Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych
7 sierpnia 2016
Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie danych z korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) poprzez połączenie informacji z immunocytochemii fluorescencyjnej z morfologią ultrastrukturalną z mikroskopii elektronowej transmisyjnej na jednym obrazie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunocytochemii i patologii, takie jak to, z jaką strukturą subkomórkową związany jest konkretny białko zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie tej samej sondy z nanocząsteczek kropek kwantowych do uzyskania zarówno sygnału z mikroskopii żywych komórek z docelowego białka, jak i lokalizacji strukturalnej w mikroskopii elektronowej.
Po utrwaleniu, zatopieniu i przygotowaniu skrawków tkanki guza somatostatinoma człowieka zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować roztwór kleju do skrawków, umieszczając 20 centymetrów przezroczystej taśmy klejącej w butelce o pojemności pięciu mililitrów zawierającej 2,0 mililitrów acetonu i pozostawiając ją na 10 minut. Należy wyjąć taśmę, zanurzyć w roztworze siateczkę niklową, a następnie wyjąć siateczkę i pozostawić ją do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu należy użyć matowej strony siateczki do pobrania ultrazcieńkiego skrawka.
Kluczowe jest ustalenie prawidłowego czasu trawienia dla wybranej formulacji żywicy. W przypadku tej formulacji odpowiedni jest czas 30 minut, jednak może on wymagać ponownego przeliczenia dla formulacji twardszych lub miększych. Przygotować jeden mililitr świeżego nasyconego roztworu trawiącego nadjodynanu sodu w wodzie destylowanej i nanieść krople roztworu na czystą powierzchnię folii laboratoryjnej.
Umieścić całkowicie suche siatki z przekrojami na kropelkach i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przenieść siatki do kropelek wody destylowanej na 60 sekund w celu ich wypłukania. Aby przeprowadzić znakowanie przeciwciałami i kropkami kwantowymi (QD) na czystej powierzchni folii laboratoryjnej, nanieść pipetą krople 0,05 M glicyny oraz PBS.
Umieść siateczki na kroplach i inkubuj przez 10 minut, aby zablokować resztkową aldehyd na skrawkach. Aby usunąć blokadę aldehydową, krótko osusz krawędź siateczki. Następnie umieść siateczkę na kropli jednego procentowego normalnego surowicy koziej (NGS) oraz jednego procentowego BSAC w PBS na 10 minut.
Przygotować jeden mililitr roztworu blokującego, dodając 10 µL NGS oraz 100 µL BSAC do 890 µL PBS. Następnie przeprowadzić kondycjonowanie skrawków, umieszczając je w kropli rozcieńczalnika przeciwciał na 10 minut. Następnie rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało przeciwko somatostatynie w rozcieńczalniku przeciwciał w stosunku 1:10 i umieścić siatki w kroplach otrzymanego roztworu.
Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po inkubacji usunąć odczynnik przeciwciał, osuszając krawędź siatki. Następnie przemyć przekroje dwa razy przez pięć minut za każdym razem, używając rozcieńczalnika przeciwciał.
Po rozcieńczeniu przeciwciała wtórnego w stosunku 1:10 i przygotowaniu kropel, inkubuj siatki w kroplach w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie usuń roztwór przeciwciał i przemyj preparaty dwukrotnie. Rozcieńcz kropki kwantowe (QDs) sprzężone ze streptawidyną w stosunku 1:10 i inkubuj próbki w kroplach roztworu w ciemności, w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
Następnie należy dwukrotnie przemyć siatki rozcieńczalnikiem do przeciwciał, za każdym razem przez pięć minut, a potem osuszyć krawędzie siatek. Dalej należy przemyć siatki wodą destylowaną przez dwie minuty, po czym ponownie osuszyć krawędzie. Przebarwiony immunocytochemicznie fragment siatki należy umieścić w kropli wody na szkiełku przedmiotowym i przykryć szkiełkiem nakrywnym.
Aby przeprowadzić fluorescencyjną mikroskopię świetlną, należy włożyć kostkę filtrów o następujących charakterystykach i zastosować oświetlenie LED o długości fali 365 nanometrów. Umieść preparat z barwieniem immunocytochemicznym na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Wykorzystaj mikroskopię świetlną do oceny wzoru znakowania, poziomu ewentualnego znakowania nieswoistego oraz do potwierdzenia, że kontrole negatywne są czyste.
Następnie należy wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) w odniesieniu do prętów siatki. Potem należy ustawić pełnokolorową kamerę cyfrową na tryb FL auto color i ustawić balans bieli na 3 200 K. Kamerę należy przełączyć w tryb automatycznej ekspozycji z ustawieniem gamma między 0,45 a 1,00 w celu optymalizacji wyglądu obrazów, a wzmocnienie analogowe ustawić na 1X. Należy kliknąć ikonę kamery w interfejsie graficznym oprogramowania ZEN Two Light, aby przejść do trybu podglądu na żywo. Następnie należy ustawić ostrość obrazu i kliknąć Snap w interfejsie graficznym oprogramowania ZEN Two Light, aby zapisać obraz w pamięci klatek.
Zapisz obrazy w formacie plików tf, aby uniknąć kompresji i pikselizacji. Przygotuj wydruk wskazujący położenie ROI w odniesieniu do prętów siatki lub innych istotnych punktów orientacyjnych tkanki. Następnie usuń siatkę z preparatu, przemyj go wodą destylowaną i delikatnie osusz krawędzie.
Aby przeprowadzić transmisyjną mikroskopię elektronową, przenieś siatkę do mikroskopu w celu badania przy napięciu przyspieszającym 100 kV. Rozpocznij od niskiego powiększenia, około 1 400X, aby zorientować się na siatce i zlokalizować obszary zainteresowania (ROI) zidentyfikowane podczas mikroskopii świetlnej. Obserwuj pojedyncze kropki kwantowe (QD) przy powiększeniu 70 000X lub wyższym.
Będą one widoczne jako nieregularne struktury krystaliczne o umiarkowanej gęstości elektronowej. Następnie, korzystając z interfejsu graficznego oprogramowania do obrazowania i cyfrowego aparatu z monochromatyczną matrycą o rozdzielczości 1 392 na 1 040 pikseli, kliknij ikonę aparatu, aby go włączyć i pozyskać obrazy. Przesuń ikonę aparatu do pozycji wyłączonej, aby zapisać obraz w pamięci klatek.
Aby przeprowadzić obrazowanie CLEM, należy wykorzystać wydruk z obrazowania mikroskopią świetlną do zlokalizowania odpowiadających im ROI za pomocą TEM. Cechy architektury tkanki są pomocne w nawigacji po preparacie. Następnie należy zarejestrować obraz odpowiadającego ROI za pomocą TEM.
Następnie, aby przygotować obraz CLEM, należy upewnić się, że obraz TEM jest prawidłowo zorientowany i powiększony do tego samego rozmiaru i rozdzielczości co obraz z mikroskopu świetlnego, w tym przypadku 300 pixels per inch. Zwiększ rozmiar obszaru roboczego obrazu z mikroskopii świetlnej do podwójnej wartości. Następnie skopiuj i wklej obraz TEM obok obrazu fluorescencyjnego.
Aby utworzyć nałożenie fluorescencji w programie Photoshop CS2, należy kliknąć narzędzie prostokątnego zaznaczenia, wybrać obraz fluorescencyjny i utworzyć z niego duplikowaną warstwę. W opcjach mieszania stylu warstwy należy ustawić przezroczystość na poziomie od 30 do 40%. Następnie należy kliknąć narzędzie przesuwania, przeciągnąć warstwę z nałożeniem fluorescencji na odpowiadający jej obraz TEM i wyrównać oba obrazy.
Po wyrównaniu obrazów, spłaszcz obraz, aby uzyskać końcową nakładkę. Następnie użyj narzędzia zaznaczenia prostokątnego, aby wybrać nowy obraz nakładki i skopiować go na nowe płótno. Na koniec zapisz obraz jako plik tf.
Na tym obrazie z mikroskopii fluorescencyjnej poszczególne komórki guza somatostatinoma zawierają liczne ziarnistości wydzielnicze i zostały dodatnio oznakowane w kierunku hormonu somatostatyny. Jądra komórkowe widoczne są jako ciemne obszary, a przy małym powiększeniu w cytoplazmie zaobserwowano fluorescencję kropek kwantowych (QD) o zmiennej intensywności i ziarnistym, pomarańczowym zabarwieniu. Obszar zainteresowania (ROI) wybrany za pomocą mikroskopii świetlnej został zidentyfikowany i zobrazowany przy użyciu TEM, opierając się na obrazie z mikroskopii świetlnej przy 20X powiększeniu, jak wskazano tutaj.
Przy większym powiększeniu komórka wykazuje jasną fluorescencję i intensywne znakowanie QD w ziarnistościach cytoplazmatycznych. Nałożenie danych z fluorescencji na obrazy TEM, jak w tym przykładzie, sugeruje, że silne znakowanie pozytywne odpowiada ziarnistościom zawierającym materiał o umiarkowanej gęstości elektronowej wewnątrz błony ograniczającej pęcherzyk. Wreszcie, jak widać tutaj przy większym powiększeniu, ziarnistości o umiarkowanej gęstości elektronowej wykazały intensywne immunoznakowanie nanokryształami QD.
Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu ośmiu godzin. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z siatkami, trzymając je wyłącznie za krawędzie. Dotknięcie preparatu podczas podnoszenia siatki może spowodować jego oddzielenie od podłoża.
Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoznakowanie multipleksowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy badane białko ko-lokalizuje się z innym białkiem. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie patologii do badania lokalizacji białek w archiwalnych tkankach ludzkich przygotowanych do mikroskopii elektronowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak łączyć informacje immunocytochemiczne z fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej z ultrastrukturą z transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Należy pamiętać, że praca z czwartotlenkiem osmu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej, praca w dygestorium oraz właściwa utylizacja odpadów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę wykorzystania nanocząsteczek kropek kwantowych (QD) w korelatywnych badaniach immunocytochemicznych tkanek patologicznych człowieka. Technika ta łączy mikroskopię fluorescencyjną z transmisyjną mikroskopią elektronową, aby dostarczyć szczegółowych informacji na temat lokalizacji białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunocytochemia
- Patologia
- Techniki mikroskopowe
Wprowadzenie
- Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jest niezbędna do zrozumienia lokalizacji białek.
- Kropki kwantowe zapewniają wyjątkową przewagę w wizualizacji białek w mikroskopii żywych komórek.
- Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie immunocytochemii.
- Łączenie obrazowania strukturalnego i funkcjonalnego usprawnia interpretację danych.
Cel badania
- Uzyskanie danych CLEM z tkanki guza somatostatinoma człowieka.
- Wizualizacja lokalizacji białek i powiązanych struktur subkomórkowych.
- Wykorzystanie pojedynczej sondy nanocząsteczkowej zarówno do mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektronowej.
Zastosowane metody
- Zatopienie i krojenie tkanki nowotworowej człowieka.
- Przygotowanie roztworu adhezyjnego z użyciem przezroczystej taśmy i acetonu.
- Zastosowanie przeciwciał sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu wizualizacji.
- Wykorzystanie szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja lokalizacji białek w tkance nowotworowej.
- Wykazanie efektywności nanocząsteczek kropek kwantowych.
- Integracja danych z mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej.
- Pogłębione zrozumienie powiązań białek ze strukturami subkomórkowymi.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badań immunocytochemicznych.
- Kropki kwantowe umożliwiają jednoczesne obrazowanie struktury i funkcji.
- Podejście to może przyczynić się do rozwoju badań w patologii i dziedzinach pokrewnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) z wykorzystaniem nanocząsteczek kropek kwantowych umożliwia precyzyjne mapowanie lokalizacji białek w tkance patologicznej człowieka, wypełniając lukę między detekcją molekularną a kontekstem ultrastrukturalnym. To dwumodalne podejście zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w krytycznych punktach zwrotnych etapu odkrywania. Integracja danych z mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej wspiera podejmowanie trafnych decyzji portfelowych poprzez wyjaśnienie powiązań subkomórkowych celów terapeutycznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację lokalizacji białek w przekrojach tkanek ludzkich istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez korelację immunoznakowania z cechami ultrastrukturalnymi.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu dzięki wysokorozdzielczemu mapowaniu przestrzennemu.
- Ułatwia selekcję celów w oparciu o ich dystrybucję subkomórkową i kontekst.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane odczyty biologiczne dla późniejszych etapów opracowywania testów.
- Gwarantuje powtarzalność i standaryzację dzięki zastosowaniu tej samej sondy w postaci kropek kwantowych w różnych modalnościach.
- Umożliwia ilościową ocenę specyficzności znakowania oraz tła przed przeprowadzeniem przesiewu o wysokiej zawartości informacji (high-content screening).
- Wspiera wiarygodną ocenę wydajności przeciwciał i sond w złożonych macierzach tkankowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie detekcji molekularnej z patologią ultrastrukturalną w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki wykorzystaniu archiwalnych tkanek ludzkich.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne w modelach przedklinicznych poprzez potwierdzenie lokalizacji celu w odpowiedniej architekturze tkankowej.
- Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju, skorygowane o ryzyko, w oparciu o zintegrowane dane molekularne i morfologiczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Opisana metoda CLEM znajduje się na styku biologii odkrywczej, opracowywania testów oraz badań translacyjnych, umożliwiając płynną integrację danych – od wczesnej walidacji po badania przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie lokalizacji białek na poziomie ultrastrukturalnym.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w celu przygotowania testów i walidacji sond.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości oraz nakładki umożliwiające bezpośrednie porównanie danych molekularnych i strukturalnych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie lokalizacji biomarkerów w ludzkich próbkach patologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat obrazowania, który można dostosować do różnych celów i typów tkanek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych projektach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia zarówno w technikach mikroskopii fluorescencyjnej, jak i elektronowej.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury obrazującej oraz oprogramowania do analizy cyfrowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znakowania i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych składów żywic lub typów tkanek.
- Ze względu na stosowanie niebezpiecznych odczynników, takich jak osmium tetroxide, niezbędna jest ostrożność podczas pracy i przestrzeganie zasad bezpieczeństwa.
