Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

W tym filmie pokażemy, jak przygotować i scharakteryzować biofunkcjonalizowaną płaską podpartą lipidówkę. Opiszemy również szczegółowo architekturę mikroskopu refleksyjnego z możliwością detekcji pojedynczych cząsteczek. Zmierzymy gęstość mocy wzbudzenia, płynność i gęstość białka lipidu blay.

Zacznijmy od krótkiego wprowadzenia: Do płaskiego szkła podpartego szkłem lipidowym. Kiedy małe pęcherzyki jednoliorne napotykają czystą szklaną powierzchnię, pękają i rozprzestrzeniają się, tworząc ciągłą dwuwarstwę lipidową. Na poduszkę wodną zazwyczaj wybieramy materiał dłoni

Olefosfocholina lub POPC ma dominujący lipid, ponieważ powoduje powstawanie płynnych dwuwarstw lipidowych w temperaturze pokojowej i 37 stopniach Celsjusza. Do funkcjonalizacji dodajemy antiox niklu, syntetyczny lipid z grupą głowy chelatującą nikiel, która wiąże białka znacznika polihistaminy. Na przykład cząsteczka kostymulująca B siedem jeden, cząsteczka adhezyjna ICAM jeden i znakowana fluorescencyjnie cząsteczka MHC obciążona peptydami do rozpoznawania limfocytów T, jak pokazano tutaj, jednak ten dwuwarstwowy system może być w zasadzie stosowany do rozwiązywania zupełnie innych procesów w różnych systemach biologicznych.

Ze względu na charakter układu płaskiego, zdarzenia fluorescencji mogą być monitorowane w trybie całkowitego wewnętrznego odbicia, co znacznie zmniejsza tło komórkowe i bardzo dobrze nadaje się do mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki Do przygotowania lipidów potrzebne są lipidy, POPC i chloroform antyoksyksu niklu, a w czystej kolbie z okrągłym dnem rozpuścić lipidy w pożądanym stosunku i chloroformie i wysuszyć je w próżni, jak pokazano tutaj. Po obróbce próżniowej przez noc lipidy tworzą film po wewnętrznej stronie kolby. W celu nawodnienia lipidów użyj Degas PBS w ilości 10 mililitrów Degas PBS do wysuszonej mieszaniny lipidów.

Nie mieszać. Teraz, aby uniknąć utleniania lipidów, napełnić kolbę gazem obojętnym, takim jak azot lub argon, obrócić kolbę. Lipidy tworzą mleczną zawiesinę.

Pobrać małą próbkę jako ślepą próbę dla spektrofotometru, aby zapobiec wymianie gazowej podczas następnego etapu. Bardzo ważne jest prawidłowe uszczelnienie kolby zawierającej zawiesinę lipidową. Użyj stabilnej termicznie taśmy klejącej, na przykład taśmy autoklawu, która zapewnia ochronę powietrza podczas formowania fizycznego za pomocą dołączonej kąpieli ultradźwiękowej.

Po zamontowaniu kolby należy rozpocząć procedurę sonikacji przy maksymalnej mocy 170 watów. Sonic Cade przez 60 minut. Ze względu na formację fizyczną zmętnienie znacznie spadło.

Można to zweryfikować za pomocą spektrofotometrii o długości 550 nanometrów. Użyć podwielokrotności pobranej przed sonikacją jako ślepej próby. Gęstość optyczna przy 230 nanometrach, która wskazuje na ilość lipidów, powinna pozostać stała.

Tutaj napełniamy małe ultra probówki wirówkowe jednym mililitrowym zawiesiną visl i umieszczamy je w wirniku o stałym kącie ultrawirówki stołowej. Bardzo ważne jest, aby do przygotowania dwuwarstwowego używać tylko małych pęcherzyków uni laina. Większe i bardziej gęste pęcherzyki wielowarstwowe, które również powstają podczas sonikacji, zakłócają płynność dwuwarstwową i dlatego muszą być bladoszałe i usuwane przez wirowanie.

Najpierw wirujemy przez godzinę w temperaturze 150 000 G w temperaturze pokojowej. Otrzymany wyciek jest następnie odwirowywany przez dodatkowe osiem godzin w temperaturze 288 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szklane lampy muszą być bardzo czyste, zanim pęcherzyki lipidowe będą mogły się na nich rozprzestrzenić, tworząc ciągłą i płynną dwuwarstwę.

W tym celu umieszczamy zrazy osłonowe w kopcu teflonowym, które następnie wkładamy do ćwiczenia w szklanym naczyniu. Duża ostrożność tam, gdzie ochrona oczu, rękawice ochronne i fartuch laboratoryjny oraz praca w szafie chemicznej. Dodajemy jedną część 30% nadtlenku wodoru, a następnie trzy części stężonego kwasu siarkowego, aby uzyskać bardzo reaktywny i utleniający kwas perio monosiarkowy.

Ta mieszanina gwałtownie reaguje z substancjami organicznymi, w tym z substancjami skóry, oczu i odzieży. Nagrzewa się natychmiast. Inkubuj szkiełka przez 30 minut.

Chwyć szkiełko nakrywkowe z siłą Dokładnie zmyj kwas po obu stronach czystego szkiełka nakrywkowego za pomocą W destylowanej lub wysokiej jakości wody związkowej. Następnie umieść szkiełko na stojaku teflonowym i pozostaw do wyschnięcia nie dłużej niż 10 minut, aby móc wytworzyć kilka pojedynczych dwuwarstw lipidowych jednocześnie. Przyklejamy wysuszone szkiełka nakrywkowe o szybkim utwardzaniu.

Dwuskładnikowy klej epoksydowy do ośmiodołkowej lub 16-dołkowej laboratoryjnej komory technicznej. Najpierw ostrożnie wyjmij oryginalny szkiełko szklane z ramy. Wymieszaj dwa składniki kleju w stosunku jeden do jednego.

Rozprowadź go równomiernie w dolnych rowkach ramy studzienki. Umieść czystą szkiełko nakrywkowe na pokrytym klejem dnie ramy studzienki. Upewnij się, że klej jest równomiernie rozprowadzony między szkiełkiem a plastikową ramą.

Pozwól klejowi stwardnieć przez 30 minut. Rozcieńczyć fizyczną zawiesinę lipidów w PBS od 1 do 10 i przefiltrować ją przez filtr 0,2 mikrona przy 120 mikrolitrach tego rozcieńczenia do każdej studzienki w komorze ośmiodołkowej lub 60 mikrolitrów do każdej studzienki w komorze 16-dołkowej. Upewnij się, że cała szklana powierzchnia jest pokryta i odczekaj 20 minut.

Dwuwarstwa teraz się uformowała Aby pozbyć się resztek les, spłucz każdą studzienkę 30 mililitrami PBS. Za wszelką cenę unikaj ekspozycji powierzchni szkła na powietrze. To natychmiast zniszczyłoby dwuwarstwę, aby upewnić się, że każda studzienka zawiera taką samą objętość buforu W następnym kroku dekoracji białka całkowicie napełnij każdą studzienkę i usuń płynną kopułę.

Wyjmij 330 mikrolitrów. Pozostawi to około 350 mikrolitrów w każdym. Aby dobrze ozdobić dwuwarstwę białkami, przygotuj główną mieszankę zawierającą wybrane białka polihistaminowe i dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki.

Białka wiążą się z grupą niklu anty głowy ciemnego lipidu, aby zapewnić powtarzalne wyniki, dokładnie wymieszane, ale ostrożnie i zawsze inkubowane przez 60 minut w celu usunięcia niezwiązanych białek. Umyj ponownie 30 mililitrami PBS. Skupmy się teraz na sprzęcie do mikroskopii.

Po pierwsze, zilustrujemy wymagania mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia dla obiektywnej mikroskopii murawy. Potrzebny jest obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze numerycznej. Przychodząca wiązka wzbudzenia lasera jest odbijana przez zwierciadło dichroiczne i skupiana za pomocą zestawu dwóch lub trzech soczewek tylko na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.

Następnie światło lasera prowadzi obiektyw jako powlekaną wiązkę wzdłuż osi optycznej. W ten sposób próbka fluorescencyjna jest oświetlona na całej swojej głębokości. Po przemieszczeniu wiązki prostopadle do osi optycznej, wiązka pozostaje zbiorowa, ale pozostawia obiektyw w sposób pochylony.

Jeśli będziesz kontynuował translokację, w pewnym momencie osiągniesz krytyczny kąt, przy którym wiązka jest całkowicie odbijana na granicy między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a próbką. Intensywność powstałej fali ulotnej zanika wykładniczo i wzbudzane są tylko czwarte piętro, które znajdują się w bliskim sąsiedztwie granicy faz na głębokości do kilkuset nanometrów. Teraz zilustrujemy, jak ręcznie skupić wiązkę laserową na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.

Używając trzech lub dwóch soczewek z pierwszymi dwiema soczewkami, zwiększa się średnica wiązki laserowej. Stosunek ich ogniskowej określa wielkość plamki świetlnej na płaszczyźnie próbki. Aby upewnić się, że wiązka pozostaje zestawiona, dostosuj odległość między tymi soczewkami tak, aby była równa sumie obu ogniskowych.

Trzecia soczewka służy do skupiania poszerzonej wiązki w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Ponieważ ogniskowa tego obiektywu musi być dostosowana do wymiarów korpusu mikroskopu i powiązanego peryskopu, w naszym przypadku musi być znacznie dłuższa, różniąca się o 75 centymetrów. Odległość między soczewką drugą a trzecią nie ma wpływu na właściwości wiązki.

W związku z tym przestrzeń nieskończoności pomiędzy nimi może być wykorzystana do modyfikacji wiązki w określony sposób bez zniekształceń. Na przykład można wstawić otwór i precyzyjnie rzutować na płaszczyznę próbki. Zasadniczo możesz osiągnąć to samo za pomocą dwóch soczewek zamiast trzech.

System dwóch soczewek jest mniej zdefiniowany, ale wprowadza mniej aberracji obiektywu. Proste funkcje, takie jak przysłona, nadal mogą być bardzo dobrze zaimplementowane do modulacji czasowej. Laser gazowy, żelazny lub półprzewodnikowy powinien być umieszczony przed migawką o zasięgu milisekundowym, na przykład migawką mechaniczną lub al-modulatorem optycznym.

Dobrą alternatywą jest laser diodowy, który może być modulowany elektronicznie i nie wymaga zewnętrznego wyłączania. Wystarczą dwa lustra, aby skierować wiązkę w dowolne miejsce i w dowolnym kierunku. Jak wspomniano wcześniej, dwie soczewki służą do poszerzania wiązki i skupiania jej na tylnej płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu. Cel.

Możemy przemieścić wiązkę do konfiguracji murawy, przesuwając dolne zwierciadło peryskopu na szynie optycznej. Do detekcji obrazu używamy bardzo czułej kamery. Na przykład urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotniającym elektrony lub druga wiązka laserowa em CCDA o innej długości fali może być wyrównana ze ścieżką wiązki.

Z wykorzystaniem luster i nakładki dichroicznej. W celu jednoczesnej detekcji dwóch kolorów umieszczamy dostępne na rynku urządzenie do rozdzielania wiązki w ścieżce emisji. W eksperymentach bardzo przydatne jest posiadanie dwóch niezależnych ścieżek wiązki wzbudzenia.

Na przykład jeden do obrazowania murawy, a drugi do celowanego fotowybielania lub aktywacji. Można to łatwo osiągnąć, stosując zestaw 2 50 50 rozdzielaczy wiązki. Jak pokazano na naszej ilustracji, dwa różne systemy regulacji soczewek i lusterek spowodują powstanie dwóch indywidualnych profili wiązki i kątów wiązki.

Na przykład poszerzony do obrazowania na murawie i bardziej skoncentrowany do wybielania lub aktywacji poza murawą. W belce bez murawy można umieścić otwór, aby precyzyjnie ukształtować miejsce wybielania lub aktywacji. Dwie dodatkowe przesłony, po jednej dla każdej ścieżki wiązki Włącz niezależne sterowanie przełącznikiem na wiązce laserowej, pozostawiając obiektyw w prostej, nieprzechylonej ścieżce.

Włącz miernik mocy i dostosuj go do odpowiedniej długości fali lasera. Zmierz moc światła laserowego na celu i zapisz ją. Teraz przenieś lustro za mikroskop, aby przechylić wiązkę lasera na obiektywie do pozycji murawy.

Nigdy nie patrz bezpośrednio w światło lasera. W prawym dolnym rogu widać profil intensywności lasera wzbudzającego uwidoczniony poprzez emisję dwuwarstwy ozdobionej białkami fluorescencyjnymi. W tym miejscu używamy reprezentacji fałszywych kolorów, aby podkreślić obszary o różnej intensywności.

Zmierz średnią intensywność tła w wystarczająco dużym obszarze zainteresowania. Wartość ta zależy od konkretnych ustawień kamery, takich jak wzmocnienie EM i prędkość odczytu, i będzie musiała zostać odjęta od wszystkich zmierzonych intensywności. Określ średnie natężenie w całym oświetlanym obszarze.

Wybierz średnicę na tyle dużą, aby wartości intensywności na obrzeżach były podobne do wartości tła kamery, zmierz średnią intensywność obszaru centralnego. Obszar ten określa obszar zainteresowania, w którym później będą wykonywane eksperymenty mikroskopowe. Teraz odejmij średnią wartość intensywności tła od intensywności zarówno obszaru wyeliminowanego, jak i centralnego.

Następnie pomnóż skorygowane intensywności tła przez odpowiednią liczbę pikseli rozmiaru regionu, aby uzyskać zintegrowane intensywności. Ustaw zintegrowane natężenie oświetlonego obszaru jako jeden i oblicz ułamek dla obszaru centralnego. Moc mierzona miernikiem mocy.

W naszym przypadku pięć miliwatów jest wprost proporcjonalne do zintegrowanego natężenia całego oświetlanego obszaru. Pomnóż tę wartość przez ułamek mocy obszaru centralnego, aby określić moc w obszarze centralnym. W naszym przykładzie, 1,15 miliwata, współczynnik konwersji liczby pikseli na mikrony kwadratowe zależy od rzeczywistego rozmiaru piksela chipa aparatu i powiększenia ścieżki emisji.

Można go łatwo określić za pomocą szkiełka mikrometrycznego. W naszym przykładzie obszar centralny odpowiada 170,8 mikronom kwadratowym. Gęstość mocy odnosi się do zmierzonej mocy podzielonej przez powierzchnię, a zatem wynosi 1,15 miliwata podzielonego przez 170,8 mikrona kwadratowego lub 0,007 miliwata na mikron kwadratowy.

To jest 0,7 kilowata na centymetr kwadratowy. Aby określić płynność dwuwarstwy, przeprowadzamy odzysk fluorescencji po fotowybielaniu eksperymentu z chustą. Jak pokazano na lewym dolnym filmie, obrazujemy dwuwarstwę fluorescencyjną przy niskiej gęstości mocy.

Na prawym dolnym filmie można zobaczyć odpowiednią laboratoryjną komorę techniczną pod mikroskopem. Następnie wybielamy okrągły obszar krótkimi impulsami o wysokiej gęstości mocy i monitorujemy odzysk przy niskiej gęstości mocy. Ponownie, montaż zawiera przegląd eksperymentu dla różnych punktów czasowych, przy czym czas zerowy to impulsy wybielacza.

Określamy ilościowo średnią intensywność fluorescencji skorygowanej o tło w okręgu znacznika i normalizujemy wszystkie zmierzone intensywności do intensywności na początku eksperymentu. Przed impulsami wybielacza wykreślamy znormalizowane wartości intensywności w czasie. Wartość nasycenia reprezentuje frakcję ruchomą w naszym przypadku ponad 90%Najpierw zrób zdjęcie dwuwarstwy przy niskiej gęstości mocy wzbudzenia.

Na przykład umieszczenie filtra gęstości optycznej o logarytmicznej wartości tłumienia wynoszącej dwa zmniejsza moc o współczynnik 100. Czas ekspozycji powinien być stały przez cały czas trwania procedury i wystarczający do zobrazowania siły pojedynczego płynu przy nietłumionej gęstości mocy w naszym przypadku, 10 milisekund przy 0,7 kilowata na centymetr kwadratowy. Użyj reprezentacji fałszywych kolorów, aby wyróżnić obszary o różnej intensywności.

Wybierz jeden obszar zainteresowania, w którym zostaną później wykonane pomiary pojedynczych cząsteczek i jeden region o tej samej wielkości. W przypadku odejmowania tła oblicz zintegrowaną intensywność odjętego tła. Teraz usuń filtr gęstości optycznej ze ścieżki wiązki wzbudzenia, wybiel obszar i zrób zdjęcie.

Zobaczysz, jak indywidualna siła grypy dyfunduje w wybielonym obszarze. Pojedyncza siła grypy jest ograniczona dyfrakcją o typowej średnicy od dwóch do trzech pikseli, weź jeden obszar o wymiarach siedem na siedem pikseli wokół każdego sygnału pojedynczej cząsteczki i drugi obszar w pobliżu. W przypadku odejmowania tła ważne jest, aby określić ilościowo sygnał tylko pojedynczej siły fluoru.

Dlatego najlepiej jest obrazować białka na warstwie BI o stosunku do białka mniejszym niż jeden lub w przypadku białek specyficznie znakowanych SAT. Jeszcze większy stosunek diety do białka jeden, jak pokazano w naszym przykładzie, zmierz zintegrowane intensywności dla obu regionów i odejmij tło od sygnału, aby nie brać ostatniego zaobserwowanego zdarzenia pokazanego w naszym przykładzie, ponieważ bielenie prawdopodobnie wystąpiło podczas średniej ekspozycji. Skorygowane sygnały tutaj, robimy to dla jednej grypy z czterech, które obserwujemy w ciągu dziewięciu klatek.

Procedura ta powinna być jednak wykonywana dla co najmniej kilkuset zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Wróćmy do naszego pierwotnego obrazu dwuwarstwowego obserwowanego przy osłabionej gęstości mocy wzbudzenia. Gęstość cząsteczkową określa się poprzez skorygowanie zintegrowanej intensywności obszaru zainteresowania dla niskiej gęstości mocy wzbudzenia poprzez pomnożenie przez sto i podzielenie przez średnią intensywność pojedynczej cząsteczki i powierzchnię.

Mamy do czynienia z gęstością 421,4 siły fluoru na mikron kwadratowy. W naszym przykładzie, przy stosunku diety do białka wynoszącym jeden, odpowiada to tej samej liczbie cząsteczek na mikron kwadratowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przygotować i scharakteryzować dwuwarstwę lipidową funkcjonalizowaną białkiem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki.

Ponadto należy zapoznać się z podstawowymi zasadami modyfikacji i modernizacji standardowego mikroskopu w tym celu. Później użyjemy tej metodologii do określenia kinetyki wiązania antygenu związanego z dwiema warstwami z receptorami komórek T związanych z komórkami, ale wiele innych zastosowań opartych na tym jest z pewnością wykonalnych.