Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością do jednego nanometra lub eksperymenty Fiona. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie wymaganego sprzętu i ustawienie optyki pod kątem całkowitego odbicia wewnętrznego, fluorescencji, mikroskopii lub murawy. Kolejnym krokiem jest unieruchomienie CY 3D NA na wewnętrznej powierzchni komory próbki i zlokalizowanie pojedynczych cząsteczek CY 3D NA z nanometrową precyzją.

Następnie Fiona jest stosowana do badania ruchu pojedynczej, skróconej miozyny pięciu silników oznaczonych kropką kwantową. Ostatecznie, rozmiar kroku miozyny podczas chodzenia, Acton został zmierzony jako 36 nanometrów za pomocą analizy Fiona. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w silniki molekularne, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak śledzenie receptorów na błonie komórkowej.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ szczegóły eksperymentu są trudne do nauczenia. Ważne jest, aby nosić laserowe okulary ochronne przez cały czas podczas konfiguracji. Do całkowitego wewnętrznego odbicia, fluorescencji, mikroskopii lub murawy.

Aby rozpocząć, ustaw wysokości wszystkich elementów optycznych na wysokość środka mikroskopu, tylnego portu, zamontuj laser, migawkę laserową i filtry ND. Użyj filtrów ND, aby jak najniżej zmniejszyć moc lasera, zachowując jednocześnie widoczność wiązki. Dokręć odpowiednimi kluczami imbusowymi.

Zaplanuj ścieżkę wiązki, jak pokazano za pomocą przerywanych niebieskich linii. Na tym schemacie zaznacz ścieżkę wiązki taśmą lub markerem na stole optycznym. Umieść lustro M1 na pierwszym zakręcie pod kątem prostym, umieść dwie tęczówki wzdłuż drugiego prostego odcinka planowanej ścieżki belki.

Dostosuj zarówno pozycję, jak i nachylenie M1 tak, aby laser przechodził przez irysy, umieść lustro M dwa. Przy drugim skręcie pod kątem prostym umieść ekspander wiązki 10 x wzdłuż trzeciego prostego odcinka ścieżki. Dostosuj jego nachylenie tak, aby ekspander wiązki był równoległy zarówno do stołu optycznego, jak i planowanej ścieżki wiązki.

Następnym krokiem jest iteracyjna regulacja M1 i M dwa tak, aby laser przechodził prosto przez środki obu soczewek, L jednej i L 2 ekspandera wiązki. Użyj kawałka białego papieru, aby zablokować belkę za ekspanderem wiązki, aby sprawdzić profil belki na oko. Wyreguluj, aż profil belki rozszerzonej belki nie będzie objęty ED.

Gaussian dostosuj odległość między L jeden i L 2 tak, aby wiązka była łączona migawką. Laser odkręca obiektyw mikroskopu i wkręca ustawienie fluorescencyjne. Zwierciadła miejsca docelowego M trzy i M cztery, aby skierować rozszerzoną wiązkę do portu mikroskopu i na zwierciadło dichroiczne.

Wewnątrz wieży. Ustaw M trzy, aby wyśrodkować najjaśniejszą część wiązki na celu fluorescencyjnym i M cztery, aby przechylić wiązkę w pionie, wyłącz laser i przykręć obiektyw z powrotem. Grzywna. Dostosuj nachylenie M three i M four, aby zoptymalizować moc lasera i profil wiązki poza obiektywem.

Zamontuj kamerę E-M-C-C-D do mikroskopu i podłącz aparat do komputera. Uruchom oprogramowanie aparatu. Zamontuj próbkę fluorescencyjną na mikroskopie.

Spójrz na jasną fluorescencyjną plamkę na aparacie. Sprawdź, czy miejsce nie przesuwa się na ekranie wraz ze zmianą ostrości. Umieść soczewkę TIR na stoliku translacyjnym XY, Z w odległości od tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu, która jest równa ogniskowej, L trzy, czyli około 30 centymetrów.

Dostosuj położenie L trzy tak, aby laser przechodził przez środek soczewki. Przesuń L trzy wzdłuż ścieżki belki, aby dostosować sortowanie wiązki. Upewnij się, że wiązka jest nadal wyśrodkowana na monitorze i ma symetryczny kształt.

Przesuń L trzy prostopadle do ścieżki wiązki, aby odchylić wiązkę od celu. Kontynuuj tłumaczenie soczewki TIR tak, aby TIR został osiągnięty przed wykonaniem Fiony. Eksperyment z lokalizacją i mobilizacją CY 3D NA. Pojedyncze cząsteczki budują komory na próbki, jak opisano w tekście protokołu.

Dwa paski taśmy dwustronnej nakłada się na szkiełko wzdłuż długich krawędzi, pozostawiając odstęp od trzech do pięciu milimetrów pośrodku, a następnie na szkiełku umieszcza się oczyszczone szkiełko nakrywkowe, pokazane są boczne widoki komory z prawej i z przodu. Otwarte końce komory pozostają otwarte i służą jako wlot i wylot do unieruchamiania SI 3D NA na wewnętrznych powierzchniach komory próbki. Odpipetować 10 mikrolitrów biotyny BSA do komory.

Poczekaj pięć minut. Umyć komorę na próbkę, pipetując 40 mikrolitrów T 50 BSA do komory. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów neut travain do komory i inkubować przez pięć minut.

Ponownie umyć komorę 40 mikrolitrami pipety T 50 BSA, 20 mikrolitrami SI 3D NA do komory na próbkę i inkubować przez pięć minut. Na koniec umyj komorę 80 mikrolitrami T 50 BSA. Aby rozpocząć procedurę obrazowania pojedynczych cząsteczek SI 3D NA pod murawą M, należy pobrać pipetę z 30 mikrolitrów buforu obrazującego do komory próbki i odczekać od ośmiu do 10 minut.

Zamontuj próbkę do obrazowania na mikroskopie murawy, który jest wyposażony w zielony laser, obiektyw zanurzeniowy 100 X i kamerę E-M-C-C-D. Ustaw czas ekspozycji i wzmocnienie EM. Uzyskaj film z próbką dla 1000 klatek.

Skompiluj i uruchom Fiona Pro do analizy Fiona. Użyj tego programu IDL, aby zaimportować uzyskany obraz, wprowadzić efektywny rozmiar piksela i współczynnik konwersji z intensywności na liczbę fotonów oraz wybrać miejsca do analizy Fiona. Na koniec program wyświetli wyniki dopasowania z funkcjami Gaussa 2D, a także całkowitą liczbą fotonów i precyzją lokalizacji, skompiluje i uruchomi zliczanie pH pro.

Aby scharakteryzować liczbę fotonów, użyj tego programu DL do pomiaru średniej liczby fotonów emitowanych przez florę. Cztery przed wybielaniem zdjęć, aby zaimportować uzyskany obraz i wprowadzić współczynnik konwersji z intensywności na liczbę fotonów. Program wykryje plamki fluorescencyjne, automatycznie obliczy liczbę fotonów w funkcji numeru klatki i wyśle ślady liczby fotonów.

Przygotuj próbkę do tego eksperymentu, pipetując 20 mikrolitrów biotynylowanego BSA w ilości jednego miligrama na mililitr w DD H2O do komory na próbkę. Inkubować przez 10 minut. Spłukać 30 mikrolitrami D ddh, dwiema pipetami O w 0,5 miligrama na mililitr trawy neut i inkubować przez dwie minuty.

Umyj komorę 30 mikrolitrami M five PSA. Akton do tego eksperymentu musi być przygotowany w dniu poprzednim, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Rozcieńczyć przygotowaną f aktynę 25 razy ogólnie, bufor aktynowy do końcowego stężenia około 0,004 miligrama na mililitr.

Odpipetuj roztwór aktyny do komory i odczekaj 10 minut. Przepłukać komorę 30 mikrolitrami buforu, rozcieńczyć miozynę pięć A z znacznikami flagowymi przez 30. Złożyć bufor M 5 do końcowego stężenia 250 nanomolowców.

Zmieszaj jeden mikrolitr rozcieńczonej miozyny z jednym mikrolitrem Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Dodaj osiem mikrolitrów M pięć, aby napełnić do 10 mikrolitrów i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Dobrze inkubować przez 10 minut na lodzie.

Odpipetować 20 mikrolitrów buforu obrazującego zawierającego miozynę Q dot do komory próbki. Inkubować przez osiem do 10 minut. Zobrazuj próbkę pod mikroskopem murawy przy ekspozycji 30 milisekund.

Uzyskaj co najmniej 1000 klatek, aby rozpocząć analizę danych. Otwórz plik wideo na obrazie J i przytnij wideo wokół ruchomego miejsca. Śledź miejsce w filmie, aby wygenerować współrzędne X i Y w czasie w pikselach, stosując analizę Fiona do każdej klatki wideo.

Konwertuj piksele na nanometry zgodnie z opisem w tekście protokołu. Obliczać przemieszczenie od pozycji początkowej w funkcji czasu. Przeprowadź test T na przemieszczeniu, aby uzyskać kroki chodzenia miozyny.

Usuń wszystkie wartości zerowe z kolumny rozmiaru kroku. Wykreśl rozkład rozmiarów kroków za pomocą punktu początkowego lub matlaba. Dopasuj gaussa do histogramu.

Na tym typowym obrazie powierzchni unieruchamia się SI 3D NA. Żółta strzałka wskazuje pojedynczą cząsteczkę SI 3D NA, której funkcja rozrzutu punktowego lub PSF jest pokazana tutaj. PSF jest wyposażony w dwuwymiarową funkcję Gaussa, a także pokazane są reszty dopasowania. Ten wykres jest typowym śladem liczby fotonów w funkcji liczby ramek, a dopasowanie wykładnicze daje średnią liczbę fotonów około 1,4 razy 10 do szóstego, aby zmierzyć rozmiar kroku miozyny plik wideo z dobrym sygnałem do szumu pojedynczej miozyny.

Podczas spaceru wychwytywane jest włókno aktynowe. Pokazane są trzy przykładowe ramki. Zastosowanie Fiony do każdej klatki daje ślad odległości w funkcji czasu narysowany na czerwono.

Algorytm znajdowania kroków oparty na teście T jest używany do wyodrębniania poszczególnych kroków, a dane wyjściowe są nakładane na kolor biały; Rozmiary kroków, a nanometry są oznaczone na biało. Gdy kroki z wielu ścieżek są łączone w histogramie, zmierzone rozmiary kroków mają rozkład Gaussa około 35,8 plus minus 0,4 nanometra. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty Fiona, w tym ustawiać mikroskop murawy Aby osiągnąć najlepsze wyniki Dzięki tym procedurom ważne jest, aby zminimalizować uszkodzenia fotograficzne spowodowane użyciem siły podłogi i eksperymentami.

Nie zapominaj, że praca z mikroskopią murawy i Fioną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy nosić środki ostrożności, takie jak okulary ochronne.