Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie korelacyjnych danych z mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) poprzez połączenie informacji immunocytochemicznych fluorescencji z morfologią ultrastrukturalną z transmisyjnej mikroskopii elektronowej na jednym obrazie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunocytochemii i patologii, takie jak to, z jaką strukturą subkomórkową związane jest określone białko będące przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona tę samą sondę nanocząstek kropek kwantowych do uzyskania zarówno sygnału mikroskopowego na żywo z białka docelowego, jak i lokalizacji strukturalnej mikroskopii elektronowej.

Po zamocowaniu, zatopieniu i pocięciu ludzkiej tkanki nowotworowej somatostatynomy zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj roztwór kleju do sekcji, umieszczając 20 centymetrów przezroczystej taśmy klejącej w pięciomililitrowej butelce zawierającej 2,0 mililitra acetonu i odstaw na 10 minut. Usuń taśmę i zanurz siatkę niklową w roztworze, a następnie usuń siatkę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu użyj matowej strony siatki, aby podnieść ultra cienki odcinek.

Bardzo ważne jest, aby ustalić prawidłowy czas trawienia dla wybranej formuły żywicy. 30 minut dobrze sprawdza się w przypadku tego preparatu, ale może być konieczne ponowne przeliczenie w przypadku twardszych lub bardziej miękkich preparatów. Przygotuj jeden mililitr świeżo nasyconego roztworu do trawienia metaperiodynianu sodu w wodzie destylowanej i umieść kropelki roztworu na czystej powierzchni folii laboratoryjnej.

Umieść całkowicie suche siatki z sekcjami na kropelkach i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przenieś kratki do kropelek wody destylowanej na 60 sekund, aby je zmyć. Aby przeprowadzić znakowanie przeciwciał i kropek kwantowych lub QD na czystej powierzchni folii laboratoryjnej, pipetą upuść 0,05 glicenu molowego i PBS.

Umieść kratki na kropelkach i inkubuj przez 10 minut, aby zablokować resztki aldehydu na sekcjach. Aby usunąć blok aldehydu, krótko osusz krawędź siatki. Następnie umieść siatkę na kropli jednego procenta normalnej koziej surowicy lub NGS i jednego procenta BSAC w PBS na 10 minut.

Przygotuj jeden mililitr roztworu blokującego, dodając 10 mikrolitrów NGS i 100 mikrolitrów BSAC do 890 mikrolitrów PBS. Następnie kondycjonuj skrawki, umieszczając je na kropelce rozcieńczalnika przeciwciał na 10 minut. Następnie użyj rozcieńczalnika przeciwciał, aby rozcieńczyć przeciwciało poliklonalne anty-somatostatyny od 1 do 10 i umieść siatki na kropelkach roztworu.

Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji usunąć odczynnik z przeciwciałami, osuszając krawędź siatki. Następnie użyj rozcieńczalnika do przeciwciał, aby umyć sekcje dwa razy po pięć minut każda.

Po rozcieńczeniu przeciwciała drugorzędowego od 1 do 10 i przygotowaniu kropli, inkubować siatki na kropelkach w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie usuń roztwór przeciwciała i umyj skrawki dwa razy. Rozcieńczyć sprzężone ze streptawidyną odstępy czasu od 1 do 10 i inkubować próbki na kroplach roztworu w ciemności, w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie użyj rozcieńczalnika do przeciwciał, aby umyć kratki dwukrotnie, za każdym razem przez pięć minut, i osusz krawędź kratek. Następnie umyj kratki w wodzie destylowanej przez dwie minuty przed osuszeniem krawędzi. Umieść wybarwiony immunologicznie fragment siatki w kropli wody na szkiełku podstawowym i użyj szklanego szkiełka nakrywkowego, aby go przykryć.

Aby przeprowadzić mikroskopię światła fluorescencyjnego, włóż kostkę filtracyjną o następujących parametrach i użyj oświetlenia LED 365 nanometrów. Umieść wycinek wybarwiony immunologicznie na stoliku mikroskopu immunofluorescencyjnego. Użyć mikroskopii świetlnej w celu oceny wzorca etykietowania, poziomu wszelkich niespecyficznych etykiet oraz w celu ustalenia, czy kontrole ujemne są czyste.

Następnie zidentyfikuj ROI w odniesieniu do słupków siatki. Następnie ustaw pełnokolorowy aparat cyfrowy na automatyczny kolor FL i ustaw balans bieli na 3, 200 K. Ustaw aparat w trybie automatycznej ekspozycji z ustawieniem gamma w zakresie od 0.45 do 1.00, aby zoptymalizować wygląd obrazów, a wzmocnienie analogowe ustawić na jeden X. Kliknij ikonę kamery w interfejsie graficznym oprogramowania ZEN Two Light, aby żyć. Następnie skoncentruj się na obrazie i kliknij przycisk Snap w interfejsie graficznym oprogramowania ZEN Two Light, aby przechwycić obraz do magazynu ramek.

Zapisz obrazy jako pliki tf, aby uniknąć kompresji i pikselizacji. Przygotuj wydruk przedstawiający położenie zwrotu z inwestycji w stosunku do pasków siatki lub innych istotnych punktów orientacyjnych tkanki. Następnie zdejmij kratkę ze szkiełka, umyj w wodzie destylowanej i delikatnie osusz krawędzie.

Aby przeprowadzić transmisyjną mikroskopię elektronową, przenieś siatkę do mikroskopu w celu zbadania przy użyciu przyspieszającego napięcia 100 kilowoltów. Zacznij od małego powiększenia około 1 400X, aby poruszać się po siatce i znaleźć ROI z tymi znalezionymi za pomocą mikroskopii świetlnej. Obserwuj poszczególne kolejki kolejek przy powiększeniu 70 000x lub większym.

Pojawią się jako nieregularne struktury krystaliczne o umiarkowanej gęstości elektronów. Następnie, korzystając z aparatu cyfrowego z monochromatycznym czujnikiem o wymiarach 1 392 na 1 040 pikseli w interfejsie graficznym oprogramowania do przetwarzania obrazu, kliknij ikonę aparatu, aby włączyć i uzyskać obrazy. Przesuń ikonę kamery do pozycji wyłączonej, aby zapisać obraz w magazynie ramek.

Aby przeprowadzić obrazowanie CLEM, użyj wydruku z obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej, aby zlokalizować odpowiednie zwroty z inwestycji według TEM. Cechy architektury tkankowej są przydatne do nawigacji po sekcji. Przechwyć obraz odpowiedniego zwrotu z inwestycji przez TEM.

Następnie, aby przygotować obraz CLEM, upewnij się, że obraz TEM jest prawidłowo zorientowany i powiększony do tego samego rozmiaru i rozdzielczości co obraz z mikroskopu świetlnego, w tym przypadku 300 pikseli na cal. Zwiększ rozmiar płótna obrazu mikroskopii świetlnej, aby podwoić jego rozmiar. Następnie skopiuj i wklej obraz TEM obok obrazu fluorescencyjnego.

Aby utworzyć nakładkę fluorescencyjną w programie Photoshop CS2, kliknij narzędzie do zaznaczania prostokątnego, wybierz obraz fluorescencyjny i utwórz z niego zduplikowaną warstwę. Dostosuj opcje mieszania stylów warstw do 30 do 40% przezroczystości. Następnie kliknij narzędzie do przesuwania i przeciągnij warstwę nakładki fluorescencyjnej na odpowiedni obraz TEM i wyrównaj obrazy.

Po wyrównaniu obrazów spłaszcz obraz, aby uzyskać ostateczną nakładkę. Następnie użyj narzędzia Zaznaczanie prostokątne, aby wybrać nowy obraz nakładki i skopiować go na nowe płótno. Na koniec zapisz obraz jako plik tf.

Na tym obrazie z mikroskopii fluorescencyjnej poszczególne komórki nowotworowe somatostinoma zawierają obfite ziarnistości wydzielnicze i zostały pozytywnie oznaczone na hormon somatostatyny. Jądra wyglądały jak ciemne, a przy małym powiększeniu w cytoplazmie obserwowano zmiennie intensywną, ziarnistą, pomarańczową fluorescencję QD. Zwrot z inwestycji wybrany przez mikroskopię świetlną został rozpoznany i zobrazowany za pomocą TEM poprzez odniesienie do obrazu z 20-krotnej mikroskopii świetlnej, jak wskazano tutaj.

Przy większym powiększeniu komórka wykazuje jasną fluorescencję i intensywne znakowanie QD w ziarnistościach cytoplazmatycznych. Nakładanie danych fluorescencyjnych na obrazy TEM, jak w tym przykładzie, sugeruje, że silne znakowanie dodatnie odpowiada granulkom zawierającym materiał o umiarkowanej gęstości elektronów w błonie ograniczającej pęcherzyki. W końcu, jak widać tutaj w większym powiększeniu, granulki o umiarkowanej gęstości elektronów wykazywały intensywne immunoznakowanie nanokryształów QD.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać, aby obchodzić się z kratkami ostrożnie, tylko przy krawędziach. Dotknięcie sekcji podczas podnoszenia siatki może spowodować odłączenie sekcji od siatki.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak multipleksowe znakowanie immunologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy białko, które Cię interesuje, kolokalizuje się z innym białkiem. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się patologią do zbadania lokalizacji białek w procesie archiwizacji tkanek ludzkich na potrzeby mikroskopii elektronowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć informacje immunocytochemiczne z mikroskopii światła fluorescencyjnego z ultrastrukturą z transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Nie zapominaj, że praca z tetratlenkiem osmu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie sprzętu ochronnego, praca w dygestoriach i odpowiednia utylizacja odpadów.