Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

W tym filmie pokażemy, jak przygotować i scharakteryzować biofunkcjonalizowane płaskie wspomagane warstwy lipidowe. Szczegółowo opiszemy również architekturę mikroskopu z całkowitym wewnętrznym odbiciem z możliwością detekcji pojedynczych cząsteczek. Zmierzymy gęstość mocy wzbudzenia, płynność oraz gęstość białek w warstwie lipidowej.

Zacznijmy od krótkiego wstępu do płaskich lipidowych dwuwarstw wspieranych na szkle. Gdy małe pęcherzyki jednowarstwowe napotykają czystą powierzchnię szkła, pękają i rozprzestrzeniają się, tworząc ciągłą lipidową dwuwarstwę. Jako materiał do poduszki wodnej zazwyczaj wybieramy PALM.

Oleofosfocholina, czyli POPC, jest dominującym lipidem, ponieważ tworzy płynne dwuwarstwy lipidowe w temperaturze pokojowej oraz 37 °C. W celu funkcjonalizacji dodajemy nikiel antiox, syntetyczny lipid z głową chelatującą nikiel, która wiąże białka z poli-histydynowym znacznikiem. Przykładami są m.in. cząsteczka kostymulująca B7-1, cząsteczka adhezyjna ICAM-1 oraz znakowany fluorescencyjnie peptyd w cząsteczce MHC do rozpoznawania przez limfocyty T, jak pokazano tutaj; jednak ten system dwuwarstwowy może w zasadzie służyć do badania całkowicie innych procesów w różnych układach biologicznych.

Ze względu na charakter układu planarnego, zdarzenia fluorescencyjne można monitorować w trybie całkowitego wewnętrznego odbicia, co znacząco redukuje tło komórkowe i bardzo dobrze nadaje się do mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek. Do przygotowania lipidów potrzebne są lipidy POPC i nikiel w chloroformie oraz czysta kolba okrągłodenna; należy rozpuścić lipidy w odpowiednim stosunku w chloroformie i wysuszyć je pod próżnią, jak pokazano tutaj. Po całonocnej obróbce w wysokiej próżni lipidy tworzą film na wewnętrznej ściance kolby. Do rehydratacji lipidów należy użyć odgazowanego PBS, dodając 10 ml odgazowanego PBS do wysuszonej mieszaniny lipidów.

Nie mieszać. Aby zapobiec utlenianiu lipidów, należy napełnić kolbę gazem obojętnym, takim jak azot lub argon, a następnie zakręcić kolbą. Lipidy utworzą mleczną zawiesinę.

Pobierz niewielką próbkę jako próbę ślepą do spektrofotometru, aby zapobiec wymianie gazowej podczas następnego etapu. Bardzo ważne jest prawidłowe uszczelnienie kolby zawierającej zawiesinę lipidową. Użyj odpornej na temperaturę taśmy klejącej, na przykład taśmy do autoklawowania, aby zapewnić ochronę przed powietrzem podczas formowania fizycznego w zamkniętej kąpieli ultradźwiękowej.

Po zamocowaniu kolby rozpocząć procedurę sonikacji przy maksymalnej mocy 170 W. Sonikować przez 60 minut. Ze względu na procesy fizyczne mętność uległa znacznemu zmniejszeniu.

Można to zweryfikować za pomocą spektrofotometrii przy 550 nanometrach. Jako próbę ślepą należy wykorzystać alikwot pobrany przed sonikacją. Gęstość optyczna przy 230 nanometrach, która wskazuje na ilość lipidów, powinna pozostać stała.

Tutaj napełniamy małe probówki do ultrawirowania jednym mililitrem zawiesiny pęcherzyków i umieszczamy je w rotorze z kątem stałym wirówki stołowej. Bardzo ważne jest, aby do przygotowania dwuwarstwy używać wyłącznie małych pęcherzyków jednowarstwowych. Większe i gęstsze pęcherzyki wielowarstwowe, które również powstają podczas sonikacji, zakłócają płynność dwuwarstwy i muszą zatem zostać odseparowane oraz usunięte poprzez wirowanie.

W pierwszej kolejności wirujemy przez jedną godzinę przy 150 000 G w temperaturze pokojowej. Otrzymany znad następnie wirujemy przez kolejne osiem godzin przy 288 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Płytki szklane muszą być bardzo czyste, aby pęcherzyki lipidowe mogły się na nich rozprzestrzenić, tworząc ciągłą i płynną dwuwarstwę.

W tym celu umieszczamy szkiełka nakrywkowe w teflonowym uchwycie, który następnie wstawiamy do szklanego naczynia. Należy zachować szczególną ostrożność, stosując ochronę oczu, rękawice ochronne oraz fartuch laboratoryjny, a całość prac przeprowadzić w dygestorium. Dodajemy jedną część 30% nadtlenku wodoru, a następnie trzy części stężonego kwasu siarkowego, aby otrzymać bardzo reaktywny i utleniający kwas peromonosiarkowy.

Mieszanina ta gwałtownie reaguje z substancjami organicznymi, w tym z tkankami skóry, oczu i odzieży. Natychmiast ulega ona rozgrzaniu. Inkubować preparaty przez 30 minut.

Chwyć szkiełko nakrywkowe pęsetą. Dokładnie wypłucz kwas z obu stron czystego szkiełka nakrywkowego, używając wody destylowanej lub wysokiej jakości wody dejonizowanej. Następnie umieść szkiełko na stojaku teflonowym i pozostaw do wyschnięcia na nie więcej niż 10 minut, aby móc jednocześnie wytworzyć kilka pojedynczych dwuwarstw lipidowych. Wysuszone szkiełka nakrywkowe przyklejamy za pomocą szybko twardniejącego kleju.

Dwuskładnikowy klej epoksydowy do komory Lab Tech z ośmioma lub szesnastoma dołkami. Najpierw ostrożnie usuń oryginalną szkiełko przedmiotowe z ramki. Wymieszaj dwa składniki kleju w stosunku jeden do jednego.

Równomiernie rozprowadź go w dolnych rowkach ramki komory. Umieść czystą lamellkę na pokrytym klejem dnie ramki komory. Upewnij się, że klej jest równomiernie rozprowadzony między szkiełkiem przedmiotowym a plastikową ramką.

Pozostaw klej do utwardzenia na 30 minut. Rozcieńcz fizyczną zawiesinę lipidową w PBS w stosunku 1:10 i przefiltruj ją przez filtr 0,2 mikrona, a następnie nanieś 120 µL tego rozcieńczenia do każdej studni komory ośmiostudniowej lub 60 µL do każdej studni komory szesnastostudniowej. Upewnij się, że cała szklana powierzchnia jest pokryta i odczekaj 20 minut.

Warstwa dwuwarstwowa została utworzona. Aby usunąć pozostałości, należy przepłukać każdą studzienkę 30 ml PBS. Za wszelką cenę należy unikać wystawienia szklanej powierzchni na działanie powietrza, ponieważ doprowadziłoby to do natychmiastowego zniszczenia dwuwarstwy. Aby zapewnić taką samą objętość buforu w każdej studni przed kolejnym etapem dekoracji białkami, należy całkowicie wypełnić każdą studzienkę i usunąć wypukłość cieczy.

Odbierz 330 µL. W każdym dołku pozostanie około 350 µL. Aby udekorować dwuwarstwę białkami, przygotuj mieszaninę główną zawierającą wybrane białka z polihistydynową etykietą i dodaj 50 µL tej mieszaniny do każdego dołka.

Białka wiążą się z niklową grupą głowy ciemnego lipidu, aby zapewnić powtarzalne wyniki; wymieszać dokładnie, lecz ostrożnie, a następnie zawsze inkubować przez 60 minut w celu usunięcia niezwiązanych białek. Ponownie przemyć 30 ml PBS. Skupmy się teraz na sprzęcie mikroskopowym.

W pierwszej kolejności omówimy wymagania dotyczące mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia w odniesieniu do mikroskopii powierzchniowej opartej na obiektywie. Niezbędny jest obiektyw immersyjny olejowy o wysokiej aperturze numerycznej. Padająca wiązka wzbudzenia lasera jest odbijana przez lustro dichroiczne i skupiana za pomocą zestawu dwóch lub trzech soczewek wyłącznie na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.

Następnie światło lasera prowadzi obiektyw w postaci skupionej wiązki wzdłuż osi optycznej. W ten sposób preparat fluorescencyjny jest oświetlony w całej swojej głębokości. Podczas przemieszczania wiązki prostopadle do osi optycznej, wiązka pozostaje skupiona, lecz opuszcza obiektyw pod kątem.

Kontynuując translację, w pewnym momencie osiągną Państwo kąt krytyczny, przy którym wiązka ulega całkowitemu odbiciu na granicy między szkiełkiem podstawowym a preparatem. Natężenie powstałej fali ewanescentnej zanika wykładniczo, a pobudzeniu ulegają jedynie poziomy podłogi, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie granicy, do zasięgu kilku stu nanometrów. Teraz zaprezentujemy, jak ręcznie skupić wiązkę lasera w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.

Przy użyciu trzech lub dwóch soczewek, pierwsze dwie soczewki służą do zwiększenia średnicy wiązki lasera. Stosunek ich ogniskowych określa wielkość plamki oświetlenia w płaszczyźnie preparatu. Aby zapewnić kolimację wiązki, należy dostosować odległość między tymi soczewkami tak, aby była ona równa sumie obu ogniskowych.

Trzecia soczewka służy do skupienia poszerzonej wiązki w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Ponieważ ogniskowa tej soczewki musi być dostosowana do wymiarów korpusu mikroskopu oraz powiązanego z nim peryskopu, w naszym przypadku musi być ona znacznie dłuższa i wynosi 75 cm z pewną zmiennością. Odległość między drugą a trzecią soczewką nie ma wpływu na właściwości wiązki.

Zatem nieskończona przestrzeń pomiędzy nimi może zostać wykorzystana do modyfikowania wiązki w określony sposób, bez wprowadzania zniekształceń. Można na przykład wstawić aperturę i precyzyjnie rzutować obraz na płaszczyznę preparatu. W istocie, ten sam efekt można osiągnąć przy użyciu dwóch soczewek zamiast trzech.

System dwusoczewkowy jest mniej zdefiniowany, ale wprowadza mniej aberracji soczewkowych. Proste elementy, takie jak przysłona, wciąż mogą być bardzo skutecznie wykorzystywane do modulacji czasowej. Laser gazowy, żelazowy lub półprzewodnikowy powinien zostać umieszczony przed migawką o czasie reakcji w zakresie milisekund, na przykład przed migawką mechaniczną lub optycznym modulatorem światła.

Dobrą alternatywą jest laser diodowy, który może być modulowany elektronicznie i nie wymaga zewnętrznej migawki. Dwa lustra wystarczają, aby skierować wiązkę w dowolne miejsce i w dowolnym kierunku. Jak omówiono wcześniej, dwie soczewki służą do rozszerzenia wiązki i skupienia jej na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu mikroskopu.

Możemy przemieścić wiązkę w celu konfiguracji turf, przesuwając dolne lustro peryskopu na szynie optycznej. Do detekcji obrazu używamy wysokoczułej kamery, na przykład urządzenia CCD z mnożeniem elektronów (em CCD). Do toru wiązki można wprowadzić i dopasować drugą wiązkę laserową o innej długości fali.

Z wykorzystaniem luster i nakładki dichroicznej. W celu jednoczesnej detekcji dwóch kolorów, w torze emisji umieszczamy dostępny komercyjnie dzielnik wiązki. W przypadku przeprowadzania eksperymentów bardzo przydatne jest zastosowanie dwóch niezależnych torów wiązki wzbudzenia.

Na przykład jeden do obrazowania szerokopolowego (turf imaging), a drugi do ukierunkowanego fotobleachingu lub aktywacji. Można to łatwo osiągnąć poprzez zastosowanie zestawu dwóch dzielników wiązki 50:50. Jak pokazano na naszej ilustracji, dwa różne systemy regulacji soczewek i luster pozwolą na uzyskanie dwóch oddzielnych profili i kątów wiązki.

Na przykład, szerszy otwór do obrazowania w strefie turf oraz bardziej skupiony do wybielania lub aktywacji poza strefą turf. W wiązce poza strefą turf można umieścić przysłonę, aby precyzyjnie ukształtować punkt wybielania lub aktywacji. Dwie dodatkowe migawki, po jednej dla każdej ścieżki wiązki, umożliwiają niezależne sterowanie włączaniem wiązki laserowej, pozostawiając obiektyw na prostej, niepochylonej ścieżce.

Włącz miernik mocy i dostrój go do odpowiedniej długości fali lasera. Zmierz moc wiązki laserowej na obiektywie i zapisz wynik. Następnie przesuń lustro znajdujące się za mikroskopem, aby pochylić wiązkę lasera w obiektywie do pozycji roboczej.

Nigdy nie należy patrzeć bezpośrednio w wiązkę lasera. W prawym dolnym rogu widoczny jest profil intensywności lasera wzbudzającego, zwizualizowany poprzez emisję dwuwarstwy znakowanej białkami fluorescencyjnymi. Zastosowano tutaj reprezentację w fałszywych kolorach, aby wyróżnić obszary o różnej intensywności.

Zmierz średnią intensywność tła w obszarze zainteresowania o odpowiednio dużej wielkości. Wartość ta zależy od konkretnych ustawień kamery, takich jak wzmocnienie EM i prędkość odczytu, i będzie musiała zostać odjęta od wszystkich zmierzonych intensywności. Wyznacz średnią intensywność w całym oświetlonym obszarze.

Wybierz średnicę wystarczająco dużą, aby wartości natężenia na obwodzie były zbliżone do pomiaru tła kamery i zmierz średnie natężenie obszaru centralnego. Obszar ten definiuje region zainteresowania, w którym później zostaną przeprowadzone eksperymenty mikroskopowe. Następnie odejmij średnią wartość natężenia tła od natężeń zarówno obszaru wyeliminowanego, jak i centralnego.

Następnie pomnóż intensywności po korekcie tła przez odpowiadającą im liczbę pikseli w obszarze, aby otrzymać intensywności zintegrowane. Przyjmij intensywność zintegrowaną obszaru oświetlonego jako jeden i oblicz ułamek dla obszaru centralnego. Moc zmierzono za pomocą miernika mocy.

W naszym przypadku pięć miliwatów jest wprost proporcjonalne do zintegrowanej intensywności całego oświetlonego obszaru. Pomnóż tę wartość przez ułamek mocy obszaru centralnego, aby określić moc w obrębie tego obszaru. W naszym przykładzie wynosi ona 1,15 miliwata; czynnik konwersji liczby pikseli na mikrometry kwadratowe zależy od rzeczywistego rozmiaru piksela matrycy kamery oraz powiększenia toru emisji.

Można to łatwo określić za pomocą szkiełka mikrometrycznego. W naszym przykładzie obszar centralny odpowiada 170,8 µm². Gęstość mocy to zmierzona moc podzielona przez powierzchnię, zatem wynosi ona 1,15 mW podzielone przez 170,8 µm², czyli 0,007 mW/µm².

Wartość ta wynosi 0,7 kW/cm². Aby określić płynność dwuwarstwy, przeprowadzamy eksperyment fluorescencyjnego odzyskiwania po fotobleachingu (FRAP). Jak pokazano na filmie w lewym dolnym rogu, obrazujemy fluorescencyjną dwuwarstwę przy niskiej gęstości mocy.

Na filmie w prawym dolnym rogu widać odpowiadającą mu komorę techniczną laboratorium w mikroskopie. Następnie wybielamy okrągły obszar za pomocą krótkich impulsów o wysokiej gęstości mocy i monitorujemy regenerację przy niskiej gęstości mocy. Ponownie, montaż zapewnia przegląd eksperymentu dla różnych punktów czasowych, gdzie momentem zerowym są impulsy wybielające.

Obliczamy średnią intensywność fluorescencji z korekcją tła wewnątrz zaznaczonego okręgu i normalizujemy wszystkie zmierzone intensywności do intensywności z początku eksperymentu. Przed impulsami wybielania nanosimy znormalizowane wartości intensywności na wykres w funkcji czasu. Wartość nasycenia reprezentuje w naszym przypadku frakcję mobilną wynoszącą ponad 90%. W pierwszej kolejności należy wykonać obraz dwuwarstwy przy niskiej gęstości mocy wzbudzenia.

Na przykład poprzez zastosowanie filtra gęstości optycznej o logarytmicznej wartości tłumienia równej dwa, moc zostaje zredukowana stukrotnie. Czas ekspozycji powinien pozostać stały przez cały proces i być wystarczający do obrazowania pojedynczej siły płynu przy nieosłabionej gęstości mocy, co w naszym przypadku wynosi 10 milliseconds przy 0.7 kilowatt per square centimeter. Należy użyć reprezentacji w fałszywych kolorach, aby wyróżnić obszary o różnych intensywnościach.

Wybierz jeden obszar zainteresowania, w którym później zostaną przeprowadzone pomiary pojedynczych cząsteczek, oraz jeden obszar o tej samej wielkości. W celu odjęcia tła oblicz zintegrowaną intensywność po odjęciu tła. Następnie usuń filtr gęstości optycznej z drogi wiązki wzbudzenia, wybiel obszar i wykonaj zdjęcie.

Widoczne będą pojedyncze cząsteczki fluoroforu dyfundujące w obszarze wygaszonym. Pojedyncze cząsteczki fluoroforu są ograniczone dyfrakcyjnie, z typową średnicą od dwóch do trzech pikseli; należy wyznaczyć obszar o rozmiarze siedem na siedem pikseli wokół sygnału każdej pojedynczej cząsteczki oraz drugi obszar znajdujący się w pobliżu. W celu odjęcia tła ważne jest ilościowe oznaczenie sygnału wyłącznie pojedynczych cząsteczek fluoroforu.

Dlatego najlepiej jest obrazować białka na warstwie BI przy stosunku białka do białka mniejszym niż jeden lub w przypadku białek specyficznie znakowanych za pomocą SAT. Przy stosunku białka do białka wynoszącym jeden, jak pokazano w naszym przykładzie, należy zmierzyć zintegrowane intensywności dla obu obszarów i odjąć tło od sygnału, aby nie uwzględniać ostatniego zaobserwowanego zdarzenia pokazanego w naszym przykładzie, ponieważ podczas naświetlania prawdopodobnie doszło do blaknięcia. Skorygowane sygnały są tutaj obliczane dla jednej jednostki fluorescencji z czterech, którą obserwujemy w dziewięciu klatkach.

Procedurę tę należy jednak przeprowadzić dla co najmniej kilkuset pojedynczych zdarzeń molekularnych. Wróćmy do oryginalnego obrazu dwuwarstwy zarejestrowanego przy osłabionej gęstości mocy wzbudzenia. Gęstość molekularną wyznacza się poprzez skorygowanie całkowitej intensywności obszaru zainteresowania dla niskiej gęstości mocy wzbudzenia poprzez pomnożenie jej przez sto, a następnie podzielenie przez średnią intensywność pojedynczej cząsteczki oraz powierzchnię.

Mamy do czynienia z gęstością wynoszącą 421,4 Fluor force na mikrometr kwadratowy. W naszym przykładzie, przy stosunku lipidów do białek wynoszącym jeden, odpowiada to tej samej liczbie cząsteczek na mikrometr kwadratowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przygotować i scharakteryzować funkcjonalizowaną białkami dwuwarstwę lipidową przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek.

Ponadto należy zapoznać się z podstawowymi zasadami modyfikacji i ulepszania standardowego mikroskopu do tego celu. Metodologię tę wykorzystamy później do określenia kinetyki wiązania antygenu związanego z dwuwarstwą do receptorów limfocytów T związanych z komórką, jednak możliwe są oczywiście wiele innych zastosowań opartych na tym podejściu.