Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych
7 sierpnia 2016
Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie korelacyjnych danych z mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) poprzez połączenie informacji immunocytochemicznych fluorescencji z morfologią ultrastrukturalną z transmisyjnej mikroskopii elektronowej na jednym obrazie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunocytochemii i patologii, takie jak to, z jaką strukturą subkomórkową związane jest określone białko będące przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona tę samą sondę nanocząstek kropek kwantowych do uzyskania zarówno sygnału mikroskopowego na żywo z białka docelowego, jak i lokalizacji strukturalnej mikroskopii elektronowej.
Po zamocowaniu, zatopieniu i pocięciu ludzkiej tkanki nowotworowej somatostatynomy zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj roztwór kleju do sekcji, umieszczając 20 centymetrów przezroczystej taśmy klejącej w pięciomililitrowej butelce zawierającej 2,0 mililitra acetonu i odstaw na 10 minut. Usuń taśmę i zanurz siatkę niklową w roztworze, a następnie usuń siatkę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu użyj matowej strony siatki, aby podnieść ultra cienki odcinek.
Bardzo ważne jest, aby ustalić prawidłowy czas trawienia dla wybranej formuły żywicy. 30 minut dobrze sprawdza się w przypadku tego preparatu, ale może być konieczne ponowne przeliczenie w przypadku twardszych lub bardziej miękkich preparatów. Przygotuj jeden mililitr świeżo nasyconego roztworu do trawienia metaperiodynianu sodu w wodzie destylowanej i umieść kropelki roztworu na czystej powierzchni folii laboratoryjnej.
Umieść całkowicie suche siatki z sekcjami na kropelkach i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przenieś kratki do kropelek wody destylowanej na 60 sekund, aby je zmyć. Aby przeprowadzić znakowanie przeciwciał i kropek kwantowych lub QD na czystej powierzchni folii laboratoryjnej, pipetą upuść 0,05 glicenu molowego i PBS.
Umieść kratki na kropelkach i inkubuj przez 10 minut, aby zablokować resztki aldehydu na sekcjach. Aby usunąć blok aldehydu, krótko osusz krawędź siatki. Następnie umieść siatkę na kropli jednego procenta normalnej koziej surowicy lub NGS i jednego procenta BSAC w PBS na 10 minut.
Przygotuj jeden mililitr roztworu blokującego, dodając 10 mikrolitrów NGS i 100 mikrolitrów BSAC do 890 mikrolitrów PBS. Następnie kondycjonuj skrawki, umieszczając je na kropelce rozcieńczalnika przeciwciał na 10 minut. Następnie użyj rozcieńczalnika przeciwciał, aby rozcieńczyć przeciwciało poliklonalne anty-somatostatyny od 1 do 10 i umieść siatki na kropelkach roztworu.
Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji usunąć odczynnik z przeciwciałami, osuszając krawędź siatki. Następnie użyj rozcieńczalnika do przeciwciał, aby umyć sekcje dwa razy po pięć minut każda.
Po rozcieńczeniu przeciwciała drugorzędowego od 1 do 10 i przygotowaniu kropli, inkubować siatki na kropelkach w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie usuń roztwór przeciwciała i umyj skrawki dwa razy. Rozcieńczyć sprzężone ze streptawidyną odstępy czasu od 1 do 10 i inkubować próbki na kroplach roztworu w ciemności, w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
Następnie użyj rozcieńczalnika do przeciwciał, aby umyć kratki dwukrotnie, za każdym razem przez pięć minut, i osusz krawędź kratek. Następnie umyj kratki w wodzie destylowanej przez dwie minuty przed osuszeniem krawędzi. Umieść wybarwiony immunologicznie fragment siatki w kropli wody na szkiełku podstawowym i użyj szklanego szkiełka nakrywkowego, aby go przykryć.
Aby przeprowadzić mikroskopię światła fluorescencyjnego, włóż kostkę filtracyjną o następujących parametrach i użyj oświetlenia LED 365 nanometrów. Umieść wycinek wybarwiony immunologicznie na stoliku mikroskopu immunofluorescencyjnego. Użyć mikroskopii świetlnej w celu oceny wzorca etykietowania, poziomu wszelkich niespecyficznych etykiet oraz w celu ustalenia, czy kontrole ujemne są czyste.
Następnie zidentyfikuj ROI w odniesieniu do słupków siatki. Następnie ustaw pełnokolorowy aparat cyfrowy na automatyczny kolor FL i ustaw balans bieli na 3, 200 K. Ustaw aparat w trybie automatycznej ekspozycji z ustawieniem gamma w zakresie od 0.45 do 1.00, aby zoptymalizować wygląd obrazów, a wzmocnienie analogowe ustawić na jeden X. Kliknij ikonę kamery w interfejsie graficznym oprogramowania ZEN Two Light, aby żyć. Następnie skoncentruj się na obrazie i kliknij przycisk Snap w interfejsie graficznym oprogramowania ZEN Two Light, aby przechwycić obraz do magazynu ramek.
Zapisz obrazy jako pliki tf, aby uniknąć kompresji i pikselizacji. Przygotuj wydruk przedstawiający położenie zwrotu z inwestycji w stosunku do pasków siatki lub innych istotnych punktów orientacyjnych tkanki. Następnie zdejmij kratkę ze szkiełka, umyj w wodzie destylowanej i delikatnie osusz krawędzie.
Aby przeprowadzić transmisyjną mikroskopię elektronową, przenieś siatkę do mikroskopu w celu zbadania przy użyciu przyspieszającego napięcia 100 kilowoltów. Zacznij od małego powiększenia około 1 400X, aby poruszać się po siatce i znaleźć ROI z tymi znalezionymi za pomocą mikroskopii świetlnej. Obserwuj poszczególne kolejki kolejek przy powiększeniu 70 000x lub większym.
Pojawią się jako nieregularne struktury krystaliczne o umiarkowanej gęstości elektronów. Następnie, korzystając z aparatu cyfrowego z monochromatycznym czujnikiem o wymiarach 1 392 na 1 040 pikseli w interfejsie graficznym oprogramowania do przetwarzania obrazu, kliknij ikonę aparatu, aby włączyć i uzyskać obrazy. Przesuń ikonę kamery do pozycji wyłączonej, aby zapisać obraz w magazynie ramek.
Aby przeprowadzić obrazowanie CLEM, użyj wydruku z obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej, aby zlokalizować odpowiednie zwroty z inwestycji według TEM. Cechy architektury tkankowej są przydatne do nawigacji po sekcji. Przechwyć obraz odpowiedniego zwrotu z inwestycji przez TEM.
Następnie, aby przygotować obraz CLEM, upewnij się, że obraz TEM jest prawidłowo zorientowany i powiększony do tego samego rozmiaru i rozdzielczości co obraz z mikroskopu świetlnego, w tym przypadku 300 pikseli na cal. Zwiększ rozmiar płótna obrazu mikroskopii świetlnej, aby podwoić jego rozmiar. Następnie skopiuj i wklej obraz TEM obok obrazu fluorescencyjnego.
Aby utworzyć nakładkę fluorescencyjną w programie Photoshop CS2, kliknij narzędzie do zaznaczania prostokątnego, wybierz obraz fluorescencyjny i utwórz z niego zduplikowaną warstwę. Dostosuj opcje mieszania stylów warstw do 30 do 40% przezroczystości. Następnie kliknij narzędzie do przesuwania i przeciągnij warstwę nakładki fluorescencyjnej na odpowiedni obraz TEM i wyrównaj obrazy.
Po wyrównaniu obrazów spłaszcz obraz, aby uzyskać ostateczną nakładkę. Następnie użyj narzędzia Zaznaczanie prostokątne, aby wybrać nowy obraz nakładki i skopiować go na nowe płótno. Na koniec zapisz obraz jako plik tf.
Na tym obrazie z mikroskopii fluorescencyjnej poszczególne komórki nowotworowe somatostinoma zawierają obfite ziarnistości wydzielnicze i zostały pozytywnie oznaczone na hormon somatostatyny. Jądra wyglądały jak ciemne, a przy małym powiększeniu w cytoplazmie obserwowano zmiennie intensywną, ziarnistą, pomarańczową fluorescencję QD. Zwrot z inwestycji wybrany przez mikroskopię świetlną został rozpoznany i zobrazowany za pomocą TEM poprzez odniesienie do obrazu z 20-krotnej mikroskopii świetlnej, jak wskazano tutaj.
Przy większym powiększeniu komórka wykazuje jasną fluorescencję i intensywne znakowanie QD w ziarnistościach cytoplazmatycznych. Nakładanie danych fluorescencyjnych na obrazy TEM, jak w tym przykładzie, sugeruje, że silne znakowanie dodatnie odpowiada granulkom zawierającym materiał o umiarkowanej gęstości elektronów w błonie ograniczającej pęcherzyki. W końcu, jak widać tutaj w większym powiększeniu, granulki o umiarkowanej gęstości elektronów wykazywały intensywne immunoznakowanie nanokryształów QD.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać, aby obchodzić się z kratkami ostrożnie, tylko przy krawędziach. Dotknięcie sekcji podczas podnoszenia siatki może spowodować odłączenie sekcji od siatki.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak multipleksowe znakowanie immunologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy białko, które Cię interesuje, kolokalizuje się z innym białkiem. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się patologią do zbadania lokalizacji białek w procesie archiwizacji tkanek ludzkich na potrzeby mikroskopii elektronowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć informacje immunocytochemiczne z mikroskopii światła fluorescencyjnego z ultrastrukturą z transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Nie zapominaj, że praca z tetratlenkiem osmu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie sprzętu ochronnego, praca w dygestoriach i odpowiednia utylizacja odpadów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wykorzystania nanocząstek kropek kwantowych (QD) w korelacyjnych immunocytochemicznych badaniach ludzkiego tkankowego materiału patologicznego. Technika łączy fluorescencyjną mikroskopio świetlną z transmisyjną mikroskopio elektronową, aby zapewnić szczegółowe informacje na temat lokalizacji białek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunocitochemia
- Patologia
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Korelacjonowanie mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) jest niezbędne do zrozumienia lokalizacji białek.
- Kropki kwantowe zapewniają unikalną przewagę w wizualizowanie białek w mikroskopii na żywo.
- Ta metoda odpowiada na kluczowe pytania w immunocytochemii.
- Łączenie obrazowania strukturalnego i funkcjonalnego poprawia interpretację danych.
Cel badania
- Uzyskanie danych CLEM z ludzkiego tkankowego materiału nowotworowego somatostatynoma.
- Wizualizacja lokalizacji białek i powiązanych struktur subkomórkowych.
- Wykorzystanie pojedynczej nanocząstki sondy zarówno w mikroskopii fluorescencyjnej jak i elektronowej.
Stosowane metody
- Zanurzanie i cięcie ludzkiego tkankowego materiału nowotworowego.
- Przygotowanie roztworu klejącego za pomocą przezroczystej taśmy i acetonu.
- Zastosowanie przeciwciał sprzężonych z kropkami kwantowymi do wizualizowania.
- Wykorzystanie szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopio świetlnej i transmisyjnej mikroskopio elektronowej.
Główne wyniki
- Udana wizualizację lokalizacji białek w tkankowych materiałach nowotworowych.
- Wykazanie skuteczności nanocząstek kropek kwantowych.
- Integracja danych z fluorescencyjnej i elektronowo mikroskopii.
- Ulepszone zrozumienie powiązań białek z strukturami subkomórkowymi.
Wnioski
- Metoda dostarcza potężnego narzędzia do immunocytochemicznych badań.
- Kropki kwantowe umożliwiają jednoczesne obrazy struktury i funkcji.
- To podejście może rozwijać badania w dziedzinie patologii i pokrewnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Correlative light and electron microscopy (CLEM) using quantum dot nanoparticles enables precise mapping of protein localization within human pathology tissue, bridging the gap between molecular detection and ultrastructural context. This dual-modality approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at critical discovery inflection points. Integrating fluorescence and electron microscopy data supports robust portfolio decisions by clarifying subcellular associations of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein localization within disease-relevant human tissue sections.
- Supports mechanistic de-risking by correlating immunolabeling with ultrastructural features.
- Improves predictive confidence in target validation through high-resolution spatial mapping.
- Facilitates triage of targets based on subcellular distribution and context.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological readouts for downstream assay development workflows.
- Ensures reproducibility and standardization by using the same quantum dot probe across modalities.
- Enables quantitative assessment of labeling specificity and background prior to high-content screening.
- Supports reliable evaluation of antibody and probe performance in complex tissue matrices.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular detection with ultrastructural pathology for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by leveraging archival human tissue.
- Reduces biological risk in preclinical models by confirming target localization in relevant tissue architecture.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on integrated molecular and morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This CLEM method positions itself at the intersection of discovery biology, assay development, and translational research, enabling seamless data integration from early validation to preclinical studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein localization at the ultrastructural level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and probe validation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements and overlays for direct comparison of molecular and structural data.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by confirming biomarker localization in human pathology samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse targets and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both fluorescence and electron microscopy techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and digital analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of labeling and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different resin formulations or tissue types.
- Careful handling and safety precautions are essential due to hazardous reagents like osmium tetroxide.
