Name: Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą śledzenia wielu celów (MTT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj algorytm MTT do śledzenia pojedynczych cząsteczek w błonie komórkowej z wysoką gęstością etykietowania. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki receptorów EGF w skali nanometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom naszego zespołu, w szczególności MC Blache za pomoc techniczną, a także M Irla i B Imhof za wsparcie i owocne dyskusje. Ryciny dotyczące deflacji i ograniczenia przestrzennego (confinement) zostały powtórzone dzięki uprzejmości Nature Methods. Projekt ten jest wspierany przez granty instytucjonalne CNRS, INSERM i Uniwersytetu w Marsylii, a także przez specyficzne granty z Région Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI-0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) oraz Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z Ligue Nationale Contre le Cancer.

<ol><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).</li>
<li>Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+molecule+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).</li>
<li>Lommerse, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+the+H-ras+membrane-anchor+reveals+domains+in+the+cytoplasmic+leaflet+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane.</a> Biophys. J. 86, 609-616 (2004).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+dynamics+of+glycine+receptors+revealed+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Harms, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+l-type+Ca%282%2B%29+channels+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells.</a> Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).</li>
<li>Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+of+green+fluorescent+proteins+in+living+cells%3A+E-cadherin+forms+oligomers+on+the+free+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface.</a> Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).</li>
<li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+EGFR+signalling+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells.</a> Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).</li>
<li>Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+microdomains+in+a+muscle+cell+membrane+visualized+by+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy.</a> Embo. J. 19, 892-901 (2000).</li>
<li>Seisenberger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+of+the+infection+pathway+of+an+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus.</a> Science. 294, 1929-1932 (2001).</li>
<li>Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+fluid+mosaic+model+of+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Revisiting the fluid mosaic model of membranes.</a> Science. 268, 1441-1442 (1995).</li>
<li>Saffman, P. G., Delbruck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brownian motion in biological membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Papoulis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapoulis%2C+A+%22Probability%2C+Random+Variables+and+Stochastic+Process+277%22">Probability, Random Variables and Stochastic Process 277</a>. , McGraw Hill. (2001).</li>
<li>Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).</li>
<li>Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mountains+yield+nanoscale+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mountains yield nanoscale cell images.</a> Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Andrew, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).</li>
<li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E.+Stat.+Nonlin.+Soft.+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+effects+of+corrals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li>
<li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li>
<li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li>
<li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li>
<li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labelling+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li>
<li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li>
<li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li>
<li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li>
<li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li>
<li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions%3A+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W śledzeniu pojedynczych cząsteczek, poza aspektami dotyczącymi komórek i mikroskopii, analiza stanowi istotną część pracy. Dotyczy to algorytmu wykorzystywanego do wykonania trzech głównych zadań: detekcji, estymacji i ponownego łączenia pików w każdej klatce. Kolejnym aspektem tej pracy jest dopracowanie samego algorytmu, który może wymagać adaptacji do każdego nowego, dedykowanego badania, w szczególności w przypadku końcowych, dodatkowych kroków (takich jak określanie trybów ruchu, oddziaływań lub stechiometrii)....

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa Cos-7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>5 000 komórek/dołek</td></tr><tr><td>HBSS bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>płytka Lab-tek 8-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155441</td><td>1</td></tr><tr><td>streptawidyna QDot-605</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Biotynilowany fragment Fab&lt;/strong&gt; (w celu syntezy fragmentów Fab należy zapoznać się z publikacją &lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fragment Fab przeciwciała monoklonalnego 108</td><td>ATCC</td><td>HB-9764</td><td>200 &amp;mu;g</td></tr><tr><td>NHS-biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21435</td><td>18.5 &amp;mu;g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pożywka kompletna&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41965</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>pirowinian sodu</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>11360</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Medium obrazujące&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS z Ca2+&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td>250 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE2000U</td><td></td></tr><tr><td>Lampa fluorescencyjna</td><td>Nikon Instruments</td><td>Intensilight C-HGFIE</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 100x o aperturze numerycznej (NA) 1,3</td><td>Nikon Instruments</td><td>Obiektyw Plan Fluor 1,30</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw 100x NA 1,49</td><td>Nikon Instruments</td><td>APO TIRF 1.49</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Roper Scientific</td><td>Kaskada 512 B</td><td></td></tr><tr><td>Komora termostatowana</td><td>Usługi obrazowania żywych komórek</td><td>Pudełko</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dodatek: przykładowy skrypt uzupełniającej analizy MTT</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;funkcja&lt;/strong&gt; MTT_przykład(nazwa_pliku)&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Podstawowe przykłady pokazujące, jak odzyskać wyniki wyjściowe z MTT&lt;br/&gt;%%% aby wykreślić każdy ślad i sporządzić histogram &lt;br/&gt;%%% intensywności fluorescencji&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;jeśli&lt;/strong&gt; nargin&amp;<1 % brak podanej nazwy pliku?&lt;br/&gt;pliki = dir('*.stk'); &lt;br/&gt;&lt;strong&gt;jeśli&lt;/strong&gt; isempty(files), disp('brak danych w bieżącym katalogu'), &lt;strong&gt;powrót, koniec&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;file_name = files(1).name; % domyślnie: pierwszy plik stk&lt;br/&gt;disp(['używanie' file_name 'domyślnie'])&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Koniec&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % plik wyjściowy</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%% Wczytaj dane&lt;br/&gt;&lt;/em&gt; cd('output23') % lub (&amp;#8216;wynik22'), zgodnie z używaną wersją&lt;br/&gt;&lt;em&gt;% Zastrzeżenie: wersja 2.2 generuje tylko 7 parametrów,&lt;br/&gt;% w wersji 2.3 dodano dodatkowy parametr: szum (noise)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;% Aby odczytać wszystkie parametry jednocześnie, w jednej tabeli&lt;br/&gt;% tab_param = fread_all_param(file_param);&lt;br/&gt;% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ...&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;% Aby odczytać wszystkie parametry (z wyjątkiem frame_number) w osobnych tabelach&lt;br/&gt;% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); &lt;em&gt;% indeks wynosi 3, ponieważ jest to numer śladu &amp;numer klatki, który nie dostarcza istotnych informacji, zostaje odrzucony!&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);&lt;br/&gt;tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);&lt;br/&gt;tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%% Pętla dla śladów&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;N_traces = size(tab_i,1);&lt;br/&gt;&lt;em&gt;% Tabele mają N_traces wierszy i N_frames kolumn&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;dla&lt;/strong&gt; itrc = 1:N_traces &lt;br/&gt;No_blk_index = tab_blk(itrc, :)&amp;gt;0; &lt;em&gt;% tylko etapy bez migotania&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))&lt;br/&gt;xlabel('i (piksel)'), ylabel('j (piksel)')&lt;br/&gt;title(['ścieżka nr ' num2str(itrc)])&lt;br/&gt;disp('Proszę nacisnąć dowolny klawisz, aby przejść do następnego śladu'), pause&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Koniec&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;%% Histogram fluorescencji&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;N_datapoints = sum(tab_blk(:)&amp;gt;0); &lt;em&gt;% tylko kroki bez migotania&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;hist(tab_alpha(tab_blk&amp;gt;0),2*sqrt(N_datapoints)) &lt;em&gt;% stosując 2sqrt(N) przedziałów&lt;/em&gt;&lt;br/&gt;xlabel('intensywność (a.u.)'), ylabel('częstotliwość występowania')&lt;br/&gt;tytuł('histogram intensywności fluorescencji cząstek')</td></tr></tbody></table>

mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą multiple-target tracing (mtt)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Naszym celem jest uzyskanie kompleksowego opisu procesów molekularnych zachodzących w błonach komórkowych w różnych funkcjach biologicznych. Dążymy do scharakteryzowania złożonej organizacji i dynamiki błony plazmatycznej na poziomie pojedynczych cząsteczek poprzez opracowanie narzędzi analitycznych dedykowanych śledzeniu pojedynczych cząstek (Single-Particle Tracking, SPT) przy wysokiej gęstości: śledzeniu wielu celów (Multiple-Target Tracing, MTT)1. Wideomikroskopia pojedynczych cząsteczek, oferująca rozdzielczość milisekundową i nanometryczną1-11, pozwala na szczegółowe przedstawienie organizacji błony12-14 poprzez dokładne mapowanie deskryptorów, takich jak lokalizacja, mobilność, ograniczenie przestrzenne lub oddziaływania receptorów komórkowych.
Ponownie przeanalizowaliśmy SPT, zarówno pod kątem eksperymentalnym, jak i algorytmicznym. Aspekty eksperymentalne obejmowały optymalizację układu i znakowania komórek, ze szczególnym naciskiem na osiągnięcie jak najwyższej gęstości znakowania, aby uzyskać dynamiczny obraz dynamiki molekularnej zachodzącej w błonie. Kwestie algorytmiczne dotyczyły każdego etapu rekonstrukcji trajektorii: detekcji szczytów, ich estymacji i łączenia, co rozwiązano za pomocą specyficznych narzędzi analizy obrazu15,16. Zaimplementowanie deflacji po detekcji pozwala na odzyskanie szczytów początkowo przesłoniętych przez sąsiednie, silniejsze szczyty. Warto zauważyć, że poprawa detekcji bezpośrednio wpływa na łączenie trajektorii poprzez redukcję przerw w ich przebiegu. Wydajność została oceniona przy użyciu symulacji Monte-Carlo dla różnych wartości gęstości znakowania i poziomu szumu, które zazwyczaj stanowią dwa główne ograniczenia dla pomiarów równoległych o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.
Dokładność nanometryczna17 uzyskiwana dla pojedynczych cząsteczek, przy użyciu następczego przełączania fotoaktywacyjnego on/off lub optyki nieliniowej, pozwala na przeprowadzenie wyczerpujących obserwacji. Stanowi to podstawę metod nanoskopii17, takich jak STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 lub STED22,23, które często wymagają obrazowania próbek utrwalonych. Kluczowym zadaniem jest detekcja i estymacja ograniczonych dyfrakcyjnie pików pochodzących od pojedynczych cząsteczek. Zatem, przy zastosowaniu odpowiednich założeń, takich jak przyjęcie stałej dokładności pozycyjnej zamiast ruchu Browna, MTT jest bezpośrednio odpowiednie do analiz nanoskopowych. Co więcej, MTT może być fundamentalnie stosowane w każdej skali: nie tylko dla cząsteczek, ale na przykład również dla komórek lub zwierząt. Tym samym MTT jest potężnym algorytmem śledzenia, który znajduje zastosowania w skalach molekularnej i komórkowej.

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Naszym celem jest uzyskanie kompleksowego opisu procesów molekularnych zachodzących w błonach komórkowych w ramach różnych funkcji biologicznych. Dążymy do scharakteryzowania złożonej organizacji i dynamiki błony plazmatycznej na poziomie pojedynczych cząsteczek poprzez opracowanie narzędzi analitycznych przeznaczonych do śledzenia pojedynczych cząstek (Single-Particle Tracking, SPT) przy wysokiej gęstości: Multiple-Target Tracing (MTT). Videomikroskopia pojedynczych cząsteczek, oferująca rozdzielczość milisekundową i nanometryczną, umożliwia szczegółowe przedstawienie organizacji błony poprzez dokładne mapowanie takich parametrów jak lokalizacja, mobilność, ograniczenie przestrzenne (confinement) lub interakcje receptorów komórkowych. Ponownie przeanalizowaliśmy metodę SPT, zarówno pod kątem eksperymentalnym, jak i algorytmicznym. Aspekty eksperymentalne obejmowały optymalizację układu oraz znakowanie komórek, ze szczególnym naciskiem na osiągnięcie jak najwyższej możliwej gęstości znakowania, aby uzyskać dynamiczny obraz dynamiki molekularnej zachodzącej w błonie. Kwestie algorytmiczne dotyczyły każdego etapu rekonstrukcji trajektorii: detekcji szczytów, ich estymacji oraz łączenia, co zrealizowano za pomocą specyficznych narzędzi analizy obrazu. Zastosowanie deflacji po detekcji pozwala na odzyskanie szczytów początkowo przesłoniętych przez sąsiednie, silniejsze szczyty. Warto zaznaczyć, że usprawnienie detekcji ma bezpośredni wpływ na łączenie trajektorii, redukując przerwy w ich przebiegu. Wydajność oceniono za pomocą symulacji Monte-Carlo dla różnych wartości gęstości znakowania i poziomu szumu, które zazwyczaj stanowią dwa główne ograniczenia dla pomiarów równoległych o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Dokładność nanometryczna uzyskana dla pojedynczych cząsteczek, z wykorzystaniem następczego przełączania on/off lub optyki nieliniowej, pozwala na przeprowadzenie wyczerpujących obserwacji. Stanowi to podstawę metod nanoskopowych, takich jak STORM, PALM, RESOLFT czy STED, które często wymagają obrazowania utrwalonych próbek. Kluczowym zadaniem jest detekcja i estymacja ograniczonych dyfrakcyjnie szczytów pochodzących od pojedynczych cząsteczek. Zatem przy zastosowaniu odpowiednich założeń, takich jak przyjęcie stałej dokładności pozycjonowania zamiast ruchu Browna, MTT jest bezpośrednio dostosowane do analiz nanoskopowych. Co więcej, MTT może być zasadniczo stosowane w każdej skali: nie tylko dla cząsteczek, ale na przykład także dla komórek lub zwierząt. W związku z tym MTT jest potężnym algorytmem śledzenia, który znajduje zastosowanie w skali molekularnej i komórkowej.

Witajcie. W tym filmie prezentujemy pełny eksperyment śledzenia pojedynczych kwantów. Dedykowany algorytm został w całości opracowany we współpracy z ekspertami z ISIS z zakresu analizy obrazu. W trakcie tego filmu wykorzystamy receptor epidermalnego czynnika wzrostu jako model do opisania metody tej techniki.Receptor epidermalnego czynnika wzrostu jest białkiem transbłonowym. Receptor ten zostanie oznakowany za pomocą przeciwciała monoklonalnego, które zostanie zredukowane tak, aby zachować jedynie fragment Fab. Fragment Fab zostanie biotynilowany, a następnie po powiązaniu ze streptawidyną kropki kwantowej, cały układ precyzyjnie rozpozna receptor EGF.Naszym celem jest zapewnienie kompleksowego spojrzenia na dynamikę receptorów powierzchni komórkowych. W istocie trajektorie molekularne mogą odbiegać od dyfuzji Browna poprzez ograniczenie w obrębie nanodomen. Może to być na przykład sygnatura zachodzącej interakcji, na przykład z partnerami sygnałowymi lub rusztowaniami molekularnymi.Dążymy do wyczerpującego opisania takich zdarzeń poprzez ich mapowanie w obrębie komórki, co wymaga pracy przy wysokiej rozdzielczości czasowej SPECT oraz wysokiej gęstości znakowania. Podejście to na

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwzorowanie dyfuzji cząłek w błonie plazmatycznej za pomocą wielotargetowego śledzenia (MTT)

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj algorytm MTT do śledzenia pojedynczych cząsteczek w błonie komórkowej z wysoką gęstością etykietowania. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki receptorów EGF w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Przeglądaj więcej filmów