Name: Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj korelacyjną mikroskopię świetlną i elektronową z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych do badań immunocytochemicznych tkanki nowotworowej. Ta metoda łączy fluorescencję z mikroskopią transmisyjną w celu szczegółowej lokalizacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować za wsparcie Xiao Juan Wu (Laboratorium Immunohistochemii) oraz Departamentowi Patologii Anatomicznej, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, Nowa Południowa Walia, Australia.

1. Sekcja i utrwalenie tkanek
<ol>
	<li>Rozwarstwienie tkanek
	<ol>
		<li>Wypreparuj fragmenty tkanek z chirurgicznie wyciętej próbki guza lub biopsji tkanki. 
		Uwaga: Tkanka użyta w tym badaniu była rutynowo utrwalana w formalinie, ale odpowiednia jest również świeża tkanka. Wybraliśmy obszar potwierdzony i zgłoszony przez patologa anatomicznego, który zawiera guz somatostatynoma po rutynowym barwieniu histologicznym i barwieniu immunologicznym anty-somatostatyny (nie pokazano).</li>
		<li>Używaj kawałków chusteczek nie większych niż około 1,0 mm3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu kakodylowego
	<ol>
		<li>Przygotować podstawowy roztwór buforowy (1 M), dodając 21,4 g kakodylanu sodu (patrz wykaz materiałów) i 3,0 ml 1% roztworu chlorku wapnia do 90 ml wody destylowanej, a następnie uzupełniając roztwór do końcowej objętości 100 ml. Wymieszać roztwór i odstawić na noc, aby krystaliczny odczynnik całkowicie się rozpuścił.</li>
		<li>Przygotować buforowy roztwór roboczy, dodając 20 ml roztworu podstawowego do 170 ml wody, a następnie sprawdzając pH za pomocą pasków wskaźnikowych. Doprowadzić pH do 7,4 przez dodanie 3 - 4 kropli 3% HCl. Uzupełnić roztwór do końcowej objętości 200 ml o końcowej molowości 0,1 M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i stosowanie utrwalacza
	<ol>
		<li>Dodać jedną 10 ml ampułki z 50% roztworem aldehydu glutarowego do 20 ml roztworu podstawowego kakodylanu sodu (1 M). Uzupełnij wodą destylowaną do 190 ml. Sprawdź pH i dostosuj do 7,4, dodając 1 - 4 krople 3% kwasu solnego (HCl), jeśli to konieczne.</li>
		<li>Uzupełnij wodą destylowaną, aby uzyskać końcową objętość 200 ml.</li>
		<li>Zanurzyć tkankę w utrwalaczu zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4 przez 24 godziny w temperaturze 4 oC w szklanej probówce na próbkę. Niewykorzystany utrwalacz wyrzucić po 1 tygodniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie i osadzanie tkanek
<ol>
	<li>Barwienie tetratoksydem osmu
	<ol>
		<li>Po zakończeniu utrwalenia zanurzyć tkankę w buforze kakodylanu sodu (0,1 M) na 20 minut, a następnie powtarzać przez kolejne 20 minut.</li>
		<li>Przygotować 2% wodny roztwór roboczy tetratlenku osmu (OsO4), dodając 8,0 ml 5% roztworu podstawowego OsO4 do 2,0 ml roztworu podstawowego buforu kakodylanu sodu (1 M) i 10,0 ml wody destylowanej do uzyskania końcowej objętości 20,0 ml.</li>
		<li>Usuń bufor, a następnie zanurz tkankę w 2% OsO4 o pH 7,4 przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. 
		ostrożność! Należy zachować ostrożność podczas dekantacji i przygotowywania roztworów OsO4, nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i przez cały czas pracować pod wyciągiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie octanem uranylu
	<ol>
		<li>Po zakończeniu osmikacji tkanek usuń roztwór OsO4 i zanurz tkankę w 2% octanie sodu na 10 minut. Usuń 2% octan sodu, a następnie zanurz w 2% octanie uranylu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Odwodnić tkankę za pomocą stopniowanych alkoholi. Używaj 50% etanolu przez 10 minut, 70% etanolu przez 10 minut, 95% etanolu przez 10 minut i dwóch zmian 100% etanolu przez 20 minut każda w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wykonaj dwie zmiany 100% acetonu przez 30 minut każda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impregnacja i utwardzanie żywicy
	<ol>
		<li>Wymieszaj żywicę epoksydową o niskiej lepkości w jednorazowym kubku polietylenowym. Dodać 10,0 g monomeru epoksydowego dwutlenku cykloheksenu winylu (ERL 4221), 6 g eteru diglicydylowego glikolu polipropylenowego (DER 732) i 26,0 g bezwodnika nonenylobursztynowego (NSA). Dokładnie mieszaj ręcznie za pomocą drewnianych patyczków przez 2 min.</li>
		<li>Dodaj piętnaście kropli akceleratora epoksydowego 2-dimetyloaminoetanolu (DMAE) i ponownie mieszaj przez 2 minuty. Proszę zwrócić uwagę, aby w pełni wymieszać składniki ERL, DER i NSA przed dodaniem akceleratora DMAE.</li>
		<li>Impregnację tkanki żywicą należy rozpocząć od zastąpienia 100% acetonu żywicą 1:1 na aceton na 1 godzinę, następnie zastąpić żywicą 6:1 na aceton na 3 godziny, a na koniec 100% żywicą na noc.</li>
		<li>Przenieś tkankę do świeżej żywicy w mikroforemkach o średnicy 8 mm. Utwardzać w temperaturze 70 oC przez noc. Żywica powinna być twarda, ale nie krucha po utwardzeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ultramikrotomia
<ol>
	<li>nóż, parametry cięcia i grubość przekroju
	<ol>
		<li>Umieść półcienki nóż diamentowy w ultramikrotomie i odetnij skrawki tkanki o grubości 500 nm.</li>
		<li>Spławiaj sekcje na łaźnię wodną za krawędzią noża. Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym i suszyć je przez 10 do 20 sekund na płycie grzejnej o temperaturze około 110 oC.</li>
		<li>Wytrawiaj skrawki roztworem etoksydu sodu przez 20 sekund, a następnie zmyj 100% etanolem, a następnie wodą destylowaną. Plamić 2% błękitem metylenowym w 1% boraksie przez 20 sekund na płycie grzejnej, spłukać bieżącą wodą z kranu przez 5 sekund i suszyć na płycie grzejnej przez 5 sekund. Następnie zabejcuj 1,5% zasadową fuksją na płycie grzejnej przez 5 sekund, a następnie wysusz na płycie grzejnej przez 20 sekund.</li>
		<li>Zbadaj za pomocą mikroskopii światła jasnego pola i potwierdź, że komórki nowotworowe i obszar zainteresowania (ROI) są obecne w sekcji.</li>
		<li>Zmień półcienki nóż diamentowy na ultracienki nóż diamentowy i ustaw prawidłowy kąt noża i prędkość cięcia zgodnie z zaleceniami producenta noża.</li>
		<li>Cięcie ultracienkich odcinków o grubości 90 nm. Obserwuj złote zabarwienie sekcji podczas unoszenia się na łaźni wodnej.</li>
		<li>Rozciągnij i spłaszcz sekcje, falując oparami chloroformu z kawałka bibuły filtracyjnej o długości 1 cm2 w odległości kilku milimetrów od sekcji. Uważaj, aby nie dopuścić do kontaktu papieru nasączonego chloroformem z powierzchnią wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż na siatce ultracienkich sekcji
	<ol>
		<li>Podnieś ultracienkie sekcje z powierzchni wody za pomocą cienkiej siatki TEM o oczkach 300 prętów, która została zanurzona w roztworze kleju sekcyjnego. Zlokalizuj sekcje po matowej stronie siatki. Kratki mają matową lub matową powierzchnię z jednej strony i polerowaną lub błyszczącą powierzchnię z drugiej. Nie jest wymagana folia nośna. Uwaga: Konieczne jest obchodzenie się z tymi kratkami za pomocą kleszczy antymagnetycznych, aby uniknąć przyklejania się siatek do kleszczy.</li>
		<li>Przygotować plaster kleju, umieszczając 20 cm przezroczystej taśmy klejącej w 5 ml fiolce z 2,0 ml acetonu. Zakręć fiolkę i wstrząśnij nią, odstaw na 10 minut, a następnie usuń taśmę, pozostawiając roztwór kleju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Znakowanie immunologiczne
<ol>
	<li>Demaskowanie antygenu
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml świeżo nasyconego roztworu do wytrawiania metaperiodianu sodu w wodzie destylowanej i natychmiast zużyć. Umieść kropelki roztworu do trawienia na czystej powierzchni filmu laboratoryjnego.</li>
		<li>Umieść całkowicie suche kratki sekcjami do dołu na kropelkach roztworu metaperiodianu sodu w temperaturze pokojowej na 30 minut. Przenieś kratki do kropelek wody destylowanej na 60 sekund mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał i znakowanie sondą QD
	<ol>
		<li>Wszystkie inkubacje i etykietowanie należy wykonać na kropelkach roztworu umieszczonych na czystej powierzchni Parafilmu.</li>
		<li>Umieść siatkę na kropli 0,05 M glicyny w PBS na 10 minut, aby zablokować resztki aldehydu w sekcji. Usuń blok aldehydu, krótko osuszając krawędź siatki.</li>
		<li>Umieścić siatkę na kropelce 1% normalnej surowicy koziej (NGS) i 1% BSAc (10%) w PBS na 10 minut. Przygotować roztwór blokujący, dodając 10 μl NGS i 100 μl BSAc do 890 μl PBS, aby uzyskać końcową objętość 1 000 μl.</li>
		<li>Kondycjonować skrawki, umieszczając je na kropelce rozcieńczalnika przeciwciał na 10 minut.</li>
		<li>Przeprowadzić inkubację znakowania immunologicznego przy użyciu przeciwciała poliklonalnego anty-somatostatyny rozcieńczonego w stosunku 1:10 rozcieńczalnikiem przeciwciał o stężeniu 3,47 g/l. Uwaga: Inkubację przeciwciał przeprowadza się poprzez umieszczenie siatek na kropelkach na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Usuń odczynnik z przeciwciałami z kroku 4.2.5, osuszając krawędź siatki, a następnie myj sekcje na rozcieńczalniku przez 2 x 5 minut.</li>
		<li>Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym (biotynylowanym kozie anty-króliczym poliklonalnym) rozcieńczonym w stosunku 1:10 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała. Myć w rozcieńczalniku przez 2 x 5 min.</li>
		<li>Inkubować w sprzężonych ze streptawidyną odstępach QD (585 nm) rozcieńczonych w stosunku 1:10 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przykryj folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na światło podczas inkubacji.</li>
		<li>Myj ruszty w świeżej wodzie destylowanej przez 2 minuty. Osusz brzegi rusztu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Mikroskopia świetlna fluorescencyjna
<ol>
	<li>Źródło światła i kostki filtracyjne
	<ol>
		<li>Użyj oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) 365 nm do szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Włóż kostkę filtracyjną o następujących właściwościach: (Ex G 365 nm, BS FT 395 i EM LP 420 nm). 
		Uwaga: Ten sześcian filtrujący pozwoli na jednoczesną wizualizację widm emisyjnych wszystkich rozmiarów QD pod tą samą długością fali wzbudzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcje Wyświetlanie i obrazowanie
	<ol>
		<li>Umieść immunologicznie wybarwiony fragment siatki na szkiełku podstawowym w kropli wody i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym (grubość 1,5). Użyć mikroskopii świetlnej w celu oceny wzorca etykietowania, poziomu wszelkiego niespecyficznego oznakowania oraz w celu ustalenia, czy kontrole ujemne są wolne od etykietowania.</li>
		<li>Zidentyfikuj zwrot z inwestycji w odniesieniu do słupków siatki. Siatki szukacza mogą być pomocne w ustalaniu współrzędnych struktur docelowych.</li>
		<li>Uzyskaj obrazy pozytywnego etykietowania na sekcji za pomocą pełnokolorowego aparatu cyfrowego z ustawieniem aparatu na "FL auto colour" i "White Balance" ustawionym na 3,200K. Użyj aparatu w trybie "Automatyczna ekspozycja" z ustawieniem "Gamma" w zakresie od 0.45 do 1.00, aby zoptymalizować wygląd obrazów i "Wzmocnienie analogowe" ustawione na 1x. Kliknij ikonę aparatu w interfejsie graficznym oprogramowania Zen 2 Lite, aby przejść do opcji "Na żywo", ustaw ostrość obrazu, a następnie kliknij "Snap", aby przechwycić obraz do magazynu ramek.</li>
		<li>Zapisuj obrazy jako pliki .tif, aby uniknąć widocznej kompresji i pikselizacji.</li>
		<li>Przygotuj wydruk przedstawiający położenie zwrotu z inwestycji w stosunku do pasków siatki lub innych istotnych punktów orientacyjnych tkanki. Wydruki te będą przydatne do późniejszej nawigacji w sekcji i ponownego znajdowania ROI za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).</li>
		<li>Zdejmij kratkę ze szkiełka, umyj w wodzie destylowanej i delikatnie osusz krawędzie. 
		Uwaga: Nie używaj zbyt intensywnego oświetlenia do uzyskiwania obrazów fluorescencyjnych. Fotostabilność QD pozwala na obrazowanie w czasie do kilku sekund, ale należy uważać, aby nie przedłużać ekspozycji, ponieważ wygaszenie sygnału QD może nastąpić po około 1 minucie w wodzie. Rozszerzoną lub trwałą fotostabilność uzyskuje się tylko wtedy, gdy sekcje z oznaczeniem QD są odwadniane toluenem i zatopione pod szkiełkami nakrywkowymi zgodnie ze specyfikacjami producenta. Jednak proces ten wykluczy wówczas możliwość korelacyjnego badania tego samego przekroju przez TEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Transmisyjna mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Konfiguracja i wyświetlanie TEM
	<ol>
		<li>Przenieść sieć do TEM w celu zbadania przy użyciu napięcia przyspieszającego 100 kV. Użyj małego powiększenia około 1,400X, aby poruszać się po siatce i znaleźć zwroty z inwestycji, które korelują z widokami mikroskopii świetlnej. Widok gromad QD w powiększeniach około 50 000X.</li>
		<li>Obserwuj poszczególne QD przy powiększeniu 70 000x lub większym. Obserwuj QD jako nieregularne struktury krystaliczne o umiarkowanej gęstości elektronów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania
	<ol>
		<li>Do obrazowania TEM należy używać aparatu cyfrowego. Wystarczy monochromatyczna matryca o wymiarach 1 392 x 1 040 pikseli.</li>
		<li>Obrazy można uzyskać, klikając ikonę "Kamera" na "Włączone" w interfejsie graficznym mikroskopu oprogramowania do obrazowania, a następnie na "Wyłącz", aby zapisać obraz w magazynie ramek. Uwaga: te operacje będą się różnić w zależności od używanego systemu mikroskopu. Używaj aparatu w trybie automatycznej ekspozycji z ustawieniem "Gamma" 1.00.</li>
		<li>Zapisuj obrazy jako pliki .tif.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Obrazowanie CLEM
<ol>
	<li>Lokalizowanie zwrotu z inwestycji we fluorescencję za pomocą TEM
	<ol>
		<li>Użyj wydruku z obrazu z mikroskopii świetlnej, aby zlokalizować odpowiednie zwroty z inwestycji według TEM. Cechy architektury tkankowej, takie jak naczynia krwionośne i struktury świetlne, są przydatne do nawigacji po sekcji za pomocą TEM.</li>
		<li>Przechwyć obraz odpowiedniego zwrotu z inwestycji przez TEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nakładka obrazu CLEM
	<ol>
		<li>Upewnij się, że obraz TEM jest prawidłowo zorientowany w stosunku do obrazu z mikroskopii świetlnej i skoryguj powiększenie każdego z nich, tak aby ta sama struktura widoczna w każdej modalności miała ten sam rozmiar.</li>
		<li>Zorientuj obrazy mikroskopii świetlnej i TEM i wyświetl je obok siebie lub jako nakładki, aby podkreślić ultrastrukturalne cechy ROI znakowanych immunologicznie.</li>
		<li>Utwórz obraz nakładki za pomocą programu Photoshop CS2. Najpierw powiększ obraz fluorescencyjny do takiego samego powiększenia, jak obraz TEM o małej mocy. Zorientuj oba obrazy, a następnie wklej je obok siebie na jednym płótnie.</li>
		<li>Spłaszcz obraz.</li>
		<li>Utwórz nakładkę fluorescencyjną z tego obrazu kompozytowego. Kliknij "Narzędzie do zaznaczania prostokątnego", wybierz obraz fluorescencyjny i utwórz z niego zduplikowaną warstwę.</li>
		<li>Dostosuj "Styl warstwy/Opcje mieszania" do 30 - 40% przezroczystości.</li>
		<li>Kliknij "Narzędzie do przesuwania" i przeciągnij warstwę nakładki fluorescencyjnej na odpowiedni obraz TEM. Wyrównaj obrazy.</li>
		<li>Po osiągnięciu wyrównania "spłaszcz" warstwy, aby uzyskać ostateczny obraz nakładki.</li>
		<li>Użyj narzędzia "Prostokątny obszar zaznaczenia", aby wybrać nowy obraz nakładki i skopiować go na nowe płótno. Zapisz to jako plik .tiff.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction to correlative light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).</li>
<li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+ultrastructure+lights+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li>
<li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+fluorescently+labeled+structures+in+frozen-hydrated+samples+using+integrated+light+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy.</a> J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).</li>
<li>Redemann, S., Müller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li>
<li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure%3A+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PLoS One. 5 (2), e9014(2010).</li>
<li>Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+immunocytochemical+localization+of+somatostatin+in+somatostatinoma+by+widefield+epifluorescence%2C+super-resolution+light%2C+and+immunoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).</li>
<li>Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantum+dots+as+probes+for+correlative+fluorescence%2C+conventional%2C+and+energy-filtered+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots.</a> Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).</li>
<li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples%3A+Large-field+of+view%2C+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).</li>
<li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantum dots in cell biology.</a> J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 5, 538-544 (2005).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms.</a> PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).</li>
<li>Thomas, J. M., Midgley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transmission+electron+microscopy%3A+the+ultimate+nanoanalytical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique.</a> Chem Commun. , 1253-1267 (2004).</li>
<li>Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).</li>
<li>Marc, R. E., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+GABAergic+amacrine+cell+circuitries+in+the+retina%3A+nested+feedback%2C+concatenated+inhibition%2C+and+axosomatic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses.</a> J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Loussert Fonta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+acute+brain+slices+by+electron+microscopy%3A+a+correlative+light-electron+microscopy+workflow+based+on+Tokuyasu+cryo-sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning.</a> J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Badanie to wykazało potencjalną użyteczność QD jako uniwersalnych sond do badań CLEM. Zastosowane nanocząstki QD o długości fali 585 nm wykazywały jasną i stabilną fluorescencję podczas obserwacji za pomocą mikroskopii światła szerokokątnego i były łatwo obserwowane przez TEM. Poprzednie badania przeprowadzone przez jednego z obecnych autorów wykazały, że QD są również odpowiednie dla superrozdzielczej mikroskopii świetlnej7. Ich fotostabilność była szczególnie przydatna przy długich okresach oglądania i długi...

Korelacyjne mikroskopie świetlne i elektronowe (CLEM) to potężne podejście do analizy przejściowych zdarzeń dynamicznych1, rzadkich zdarzeń2, 3 i układów złożonych4. Dostępnych jest wiele różnych permutacji technicznych5 w zależności od zadawanego pytania, jednak powszechnym wymogiem jest, aby ta sama struktura w pojedynczej próbce6 była obrazowana za pomocą wielu modalności mikroskopowych. Nasze szczególne podejście do CLEM zostało opracowane do badania archiwalnych tkanek patologicznych człowieka, a zastosowany tutaj przypadek został dobrze scharakteryzowany i opublikowany wcześniej7. Celem było, po pierwsze, maksymalizacja danych analitycznych z pojedynczej biopsji lub próbki chirurgicznej, a po drugie, wykorzystanie mikroskopii światła fluorescencyjnego w celu wyjaśnienia kontekstu wzorca znakowania immunocytochemicznego obserwowanego na poziomie ultrastrukturalnym.
Nanokryształy kropek kwantowych (QD) oferują potencjał uniwersalnego systemu markerów, który można oglądać zarówno za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak i mikroskopii elektronowej8, 9, 10. Ich krystaliczna struktura jądra pozwala QD o różnych rozmiarach generować szeroki zakres pików emisji fluorescencji, gdy są wzbudzane przez światło na długościach fal odległych od ich widm emisyjnych11. Ich masa atomowa jest wystarczająca do uzyskania gęstości elektronów, która jest wykrywalna za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) lub skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją pola. Są one szczególnie przydatne w badaniach immunocytochemicznych, ponieważ można zaobserwować nawet pojedyncze QD, co daje ostateczną czułość 1 QD na cząsteczkę docelową12. Ponadto, w zależności od zastosowanego QD, mogą one posiadać indywidualną sygnaturę elementarną odpowiednią do mapowania.
Próbki z patologii człowieka oferują znaczące korzyści dla translacyjnych badań biomedycznych. Próbki tkanek chirurgicznych i biopsji są rutynowo przekazywane do biobankowania, a po uzyskaniu odpowiednich zezwoleń etycznych można uzyskać dostęp do badań naukowych. Tkanka ludzka nie ma problemów związanych z istotnością lub interpretacją, które mogą wystąpić w zwierzęcych lub in vitro modelach chorób. Jednak przygotowanie próbek patologicznych często nie jest optymalne. Może wystąpić opóźnienie w utrwalaniu tkanki, stosowanie niewłaściwego utrwalacza, takiego jak formalina zamiast aldehydu glutarowego do TEM oraz niewłaściwe pobieranie próbek. Metody CLEM mogą zoptymalizować informacje diagnostyczne i prognostyczne dostępne z pojedynczej próbki pobranej od człowieka. Jednak niektóre nowo opracowane podejścia korelacyjne, takie jak te wykorzystujące mini singletowy generator tlenu (miniSOG), nie są dostępne do stosowania w patologii ze względu na potrzebę genetycznego kodowania znacznika w komórce będącej przedmiotem zainteresowania13. Z tego powodu zbadaliśmy przydatność znakowania QD rutynowo przygotowywanej tkanki TEM do korelacyjnych badań immunocytochemicznych. Odstępy czasu nałożone na wytrawione skrawki żywicy epoksydowej lub akrylowej z lekko utrwalonej biopsji aldehydowej i próbek tkanek dają możliwość uzyskania korelacyjnych danych z fluorescencji, mikroskopii świetlnej i TEM z pojedynczej próbki.

<table><tbody><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Proscitech</td><td>C0205</td><td>Szkodliwa substancja chemiczna</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Proscitech</td><td>C010</td><td>Stosować tylko w dygestorii</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Univar-Ajax</td><td>569</td><td>Niebezpieczna substancja chemiczna</td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>Fronina</td><td>JJ008</td><td></td></tr><tr><td>Aceton 100%</td> <td>Fronina</td><td>JJ006</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Proscitech</td><td>C056</td><td></td></tr><tr><td>DER 732</td><td>Proscitech</td><td>C047</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Proscitech</td><td>C059</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Proscitech</td><td>C050</td><td></td></tr><tr><td>Metaperiodynian sodu</td><td>Analar BDH</td><td>10259</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-somatostatynowe</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 585 Koniugat streptawidyny&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10113MP</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>Sigma</td><td>B7389-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 50%</td><td>EMS</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS "Dulbecco A"</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td></td><td></td>BR0014G</tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Aurion</td><td>900.022</td><td></td></tr> Paski wskaźnikowe pH <tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney PP</td><td>M</td><td></td></tr><tr><td>(pH 2,0 - 9,0)</td><td>Merck</td><td>1.09584.0001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroformy</td><td>Proscitech</td><td>RL063</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td>Mikroskop fluorescencyjny <td>Morgagni 268D</td><td></td></tr> Carl <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axioscope A1</td><td></td></tr><tr><td>Siatki 300 mesh nikiel (cienki pręt)</td><td>Agar Scientific</td><td>G2740N</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>RMC</td><td>Powertome</td><td></td></tr><tr><td>TEM oprogramowanie sterujące kamerą</td><td>Soft Imaging System</td><td>AnalySIS</td><td>w wersji 3.0</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>Adobe Systems Dołączony</td><td>program Photoshop CS2</td><td></td></tr></tbody></table>

korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych ludzkiej tkanki patologicznej przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Aby zademonstrować protokół, mamy znakowane immunologicznie ultracienkie skrawki epoksydowe ludzkiego guza somatostatynomy przy użyciu pierwotnego przeciwciała przeciwko somatostatynie, a następnie biotynylowanego przeciwciała wtórnego i wizualizacji za pomocą kropek kwantowych (QD) kadmowo-selenowych (CdSe) sprzężonych z streptawidyną 585 nm kadm-selen (CdSe). Sekcje są montowane na siatce próbek TEM, a następnie umieszczane na szklanym szkiełku w celu obserwacji za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Mikroskopia świetlna ujawnia znakowanie QD 585 nm jako jasnopomarańczową fluorescencję tworzącą ziarnisty wzór w cytoplazmie komórek nowotworowych. Przy małym i średnim zakresie powiększenia za pomocą mikroskopii świetlnej można łatwo rozpoznać wzór etykietowania i ocenić poziom oznakowania niespecyficznego lub tła. Jest to kluczowy krok dla późniejszej interpretacji wzorca znakowania immunologicznego za pomocą TEM i oceny kontekstu morfologicznego. Ten sam fragment jest następnie osuszany i oglądany przez TEM. Obserwuje się, że sondy QD są przyłączone do materiału amorficznego zawartego w pojedynczych granulkach wydzielniczych. Obrazy są pozyskiwane z tego samego obszaru zainteresowania (ROI), który jest widziany pod mikroskopią świetlną w celu analizy korelacyjnej. Odpowiednie obrazy z każdej modalności mogą być następnie mieszane w celu nałożenia danych fluorescencyjnych na ultrastrukturę TEM odpowiedniego regionu.

Próbka guza somatostatinoma użyta w tym badaniu składała się z komórek nowotworowych tworzących struktury przewodowe zmieszane z kolagenową tkanką zrębową. W mikroskopii fluorescencyjnej pojedyncze komórki nowotworowe zawierające liczne granulki wydzielnicze wykazały pozytywne znakowanie dla hormonu somatostatyny. Jądra komórkowe widoczne były jako ciemne otwory z minimalnym, wykrywalnym niespecyficznym znakowaniem (Rysunek 1). Przy małych powiększeniach w cytoplazmie tyc...

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie danych z korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) poprzez połączenie informacji z immunocytochemii fluorescencyjnej z morfologią ultrastrukturalną z mikroskopii elektronowej transmisyjnej na jednym obrazie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunocytochemii i patologii, takie jak to, z jaką strukturą subkomórkową związany jest konkretny białko zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie tej samej sondy z nanocząsteczek kropek kwantowych do uzyskania zarówno sygnału z mikroskopii żywych komórek z docelowego białka, jak i lokalizacji strukturalnej w mikroskopii elektronowej.Po utrwaleniu, zatopieniu i przygotowaniu skrawków tkanki guza somatostatinoma człowieka zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować roztwór kleju do skrawków, umieszczając 20 centymetrów przezroczystej taśmy klejącej w butelce o pojemności pięciu mililitrów zawierającej 2,0 mililitrów acetonu i pozostawiając ją na 10 minut. Należy wyjąć taśmę, zanurzyć w roztworze siateczkę niklową, a następnie wyjąć siateczkę i pozostawić ją do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu należy użyć matowej

correlative-light-electron-microscopy-using-quantum-dot

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, nanocząstki te mają rozmiar zbliżony do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczych cząsteczek, stabilności przeciwko fotodegradacji oraz odporności na nieswoiste wiązanie z białkami i komórkami.

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Tutaj prezentujemy niezawodną metodę monitorowania inkorporacji nanocząstek do matrycy gospodarza polimeru poprzez enkapsulację pęcznienia. Pokazujemy, że stężenie powierzchniowe kropek kwantowych selenku kadmu można dokładnie zobrazować za pomocą przekrojowego obrazowania fluorescencyjnego.

Zaawansowana analiza składu kompozytów nanocząstkowo-polimerowych z wykorzystaniem bezpośredniego obrazowania fluorescencyjnego

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Obecny protokół opisuje metodę immunoznakowania białka w skrawkach tkanki serca za pomocą kropek kwantowych. Technika ta stanowi użyteczne narzędzie do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i ekspresji dowolnego białka na poziomie ultrastrukturalnym.

Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji białka w sercu za pomocą znakowania immunologicznego za pośrednictwem kropek kwantowych, a następnie transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Poznaj korelacyjną mikroskopię świetlną i elektronową z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych do badań immunocytochemicznych tkanki nowotworowej. Ta metoda łączy fluorescencję z mikroskopią transmisyjną w celu szczegółowej lokalizacji białek.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Przeglądaj więcej filmów