Name: Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę znakowania immunologicznego z kropkami kwantowymi do wizualizacji lokalizacji białek w tkance serca myszy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Protokół umożliwia badanie funkcji białek na poziomie subkomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 i R01HL152723; Nagroda LSUHSC-S CCDS Finish Line, Nagroda za badania nad COVID-19 i Nagroda za badania LARC dla MSB; LSUHSC-S Stypendium podoktorskie Malcolma Feista w dziedzinie chorób sercowo-naczyniowych i AHA w CSA (20POST35210789); oraz LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship dla RA.

Procedury postępowania ze zwierzętami w tym protokole były zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (wydanie ósme, National Institutes of Health, Bethesda, MD) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Stanowego Luizjany-Shreveport. Do niniejszego badania wykorzystano sześciomiesięczne samce myszy z pochodzeniem FVB/N. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów). Wykorzystane myszy były trzymane w dobrze regulowanym środowisku w klatkach umożliwiających 12-godzinny cykl światła i ciemności, zaopatrzone w wodę i regularną dietę ad libitum i były pod opieką zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Cały proces jest zilustrowany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu. Otwórz klatkę piersiową, wykonując poziome nacięcie w okolicy nad środkową częścią brzucha i ciągnąc za skórę. Ostrożnie wykonaj kolejne nacięcie, aby otworzyć jamę klatki piersiowej bez nakłuwania innych narządów21,22,23.
	<ol>
		<li>Perfuse24 najpierw przez wierzchołek, a następnie przez prawą komorę, używając zimnego 3% aldehydu glutarowego w roztworze kardioplegicznym (50 mM KCl, 5% dekstrozy w PBS, patrz Plik Uzupełniający 1) przez 2 minuty, aby zapewnić całkowite rozluźnienie mięśnia sercowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzjować serce za pomocą lodowatego 3% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,4, krok 2.1.1) przez kolejne 2 minuty. Używając ciśnienia grawitacyjnego, użyj igły 25 G 5/8", aby wprowadzić utrwalacze do serca. Natychmiast po tym, jak serce zacznie wypełniać się utrwalaczem, podnieś wierzchołek serca i przetnij naczynia pod spodem w odległości 1-2 mm od serca, aby zmniejszyć ciśnienie i umożliwić odpływ płynów.</li>
	<li>Rozkrój serce, usuń przedsionki24 i wrzuć komory do lodowatego 3% aldehydu glutarowego/0,1 M kakodylanu sodu na szalce Petriego. Wykonaj cięcie motyla po 30-60 minutach utrwalania i umieść go na szalce Petriego zawierającej 3% aldehydu glutarowego/kakodylanu (patrz tabela materiałów). Posiekaj serce za pomocą ostrza chirurgicznego w małe kostki o wielkości 1 mm3 w roztworze aldehydu glutarowego/kakodylanu.</li>
	<li>Utrwalić/zanurzyć wypreparowaną tkankę serca w roztworze aldehydu glutarowego/kakodylanu na 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanki serca
<ol>
	<li>Po 24 godzinach utrwalania przemyć tkanki w 0,1 M buforu kakodylanu sodu przez 20 minut.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 M bufor kakodylowy, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
		<ol>
			<li>Aby przygotować 0,1 M bufor kakodylanu sodu, należy przygotować zapas z 1 M buforu kakodylanu sodu, rozpuszczając kakodylan sodu (21,4 g) i 1% roztworu chlorku wapnia (3 ml) w 90 ml wody destylowanej. Zwiększ objętość roztworu do 100 ml, dodając wodę destylowaną. Dobrze wymieszaj roztwór i pozostaw na noc, aby rozpuścił substancję rozpuszczoną.</li>
			<li>Następnie weź 10 ml 1 M roztworu podstawowego kakodylanu sodu i dodaj go do 80 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i zwiększ objętość do 100 ml, dodając wodę destylowaną.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć płukanie w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przez kolejne 20 minut. Usunąć tkanki z buforu kakodylanu sodu i zanurzyć je w 2% roztworze tetratlenku osmu na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Ten proces nazywa się osmikacją.
	<ol>
		<li>Przygotuj 2% roztwór tetratlenku osmu, wykonując poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Aby przygotować 2% roztwór tetratlenku osmu, weź 4% roztwór tetratlenku osmu, 4 ml (patrz tabela materiałów), 1 M roztwór podstawowy kakodylanu sodu (0,8 ml) i wodę destylowaną (3,2 ml), aby uzyskać łącznie 8 ml roztworu. 
			UWAGA: Cały ten proces i kolejne kroki należy przeprowadzić w dygestorium.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po osmikacji zanurz tkanki w 2% roztworze octanu sodu na 10 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przygotować 2% roztwór octanu sodu, rozpuszczając 4 g octanu sodu w 20 ml wody destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie zanurz tkanki w 2% roztworze octanu uranylu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przygotować 2% roztwór octanu uranylu, rozpuszczając 4 g octanu uranylu w 20 ml wody destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po barwieniu octanem uranylu należy odwodnić tkanki kolejno za pomocą stopniowanych alkoholi i acetonu w kolejności podanej w pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
3. Osadzanie tkanki serca
<ol>
	<li>Osadź odwodnione tkanki w żywicy epoksydowej o niskiej lepkości, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć żywicę epoksydową o niskiej lepkości, wymieszaj 10,24 ml monomeru epoksydowego dwutlenku cykloheksenu winylu (ERL 4221), 6,74 ml eteru diglicydylowego glikolu polipropylenowego (DER 732) i 30,05 ml bezwodnika nonenylobursztynowego (NSA) (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml. Dobrze mieszać zawiesinę ręcznie przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 18 kropli przyspieszacza epoksydowego 2-dimetyloaminoetanolu (DMAE, patrz tabela materiałów) i wymieszać zawiesinę, aby dokładnie wymieszać składniki.</li>
		<li>Zaimpregnować tkanki żywicą epoksydową w następującej kolejności mieszanki.
		<ol>
			<li>Zastąp 100% aceton żywicą 1:1: zawiesina acetonu i zanurz w niej tkanki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zastąp żywicę: zawiesinę acetonu żywicą 6:1: zawiesinę acetonu i zanurz w niej tkanki na 3 godziny.</li>
			<li>Na koniec zastąp zawiesinę żywicy 6:1 – acetonem 100% zawiesiną żywicy i pozostaw zanurzone w niej tkanki na noc w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść chusteczki w świeżej żywicy w mikroforemkach o średnicy 8 mm (patrz tabela materiałów) i utwardź osadzone tkanki w temperaturze 70 °C przez noc. 
	UWAGA: Upewnij się, że żywica jest twarda, ale nie krucha po utwardzeniu.</li>
</ol>
4. Cięcie tkanek za pomocą ultramikrotomu
<ol>
	<li>Przyciąć bloki żywicy z tkanką do nie większej niż 1 mm przed zamontowaniem na ultramikrotomie (patrz Tabela materiałów). Umieść formę tak precyzyjnie, jak to możliwe, w segmentowym ramieniu ultramikrotomu i ręcznie przesuń formę próbki w kierunku noża diamentowego.</li>
	<li>Wytnij sekcje o grubości 500 nm (pół mikrona) nożem Histo (patrz Tabela materiałów) i za pomocą narzędzia do pętli EM podnieś je i umieść na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Umieść szkiełko podstawowe na gorącym talerzu, aby uzyskać niebieską plamę toluidynową25, aby znaleźć obszar zainteresowania.</li>
	<li>Po znalezieniu obszaru zainteresowania użyj noża Ultra 45° (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać ultracienkie sekcje z jasnego złota (100 nm). Umieść te ultracienkie sekcje po matowej stronie miedzianej siatki o oczkach 200.</li>
</ol>
5. Ultracienkie barwienie sekcji serca
<ol>
	<li>Barwienie należy rozpocząć od zdemaskowania antygenu za pomocą roztworu do wytrawiania, tj. 5% roztworu metaperiodianu sodu.
	<ol>
		<li>Przygotować 500 μl 5% roztworu metaperiodianu sodu (patrz Tabela Materiałów) w wodzie destylowanej. 
		UWAGA: Przed użyciem przygotuj świeży roztwór.</li>
		<li>Umieść 20 μl roztworu metaperiodynianu sodu na czystej folii parafinowej. Umieść całkowicie wysuszone siatki z sekcjami tkanek na kropli roztworu do wytrawiania. 
		UWAGA: Matowa strona siatki z sekcją tkankową musi być skierowana w stronę roztworu do trawienia.</li>
		<li>Pozostaw siatkę sekcji na roztworze na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj wytrawiony fragment tkanki, umieszczając go na kropli wody destylowanej na 60 s.</li>
	<li>Zablokuj resztkowe aldehydy, umieszczając siatki sekcyjne na kropli 0,05 M roztworu glicyny na 10 minut w temperaturze pokojowej. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej, aby usunąć resztki roztworu glicyny.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,05 M roztwór glicyny (patrz Tabela Materiałów) rozpuszczając 3,75 mg glicyny w 1 ml 1x PBS (pH 7,4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić kratki sekcyjne w 10-20 μl roztworu blokującego na 25 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Skład roztworu blokującego: 2 μL 1% normalnej surowicy koziej (NGS) + 20 μL 1% BSA (stężenie końcowe: 10%) + 178 μL 1x PBS (pH 7,4), aby uzyskać końcową objętość 200 μL.</li>
	<li>Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej i umieść część siatki na rozcieńczalniku przeciwciał w celu kondycjonowania w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
	<li>Inkubować skrawki siatki z pierwszorzędowym przeciwciałem (w tym przypadku Sigmar1, patrz Tabela Materiałów; rozcieńczone w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciał) przez 1 godzinę 30 minut w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Osuszyć siatkę i umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować skrawki siatki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (w tym przypadku biotynylowanym kozim poliklonalnym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko królikowi, patrz Tabela materiałów; rozcieńczone w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Osuszyć siatkę i umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować odcinki siatki w dostępnej w handlu QD sprzężonej ze streptawidyną (QD655nm, patrz Tabela materiałów; rozcieńczony w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Zapobiegaj ekspozycji na światło, przykrywając komorę folią aluminiową.</li>
	<li>Osusz krawędzie rusztu za pomocą bibuły filtracyjnej i umyj sekcje siatki, umieszczając je na kropelkach wody na 2 minuty.</li>
	<li>Osusz krawędzie siatki do wyschnięcia.</li>
</ol>
6. Obrazowanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
<ol>
	<li>Umieść ultracienkie sekcje na miedzianych siatkach w uchwycie na kwartet próbek i zaciśnij je w pozycji umożliwiającej wybór siatek w wiązce elektronów.</li>
	<li>Włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu i włącz przełącznik pompy, aby opróżnić goniometr, a następnie całkowicie włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw napięcie na 80 kV przed wygenerowaniem wiązki do obserwacji obrazu.</li>
	<li>Ustaw ostrość na żądanym obszarze, uchwyć obraz za pomocą szybkiego aparatu cyfrowego i zapisz plik w .tif formacie. 
	UWAGA: Ustawienie mikroskopu do uchwycenia obrazu w tym badaniu polegało na przyspieszeniu napięcia lub napięcia wysokiego napięcia 80 kV i powiększeniu 20 000x.</li>
</ol>

<ol><li>Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-resolution+imaging+-+techniques+for+three-dimensional+imaging+of+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures.</a> Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).</li>
<li>de Duve, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+fraction-past+and+present%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue fraction-past and present.</a> The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20(1971).</li>
<li>Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPleskova%2C+S+%22Cellular+and+Molecular+Toxicology+of+Nanoparticles%22">Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles</a>. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).</li>
<li>Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells%2C+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+-+Anatomischer+Anzeiger%22%5BJournal%5D)">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).</li>
<li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples%3A+Large-field+of+view%2C+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).</li>
<li>Deerinck, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+fluorescent+quantum+dots+to+confocal%2C+multiphoton%2C+and+electron+microscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).</li>
<li>Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantum+dots+as+probes+for+correlative+fluorescence%2C+conventional%2C+and+energy-filtered+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307 (5709), 538-544 (2005).</li>
<li>Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-+and+electron+microscopy+using+quantum+dot+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54307(2016).</li>
<li>Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeerinck%2C+TJ+%22Quantum+Dots%3A+Applications+in+Biology%22">Quantum Dots: Applications in Biology</a>. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).</li>
<li>Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).</li>
<li>Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+ligands+provide+new+insights+into+erbB%2FHER+receptor-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).</li>
<li>Pleskova, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+functional+activity+of+human+neutrophilic+granulocytes+in+their+interactions+with+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Morfologiia%22%5BJournal%5D)">Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots.</a> Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).</li>
<li>Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+single+molecule+tracking+reveals+a+wide+range+of+diffusive+motions+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins.</a> Proceedings of SPIE. 7189, (2009).</li>
<li>Hanaki, K. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiconductor+quantum+dot%2Falbumin+complex+is+a+long-life+and+highly+photostable+endosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).</li>
<li>Lim, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLim%2C+YT+%22Selection+of+quantum+dot+wavelengths+for+biomedical+assays+and+imaging%22">Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging</a>. 2, 50-64 (2003).</li>
<li>Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+targeting+and+imaging+with+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).</li>
<li>Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocrystal+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanocrystal targeting in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).</li>
<li>Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+in+ophthalmology%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Quantum dots in ophthalmology: A literature review.</a> Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).</li>
<li>Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigmar1%27s+molecular%2C+cellular%2C+and+biological+functions+in+regulating+cellular+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology.</a> Frontiers in Physiology. 12, 705575(2021).</li>
<li>Bohne, B., Harding, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+B+%22Processing+the+mouse+temporal+bone+for+gross%2C+cellular+and+subcellular+evaluation+poster%22">Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster</a>. , (2004).</li>
<li>Roszkowski, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoszkowski%2C+M+%22The+effects+of+acute+stress+on+Apold1+gene+expression+and+blood-brain+barrier+permeability%22">The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability</a>. , (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-protocol. 11 (5), 3988(2021).</li>
<li>Jones, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+murine+alpha+myosin+heavy+chain+gene+leads+to+dosage+effects+and+functional+deficits+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).</li>
<li>Hunter, E. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+EE+%22Practical+Electron+Microscopy%3A+A+Beginner%27s+Illustrated+Guide%22">Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide</a>. , Cambridge University Press. (1993).</li>
<li>Morris, R. E., Ciraolo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+post-embedding+protocol+for+immunogold+labelling+of+osmium-fixed%2C+epoxy+resin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue.</a> Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).</li>
<li>Brorson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deplasticizing+or+etching+of+epoxy+sections+with+different+concentrations+of+sodium+ethoxide+to+enhance+the+immunogold+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling.</a> Micron. 32 (2), 101-105 (2001).</li>
<li>Lobo, M. V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+Staining+with+Sodium+Metaperiodate+and+Sodium+Borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).</li>
<li>Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiconductor+nanocrystals+as+fluorescent+biological+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels.</a> Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugated+quantum+dots+for+in+vivo+molecular+and+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).</li>
<li>Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical applications of quantum dots.</a> AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu zastosowano znakowanie immunologiczne za pośrednictwem QD, aby wyraźnie pokazać subkomórkową lokalizację Sigmar1. Za pomocą QD przedstawiono lokalizację Sigmar1 na błonie mitochondrialnej, zwłaszcza na wewnętrznej błonie mitochondrialnej, w tkance serca. Ponadto stwierdzono również, że Sigmar1 znajduje się na siateczce sarkoplazmatycznej/endoplazmatycznej (S / ER) i lizosomach na poziomie ultrastrukturalnym, jak pokazano na rysunku 2A-D.
Krytycznym krokiem w tym protokole jest etap trawienia lub demaskowania antygenu przy użyciu wysoce stężonego roztworu metaperiodianu sodu w celu zdemaskowania antygenu po utrwaleniu i osmikacji aldehydu glutarowego. W protokole tym zastosowano pojedynczą kurację metaperiodianem sodu o wysokim stężeniu (5%) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ dłuższy czas trwania lub wyższe stężenie inkubacji metaperiodianu sodu spowoduje agregację struktur, utratę definicji błony dla organelli i spowoduje perforacje w przekroju, co utrudni wizualizację białka lub struktury. Alternatywnie, zamiast 5% metaperiodatu można również zastosować roztwór metaperiodatu o niższym stężeniu (3%) w dwóch etapach przez 30 minut. Badania wykazały, że ta opcja daje podobne wyniki, jak w przypadku 5% roztworu metaperiodatu do jednoetapowej 30-minutowej inkubacji. Jednak 3% roztwór metaperiodatu przez 30 minut inkubacji przez dwa razy zapewnia lepszą kontrolę nad procesem 26,27,28. Początkowo protokół ten wykorzystywał inkubację skrawków z 10% roztworem metaperiodatu przez 30 minut. Jednak ze względu na zbyt wiele perforacji powstałych w sekcji tkankowej przez to stężenie, końcowe stężenie i czas inkubacji roztworu metaperiodatu zostały zmniejszone i zoptymalizowane do 5% przez 30 minut.
Kolejnym krokiem była optymalizacja czasu wiązania aldehydem glutarowym. Nieoptymalne utrwalenie tkanek powoduje nieodpowiednie oznakowanie QD, podczas gdy nadmierne utrwalenie tkanek skutkuje wyższym znakowaniem nieswoistym. W związku z tym należy zwrócić szczególną uwagę na określenie i miareczkowanie optymalnego poziomu utrwalenia tkanek dla prawidłowego i specyficznego znakowania białek. W tej metodzie z wykorzystaniem tkanek serca czas wiązania aldehydem glutarowym miareczkowano przy użyciu 24 h i 48 h jako punktów czasowych. Na podstawie obrazów barwienia odcinków ustalonych dla obu punktów czasowych stwierdzono, że odcinki ustalone na 24 godziny wykazały lepsze wyniki. Do tej pory nanokryształy QD są dostępne w wielu rozmiarach, w tym 525, 565, 585, 605, 655 i 705 nm11,29. Każdy z tych QD ma swoje własne widma emisyjne i emituje fluorescencję na różnych długościach fal. Dodatkowo, te dostępne na rynku QD o różnych rozmiarach mają różne kształty; na przykład QD 525, 565 i 585 są praktycznie kuliste o różnych rozmiarach, podczas gdy QD 605, 655 i 705 mają nieregularny, podłużny kształt. Spośród tych różnych nanokryształów QD, QD 525, 565 i 655 są łatwo odróżnialne od siebie11,29. Te różnice w widmach emisyjnych i kształtach sprawiają, że QD jest doskonałym kandydatem do wielokrotnego znakowania białek i wizualizacji za pomocą fluorescencji i mikroskopii elektronowej. W tym badaniu użyto dostępnego na rynku QD, QD 655, do znakowania białka Sigmar1 w celu odróżnienia go od dowolnego niespecyficznego tła w barwionych sekcjach.
Innym odpowiednikiem QD do znakowania białek w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości jest cząstka immunogold. Cząsteczki immunogold są tradycyjnie używane do znakowania białek do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Te cząsteczki złota mają dużą gęstość elektronów i są łatwe do zidentyfikowania w porównaniu z nanokryształami QD. Jednak QD wykazuje lepszą skuteczność dzięki lepszej penetracji w tkankach, wyższej stabilności i trwałości oraz lepszej retencji składników ultrastrukturalnych, co czyni je lepszym kandydatem do znakowania białek 4,5. QD ma również unikalną zdolność do wykrywania zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej, co zwiększa jego wartość w porównaniu z znakowaniem immunozłotem10.
Jednym z ograniczeń tego znakowania immunologicznego za pośrednictwem QD jest użycie tetratlenku osmu podczas przetwarzania. Tetratlenek osmu jest stosowany do zwiększania gęstości elektronów, przewodności i kontrastu inaczej mniej gęstych elektronów i mniej kontrastowych biologicznych struktur błonowych 5,30. Jednak użycie tetratlenku osmu natychmiast i nieodwracalnie niszczy właściwość próbki do tworzenia fluorescencji po znakowaniu QD6. Ogranicza to zastosowanie QD w mikroskopii fluorescencyjnej. Alternatywne podejście, polegające na pominięciu tetratlenku osmu, będzie korzystne dla zachowania właściwości fluorescencyjnych, a tym samym dla podwójnego zastosowania immunoznakowania za pośrednictwem QD. Niektóre z nowszych modeli TEM mają możliwość dołączenia systemu Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDX), który umożliwia identyfikację składu pierwiastkowego materiałów. Kolejnym ograniczeniem badania jest brak mapowania pierwiastkowego próbki i analizy obrazu za pomocą EDX. Dlatego przyszłe badania powinny koncentrować się na analizie EDX widm QD w celu analizy składu pierwiastkowego.
Znakowanie QD białek zyskało w ostatnim czasie wiele uwagi. QD oferuje wiele zastosowań i zalet zarówno w badaniach biologicznych, jak i terapiach medycznych. QD dodatkowo owinięty ligandem wielozębnym wykazuje zwiększoną stabilność, utrzymując wydajność kwantową. Co więcej, kapsułkowanie QD tymi biologicznie korzystnymi środkami zwiększa również jego biodostępność w tkankach, co czyni go dobrym kandydatem do potencjalnego zastosowania w wykrywaniu nowotworów, obrazowaniu żywych komórek, dostarczaniu leków i obrazowaniu tkanek 3,31,32.

Ciało ludzkie składa się z wielu białek odpowiedzialnych za liczne funkcje organizmu. Funkcja białek w dużej mierze zależy od ich lokalizacji w narządzie i organellach komórkowych. Kilka technik, w tym frakcjonowanie subkomórkowe, immunofluorescencja i ekstrakcja białek za pośrednictwem detergentów, jest powszechnie stosowanych do określenia lokalizacji subkomórkowej białka1,2. Mikroskopia z użyciem barwnika immunofluorescencyjnego jest najczęściej stosowaną metodą spośród tych technik. Jednak barwniki fluorescencyjne używane w tej technice są mniej stabilne i podatne na fotowybielanie3. Inne techniki obejmowały mikroskopię o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji białka na poziomie ultrastrukturalnym poprzez immunoznakowanie białek za pomocą gęstych elektronów, metali ciężkich (złoto, ferrytyna) lub nanokryształów kropek kwantowych, a następnie wizualizacja ich za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)4,5.
QD to półprzewodnikowy nanokryształ złożony ze związków metali półprzewodnikowych o kontrolowanych właściwościach fotoluminescencyjnych, mający duże znaczenie w systemach biologicznych3. Nanokryształy QD są wytwarzane w formacie rdzeń-powłoka, w którym nanokryształ jest zamknięty w tworzeniu nanokryształów, aby zapewnić ich odpowiednią stabilność i funkcjonowanie. Powszechnie stosowaną kombinacją nanokryształów rdzeń-powłoka to CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS i CdTe/CdS/ZnS (rdzeń/powłoka/powłoka)3. Spośród tych kombinacji nanokryształów, CdSe/ZnS i CdSe/CdS są najintensywniej badane i często używane jako drugorzędowe koniugaty przeciwciał3,6. Te nanocząstki QD mają również właściwości fluorescencyjne z innymi widmami wzbudzenia i emisji niż tradycyjne fluorofory. QD wykorzystuje wzbudzenie elektronów z masowego pasma walencyjnego, aby wykazać wyższą wydajność kwantową fluorescencji w porównaniu z tradycyjnymi fluoroforami. Nanokrystaliczny układ metali półprzewodnikowych sprawia, że etykietowanie za pośrednictwem QD jest bardziej stabilne i odporne na fotowybielanie6. Ponadto, rdzeń nanokrystaliczny w QD i jego struktura krystaliczna pozwala QD o różnych rozmiarach na szeroki zakres widm absorpcyjnych i bardzo wąskie piki emisji7. Co więcej, te cząstki QD są wystarczająco duże, aby uzyskać wysoką gęstość elektronów, co czyni je użytecznymi w technikach mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, w tym w transmisyjnej mikroskopii elektronowej5,8,9. Te nanokryształy QD są również dostępne na rynku w wielu rozmiarach z różnymi widmami emisji fluorescencji i kształtami, co czyni je doskonałym kandydatem do znakowania wieloma przeciwciałami10,11.
Technologia QD zyskała ogromne znaczenie w badaniach biologicznych ze względu na wiele właściwości funkcjonalnych, w tym zastosowanie w obrazowaniu żywych komórek, badaniu mechanizmów transportu w komórce, transporcie błonowym ruchu dyfuzji białka, funkcjonalnej heterogeniczności komórek i znakowaniu organelli wewnątrzkomórkowych3,12,13,14,15,16. QD jest również przydatny w diagnostyce molekularnej do celowania i wykrywania tkanek nowotworowych, charakteryzowania profilu molekularnego guza i statusu immunologicznego oraz wizualizacji ciała szklistego i błon nasiatkówkowych3,17,18. Ponadto QD może być również stosowany w terapiach medycznych w leczeniu nowotworów złośliwych za pomocą terapii fotodynamicznej i anomalii okulistycznych poprzez dostarczanie leków do oczu3,17,18,19.
Korzystając z tych wysoce użytecznych nanokryształów QD, niniejsze badanie określiło subkomórkową lokalizację białka o nazwie receptor Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 jest wszechobecnym, wielozadaniowym, molekularnym białkiem opiekuńczym. Szeroko zakrojone badania koncentrujące się na subkomórkowej lokalizacji Sigmar1 w różnych tkankach i narządach wykazały specyficzną dla komórek i typów tkanek lokalizację subkomórkową wywołującą funkcję molekularną20. W różnych komórkach (neuronalnych, fotoreceptorowych i odpornościowych) i tkankach (wątroba i mózg) przy użyciu różnych podejść biochemicznych, badania wykazały lokalizację Sigmar1 na retikulum endoplazmatycznym (ER), błonie ER związanej z mitochondriami (MAM), otoczce jądrowej, błonie plazmatycznej, retikulum nukleoplazmatycznym, jądrze i mitochondriach. Pomimo tych wszystkich badań, subkomórkowa lokalizacja Sigmar1 w sercu pozostała nieznana20. W związku z tym subkomórkową lokalizację Sigmar1 w tkance serca określono za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem QD, a następnie obrazowania TEM.

<table><tbody><tr><td>Siatka miedziana 200 Mesh</td><td>Ted Pella</td><td>G200HH</td><td></td></tr><tr><td>6-miesięczne samce myszy z tłem FVB/N</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton 100%</td> <td>Fisher Chemicals</td><td>A949</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-Sigmar1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>61994S</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7389</td><td></td></tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal Xyl</td><td>Thermo fisher</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>DER 732C36AA10:C33</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Diatome</td><td>Histo; Ultra 450</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>13300</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JEOL-1400 Flash</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>Fisher Chemicals</td><td>A405P</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 3%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16538-15</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13816</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56</td><td></td></tr><tr><td>Micromolds</td><td>Ted Pella</td><td>10505</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Microsystem</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NSA Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19050</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Genesse Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Koniugat streptawidyny</td><td>Invitrogen</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Metaperiodynian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne (rozmiar 10)</td><td>Aspen surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>TEM&nbsp; oprogramowanie do obrazowania</td><td>AMT-V700</td><td>AMT Systemy</td><td></td>obrazowania</tr><tr><td>TEM Kamera do obrazowania TEM</td><td>XR80 Seria TEM</td> Systemy <td></td><td>obrazowania AMT TEM</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu toluidynowego O (0,5%)</td><td>Fisher Scientic</td><td>S25612</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Lokalizacja subkomórkowa jest kluczowa dla określenia prawidłowej funkcji i określenia mechanizmów molekularnych danego białka. W celu określenia subkomórkowej lokalizacji białek stosuje się kilka technik jakościowych i ilościowych. Jedną z pojawiających się technik określania subkomórkowej lokalizacji białka jest immunoznakowanie białka za pośrednictwem kropek kwantowych (QD), a następnie obrazowanie ich za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). QD to nanokryształ półprzewodnikowy o podwójnej właściwości struktury krystalicznej i wysokiej gęstości elektronów, co sprawia, że znajdują zastosowanie w mikroskopii elektronowej. Ta obecna metoda wizualizowała subkomórkową lokalizację białka receptora Sigma 1 (Sigmar1) za pomocą QD-TEM w tkance serca na poziomie ultrastrukturalnym. Małe kostki skrawków tkanki serca myszy typu dzikiego utrwalono w 3% aldehydzie glutarowym, a następnie osmikowano, wybarwiono octanem uranylu, a następnie sekwencyjnie odwodniono etanolem i acetonem. Te odwodnione skrawki tkanki serca zostały zatopione w żywicach epoksydowych o niskiej lepkości, pocięte na cienkie odcinki o grubości 500 nm, umieszczone na siatce, a następnie poddane demaskowaniu antygenu za pomocą 5% metaperiodianu sodu, a następnie wygaszaniu pozostałych aldehydów glicyną. Tkanki zostały zablokowane, a następnie nastąpiła sekwencyjna inkubacja w przeciwciałie pierwszorzędowym, biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym i QD sprzężonym ze streptawidyną. Te poplamione skrawki zostały wysuszone i zobrazowane w dużym powiększeniu za pomocą TEM. Technika QD-TEM pozwoliła na wizualizację Lokalizacja subkomórkowa białka Sigmar1 na poziomie ultrastrukturalnym w sercu. Techniki te można wykorzystać do wizualizacji obecności dowolnego białka i lokalizacji subkomórkowej w dowolnym układzie narządów.

Przedstawiona metodologia QD-TEM pozwoliła na wizualizację obecności Sigmar1 oraz jego lokalizacji w subkomórkowych przedziałach serca poprzez przeprowadzenie ukierunkowanego znakowania QD przeciwciałami anty-Sigmar1 na ultracienkich przekrojach serca dorosłej myszy. Obrazy QD-TEM ukazały elektronowo gęste kropki QD znakowane anty-Sigmar1 na błonach mitochondrialnych (wewnętrznej i zewnętrznej), lizosomach oraz na styku błony siateczki śródplazmatycznej / siateczki sarkoplazmatycznej (ER/SR) i mitochondriów (Rysunek 2A,B). Dodatkowo, przekroje serca zostały znakowane królikiem IgG i QD jako kontrola izotypowa dla króliczego przeciwciała pierwszorzędowego anty-Sigmar1 (Rysunek 2C,D). W związku z tym obrazowanie QD-TEM wyróżniło lokalizację endogennego Sigmar1 i jego zwiększone zagęszczenie głównie w lizosomach oraz na błonach mitochondrialnych.
<img alt="Schemat przygotowania i barwienia tkanki serca myszy z etapami fiksacji, przetwarzania, zatapiania i znakowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja przedstawiająca kolejne kroki i procedury stosowane podczas wykonywania QD-TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy ultrastruktury mitochondriów w mikroskopii elektronowej szczegółowo przedstawiające komponenty oddychania komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: QD znakowane immunologicznie Sigmar1 w tkankach serca dorosłych myszy. (A,B) Reprezentatywne obrazy TEM pokazujące QD znakowane Sigmar1 na mitochondriach (błona zewnętrzna i wewnętrzna), błonach retikulum endoplazmatycznego (ER) / retikulum sarkoplazmatycznego (SR) powiązanych z mitochondriami oraz na lizosomach. (C,D) Obraz TEM przekrojów serca kontroli izotypowej znakowanej QD i króliczymi IgG. Pasek skali: 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Skład PBS i innych roztworów użytych do odwodnienia tkanek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Obecny protokół opisuje metodę immunoznakowania białka w skrawkach tkanki serca za pomocą kropek kwantowych. Technika ta stanowi użyteczne narzędzie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i ekspresji dowolnego białka na poziomie ultrastrukturalnym.

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

Określenie subkomórkowej lokalizacji białka ma kluczowe znaczenie dla określenia jego prawidłowej funkcji i mechanizmów z nią związanych. Ta metoda może pomóc nam zwizualizować subkomórkową lokalizację białka na poziomie ultrastruktury. Znakowanie immunologiczne za pośrednictwem kropek kwantowych jest bardziej stabilne, odporne na fotowybielanie, ma własne widma emisyjne, daje wysoką gęstość elektronów i wykazuje wyższą skuteczność i retencję na tkankach z lepszą penetracją w tkankach.Wiele etapów procesu, czyli utrwalanie, trawienie, blokowanie i optymalna koncentracja kropek kwantowych, to trudne kroki do optymalizacji. Wskazane jest wypróbowanie wielu punktów czasowych i stężeń użytych odczynników. Kolejnym wyzwaniem jest obsługa siatek, w przypadku których działa tylko cierpliwość i oczywiście praktyka.Procedurę zademonstrują Chowdhury Abdullah, pracownik poczty, Naznin Remex, doktorant z mojego laboratorium, oraz Brandon Hartman, kierownik mikroskopii elektronowej z naszych usług mikroskopii elektronowej. Po znieczuleniu myszy i otwarciu jamy klatki piersiowej, obficie nasycić serce lodowatym 3% aldehydem glutarowym w 0,1 molowym buforze kakodylanu sodu przez dwie minuty. Użyj igły o rozmiarze 25 o wymiarach pięć na osiem cali, aby wprowadzić utrwalacze do serca za pomocą ciśnienia grawitacyjnego.Natychmiast po tym, jak serce zacznie wypełniać się utrwalaczem, podnieś wierzchołek serca, aby zmniejszyć ciśnienie. Przetnij naczynia znajdujące się pod spodem w odległości od jednego do dwóch milimetrów od serca i pozwól płynom spłynąć. Przeanalizuj serce.Usuń przedsionki i wrzuć komory na szalkę Petriego zawierającą lodowaty 3% aldehydu glutarowego i 0,1 molowego kakodylanu sodu. Wykonaj cięcie motyla po 30 do 60 minutach utrwalania i umieść komorę z powrotem na szalce Petriego. Pokrój serce za pomocą ostrza chirurgicznego w małe kostki o wielkości jednego milimetra sześciennego.Utrwal i zanurz wypreparowaną tkankę serca w roztworze aldehydu glutarowego i kakodylanu na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 24 godzinach od utrwalenia przemyć tkankę w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu dwa razy przez 20 minut. Usunąć tkankę z buforu kakodylanu sodu i zanurzyć w 2% roztworze tetratlenku osmu na cztery godziny w temperaturze pokojowej.Po osmikacji zanurz tkankę w 2% roztworze octanu sodu na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz tkankę w 2% roztworze octanu uranylu na godzinę w temperaturze pokojowej. Po barwieniu octanem uranylu należy kolejno odwodnić tkankę za pomocą stopniowanych alkoholi i acetonu.Zanurz odwodnioną tkankę w żywicy epoksydowej o niskiej lepkości, jak opisano w manuskrypcie. Umieść tkankę w świeżej żywicy w ośmiomilimetrowych mikroforemkach i utwardź osadzoną tkankę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc. Po znalezieniu obszaru zainteresowania, za pomocą noża ultra 45 stopni, wyprodukuj ultracienkie sekcje w kolorze bladego złota.Umieść te ultracienkie sekcje po matowej stronie miedzianej siatki o oczkach 200. Barwienie należy rozpocząć od zdemaskowania antygenu, umieszczając 20 mikrolitrów metaperiodianu roztworu trawiącego na czystej folii parafinowej. Umieść wysuszoną siatkę z kawałkami tkanki na kropli roztworu do trawienia.Pozostaw siatkę sekcji na roztworze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj wytrawione skrawki tkanki, umieszczając je na kropli wody destylowanej na 60 sekund. Zablokuj resztkowe aldehydy, umieszczając siatkę przekroju na kropli 0,05 molowego roztworu glicyny na 10 minut w temperaturze pokojowej.Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej, aby usunąć resztki roztworu glicyny. Umieść siatkę sekcyjną w 10 do 20 mikrolitrach roztworu blokującego na 25 minut w temperaturze pokojowej. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej i umieść sekcje siatki na rozcieńczalniku przeciwciał w celu kondycjonowania w temperaturze pokojowej na 10 minut.Inkubować sekcje siatki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez godzinę 30 minut w wilgotnej komorze. Osusz siatkę i umyj jej sekcje rozcieńczalnikiem z przeciwciałami dwa razy po pięć minut każda. Inkubować skrawki siatki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w wilgotnej komorze.Po wysuszeniu kratki należy umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez pięć minut każda. Inkubować skrawki siatki w dostępnym w handlu sprzężonym ze streptawidyną QD przez jedną godzinę w komorze w temperaturze pokojowej. Zapobiegaj ekspozycji na światło, przykrywając komorę folią aluminiową.Po osuszeniu krawędzi siatki za pomocą bibuły filtracyjnej, umyj sekcje siatki, umieszczając je na kropelkach wody na dwie minuty i osusz krawędzie siatki do wyschnięcia. Włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu i włącz przełącznik pompy, aby ocenić goniometr, a następnie całkowicie włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu. Skoncentruj się dobrze na żądanym obszarze.Uchwyć obraz za pomocą szybkiego aparatu cyfrowego i zapisz plik w formacie tif. Błony mitochondrialne, lizosomy i interfejs mitochondrialny retikulum endoplazmatycznego lub błony retikulum sarkoplazmatycznego wykazały obecność kropek kwantowych znakowanych Sigmar1. Skrawki serca wizualizowano przy użyciu króliczej immunoglobuliny G i kropek kwantowych jako kontroli izotypu dla pierwszorzędowego przeciwciała anty-Sigmar1 królika.Jedną z ważnych rzeczy, które należy wziąć pod uwagę podczas pracy nad tym protokołem, jest zdemaskowanie czasu dla antygenu. Jeśli skrawki tkanki są wytrawiane zbyt długo, roztwór metaperiodatu spowoduje perforacje w cienkich skrawkach tkanki. Znakowanie za pośrednictwem kropek kwantowych zyskuje na znaczeniu w wykrywaniu nowotworów, profilowaniu molekularnym i immunologicznym guza oraz obrazowaniu tkanek, torując nowy sposób diagnostyki medycznej.Kropki kwantowe są również przydatne w leczeniu nowotworów za pomocą terapii fotodynamicznych i anomalii okulistycznych poprzez dostarczanie leków do oczu.

visualizing-subcellular-localization-protein-heart-using-quantum-dots

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Ten film demonstruje technikę immunoznakowania receptorów sigma-1 w sekcji tkanki mysiego serca za pomocą kropek kwantowych. Tkanka serca jest utrwalana, osmikowana, barwiona, odwadniana, zatopiona w żywicy, a następnie cięta. Skrawki są następnie traktowane przeciwciałami i znakowane kropkami kwantowymi w celu wyznaczenia subkomórkowej lokalizacji receptorów Sigma-1 za pomocą mikroskopii elektronowej.

Technika znakowania immunologicznego do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji białek

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj metodę znakowania immunologicznego z kropkami kwantowymi do wizualizacji lokalizacji białek w tkance serca myszy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Protokół umożliwia badanie funkcji białek na poziomie subkomórkowym.

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów