Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)
27 maja 2012
Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.
Witajcie. W tym filmie prezentujemy pełny eksperyment śledzenia pojedynczych kwantów. Dedykowany algorytm został w całości opracowany we współpracy z ekspertami z ISIS z zakresu analizy obrazu. W trakcie tego filmu wykorzystamy receptor epidermalnego czynnika wzrostu jako model do opisania metody tej techniki.
Receptor epidermalnego czynnika wzrostu jest białkiem transbłonowym. Receptor ten zostanie oznakowany za pomocą przeciwciała monoklonalnego, które zostanie zredukowane tak, aby zachować jedynie fragment Fab. Fragment Fab zostanie biotynilowany, a następnie po powiązaniu ze streptawidyną kropki kwantowej, cały układ precyzyjnie rozpozna receptor EGF.
Naszym celem jest zapewnienie kompleksowego spojrzenia na dynamikę receptorów powierzchni komórkowych. W istocie trajektorie molekularne mogą odbiegać od dyfuzji Browna poprzez ograniczenie w obrębie nanodomen. Może to być na przykład sygnatura zachodzącej interakcji, na przykład z partnerami sygnałowymi lub rusztowaniami molekularnymi.
Dążymy do wyczerpującego opisania takich zdarzeń poprzez ich mapowanie w obrębie komórki, co wymaga pracy przy wysokiej rozdzielczości czasowej SPECT oraz wysokiej gęstości znakowania. Podejście to nazywamy zatem śledzeniem wielu celów (multi-target tracing). Pierwszym krokiem eksperymentu jest przygotowanie próbki.
Pracujemy na żywych komórkach z dodatkiem lub bez dodatku antybiotyków. W tym przypadku wykorzystujemy komórki COS-7, które endogennie wykazują ekspresję receptorów EGF. Po odłączeniu komórek musimy dokładnie potwierdzić ich liczbę, aby w każdym dołku płytki laboratoryjnej znajdowała się taka sama liczba komórek.
Precyzyjna liczba komórek jest bardzo ważna dla zwiększenia przewidywalności liczby kropek kwantowych na komórkę. Po wysianiu komórek w dołku H, należy inkubować hodowlę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przy 7% CO2. Kolejnym krokiem jest przygotowanie kropek kwantowych sprzężonych z przeciwciałami. Kropki kwantowe to małe fluorescencyjne nanocząstki.
Cząsteczki te budzą tutaj duże zainteresowanie, ponieważ są bardzo jasne i stabilne w porównaniu z klasycznymi sondami fluorescencyjnymi i ich sygnałem. Stosunek sygnału do szumu jest bardzo istotny w tego typu eksperymentach. W tym przypadku stosujemy pełną pożywkę w celu nasycenia miejsc wiązania wokół kropek kwantowych i zapobiegania agregacji.
Następnie zmieszaliśmy kropki kwantowe z biotynilowanym białkiem lub przeciwciałami o interesującym nas profilu w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać statystycznie więcej monowalentnych kropek kwantowych. W tym eksperymencie wykorzystujemy fragment Fab przeciwko receptorowi EGF, wytworzony w laboratorium z przeciwciał monoklonalnych i znakowany biotyną. Podczas inkubacji trwającej około 15 minut można kontrolować proces agregacji i homogeniczności, używając wytrząsarki ustawionej na 1 200 obrotów na minutę w temperaturze 25 °C.
Gdy mieszanina będzie gotowa, można ją dodać do komórek. Bardzo ostrożnie usuń medium z dołka, aby zapobiec odrywaniu się komórek podczas pracy technika laboratoryjnego, a następnie dodaj wymaganą dla Twojego eksperymentu ilość mieszaniny. W tym przypadku dodamy 100 µL mieszaniny na dołek.
Po dodaniu mieszaniny można inkubować komórki przez 15 minut. W tym przypadku w temperaturze 37°C przy 7% CO2. Po tej inkubacji w medium w zawiesinie można zauważyć dużą liczbę często występujących podwójnych kropek.
Te kropki kwantowe powinny zostać usunięte przed obrazowaniem. Wynika to z szumu, który wprowadzają. Dlatego musimy przemyć każdą studzienkę kilka razy, w tym przypadku pięć razy, aby je wypłukać.
Użyj medium do obrazowania bez autofluorescencji. W tym przypadku zastosowano bufor HBSS z dodatkiem aps. Teraz komórki są przygotowane.
Czas przejść do konfiguracji systemu akwizycji. Układ składa się z czterech głównych elementów: odwróconego mikroskopu, kamery o wysokiej czułości, mocnej lampy rtęciowej oraz inkubatora utrzymującego komórki w temperaturze 37 °C. Światło z lampy rtęciowej przechodzi przez światłowód i koło filtrowe, zanim oświetli próbkę.
Fluorescencja próbki jest filtrowana i rejestrowana przez kamerę E-M-C-C-D po lewej stronie. Obecnie stosujemy obiektywy imersyjne olejowe o aperturze numerycznej 1,3 oraz 1,49. Centralnym etapem tego eksperymentu jest sama akwizycja.
Po ustawieniu komórek w płaszczyźnie ostrości, analizujemy jedną reprezentatywną komórkę z silnym znakowaniem. W przypadku kropek kwantowych najpierw wykonujemy pojedynczy obraz w transmitowanym białym świetle, który może służyć do późniejszej weryfikacji wyglądu komórki i granicy specjalnej podia LA. Następnie rejestrujemy wideo, zazwyczaj z częstotliwością 36 milisekund, co jest najszybszą prędkością możliwą do uzyskania przy pełnej klatce.
Używamy kamery CCD z mnożeniem elektronów, aby osiągnąć czułość na poziomie pojedynczych cząsteczek przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym co najmniej 20 dB. Zazwyczaj wynosi on około 25 dB, a my zazwyczaj pozyskujemy 300 klatek. Aby ocenić dany zestaw danych, należy podać jedynie ścieżkę do katalogu zawierającego pliki wideo.
Następnie po wpisaniu polecenia tekst łączy się w MetLab lub po wpisaniu polecenia MTT 23 I, które najpierw wyświetla interfejs graficzny z listą. Wszystkie użyte parametry uruchomią w pełni zautomatyzowaną analizę. Rdzeń analizy MTT jest wykonywany dla każdej klatki, wywołując trzy główne zadania, z których pierwszym jest detekcja dla każdego piksela pod kątem obecności lub braku kwantowego długu celu.
Następnie dla każdego wykrycia wykonuje się estymację istotnych parametrów celu, takich jak jego pozycja w pikselach, intensywność sygnału i tak dalej. Na koniec następuje rekomplikacja nowych celów z trasami już zbudowanymi w poprzednich klatkach dla każdego piksela.
Biorąc pod uwagę lokalny podregion, porównujemy dwie hipotezy dotyczące obecności: albo występuje tylko szum, albo występuje sygnał. Z uwagi na funkcję rozproszenia punktowego, ModuLite posiada wąski pik. Stosujemy próg zapewniający wystarczająco niski poziom fałszywych alarmów, z liczbą mniej niż jedną detekcją błędną na klatkę dla każdego wykrytego celu.
Następnie wykonujemy dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do funkcji Gaussa, aby oszacować pozycję, szerokość i wysokość wykrytego piku. Pozwala to w szczególności na określenie precyzyjnej pozycji barwnika, zazwyczaj z dokładnością rzędu 10 do 20 nanometrów dla typowych stosunków sygnału do szumu. Przy wysokiej gęstości piki mogą być często zbyt blisko siebie, a silne piki mogą przesłaniać te słabsze; aby temu zaradzić, stosujemy deflację wykrytych pików z obrazu początkowego.
Ponownie, detekcja na residuum może zazwyczaj ponownie zniekształcić 10% pików. Osiągnięcie niemal wyczerpującej detekcji jest bardzo owocne dla dokładnej rekompozycji trajektorii. Następnie zestaw nowych celów jest dopasowywany do zestawu poprzednich śladów dla danej źrenicy.
Aby w miarę możliwości przypisać każdy ślad do celu, uwzględniając potencjalne migotanie (blinking), wykorzystujemy wszystkie dostępne informacje statystyczne uzyskane na etapie detekcji. W związku z tym cele nie są przypisywane po prostu do najbliższego śladu. W przypadku konfliktów, gdy ślady mogą się przecinać, co oznacza nakładanie się odpowiednich obszarów badawczych, będziemy brać pod uwagę statystyczne wartości intensywności, prędkości, szerokości oraz migotania zarówno dla śladów, jak i dla celów.
Dostarcza to statystycznie optymalnego wyniku ponownego łączenia (reconnection score). Strategia ta pozwala, tam gdzie to możliwe, unikać obciążania procesu ponownego łączenia w stronę najbliższych sąsiadów, co oznaczałoby najwolniejszy ruch. Następnie wykorzystujemy funkcję do oceny możliwego przejściowego uwięzienia (transient confinement) w obrębie trajektorii.
Funkcja ta jest odwrotnie proporcjonalna do lokalnej dyfuzji, co zostało wykazane przez Sextona Simpsona i współpracowników. Zastosowanie progu pozwala na zdefiniowanie epizodów z ograniczeniem ruchu lub bez niego. Poprzez iterację tego procesu na wszystkich śladach, możemy ostatecznie zmapować dynamikę błony pod kątem przejściowego ograniczenia ruchu oraz dowodów na spowolnienie, co można następnie przedstawić graficznie.
Alternatywnie, wykorzystując wartości binarne lub dyskretne tego indeksu ograniczenia, MTT domyślnie automatycznie wykona te zadania, zapisując dla każdego filmu parametry wierszy dla każdego piku w pliku eski, z myślą o dalszych zaawansowanych badaniach. Typowe wyniki, takie jak mapa śladów dla każdej komórki i wykresy histogramów dla interesujących parametrów, intensywności piku, stosunku sygnału do szumu oraz lokalnych wartości deficytowych, pozwalają na łatwe dostosowanie tego aspektu do dowolnych dedykowanych analiz. Niniejszy film podsumuje teraz typowe wyniki uzyskane za pomocą MTT.
Znaczna część pracy polega na opracowaniu algorytmu, który może wymagać dostosowania do konkretnych badań, takich jak różne tryby ruchu lub oddziaływania. Jednak uruchomienie MTT jest bardzo proste. Użytkownicy powinni zoptymalizować jedynie kilka parametrów, takich jak ograniczenia przestrzenne i czasowe.
Opracowując MTT, dążyliśmy do całkowitego przemyślenia opcji analitycznych wykorzystywanych w każdym zadaniu. Optymalizujemy ten proces wzdłuż dwóch trudnych osi. Po pierwsze, radzimy sobie z wysokimi gęstościami, aby uzyskać najlepsze informacje przestrzenne z powierzchni, a po drugie, obsługujemy słaby SNR, co zazwyczaj pozwala na pracę przy niskim poziomie eliminacji i wysokiej prędkości; ograniczenie obszaru ruchu może być interpretowane jako sygnatura zachodzącej interakcji.
Receptory błonowe mogą oddziaływać na przykład z podbłonowym cytoszkieletem lub domenami lipidowymi. Takie zdarzenia można badać poprzez analizę zmienności ograniczenia przestrzennego (confinement) w przestrzeni i czasie. Pomiary dynamiczne można porównać z podejściami komplementarnymi, takimi jak FRAP, FCS lub FRET.
Kod open source jest dostępny do celów badań akademickich. Można go pobrać z naszej strony internetowej pod adresem CML kropka univ if an S fr na stronie naszego zespołu, gdzie znajduje się link do pobierania. Zapraszamy również zainteresowane podmioty przemysłowe do kontaktu z nami.
Chcielibyśmy szczególnie podziękować członkom naszego zespołu oraz pracownikom wspólnych zaplecz badawczych za wsparcie i owocne dyskusje. Projekt ten jest finansowany ze środków CNRS w c MAA University Pac Region National de La, a Foundation Medical jest wspierana przez league controller. Dziękujemy za uwagę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowy algorytm do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta skupia się na receptorze epidermalnego czynnika wzrostu jako modelu, stanowiąc kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błony w skali nanometrycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Receptor epidermalnego czynnika wzrostu jest białkiem transbłonowym.
- Śledzenie dynamiki molekularnej jest kluczowe dla zrozumienia procesów komórkowych.
- Detekcja i śledzenie cząsteczek o wysokiej gęstości zwiększają dokładność eksperymentalną.
- Współpraca z ekspertami w dziedzinie analizy obrazu usprawnia opracowywanie algorytmów.
Cel badania
- Opracowanie przyjaznego dla użytkownika algorytmu do śledzenia cząsteczek.
- Zbadanie dynamiki nanoskalowej białek błonowych.
- Wykorzystanie receptora epidermalnego czynnika wzrostu jako modelu dla zastosowanej techniki.
Zastosowane metody
- Opracowanie dedykowanego algorytmu śledzenia.
- Oznakowanie receptora epidermalnego czynnika wzrostu za pomocą przeciwciała monoklonalnego.
- Biotynylacja fragmentu przeciwciała w celu połączenia z kropką kwantową.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania do gromadzenia danych.
Główne wyniki
- Algorytm skutecznie śledzi znakowane cząsteczki w czasie rzeczywistym.
- Detekcja o wysokiej gęstości umożliwia szczegółową analizę dynamiki błon.
- Metoda dostarcza wiedzy na temat zachowania białek transbłonowych.
- Współpraca z ekspertami zwiększa wiarygodność otrzymanych wyników.
Wnioski
- Opracowany algorytm jest skuteczny w śledzeniu białek błonowych.
- Technika ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia dynamiki komórkowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne białka transbłonowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej umożliwia precyzyjną charakterystykę dynamiki receptorów, co wspiera walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Dzięki dostarczaniu danych z śledzenia pojedynczych cząsteczek o wysokiej gęstości, metoda Multiple-Target Tracing (MTT) zwiększa pewność prognostyczną w rozumieniu oddziaływań białkowych oraz zdarzeń ograniczenia przestrzennego (confinement), które są kluczowe dla analizy szlaków sygnalizacyjnych. Podejście to rozwiązuje kluczowy problem etapu odkrywania: pozyskiwanie ilościowych, rozdzielczych przestrzennie informacji o organizacji błony, które warunkują identyfikację związków wiodących oraz decyzje dotyczące selekcji portfela projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie lokalizacji, mobilności i wzorców ograniczenia receptorów w skali nanometrycznej.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji oddziaływań receptorów z partnerami sygnałowymi lub rusztowaniami białkowymi.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe deskryptory, takie jak współczynniki dyfuzji i indeksy ograniczenia, w celu oceny zachowania celu w warunkach fizjologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowej dynamiki receptorów w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność testów dzięki detekcji o wysokiej gęstości oraz algorytmicznemu łączeniu śladów.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych białek błonowych dzięki możliwości zastosowania MTT w każdej skali, od cząsteczek po komórki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dynamikę błon w fazie odkrywczej z walidacją przedkliniczną, umożliwiając porównanie zachowania receptorów w różnych systemach modelowych.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Identyfikuje różnice w ograniczeniu dyfuzji, które mogą odzwierciedlać podstawowe oddziaływania z cytoszkieletem lub domenami lipidowymi, co zmniejsza niejednoznaczność w określaniu mechanizmu celu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza pomiarów dynamicznych uzupełniających inne podejścia, takie jak FRAP lub FCS, w celu podejmowania świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Integracja potoku i przepływu pracy
MTT wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną – oferując możliwość wielokrotnego wykorzystania w badaniu dynamiki białek błonowych w ramach wielu projektów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację uwięzienia receptorów, spowolnienia oraz sygnatur oddziaływań w żywych komórkach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej i wynikom ilościowym, takim jak maksymalna intensywność oraz stosunek sygnału do szumu.
- Analityka: Dostarcza wyników statystycznych, w tym lokalnych wartości dyfuzji i indeksów uwięzienia, co umożliwia porównywanie różnych warunków oraz klasyfikację trajektorii.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając porównywanie pomiarów dynamicznych z technikami ortogonalnymi w celu walidacji celu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pełni funkcję zstandaryzowanego algorytmu śledzenia, który można zastosować do różnych białek transbłonowych, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej obserwacji dynamiki receptorów w skali nanometrycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez zautomatyzowaną detekcję, szacowanie i ponowne łączenie pików z wykorzystaniem deflacji w celu obsługi gęstego znakowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go, dostarczając ilościowych, gotowych do replikacji danych, które zmniejszają ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki dostarczeniu danych o dynamicznym fenotypie błony, które informują wybór celu i alokację zasobów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie wideomikroskopii pojedynczych cząsteczek oraz analizy obrazu w celu optymalnego ustawienia i dostrojenia parametrów.
- Zależy od instrumentacji umożliwiającej szybką akwizycję z niskim poziomem szumów, w tym kamer EM-CCD i oświetlenia lampą rtęciową.
- Wymaga standaryzacji protokołów znakowania, koniugacji kropek kwantowych oraz warunków obrazowania pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy stosowaniu MTT do różnych systemów modelowych lub białek błonowych innych niż EGFR.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba uzyskania wysokiej gęstości znakowania i akceptowalnego stosunku sygnału do szumu, aby zapewnić dokładną detekcję pików i prawidłowe łączenie śladów.
