Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Określenie subkomórkowej lokalizacji białka ma kluczowe znaczenie dla określenia jego prawidłowej funkcji i mechanizmów z nią związanych. Ta metoda może pomóc nam zwizualizować subkomórkową lokalizację białka na poziomie ultrastruktury. Znakowanie immunologiczne za pośrednictwem kropek kwantowych jest bardziej stabilne, odporne na fotowybielanie, ma własne widma emisyjne, daje wysoką gęstość elektronów i wykazuje wyższą skuteczność i retencję na tkankach z lepszą penetracją w tkankach.

Wiele etapów procesu, czyli utrwalanie, trawienie, blokowanie i optymalna koncentracja kropek kwantowych, to trudne kroki do optymalizacji. Wskazane jest wypróbowanie wielu punktów czasowych i stężeń użytych odczynników. Kolejnym wyzwaniem jest obsługa siatek, w przypadku których działa tylko cierpliwość i oczywiście praktyka.

Procedurę zademonstrują Chowdhury Abdullah, pracownik poczty, Naznin Remex, doktorant z mojego laboratorium, oraz Brandon Hartman, kierownik mikroskopii elektronowej z naszych usług mikroskopii elektronowej. Po znieczuleniu myszy i otwarciu jamy klatki piersiowej, obficie nasycić serce lodowatym 3% aldehydem glutarowym w 0,1 molowym buforze kakodylanu sodu przez dwie minuty. Użyj igły o rozmiarze 25 o wymiarach pięć na osiem cali, aby wprowadzić utrwalacze do serca za pomocą ciśnienia grawitacyjnego.

Natychmiast po tym, jak serce zacznie wypełniać się utrwalaczem, podnieś wierzchołek serca, aby zmniejszyć ciśnienie. Przetnij naczynia znajdujące się pod spodem w odległości od jednego do dwóch milimetrów od serca i pozwól płynom spłynąć. Przeanalizuj serce.

Usuń przedsionki i wrzuć komory na szalkę Petriego zawierającą lodowaty 3% aldehydu glutarowego i 0,1 molowego kakodylanu sodu. Wykonaj cięcie motyla po 30 do 60 minutach utrwalania i umieść komorę z powrotem na szalce Petriego. Pokrój serce za pomocą ostrza chirurgicznego w małe kostki o wielkości jednego milimetra sześciennego.

Utrwal i zanurz wypreparowaną tkankę serca w roztworze aldehydu glutarowego i kakodylanu na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 24 godzinach od utrwalenia przemyć tkankę w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu dwa razy przez 20 minut. Usunąć tkankę z buforu kakodylanu sodu i zanurzyć w 2% roztworze tetratlenku osmu na cztery godziny w temperaturze pokojowej.

Po osmikacji zanurz tkankę w 2% roztworze octanu sodu na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz tkankę w 2% roztworze octanu uranylu na godzinę w temperaturze pokojowej. Po barwieniu octanem uranylu należy kolejno odwodnić tkankę za pomocą stopniowanych alkoholi i acetonu.

Zanurz odwodnioną tkankę w żywicy epoksydowej o niskiej lepkości, jak opisano w manuskrypcie. Umieść tkankę w świeżej żywicy w ośmiomilimetrowych mikroforemkach i utwardź osadzoną tkankę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc. Po znalezieniu obszaru zainteresowania, za pomocą noża ultra 45 stopni, wyprodukuj ultracienkie sekcje w kolorze bladego złota.

Umieść te ultracienkie sekcje po matowej stronie miedzianej siatki o oczkach 200. Barwienie należy rozpocząć od zdemaskowania antygenu, umieszczając 20 mikrolitrów metaperiodianu roztworu trawiącego na czystej folii parafinowej. Umieść wysuszoną siatkę z kawałkami tkanki na kropli roztworu do trawienia.

Pozostaw siatkę sekcji na roztworze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj wytrawione skrawki tkanki, umieszczając je na kropli wody destylowanej na 60 sekund. Zablokuj resztkowe aldehydy, umieszczając siatkę przekroju na kropli 0,05 molowego roztworu glicyny na 10 minut w temperaturze pokojowej.

Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej, aby usunąć resztki roztworu glicyny. Umieść siatkę sekcyjną w 10 do 20 mikrolitrach roztworu blokującego na 25 minut w temperaturze pokojowej. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej i umieść sekcje siatki na rozcieńczalniku przeciwciał w celu kondycjonowania w temperaturze pokojowej na 10 minut.

Inkubować sekcje siatki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez godzinę 30 minut w wilgotnej komorze. Osusz siatkę i umyj jej sekcje rozcieńczalnikiem z przeciwciałami dwa razy po pięć minut każda. Inkubować skrawki siatki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w wilgotnej komorze.

Po wysuszeniu kratki należy umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez pięć minut każda. Inkubować skrawki siatki w dostępnym w handlu sprzężonym ze streptawidyną QD przez jedną godzinę w komorze w temperaturze pokojowej. Zapobiegaj ekspozycji na światło, przykrywając komorę folią aluminiową.

Po osuszeniu krawędzi siatki za pomocą bibuły filtracyjnej, umyj sekcje siatki, umieszczając je na kropelkach wody na dwie minuty i osusz krawędzie siatki do wyschnięcia. Włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu i włącz przełącznik pompy, aby ocenić goniometr, a następnie całkowicie włóż uchwyt próbki do kolumny mikroskopu. Skoncentruj się dobrze na żądanym obszarze.

Uchwyć obraz za pomocą szybkiego aparatu cyfrowego i zapisz plik w formacie tif. Błony mitochondrialne, lizosomy i interfejs mitochondrialny retikulum endoplazmatycznego lub błony retikulum sarkoplazmatycznego wykazały obecność kropek kwantowych znakowanych Sigmar1. Skrawki serca wizualizowano przy użyciu króliczej immunoglobuliny G i kropek kwantowych jako kontroli izotypu dla pierwszorzędowego przeciwciała anty-Sigmar1 królika.

Jedną z ważnych rzeczy, które należy wziąć pod uwagę podczas pracy nad tym protokołem, jest zdemaskowanie czasu dla antygenu. Jeśli skrawki tkanki są wytrawiane zbyt długo, roztwór metaperiodatu spowoduje perforacje w cienkich skrawkach tkanki. Znakowanie za pośrednictwem kropek kwantowych zyskuje na znaczeniu w wykrywaniu nowotworów, profilowaniu molekularnym i immunologicznym guza oraz obrazowaniu tkanek, torując nowy sposób diagnostyki medycznej.

Kropki kwantowe są również przydatne w leczeniu nowotworów za pomocą terapii fotodynamicznych i anomalii okulistycznych poprzez dostarczanie leków do oczu.