzn. wiązka lasera wychodzi z obiektywu pod kątem względem lamellki). Wstawić dodatkową soczewkę powiększającą (3,3X lub 4,0X).</li>
		<li>Przesunąć płaszczyznę ogniskowej obiektywu do pożądanej pozycji z (np. &gt;200 µm). Rejestrować obrazy nieruchomych kropek kwantowych w próbce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić analizę FIONA zgodnie z opisem w sekcji 2.5 niniejszego protokołu.</li>
</ol>

<ol><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li>
<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+%28continued%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li>
<li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand%3A+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li>
<li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy%3A+Application+to+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li>
<li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+kinesin+is+so+processive%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li>
<li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li>
<li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li>
<li>Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+international%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

FIONA to technika lokalizacji położenia emitera fluorescencyjnego (fluoroforu organicznego lub kropki kwantowej) z nanometryczną precyzją i rozdzielczością czasową do 1 ms4-8. Gdy zbierze się wystarczająca ilość fotonów, technika ta pozwala na określenie położenia emitera fluorescencyjnego znacznie dokładniej niż granica dyfrakcji (~200 nm), a tym samym technika ta otwiera drogę do obserwacji tego, czego nie zaobserwowano za pomocą konwencjonalnej/tradycyjnej mikroskopii optycznej4-8...

Około 1882 roku Ernst Abbe odkrył, że rozdzielczość mikroskopu światła widzialnego wynosi ok. λ/2NA, czyli ok. 200 nm (gdzie λ oznacza długość fali, a NA aperturę numeryczną).1,2W związku z tym każdy obiekt mniejszy od tego wymiaru będzie widoczny w mikroskopie optycznym jako plamka ograniczona dyfrakcyjnie. Możliwe jest jednak wyznaczenie środka tej plamki, a zatem położenia obiektu, z znacznie większą precyzją.3Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością do jednego nanometra (FIONA) to prosta, lecz przydatna technika lokalizacji pojedynczych fluoroforów z nanometrową precyzją w płaszczyźnie x-y.4Precyzja lokalizacji, σµ (t.j., błąd standardowy średniej), zależy od całkowitej liczby zebranych fotonów, <img alt="Statistical error equation; √(s²/N + a²/12N + 8πs⁴b²/a²N²); formula for precision analysis." fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1">, gdzie N to liczba fotonów, s to odchylenie standardowe plamki fluorescencyjnej, a to rozmiar piksela detektora obrazującego, a b to odchylenie standardowe tła3,4W przypadku fluoroforu emitującego ok. 10 000 fotonów, metoda FIONA pozwala na osiągnięcie precyzji rzędu ok. 1 nm.4.
Metodę FIONA można wykorzystać do dokładnego określenia pozycji emitera stacjonarnego lub ruchomego (zakładając, że obrazy mogą być rejestrowane wystarczająco szybko). FIONA może być stosowana sekwencyjnie do klatek filmu, co pozwala na śledzenie ruchu pojedynczej cząsteczki4-8. Konieczne może być zastosowanie odczynników fotoprotekcyjnych, aby zapobiec fotodegradacji próbki. Co więcej, sam obiekt fluorescencyjny może mieć dowolny rozmiar, mniejszy lub większy od granicy dyfrakcyjnej — np. może to być organellum (~1 µm) z wieloma białkami fluorescencyjnymi rozproszonymi w jego błonie. Zastosowanie FIONA nadal pozwala na uzyskanie bardzo dokładnej (nanometrycznej) średniej wartości jego środka masy. Znaczna poprawa precyzji lokalizacji dzięki FIONA umożliwia rozdzielenie ruchów w skali nanometrycznej w czasie. Przeniosło to mikroskopię na skalę długości cząsteczkowych4-8.
Od czasu wynalezienia FIONA opracowano jego warianty. Na przykład obrazowanie w polu jasnym z dokładnością do jednego nanometra (bFIONA)9, będące niewielką modyfikacją FIONA, umożliwia obrazowanie i lokalizację gęstych obiektów, takich jak melanosomy in vivo (ciemne obiekty zawierające pigment melaninę) przy użyciu światła przechodzącego. Ponadto FIONA była wykorzystywana do rozróżniania wielu barwników. Przykładowo, opracowano obrazowanie pojedynczych cząsteczek o wysokiej rozdzielczości z fotoblaknięciem (SHRImP)10,11 lub kolokalizację pojedynczych cząsteczek o wysokiej rozdzielczości (SHREC)12, aby rozróżnić dwa barwniki w odległości około 10 nm. (Należy zauważyć, że chodzi tutaj o rozdzielczość, t.j. o to, jak dokładnie można odróżnić od siebie identyczne barwniki). W ostatnim czasie analiza FIONA przyczyniła się do procesu lokalizacji w niektórych metodach mikroskopii superrozdzielczej, takich jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna (STORM)13-15 oraz mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej (PALM)16, w których wzbudzane są tymczasowo ciemne fluorofory, a następnie lokalizowana jest ich fluorescencja. Poprzez wielokrotne wzbudzanie barwników o dość niskiej gęstości (mniej niż jeden na obszar ograniczony dyfrakcją), a następnie zbieranie fluorescencji i analizę każdego z nich za pomocą FIONA, można stworzyć mapę o wysokiej rozdzielczości. Rozdzielczość jest wówczas ograniczona jedynie liczbą fotonów emitowanych przez każdy barwnik, a także takimi czynnikami jak utrzymanie próbki w bezruchu (w tym, np., stolika mikroskopu) podczas akwizycji.
W niniejszej pracy przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz krótko opisano przykłady badań przeprowadzonych z jej wykorzystaniem. W pierwszej kolejności omówiono sposób konfiguracji sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia eksperymentów FIONA, t. j.omawiano mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), z uwzględnieniem szczegółów dotyczących ustawiania optyki. Następnie zilustrowano sposób przeprowadzenia prostego eksperymentu FIONA w celu lokalizacji unieruchomionych pojedynczych cząsteczek Cy3-DNA z wykorzystaniem odpowiednich protokołów. Po tym przedstawiono zastosowanie metody FIONA do pomiaru wielkości kroku wynoszącej 36 nm dla pojedynczego, skróconego motoru miozyny Va znakowanego kropką kwantową. Miozyna Va jest niezbędnym procesywnym białkiem motorowym, które transportuje ładunek komórkowy, przemieszczając się wzdłuż filamentów aktynowych. W niniejszym badaniu zastosowano skrócony konstrukt miozyny Va w celu usunięcia domen nieistotnych dla wielkości kroku, z dodanym do końca C-końca znacznikiem FLAG, aby ułatwić znakowanie kropkami kwantowymi funkcjonalizowanymi przeciwciałami anty-FLAG. Eksperyment ten przeprowadzono przy niskim stężeniu ATP, aby spowolnić miozynę i umożliwić zastosowanie wystarczająco długich czasów ekspozycji w celu uzyskania dobrej liczby fotonów w każdej klatce. W poniższym protokole można zastąpić znacznik dowolną wystarczająco jasną etykietą fluorescencyjną. Na koniec opisano niedawne próby rozszerzenia zastosowania metody FIONA na próbki grube. Jako dowód koncepcji kropki kwantowe zostały wprowadzone do sol-żeli oraz rogówek oczu królika, a następnie obrazowane i lokalizowane za pomocą FIONA. Do obrazowania wykorzystano obiektyw imersyjny z wodą 60X o aperturze numerycznej NA=1,2, ponieważ obiektyw ten posiada większą odległość roboczą niż wcześniej stosowany obiektyw imersyjny z olejem 100X. Aby zrekompensować utratę powiększenia w obiektywie, w torze emisji umieszczono dodatkową soczewkę powiększającą (3,3X lub 4,0X). Ponadto, w celu dotarcia do głębokich obszarów w grubych próbkach, konieczne było zastosowanie mikroskopii epifluorescencyjnej (nie TIR). Wykazano, że kropki kwantowe wprowadzone głęboko w sol-żele oraz w rogówki oczu królika (Z &gt; 200 µm) można zlokalizować z precyzją 2-3 nm.

<table><tbody><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &#181; m gruba</td></tr><tr><td>kamera EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>Bufor polimeryzacyjny aktyny&nbsp;</td><td>Cytoszkielet&nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna G-aktynowy</td><td>cytoszkielet&nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-aktyna&nbsp;</td><td>Cytoszkielet&nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>Ogólny bufor aktynowy&nbsp;</td><td>Cytoszkielet&nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>Migawka laserowa (ze sterownikiem)</td><td>Electro-Optical Products Corp.&nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Rozwiązania informacji wizualnej</td> Neutrawidyna<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td>Szkiełko mikroskopowe <td>o grubości 22X30-1,5</td><td>0,16-0,19 mm</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka</td><td>ze złotą pieczęcią&nbsp;</td><td>30103X1</td><td>Grubość 0,93-1,05 mm</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem&nbsp;</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N Cy3-DNA</td><td></td></tr><tr><td>oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>5'-Cy3/GCCTCCTGCCGTCGCCA-3'Bio</td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-streptawidyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Zestaw do koniugacji przeciwciał</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół optyczny</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>Seria RS4000</td></tr><tr><td>Obiektyw 60X</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X</td><td></td><td>Olympus PlanApo 100X/1.45 Oil &infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Pochodzenie</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FLAG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>Fosfokinaza kreatynowa z mięśni królika</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>Sól di(tris) fosfokreatyny</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-Ditiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime; -tetraoctowy</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>Kwas protokatechowy&nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>Protokatechuniano-3,4-dioksygenaza&nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>Ortokrzemian tetrametylu</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy</td></tr><tr><td>szerokopasmowe lustra dielektryczne o średnicy 1" z mocowaniami</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>Ilość: 2</td></tr> <tr><td>i frac12; &rdquo; średnica słupków</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR4</td><td>ilość &ge; 6</td></tr><tr><td>ekspander wiązki 10X</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>Obiektyw BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>o średnicy 2" f = 300 mm z mocowaniem</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LA1256-A, soczewka TIR LMR2</td><td></td></tr><tr><td>Cel wyrównania fluorescencyjnego&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td></td><td></td>VRC2SM1</tr><tr><td>Laserowe gogle ochronne</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>Filtr(y) <td>ND LG3</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>Profilometr wiązki optycznej</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Przysłona irysowa montowana na słupku</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ID25</td><td>Ilość: 2</td></tr><tr><td>Interferometr ścinający</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>Etap translacji <td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ, &frac12; &rdquo; podróże&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Laser World</td><td>Star Technologies&nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm, 30 mW</td></tr></tbody></table>

obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (fiona)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA) jest prostą, ale użyteczną techniką lokalizacji pojedynczych fluoroforów z nanometrową precyzją w płaszczyźnie x-y. Poniżej przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz pokrótce opisano przykłady badań, które zostały przeprowadzone przy użyciu FIONA. W pierwszej kolejności opisano, jak skonfigurować sprzęt wymagany do eksperymentów FIONA, tj. mikroskopię fluorescencyjną z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), ze szczegółami dotyczącymi ustawiania optyki. Następnie, jak przeprowadzić prosty eksperyment FIONA polegający na lokalizacji unieruchomionych pojedynczych cząsteczek Cy3-DNA przy użyciu odpowiednich protokołów, a następnie użycie FIONA do pomiaru rozmiaru kroku 36 nm pojedynczego skróconego silnika Va miozyny oznaczonego kropką kwantową. Na koniec doniesiono o niedawnych wysiłkach zmierzających do rozszerzenia stosowania FIONA na grube próbki. Wykazano, że przy użyciu obiektywu zanurzonego w wodzie i kropek kwantowych nasączonych głęboko w zol-żelach i rogówkach w kształcie oka królika (>200 μm) można osiągnąć precyzję lokalizacji 2-3 nm.

Typowy układ TIRFM z zastosowaniem obiektywu przedstawiono na Rysunku 3. W pierwszej kolejności wykonano obraz próbki Cy3-DNA unieruchomionej na powierzchni. Typowy obraz przedstawiono na Rysunku 4a. Obraz został wykonany przy czasie ekspozycji 0,5 s, z wzmocnieniem EM = 50 oraz czułością CCD = 12,13 dla kamery. Funkcję rozproszenia punktu (PSF) pojedynczej cząsteczki Cy3-DNA przedstawiono na Rysunku 4b (dla punktu wskazanego strzałką na Rysunku 4a), gdz...

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością do jednego nanometra lub eksperymenty Fiona. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie wymaganego sprzętu i ustawienie optyki pod kątem całkowitego odbicia wewnętrznego, fluorescencji, mikroskopii lub murawy. Kolejnym krokiem jest unieruchomienie CY 3D NA na wewnętrznej powierzchni komory próbki i zlokalizowanie pojedynczych cząsteczek CY 3D NA z nanometrową precyzją.Następnie Fiona jest stosowana do badania ruchu pojedynczej, skróconej miozyny pięciu silników oznaczonych kropką kwantową. Ostatecznie, rozmiar kroku miozyny podczas chodzenia, Acton został zmierzony jako 36 nanometrów za pomocą analizy Fiona. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w silniki molekularne, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak śledzenie receptorów na błonie komórkowej.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ szczegóły eksperymentu są trudne do nauczenia. Ważne jest, aby nosić laserowe okulary ochronne przez cały czas podczas konfiguracji. Do całkowitego wewnętrznego odbicia, fluorescencji, mikroskopii lub murawy.Aby rozpocząć, ustaw wysokości wszystkich elementów optycznych na wysokość środka mikroskopu, tylnego portu, zamontuj laser, migawkę laserową i filtry ND. Użyj filtrów ND, aby jak najniżej zmniejszyć moc lasera, zachowując jednocześnie widoczność wiązki. Dokręć odpowiednimi kluczami imbusowymi.Zaplanuj ścieżkę wiązki, jak pokazano za pomocą przerywanych niebieskich linii. Na tym schemacie zaznacz ścieżkę wiązki taśmą lub markerem na stole optycznym. Umieść lustro M1 na pierwszym zakręcie pod kątem prostym, umieść dwie tęczówki wzdłuż drugiego prostego odcinka planowanej ścieżki belki.Dostosuj zarówno pozycję, jak i nachylenie M1 tak, aby laser przechodził przez irysy, umieść lustro M dwa. Przy drugim skręcie pod kątem prostym umieść ekspander wiązki 10 x wzdłuż trzeciego prostego odcinka ścieżki. Dostosuj jego nachylenie tak, aby ekspander wiązki był równoległy zarówno do stołu optycznego, jak i planowanej ścieżki wiązki.Następnym krokiem jest iteracyjna regulacja M1 i M dwa tak, aby laser przechodził prosto przez środki obu soczewek, L jednej i L 2 ekspandera wiązki. Użyj kawałka białego papieru, aby zablokować belkę za ekspanderem wiązki, aby sprawdzić profil belki na oko. Wyreguluj, aż profil belki rozszerzonej belki nie będzie objęty ED.Gaussian dostosuj odległość między L jeden i L 2 tak, aby wiązka była łączona migawką. Laser odkręca obiektyw mikroskopu i wkręca ustawienie fluorescencyjne. Zwierciadła miejsca docelowego M trzy i M cztery, aby skierować rozszerzoną wiązkę do portu mikroskopu i na zwierciadło dichroiczne.Wewnątrz wieży. Ustaw M trzy, aby wyśrodkować najjaśniejszą część wiązki na celu fluorescencyjnym i M cztery, aby przechylić wiązkę w pionie, wyłącz laser i przykręć obiektyw z powrotem. Grzywna. Dostosuj nachylenie M three i M four, aby zoptymalizować moc lasera i profil wiązki poza obiektywem.Zamontuj kamerę E-M-C-C-D do mikroskopu i podłącz aparat do komputera. Uruchom oprogramowanie aparatu. Zamontuj próbkę fluorescencyjną na mikroskopie.Spójrz na jasną fluorescencyjną plamkę na aparacie. Sprawdź, czy miejsce nie przesuwa się na ekranie wraz ze zmianą ostrości. Umieść soczewkę TIR na stoliku translacyjnym XY, Z w odległości od tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu, która jest równa ogniskowej, L trzy, czyli około 30 centymetrów.Dostosuj położenie L trzy tak, aby laser przechodził przez środek soczewki. Przesuń L trzy wzdłuż ścieżki belki, aby dostosować sortowanie wiązki. Upewnij się, że wiązka jest nadal wyśrodkowana na monitorze i ma symetryczny kształt.Przesuń L trzy prostopadle do ścieżki wiązki, aby odchylić wiązkę od celu. Kontynuuj tłumaczenie soczewki TIR tak, aby TIR został osiągnięty przed wykonaniem Fiony. Eksperyment z lokalizacją i mobilizacją CY 3D NA. Pojedyncze cząsteczki budują komory na próbki, jak opisano w tekście protokołu.Dwa paski taśmy dwustronnej nakłada się na szkiełko wzdłuż długich krawędzi, pozostawiając odstęp od trzech do pięciu milimetrów pośrodku, a następnie na szkiełku umieszcza się oczyszczone szkiełko nakrywkowe, pokazane są boczne widoki komory z prawej i z przodu. Otwarte końce komory pozostają otwarte i służą jako wlot i wylot do unieruchamiania SI 3D NA na wewnętrznych powierzchniach komory próbki. Odpipetować 10 mikrolitrów biotyny BSA do komory.Poczekaj pięć minut. Umyć komorę na próbkę, pipetując 40 mikrolitrów T 50 BSA do komory. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów neut travain do komory i inkubować przez pięć minut.Ponownie umyć komorę 40 mikrolitrami pipety T 50 BSA, 20 mikrolitrami SI 3D NA do komory na próbkę i inkubować przez pięć minut. Na koniec umyj komorę 80 mikrolitrami T 50 BSA. Aby rozpocząć procedurę obrazowania pojedynczych cząsteczek SI 3D NA pod murawą M, należy pobrać pipetę z 30 mikrolitrów buforu obrazującego do komory próbki i odczekać od ośmiu do 10 minut.Zamontuj próbkę do obrazowania na mikroskopie murawy, który jest wyposażony w zielony laser, obiektyw zanurzeniowy 100 X i kamerę E-M-C-C-D. Ustaw czas ekspozycji i wzmocnienie EM. Uzyskaj film z próbką dla 1000 klatek.Skompiluj i uruchom Fiona Pro do analizy Fiona. Użyj tego programu IDL, aby zaimportować uzyskany obraz, wprowadzić efektywny rozmiar piksela i współczynnik konwersji z intensywności na liczbę fotonów oraz wybrać miejsca do analizy Fiona. Na koniec program wyświetli wyniki dopasowania z funkcjami Gaussa 2D, a także całkowitą liczbą fotonów i precyzją lokalizacji, skompiluje i uruchomi zliczanie pH pro.Aby scharakteryzować liczbę fotonów, użyj tego programu DL do pomiaru średniej liczby fotonów emitowanych przez florę. Cztery przed wybielaniem zdjęć, aby zaimportować uzyskany obraz i wprowadzić współczynnik konwersji z intensywności na liczbę fotonów. Program wykryje plamki fluorescencyjne, automatycznie obliczy liczbę fotonów w funkcji numeru klatki i wyśle ślady liczby fotonów.Przygotuj próbkę do tego eksperymentu, pipetując 20 mikrolitrów biotynylowanego BSA w ilości jednego miligrama na mililitr w DD H2O do komory na próbkę. Inkubować przez 10 minut. Spłukać 30 mikrolitrami D ddh, dwiema pipetami O w 0,5 miligrama na mililitr trawy neut i inkubować przez dwie minuty.Umyj komorę 30 mikrolitrami M five PSA. Akton do tego eksperymentu musi być przygotowany w dniu poprzednim, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Rozcieńczyć przygotowaną f aktynę 25 razy ogólnie, bufor aktynowy do końcowego stężenia około 0,004 miligrama na mililitr.Odpipetuj roztwór aktyny do komory i odczekaj 10 minut. Przepłukać komorę 30 mikrolitrami buforu, rozcieńczyć miozynę pięć A z znacznikami flagowymi przez 30. Złożyć bufor M 5 do końcowego stężenia 250 nanomolowców.Zmieszaj jeden mikrolitr rozcieńczonej miozyny z jednym mikrolitrem Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Dodaj osiem mikrolitrów M pięć, aby napełnić do 10 mikrolitrów i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Dobrze inkubować przez 10 minut na lodzie.Odpipetować 20 mikrolitrów buforu obrazującego zawierającego miozynę Q dot do komory próbki. Inkubować przez osiem do 10 minut. Zobrazuj próbkę pod mikroskopem murawy przy ekspozycji 30 milisekund.Uzyskaj co najmniej 1000 klatek, aby rozpocząć analizę danych. Otwórz plik wideo na obrazie J i przytnij wideo wokół ruchomego miejsca. Śledź miejsce w filmie, aby wygenerować współrzędne X i Y w czasie w pikselach, stosując analizę Fiona do każdej klatki wideo.Konwertuj piksele na nanometry zgodnie z opisem w tekście protokołu. Obliczać przemieszczenie od pozycji początkowej w funkcji czasu. Przeprowadź test T na przemieszczeniu, aby uzyskać kroki chodzenia miozyny.Usuń wszystkie wartości zerowe z kolumny rozmiaru kroku. Wykreśl rozkład rozmiarów kroków za pomocą punktu początkowego lub matlaba. Dopasuj gaussa do histogramu.Na tym typowym obrazie powierzchni unieruchamia się SI 3D NA. Żółta strzałka wskazuje pojedynczą cząsteczkę SI 3D NA, której funkcja rozrzutu punktowego lub PSF jest pokazana tutaj. PSF jest wyposażony w dwuwymiarową funkcję Gaussa, a także pokazane są reszty dopasowania. Ten wykres jest typowym śladem liczby fotonów w funkcji liczby ramek, a dopasowanie wykładnicze daje średnią liczbę fotonów około 1,4 razy 10 do szóstego, aby zmierzyć rozmiar kroku miozyny plik wideo z dobrym sygnałem do szumu pojedynczej miozyny.Podczas spaceru wychwytywane jest włókno aktynowe. Pokazane są trzy przykładowe ramki. Zastosowanie Fiony do każdej klatki daje ślad odległości w funkcji czasu narysowany na czerwono.Algorytm znajdowania kroków oparty na teście T jest używany do wyodrębniania poszczególnych kroków, a dane wyjściowe są nakładane na kolor biały; Rozmiary kroków, a nanometry są oznaczone na biało. Gdy kroki z wielu ścieżek są łączone w histogramie, zmierzone rozmiary kroków mają rozkład Gaussa około 35,8 plus minus 0,4 nanometra. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty Fiona, w tym ustawiać mikroskop murawy Aby osiągnąć najlepsze wyniki Dzięki tym procedurom ważne jest, aby zminimalizować uszkodzenia fotograficzne spowodowane użyciem siły podłogi i eksperymentami.Nie zapominaj, że praca z mikroskopią murawy i Fioną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy nosić środki ostrożności, takie jak okulary ochronne.

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, nanocząstki te mają rozmiar zbliżony do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczych cząsteczek, stabilności przeciwko fotodegradacji oraz odporności na nieswoiste wiązanie z białkami i komórkami.

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Poznaj technikę FIONA do lokalizacji pojedynczych fluoroforów z dokładnością nanometryczną. Metoda pozwala badać dynamikę silników molekularnych, takich jak miozyna, i ma szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Przeglądaj więcej filmów