Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą śledzenia wielu celów (MTT)
May 27th, 2012
Śledzenie wielu celów to domorosły algorytm opracowany do śledzenia indywidualnie znakowanych cząsteczek w błonie komórkowej żywych komórek. Skuteczne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie o dużej gęstości zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w nanoskali.
Hi.In tym filmie prezentujemy pełny eksperyment ze śledzeniem pojedynczym kwantowym. Dedykowany algorytm został w całości opracowany we współpracy z ekspertami ds. wizerunku ISIS. Podczas tego filmu użyjemy receptora naskórkowego czynnika wzrostu jako modelu do opisania metody tej techniki.
Receptor naskórkowego czynnika wzrostu jest białkiem transbłonowym. Receptor ten zostanie oznaczony za pomocą przeciwciała monoklonalnego, które jest redukowane, aby zachować tylko fragment A a B. Fragment A a B jest biotynylowany, a następnie, połączony ze streptawidyną kropki kwantowej, system ścienny precyzyjnie rozpozna receptor EGF.
Naszym celem jest zapewnienie kompleksowego wglądu w dynamikę receptorów na powierzchni komórki. Rzeczywiście, trajektorie molekularne mogą odbiegać od dyfuzji brotu, będąc zamkniętym w nanodomenach. Na przykład, i może to być sygnatura podstawowej interakcji z, na przykład, partnerami sygnalizacyjnymi lub rusztowaniami molekularnymi.
Naszym celem jest wyczerpujące opisanie takich zdarzeń poprzez odwzorowanie ich w komórce, co wymaga pracy w wysokiej rozdzielczości czasowej SPECT wraz z wysoką gęstością znakowania. Dlatego nazywamy to podejście śledzeniem wielu celów. Pierwszym etapem eksperymentu jest przygotowanie próbki.
Pracujemy na żywych komórkach bez antybiotyków. Tutaj używamy siedmiu komórek, które endogennie eksprymują receptory EGF. Po odłączeniu komórki musimy dokładnie potwierdzić, aby mieć taką samą liczbę komórek w studzience laboratorium.
Dokładna liczba komórek jest bardzo ważna, aby zwiększyć przewidywalność liczby kropek kwantowych na komórkę Po dozowaniu komórki w H, cóż, należy inkubować labat przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni z 7% CO2. Kolejnym krokiem jest przygotowanie kropki kwantowej sprzężonej z przeciwciałami. Kropki kwantowe to małe fluorescencyjne nanocząstki.
Cząstki te cieszą się tutaj bardzo dużym zainteresowaniem, ponieważ są bardzo jasne i stabilne w porównaniu z klasyczną sondą fluorescencyjną i sygnałem. Stosunek nosa jest bardzo ważny dla tego typu eksperymentów. W tym przypadku używamy kompletnego podłoża do nasycenia pasków wokół kropek kwantowych i zapobieżenia agregacji.
Następnie mieliśmy kropki kwantowe w białku lub przeciwciałach o podwyższonym bioTE w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać statystycznie więcej monowalentnych kropek kwantowych. W tym eksperymencie używamy fragmentu a a b przeciwko receptorowi EGF wytwarzanemu w laboratorium z przeciwciał monoklonalnych, które są ukierunkowane na biotynę. Podczas inkubacji trwającej około 15 minut można utrzymać kontrolę w stanie agregacji i jednorodności za pomocą wytrząsarki o prędkości 1 200 obrotów na minutę i dwóch pięciu stopniach.
Gdy mieszanka będzie gotowa, możesz dodać ją do swoich komórek. Usuń pożywkę z dołka bardzo delikatnie, aby zapobiec oderwaniu się komórek od technologii laboratoryjnej i dodaj potrzebną ilość mieszanki do eksperymentu. W takim przypadku dodamy 100 mikrolitrów mieszanki do dołka.
Po dodaniu mieszanki możesz inkubować komórkę przez 15 minut. W tym przypadku przy 37 stopniach z 7% CO2. Po tej inkubacji można znaleźć dużą liczbę częstych bliźniaczych kropek w zawiesinie na podłożu.
Te kropki kwantowe powinny zostać usunięte przed obrazowaniem. Z powodu hałasu, który przynosimy. Dlatego musimy umyć każdą z nich, w tym przypadku kilka razy, pięć razy, aby się umyć.
Używać podłoża obrazowego bez autofluorescencji. Tutaj używamy bufora HBSS z aps. Teraz twoje komórki są gotowe.
Nadszedł czas, aby przejść do konfiguracji w celu nabycia. Zestaw składa się z czterech głównych części: odwróconego mikroskopu, kamery z czułością oka, mocnej lampy rtęciowej i inkubatora do utrzymywania komórki pod kątem 37 stopni. Światło z lampy rtęciowej przechodzi przez włókno i koło filtrujące przed oświetleniem próbki.
Grypa eSense próbki jest filtrowana i zbierana przez kamerę E-M-C-C-D po lewej stronie. Obecnie używamy 1.3 i 1.49 apertury numerycznej oleju do celów handlowych. Centralnym krokiem tego eksperymentu jest samo nabycie.
Gdy komórki są już ostre, patrzymy na reprezentatywny z silną etykietą. W kropkach kwantowych najpierw uzyskujemy pojedynczy obraz w przechodzącym świetle białym, który może być następnie wykorzystany do sprawdzenia aspektu komórki i specjalnego limitu LA Podia. Następnie uzyskujemy wideo zazwyczaj z szybkością 36 milisekund, co jest najszybszą szybkością dozwoloną w pełnej klatce.
Używamy CCD mnożącego elektrony, aby osiągnąć czułość pojedynczej cząsteczki z wystarczającym stosunkiem sygnału do północy co najmniej powyżej 20 decybeli. Zazwyczaj około 25 decybeli, zwykle uzyskujemy 300 klatek. Aby ocenić dany zestaw danych, wystarczy podać przepustkę do katalogu zawierającego pliki wideo.
Następnie wpisując polecenie, tekst ponownie łączy się w MetLab lub komenda MTT 23 I, która najpierw wyświetla listę interfejsu graficznego. Wszystkie użyte parametry uruchomią w pełni zautomatyzowaną analizę. Podstawowa analiza MTT jest wykonywana na każdej klatce, wywołując trzy główne zadania, pierwsze wykrywanie dla każdego piksela obecności lub braku docelowego długu kwantowego.
Następnie dla każdej detekcji estymacja celu istotne parametry, takie jak położenie pikseli, intensywność sygnału i tak dalej. Ostatnie ponowne połączenie nowych celów. Ze śladami już zbudowanymi w poprzednich klatkach dla każdego piksela.
Biorąc pod uwagę podregion lokalny, porównujemy dwie hipotezy dotyczące obecności: albo samego szumu, albo sygnału. Dzięki funkcji rozrzutu punktowego, ModuLite ma szczyt hin. Używamy progu zapewniającego wystarczająco niską liczbę fałszywych alarmów z mniej niż jedną detekcją perus na klatkę dla każdego wykrytego celu.
Następnie wykonujemy najmniejsze kwadratowe stopy odżywcze ducha, aby oszacować pozycję, szerokość i wysokość wykrytego Goshena. Zapewnia to w szczególności pozycję komórki spic barwnika, zwykle z dokładnością około 10 do 20 nanometrów, ponieważ typowe stosunki sygnału do szumu przy pikach o dużej gęstości mogą być często zbyt zamknięte, a silne piki mogą utrudniać najsłabszym radzenie sobie z tym. Opróżniamy wykryte piki z początkowego uruchomionego obrazu.
Ponownie, detekcja na szczątkach może zazwyczaj przekrzywić 10% pików. Osiągnięcie prawie wyczerpującej detekcji jest bardzo owocne dla dokładnego ponownego połączenia. Następnie zestaw nowych celów jest dopasowywany do zestawu poprzednich śladów dla tego źrenicy.
W celu przypisania każdego śladu do celu, jeśli to możliwe, i obsługi ewentualnego mrugania, korzystamy ze wszystkich dostępnych informacji statystycznych uzyskanych z kroku detekcji. W związku z tym cele nie są przypisywane tylko do najbliższej trasy. W przypadku konfliktów, gdy ślady mogą się przecinać, co oznacza, że odpowiednie obszary badań nakładają się na siebie, weźmiemy pod uwagę statystyczną wartość intensywności, prędkości, szerokości i mrugania zarówno dla śladów, jak i dla celów.
Zapewnia to statystycznie optymalny wynik ponownego połączenia. Strategia pozwala unikać, jeśli to możliwe, przechylając ponowne połączenie w kierunku najbliższych sąsiadów, co oznacza najwolniejszy ruch. Następnie używamy funkcji do oceny możliwego przejściowego ograniczenia w obrębie trajektorii.
Ta funkcja jest odwrotnie proporcjonalna do lokalnej dyfuzji ustalonej przez Sextona Simpsona i współpracowników. Zastosowanie progu pozwala na zdefiniowanie epizodów ograniczonych lub nieograniczonych. Poprzez iterację tych ogólnych śladów, możemy w końcu zmapować dynamikę błony pod względem przejściowego uwięzienia, dowodów spowolnienia i można to przedstawić.
Alternatywnie, korzystając z wartości binarnych lub dyskretnych tego indeksu zamknięcia, domyślnie MTT automatycznie wykona te zadania, zapisując dla każdego filmu parametry wiersza dla każdego piku w pliku eski oraz dla dalszych zaawansowanych badań. Typowe wyniki, takie jak mapa śladów na każdej komórce i wykresy histogramów dla interesujących parametrów, intensywności szczytów, stosunku sygnału do szumu, lokalnych niedoborów, a więc ten aspekt można również łatwo dostosować do dowolnego dedykowanego badania. Ten film podsumuje teraz typowe wyniki uzyskane przez MTT.
Znaczna część pracy polega na opracowaniu algorytmu, który może wymagać dostosowania do dedykowanych badań, takich jak cierpiące tryby ruchu lub interakcje. Ale prowadzenie MTT jest bardzo proste. Użytkownicy powinni zoptymalizować tylko kilka parametrów, takich jak limity miejsca i czasu.
Opracowując MTT, staraliśmy się całkowicie ponownie rozważyć opcje analityczne wykorzystywane do każdego zadania. Optymalizujemy proces na dwóch wymagających osiach. Po pierwsze, radzenie sobie z wysokimi gęstościami w celu uzyskania najlepszych informacji specjalnych nad powierzchnią, a po drugie, radzenie sobie ze słabym SNR, który zazwyczaj pozwala na pracę przy niskiej eliminacji i ograniczeniu z dużą prędkością, może być interpretowane jako sygnatura podstawowej interakcji.
Receptory błonowe mogą na przykład wchodzić w interakcje z cytoszkieletem podbłonowym lub domenami prolipidowymi. Takie zdarzenia mogą być badane poprzez zmiany w czasie i przestrzeni. Środki dynamiczne można porównać z podejściami uzupełniającymi, takimi jak FRA, F, Cs lub fracht.
Otwarty kod źródłowy jest dostępny do badań akademickich. Można go pobrać z naszej strony internetowej pod adresem CML dot univ jeśli S fr na naszej stronie zespołów, która zawiera link do pobrania. Zainteresowanych branż zapraszamy również do kontaktu.
Serdecznie dziękujemy członkom naszego zespołu oraz wspólnego zaplecza za wsparcie i owocne dyskusje. Projekt ten jest wspierany przez fundusze z CNRS w c MAA University Pac Region National de La, a Foundation Medical jest wspierana przez kontrolera ligi. Dzięki za oglądanie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowy algorytm do śledzenia pojedynczo oznaczonych cząsteczek wewnątrz błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda koncentruje się na receptorze czynnika wzrostu naskórka jako modelu, zapewniając wszechstronne narzędzie do badania dynamiki błony na skalę nanometrową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Receptor czynnika wzrostu naskórka jest białkiem transbłonowym.
- Śledzenie dynamiki molekularnej jest kluczowe dla zrozumienia procesów komórkowych.
- Wykrywanie i śledzenie cząsteczek o wysokiej gęstości poprawia dokładność eksperymentów.
- Współpraca z ekspertami od analizy obrazów poprawia rozwój algorytmu.
Cel badania
- Rozwój przyjaznego dla użytkownika algorytmu do śledzenia cząsteczek.
- Badanie dynamiki na skalę nanometrową białek błonowych.
- Wykorzystanie receptora czynnika wzrostu naskórka jako modelu dla techniki.
Stosowane metody
- Rozwój dedykowanego algorytmu śledzenia.
- Oznaczanie receptora czynnika wzrostu naskórka monoklonalnym przeciwciałem.
- Biotynylacja fragmentu przeciwciała dla łączenia kwantowych kropek.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania do zbierania danych.
Główne wyniki
- Algorytm skutecznie śledzi oznaczone cząsteczki w czasie rzeczywistym.
- Wykrywanie o wysokiej gęstości pozwala na szczegółową analizę dynamiki błony.
- Metoda dostarcza wglądu w zachowanie białek transbłonowych.
- Współpraca z ekspertami zwiększa solidność wyników.
Wnioski
- Opracowany algorytm jest skuteczny w śledzeniu białek błonowych.
- Ta technika może poprawić zrozumienie dynamiki komórkowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne białka transbłonowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Mapping molecular diffusion in the plasma membrane enables precise characterization of receptor dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. By providing high-density, single-molecule tracking data, Multiple-Target Tracing (MTT) enhances predictive confidence in understanding protein interactions and confinement events critical for signaling pathway analysis. This approach addresses a key discovery-stage challenge: obtaining quantitative, spatially resolved insights into membrane organization that inform lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping receptor localization, mobility, and confinement patterns at nanometer scale.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of receptor interactions with signaling partners or scaffolds.
- Predictive Value: Generates quantitative descriptors such as diffusion coefficients and confinement indices to assess target behavior under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline receptor dynamics in live cells.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through high-density detection and algorithmic trace reconnection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across membrane protein targets due to MTT’s applicability at any scale, from molecules to cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase membrane dynamics to preclinical validation by enabling comparison of receptor behavior across model systems.
- Mechanistic De-risking: Identifies confinement variations that may reflect underlying interactions with cytoskeleton or lipid domains, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides dynamic measures that complement complementary approaches like FRAP or FCS for informed go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
MTT fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a reusable capability for studying membrane protein dynamics across multiple projects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying receptor confinement, slowdown, and interaction signatures in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through high spatiotemporal resolution and quantitative outputs like peak intensity and signal-to-noise ratio.
- Analytics: Provides statistical outputs including local diffusion values and confinement indices that enable cross-condition comparison and trajectory classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing dynamic measures to be compared with orthogonal techniques for target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized tracking algorithm applicable to diverse transmembrane proteins, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct nanoscale observation of receptor dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated peak detection, estimation, and reconnection with deflation to handle high-density labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying quantitative, replication-ready data that reduce late-stage biological risk in target advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering dynamic membrane phenotype data that inform target selection and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule videomicroscopy and image analysis for optimal setup and parameter tuning.
- Depends on instrumentation capable of high-speed, low-noise acquisition, including EM-CCD cameras and mercury lamp illumination.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols, quantum dot conjugation, and imaging conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying MTT to different model systems or membrane protein targets beyond EGFR.
- Includes practical limitations such as the need for high labeling density and manageable signal-to-noise ratios to ensure accurate peak detection and trace reconnection.
