Name: Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą śledzenia wielu celów (MTT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj algorytm MTT do śledzenia pojedynczych cząsteczek w błonie komórkowej z wysoką gęstością etykietowania. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki receptorów EGF w skali nanometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom naszego zespołu, w szczególności MC Blache za pomoc techniczną, a także M Irla i B Imhof za wsparcie i owocne dyskusje. Ryciny dotyczące deflacji i ograniczenia przestrzennego (confinement) zostały powtórzone dzięki uprzejmości Nature Methods. Projekt ten jest wspierany przez granty instytucjonalne CNRS, INSERM i Uniwersytetu w Marsylii, a także przez specyficzne granty z Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI-0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) oraz Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z Ligue Nationale Contre le Cancer.

<ol><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).</li>
<li>Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+molecule+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).</li>
<li>Lommerse, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+the+H-ras+membrane-anchor+reveals+domains+in+the+cytoplasmic+leaflet+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane.</a> Biophys. J. 86, 609-616 (2004).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+dynamics+of+glycine+receptors+revealed+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Harms, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+l-type+Ca%282%2B%29+channels+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells.</a> Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).</li>
<li>Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+of+green+fluorescent+proteins+in+living+cells%3A+E-cadherin+forms+oligomers+on+the+free+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface.</a> Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).</li>
<li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+EGFR+signalling+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells.</a> Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).</li>
<li>Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+microdomains+in+a+muscle+cell+membrane+visualized+by+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy.</a> Embo. J. 19, 892-901 (2000).</li>
<li>Seisenberger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+of+the+infection+pathway+of+an+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus.</a> Science. 294, 1929-1932 (2001).</li>
<li>Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+fluid+mosaic+model+of+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Revisiting the fluid mosaic model of membranes.</a> Science. 268, 1441-1442 (1995).</li>
<li>Saffman, P. G., Delbruck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brownian motion in biological membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Papoulis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapoulis%2C+A+%22Probability%2C+Random+Variables+and+Stochastic+Process+277%22">Probability, Random Variables and Stochastic Process 277</a>. , McGraw Hill. (2001).</li>
<li>Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).</li>
<li>Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mountains+yield+nanoscale+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mountains yield nanoscale cell images.</a> Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Andrew, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).</li>
<li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E.+Stat.+Nonlin.+Soft.+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+effects+of+corrals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li>
<li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li>
<li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li>
<li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li>
<li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labelling+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li>
<li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li>
<li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li>
<li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li>
<li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li>
<li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions%3A+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W śledzeniu pojedynczych cząsteczek, poza aspektami dotyczącymi komórek i mikroskopii, analiza stanowi istotną część pracy. Dotyczy to algorytmu wykorzystywanego do wykonania trzech głównych zadań: detekcji, estymacji i ponownego łączenia pików w każdej klatce. Kolejnym aspektem tej pracy jest dopracowanie samego algorytmu, który może wymagać adaptacji do każdego nowego, dedykowanego badania, w szczególności w przypadku końcowych, dodatkowych kroków (takich jak określanie trybów ruchu, oddziaływań lub stechiometrii)....

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa Cos-7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>5 000 komórek/dołek</td></tr><tr><td>HBSS bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>płytka Lab-tek 8-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155441</td><td>1</td></tr><tr><td>streptawidyna QDot-605</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Biotynilowany fragment Fab&lt;/strong&gt; (w celu syntezy fragmentów Fab należy zapoznać się z publikacją &lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fragment Fab przeciwciała monoklonalnego 108</td><td>ATCC</td><td>HB-9764</td><td>200 &amp;mu;g</td></tr><tr><td>NHS-biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21435</td><td>18.5 &amp;mu;g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pożywka kompletna&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41965</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>pirowinian sodu</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>11360</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Medium obrazujące&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS z Ca2+&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td>250 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE2000U</td><td></td></tr><tr><td>Lampa fluorescencyjna</td><td>Nikon Instruments</td><td>Intensilight C-HGFIE</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 100x o aperturze numerycznej (NA) 1,3</td><td>Nikon Instruments</td><td>Obiektyw Plan Fluor 1,30</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw 100x NA 1,49</td><td>Nikon Instruments</td><td>APO TIRF 1.49</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Roper Scientific</td><td>Kaskada 512 B</td><td></td></tr><tr><td>Komora termostatowana</td><td>Usługi obrazowania żywych komórek</td><td>Pudełko</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dodatek: przykładowy skrypt uzupełniającej analizy MTT</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;funkcja&lt;/strong&gt; MTT_przykład(nazwa_pliku)&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Podstawowe przykłady pokazujące, jak odzyskać wyniki wyjściowe z MTT&lt;br/&gt;%%% aby wykreślić każdy ślad i sporządzić histogram &lt;br/&gt;%%% intensywności fluorescencji&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;jeśli&lt;/strong&gt; nargin&amp;<1 % brak podanej nazwy pliku?&lt;br/&gt;pliki = dir('*.stk'); &lt;br/&gt;&lt;strong&gt;jeśli&lt;/strong&gt; isempty(files), disp('brak danych w bieżącym katalogu'), &lt;strong&gt;powrót, koniec&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;file_name = files(1).name; % domyślnie: pierwszy plik stk&lt;br/&gt;disp(['używanie' file_name 'domyślnie'])&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Koniec&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % plik wyjściowy</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%% Wczytaj dane&lt;br/&gt;&lt;/em&gt; cd('output23') % lub (&amp;#8216;wynik22'), zgodnie z używaną wersją&lt;br/&gt;&lt;em&gt;% Zastrzeżenie: wersja 2.2 generuje tylko 7 parametrów,&lt;br/&gt;% w wersji 2.3 dodano dodatkowy parametr: szum (noise)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;% Aby odczytać wszystkie parametry jednocześnie, w jednej tabeli&lt;br/&gt;% tab_param = fread_all_param(file_param);&lt;br/&gt;% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ...&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;% Aby odczytać wszystkie parametry (z wyjątkiem frame_number) w osobnych tabelach&lt;br/&gt;% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); &lt;em&gt;% indeks wynosi 3, ponieważ jest to numer śladu &amp;numer klatki, który nie dostarcza istotnych informacji, zostaje odrzucony!&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);&lt;br/&gt;tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);&lt;br/&gt;tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%% Pętla dla śladów&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;N_traces = size(tab_i,1);&lt;br/&gt;&lt;em&gt;% Tabele mają N_traces wierszy i N_frames kolumn&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;dla&lt;/strong&gt; itrc = 1:N_traces &lt;br/&gt;No_blk_index = tab_blk(itrc, :)&amp;gt;0; &lt;em&gt;% tylko etapy bez migotania&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))&lt;br/&gt;xlabel('i (piksel)'), ylabel('j (piksel)')&lt;br/&gt;title(['ścieżka nr ' num2str(itrc)])&lt;br/&gt;disp('Proszę nacisnąć dowolny klawisz, aby przejść do następnego śladu'), pause&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Koniec&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%% Histogram fluorescencji&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;N_datapoints = sum(tab_blk(:)&amp;gt;0); &lt;em&gt;% tylko kroki bez migotania&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;hist(tab_alpha(tab_blk&amp;gt;0),2*sqrt(N_datapoints)) &lt;em&gt;% stosując 2sqrt(N) przedziałów&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;xlabel('intensywność (a.u.)'), ylabel('częstotliwość występowania')&lt;br/&gt;tytuł('histogram intensywności fluorescencji cząstek')</td></tr></tbody></table>

mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą multiple-target tracing (mtt)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Naszym celem jest uzyskanie kompleksowego opisu procesów molekularnych zachodzących w błonach komórkowych w różnych funkcjach biologicznych. Dążymy do scharakteryzowania złożonej organizacji i dynamiki błony plazmatycznej na poziomie pojedynczych cząsteczek poprzez opracowanie narzędzi analitycznych dedykowanych śledzeniu pojedynczych cząstek (Single-Particle Tracking, SPT) przy wysokiej gęstości: śledzeniu wielu celów (Multiple-Target Tracing, MTT)1. Wideomikroskopia pojedynczych cząsteczek, oferująca rozdzielczość milisekundową i nanometryczną1-11, pozwala na szczegółowe przedstawienie organizacji błony12-14 poprzez dokładne mapowanie deskryptorów, takich jak lokalizacja, mobilność, ograniczenie przestrzenne lub oddziaływania receptorów komórkowych.
Ponownie przeanalizowaliśmy SPT, zarówno pod kątem eksperymentalnym, jak i algorytmicznym. Aspekty eksperymentalne obejmowały optymalizację układu i znakowania komórek, ze szczególnym naciskiem na osiągnięcie jak najwyższej gęstości znakowania, aby uzyskać dynamiczny obraz dynamiki molekularnej zachodzącej w błonie. Kwestie algorytmiczne dotyczyły każdego etapu rekonstrukcji trajektorii: detekcji szczytów, ich estymacji i łączenia, co rozwiązano za pomocą specyficznych narzędzi analizy obrazu15,16. Zaimplementowanie deflacji po detekcji pozwala na odzyskanie szczytów początkowo przesłoniętych przez sąsiednie, silniejsze szczyty. Warto zauważyć, że poprawa detekcji bezpośrednio wpływa na łączenie trajektorii poprzez redukcję przerw w ich przebiegu. Wydajność została oceniona przy użyciu symulacji Monte-Carlo dla różnych wartości gęstości znakowania i poziomu szumu, które zazwyczaj stanowią dwa główne ograniczenia dla pomiarów równoległych o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.
Dokładność nanometryczna17 uzyskiwana dla pojedynczych cząsteczek, przy użyciu następczego przełączania fotoaktywacyjnego on/off lub optyki nieliniowej, pozwala na przeprowadzenie wyczerpujących obserwacji. Stanowi to podstawę metod nanoskopii17, takich jak STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 lub STED22,23, które często wymagają obrazowania próbek utrwalonych. Kluczowym zadaniem jest detekcja i estymacja ograniczonych dyfrakcyjnie pików pochodzących od pojedynczych cząsteczek. Zatem, przy zastosowaniu odpowiednich założeń, takich jak przyjęcie stałej dokładności pozycyjnej zamiast ruchu Browna, MTT jest bezpośrednio odpowiednie do analiz nanoskopowych. Co więcej, MTT może być fundamentalnie stosowane w każdej skali: nie tylko dla cząsteczek, ale na przykład również dla komórek lub zwierząt. Tym samym MTT jest potężnym algorytmem śledzenia, który znajduje zastosowania w skalach molekularnej i komórkowej.

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Naszym celem jest uzyskanie kompleksowego opisu procesów molekularnych zachodzących w błonach komórkowych w ramach różnych funkcji biologicznych. Dążymy do scharakteryzowania złożonej organizacji i dynamiki błony plazmatycznej na poziomie pojedynczych cząsteczek poprzez opracowanie narzędzi analitycznych przeznaczonych do śledzenia pojedynczych cząstek (Single-Particle Tracking, SPT) przy wysokiej gęstości: Multiple-Target Tracing (MTT). Videomikroskopia pojedynczych cząsteczek, oferująca rozdzielczość milisekundową i nanometryczną, umożliwia szczegółowe przedstawienie organizacji błony poprzez dokładne mapowanie takich parametrów jak lokalizacja, mobilność, ograniczenie przestrzenne (confinement) lub interakcje receptorów komórkowych. Ponownie przeanalizowaliśmy metodę SPT, zarówno pod kątem eksperymentalnym, jak i algorytmicznym. Aspekty eksperymentalne obejmowały optymalizację układu oraz znakowanie komórek, ze szczególnym naciskiem na osiągnięcie jak najwyższej możliwej gęstości znakowania, aby uzyskać dynamiczny obraz dynamiki molekularnej zachodzącej w błonie. Kwestie algorytmiczne dotyczyły każdego etapu rekonstrukcji trajektorii: detekcji szczytów, ich estymacji oraz łączenia, co zrealizowano za pomocą specyficznych narzędzi analizy obrazu. Zastosowanie deflacji po detekcji pozwala na odzyskanie szczytów początkowo przesłoniętych przez sąsiednie, silniejsze szczyty. Warto zaznaczyć, że usprawnienie detekcji ma bezpośredni wpływ na łączenie trajektorii, redukując przerwy w ich przebiegu. Wydajność oceniono za pomocą symulacji Monte-Carlo dla różnych wartości gęstości znakowania i poziomu szumu, które zazwyczaj stanowią dwa główne ograniczenia dla pomiarów równoległych o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Dokładność nanometryczna uzyskana dla pojedynczych cząsteczek, z wykorzystaniem następczego przełączania on/off lub optyki nieliniowej, pozwala na przeprowadzenie wyczerpujących obserwacji. Stanowi to podstawę metod nanoskopowych, takich jak STORM, PALM, RESOLFT czy STED, które często wymagają obrazowania utrwalonych próbek. Kluczowym zadaniem jest detekcja i estymacja ograniczonych dyfrakcyjnie szczytów pochodzących od pojedynczych cząsteczek. Zatem przy zastosowaniu odpowiednich założeń, takich jak przyjęcie stałej dokładności pozycjonowania zamiast ruchu Browna, MTT jest bezpośrednio dostosowane do analiz nanoskopowych. Co więcej, MTT może być zasadniczo stosowane w każdej skali: nie tylko dla cząsteczek, ale na przykład także dla komórek lub zwierząt. W związku z tym MTT jest potężnym algorytmem śledzenia, który znajduje zastosowanie w skali molekularnej i komórkowej.

Witajcie. W tym filmie prezentujemy pełny eksperyment śledzenia pojedynczych kwantów. Dedykowany algorytm został w całości opracowany we współpracy z ekspertami z ISIS z zakresu analizy obrazu. W trakcie tego filmu wykorzystamy receptor epidermalnego czynnika wzrostu jako model do opisania metody tej techniki.Receptor epidermalnego czynnika wzrostu jest białkiem transbłonowym. Receptor ten zostanie oznakowany za pomocą przeciwciała monoklonalnego, które zostanie zredukowane tak, aby zachować jedynie fragment Fab. Fragment Fab zostanie biotynilowany, a następnie po powiązaniu ze streptawidyną kropki kwantowej, cały układ precyzyjnie rozpozna receptor EGF.Naszym celem jest zapewnienie kompleksowego spojrzenia na dynamikę receptorów powierzchni komórkowych. W istocie trajektorie molekularne mogą odbiegać od dyfuzji Browna poprzez ograniczenie w obrębie nanodomen. Może to być na przykład sygnatura zachodzącej interakcji, na przykład z partnerami sygnałowymi lub rusztowaniami molekularnymi.Dążymy do wyczerpującego opisania takich zdarzeń poprzez ich mapowanie w obrębie komórki, co wymaga pracy przy wysokiej rozdzielczości czasowej SPECT oraz wysokiej gęstości znakowania. Podejście to nazywamy zatem śledzeniem wielu celów (multi-target tracing). Pierwszym krokiem eksperymentu jest przygotowanie próbki.Pracujemy na żywych komórkach z dodatkiem lub bez dodatku antybiotyków. W tym przypadku wykorzystujemy komórki COS-7, które endogennie wykazują ekspresję receptorów EGF. Po odłączeniu komórek musimy dokładnie potwierdzić ich liczbę, aby w każdym dołku płytki laboratoryjnej znajdowała się taka sama liczba komórek.Precyzyjna liczba komórek jest bardzo ważna dla zwiększenia przewidywalności liczby kropek kwantowych na komórkę. Po wysianiu komórek w dołku H, należy inkubować hodowlę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przy 7% CO2. Kolejnym krokiem jest przygotowanie kropek kwantowych sprzężonych z przeciwciałami. Kropki kwantowe to małe fluorescencyjne nanocząstki.Cząsteczki te budzą tutaj duże zainteresowanie, ponieważ są bardzo jasne i stabilne w porównaniu z klasycznymi sondami fluorescencyjnymi i ich sygnałem. Stosunek sygnału do szumu jest bardzo istotny w tego typu eksperymentach. W tym przypadku stosujemy pełną pożywkę w celu nasycenia miejsc wiązania wokół kropek kwantowych i zapobiegania agregacji.Następnie zmieszaliśmy kropki kwantowe z biotynilowanym białkiem lub przeciwciałami o interesującym nas profilu w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać statystycznie więcej monowalentnych kropek kwantowych. W tym eksperymencie wykorzystujemy fragment Fab przeciwko receptorowi EGF, wytworzony w laboratorium z przeciwciał monoklonalnych i znakowany biotyną. Podczas inkubacji trwającej około 15 minut można kontrolować proces agregacji i homogeniczności, używając wytrząsarki ustawionej na 1 200 obrotów na minutę w temperaturze 25 °C.Gdy mieszanina będzie gotowa, można ją dodać do komórek. Bardzo ostrożnie usuń medium z dołka, aby zapobiec odrywaniu się komórek podczas pracy technika laboratoryjnego, a następnie dodaj wymaganą dla Twojego eksperymentu ilość mieszaniny. W tym przypadku dodamy 100 µL mieszaniny na dołek.Po dodaniu mieszaniny można inkubować komórki przez 15 minut. W tym przypadku w temperaturze 37°C przy 7% CO2. Po tej inkubacji w medium w zawiesinie można zauważyć dużą liczbę często występujących podwójnych kropek.Te kropki kwantowe powinny zostać usunięte przed obrazowaniem. Wynika to z szumu, który wprowadzają. Dlatego musimy przemyć każdą studzienkę kilka razy, w tym przypadku pięć razy, aby je wypłukać.Użyj medium do obrazowania bez autofluorescencji. W tym przypadku zastosowano bufor HBSS z dodatkiem aps. Teraz komórki są przygotowane.Czas przejść do konfiguracji systemu akwizycji. Układ składa się z czterech głównych elementów: odwróconego mikroskopu, kamery o wysokiej czułości, mocnej lampy rtęciowej oraz inkubatora utrzymującego komórki w temperaturze 37 °C. Światło z lampy rtęciowej przechodzi przez światłowód i koło filtrowe, zanim oświetli próbkę.Fluorescencja próbki jest filtrowana i rejestrowana przez kamerę E-M-C-C-D po lewej stronie. Obecnie stosujemy obiektywy imersyjne olejowe o aperturze numerycznej 1,3 oraz 1,49. Centralnym etapem tego eksperymentu jest sama akwizycja.Po ustawieniu komórek w płaszczyźnie ostrości, analizujemy jedną reprezentatywną komórkę z silnym znakowaniem. W przypadku kropek kwantowych najpierw wykonujemy pojedynczy obraz w transmitowanym białym świetle, który może służyć do późniejszej weryfikacji wyglądu komórki i granicy specjalnej podia LA. Następnie rejestrujemy wideo, zazwyczaj z częstotliwością 36 milisekund, co jest najszybszą prędkością możliwą do uzyskania przy pełnej klatce.Używamy kamery CCD z mnożeniem elektronów, aby osiągnąć czułość na poziomie pojedynczych cząsteczek przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym co najmniej 20 dB. Zazwyczaj wynosi on około 25 dB, a my zazwyczaj pozyskujemy 300 klatek. Aby ocenić dany zestaw danych, należy podać jedynie ścieżkę do katalogu zawierającego pliki wideo.Następnie po wpisaniu polecenia tekst łączy się w MetLab lub po wpisaniu polecenia MTT 23 I, które najpierw wyświetla interfejs graficzny z listą. Wszystkie użyte parametry uruchomią w pełni zautomatyzowaną analizę. Rdzeń analizy MTT jest wykonywany dla każdej klatki, wywołując trzy główne zadania, z których pierwszym jest detekcja dla każdego piksela pod kątem obecności lub braku kwantowego długu celu.Następnie dla każdego wykrycia wykonuje się estymację istotnych parametrów celu, takich jak jego pozycja w pikselach, intensywność sygnału i tak dalej. Na koniec następuje rekomplikacja nowych celów z trasami już zbudowanymi w poprzednich klatkach dla każdego piksela.Biorąc pod uwagę lokalny podregion, porównujemy dwie hipotezy dotyczące obecności: albo występuje tylko szum, albo występuje sygnał. Z uwagi na funkcję rozproszenia punktowego, ModuLite posiada wąski pik. Stosujemy próg zapewniający wystarczająco niski poziom fałszywych alarmów, z liczbą mniej niż jedną detekcją błędną na klatkę dla każdego wykrytego celu.Następnie wykonujemy dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do funkcji Gaussa, aby oszacować pozycję, szerokość i wysokość wykrytego piku. Pozwala to w szczególności na określenie precyzyjnej pozycji barwnika, zazwyczaj z dokładnością rzędu 10 do 20 nanometrów dla typowych stosunków sygnału do szumu. Przy wysokiej gęstości piki mogą być często zbyt blisko siebie, a silne piki mogą przesłaniać te słabsze; aby temu zaradzić, stosujemy deflację wykrytych pików z obrazu początkowego.Ponownie, detekcja na residuum może zazwyczaj ponownie zniekształcić 10% pików. Osiągnięcie niemal wyczerpującej detekcji jest bardzo owocne dla dokładnej rekompozycji trajektorii. Następnie zestaw nowych celów jest dopasowywany do zestawu poprzednich śladów dla danej źrenicy.Aby w miarę możliwości przypisać każdy ślad do celu, uwzględniając potencjalne migotanie (blinking), wykorzystujemy wszystkie dostępne informacje statystyczne uzyskane na etapie detekcji. W związku z tym cele nie są przypisywane po prostu do najbliższego śladu. W przypadku konfliktów, gdy ślady mogą się przecinać, co oznacza nakładanie się odpowiednich obszarów badawczych, będziemy brać pod uwagę statystyczne wartości intensywności, prędkości, szerokości oraz migotania zarówno dla śladów, jak i dla celów.Dostarcza to statystycznie optymalnego wyniku ponownego łączenia (reconnection score). Strategia ta pozwala, tam gdzie to możliwe, unikać obciążania procesu ponownego łączenia w stronę najbliższych sąsiadów, co oznaczałoby najwolniejszy ruch. Następnie wykorzystujemy funkcję do oceny możliwego przejściowego uwięzienia (transient confinement) w obrębie trajektorii.Funkcja ta jest odwrotnie proporcjonalna do lokalnej dyfuzji, co zostało wykazane przez Sextona Simpsona i współpracowników. Zastosowanie progu pozwala na zdefiniowanie epizodów z ograniczeniem ruchu lub bez niego. Poprzez iterację tego procesu na wszystkich śladach, możemy ostatecznie zmapować dynamikę błony pod kątem przejściowego ograniczenia ruchu oraz dowodów na spowolnienie, co można następnie przedstawić graficznie.Alternatywnie, wykorzystując wartości binarne lub dyskretne tego indeksu ograniczenia, MTT domyślnie automatycznie wykona te zadania, zapisując dla każdego filmu parametry wierszy dla każdego piku w pliku eski, z myślą o dalszych zaawansowanych badaniach. Typowe wyniki, takie jak mapa śladów dla każdej komórki i wykresy histogramów dla interesujących parametrów, intensywności piku, stosunku sygnału do szumu oraz lokalnych wartości deficytowych, pozwalają na łatwe dostosowanie tego aspektu do dowolnych dedykowanych analiz. Niniejszy film podsumuje teraz typowe wyniki uzyskane za pomocą MTT.Znaczna część pracy polega na opracowaniu algorytmu, który może wymagać dostosowania do konkretnych badań, takich jak różne tryby ruchu lub oddziaływania. Jednak uruchomienie MTT jest bardzo proste. Użytkownicy powinni zoptymalizować jedynie kilka parametrów, takich jak ograniczenia przestrzenne i czasowe.Opracowując MTT, dążyliśmy do całkowitego przemyślenia opcji analitycznych wykorzystywanych w każdym zadaniu. Optymalizujemy ten proces wzdłuż dwóch trudnych osi. Po pierwsze, radzimy sobie z wysokimi gęstościami, aby uzyskać najlepsze informacje przestrzenne z powierzchni, a po drugie, obsługujemy słaby SNR, co zazwyczaj pozwala na pracę przy niskim poziomie eliminacji i wysokiej prędkości; ograniczenie obszaru ruchu może być interpretowane jako sygnatura zachodzącej interakcji.Receptory błonowe mogą oddziaływać na przykład z podbłonowym cytoszkieletem lub domenami lipidowymi. Takie zdarzenia można badać poprzez analizę zmienności ograniczenia przestrzennego (confinement) w przestrzeni i czasie. Pomiary dynamiczne można porównać z podejściami komplementarnymi, takimi jak FRAP, FCS lub FRET.Kod open source jest dostępny do celów badań akademickich. Można go pobrać z naszej strony internetowej pod adresem CML kropka univ if an S fr na stronie naszego zespołu, gdzie znajduje się link do pobierania. Zapraszamy również zainteresowane podmioty przemysłowe do kontaktu z nami.Chcielibyśmy szczególnie podziękować członkom naszego zespołu oraz pracownikom wspólnych zaplecz badawczych za wsparcie i owocne dyskusje. Projekt ten jest finansowany ze środków CNRS w c MAA University Pac Region National de La, a Foundation Medical jest wspierana przez league controller. Dziękujemy za uwagę.

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwzorowanie dyfuzji cząłek w błonie plazmatycznej za pomocą wielotargetowego śledzenia (MTT)

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj algorytm MTT do śledzenia pojedynczych cząsteczek w błonie komórkowej z wysoką gęstością etykietowania. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki receptorów EGF w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Przeglądaj więcej filmów