Name: Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę wykrywania aktywacji czynników jądrowych w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta pozwala na szybką analizę poziomu białek jądrowych, w tym NF kappa B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Nancy Mora za jej pomoc techniczną.
Ta praca została sfinansowana z grantów badawczych 48573-M i 168098 z Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Meksyk, oraz z grantów IN212308 i IN205311-2 z Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Meksyk.

1. Izolacja neutrofili (PMN) z ludzkiej krwi
<ol>
	<li>Należy użyć około 20 ml krwi ludzkiej z heparyną (10 j./ml) jako antykoagulantem. Krew pobrano od dorosłych, zdrowych ochotników metodą wenoppunktury. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Bioetycznej przy Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.</li>
	<li>Umieścić 2 ml 6% dekstranu T500 w PBS do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 10 ml krwi. Wymieszaj, odwracając probówkę dwa lub trzy razy i pozostaw na 45 minut, aby umożliwić sedymentację erytrocytów.</li>
	<li>Do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml wlej 5 ml Ficoll-Paque.</li>
	<li>Weź osocze bogate w leukocyty, które utworzyło się nad osadzonymi erytrocytami, i ostrożnie pipetuj je na wierzchu Ficoll-Paque, tworząc drugą warstwę. Upewnij się, że są dwie fazy.</li>
	<li>Wirować przy 516 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu, na styku osocza i Ficoll-Paque znajduje się warstwa komórek jednojądrzastych. Neutrofile znajdują się na dnie rurki.</li>
	<li>Usunąć supernatant, rozbić osad komórkowy, stukając probówką o stojak, a następnie ponownie zawiesić komórki, dodając 10 ml zimnego (4 °C) PBS. nuta: Nie zaleca się ponownego zawieszania komórek poprzez pipetowanie w górę i w dół, ponieważ jest to zbyt szkodliwe dla komórek.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozbić osad komórkowy jak poprzednio i dodać 10 ml zimnego (4 °C) roztworu hipotonicznego (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) w celu lizy erytrocytów. Mieszaj, delikatnie obracając probówkę ręcznie przez dokładnie jedną minutę.</li>
	<li>Dodać 10 ml zimnego (4 °C) roztworu hipertonicznego (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), wymieszać i policzyć komórki za pomocą hemocytometru (zwykle >95% to PMN). 
	>nuta: Trzymaj probówkę z zawiesiną komórek na lodzie podczas liczenia komórek.</li>
	<li>Odwirować jak poprzednio i ponownie zawiesić PMN w stężeniu 107 komórek/ml w zimnym (4 °C) PBS. Przechowywać na lodzie. 
	nuta: Neutrofile pozostają żywotne i funkcjonalne w temperaturze 4 °C przez około 6 do 8 godzin.</li>
</ol>
2. Aktywacja PMN
<ol>
	<li>Umieścić 100 μl zawiesiny PMN (1 x 107komórek/ml) w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. 
	nuta: Probówki z próbkami powinny być wykonane co najmniej w dwóch egzemplarzach. Zwykłe kontrole ujemne powinny obejmować tylko pierwsze przeciwciało i tylko przeciwciało drugorzędowe.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciało monoklonalne antyintegryny lub receptora anty-Fc (mAb) w stężeniu 10 μg/ml i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Przemyć PMN, dodając 1 ml zimnego (4 °C) PBS, odwirowując przy 1,743 x g (4,500 obr./min) w mikrowirówce i odsysając supernatant.</li>
	<li>Rozbij osad komórkowy, stukając dnem probówki o stojak, dodaj 1 ml zimnego PBS i umyj jeszcze dwa razy, jak w poprzednim kroku. 
	nuta: Te płukania usuwają niezwiązane przeciwciała.</li>
	<li>Zawiesić PMN w tej samej (początkowej) objętości ciepłego (37 °C) PBS zawierającego 60 μg/ml F(ab')2 koziego anty-mysiego IgG. 
	nuta: Drugorzędowe przeciwciało anty-mysie IgG zwiąże się z pierwszym przeciwciałem antyreceptorowym i spowoduje sieciowanie receptora.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–20 minut, w zależności od czynnika jądrowego będącego przedmiotem zainteresowania. Dla NF-κB zwykle 15 min, a dla Elk-1 zwykle 5 min. 
	nuta: Inkubacja komórek w temperaturze 37 °C indukuje sieciowanie receptorów, które nie może mieć miejsca w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml zimnego PBS i odwirować przez 3 minuty przy 1,743 x g w mikrowirówce.</li>
	<li>Usunąć supernatant</li>
	<li>Natychmiast zamrozić PMN w kąpieli z suchym lodem/etanolem i przechowywać tam przez 10 minut.</li>
</ol>
3. Izolacja i utrwalenie jąder
<ol>
	<li>Zawiesić zamrożone granulki PMN w 100 μl zimnego (4 °C) buforu hipotonicznego (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 i 1 mM świeżo dodanego DL-ditiotreitolu [DTT]; pH = 7,9). Zaleca się wyjmowanie probówek z kąpieli z suchym lodem/etanolem jedna po drugiej i wytarcie dna probówki przed dodaniem buforu hipotonicznego.</li>
	<li>Umieścić na lodzie i sprawdzić integralność jąder, barwiąc podwielokrotność zawiesiny jąder błękitem trypanowym. Jądra są okrągłe i niebieskie. Nienaruszony PMN nie ulega zabarwieniu, a szczątki komórkowe pojawiają się jako niebieskie cząstki o nieregularnym kształcie. 
	nuta: Jeśli zawiesina jąder zawiera wiele nienaruszonych komórek lub szczątków, lepiej jest wyrzucić preparat i powtórzyć procedurę z inną próbką.</li>
	<li>Odwirować jądra przy 775 x g (3 000 obr./min) w mikrowirówce przez 10 minut w chłodni. W tym momencie jądra są bardzo delikatne i należy zachować szczególną ostrożność, aby próbki były zimne i nie wirowały przy nadmiernych siłach.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez bardzo ostrożne pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 100 μl zimnego 4% paraformaldehydu do PBS, aby utrwalić jądra. 
	nuta: Osad jest bardzo luźny i dodanie buforu wystarczy do ponownego zawieszenia jąder. Należy unikać pipetowania w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Jądra znakowane immunologicznie do cytometrii przepływowej lub przechowywać je do 24 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Immunoznakowanie jąder do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odwirować jądra przy 1 743 x g (4 500 obr./min) w mikrowirówce przez 1 minutę i usunąć supernatant przez bardzo delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 100 μl zimnego (4 °C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehydu w PBS do przepuszczalności jąder. Inkubować w lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować permeabilizowane jądra w mikrowirówce o stężeniu 1,743 x g i ostrożnie usunąć supernatant. W tym momencie granulki jąder nie przyczepiają się dobrze na dnie rurki. Zaleca się ponowne odwirowanie, jeśli osad się poluzuje.</li>
	<li>Zawiesić jądra w 500 μl zimnej 4% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania i inkubować na lodzie przez 20 minut. Odwirować jądra przy 1,743 x g przez 3 minuty w mikrowirówce i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić jądra w 100 μl zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 2,5 μg/ml mAb w stosunku do interesującego czynnika jądrowego. Inkubować na lodzie przez 20 min. 
	nuta: Zwykłe kontrole ujemne powinny obejmować tylko przeciwciała przeciwko czynnikowi jądrowemu i tylko przeciwciała drugorzędowe znakowane FITC.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 500 μl zimnego PBS z 4% FBS i odwirować przy 1743 x g przez 3 min.</li>
	<li>Bardzo ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić jądra w 100 μl zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 10 μg/ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego znakowanego FITC i inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć jądra 500 μl zimnego PBS z 4% FBS, tak jak w poprzednim kroku.</li>
	<li>Zawiesić jądra w 400 μl zimnego 4% paraformaldehydu w PBS. 
	nuta: Jądra umieszcza się w paraformaldehydzie, aby umożliwić przechowywanie próbki przez kilka dni bez problemów z zanieczyszczeniem, które mogą wystąpić w obecności surowicy.</li>
	<li>Natychmiast przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej lub przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do trzech dni.</li>
</ol>
5. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Analizuj jądra znakowane immunologicznie w cytometrze przepływowym, takim jak FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) lub podobne urządzenie.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia akwizycji do: FSC w skali logarytmicznej 10-1, SSC w skali logarytmicznej 196 i jąder bramki na wykresie kropkowym.</li>
	<li>Pozyskaj dziesięć tysięcy jąder na próbkę.</li>
	<li>Analiza fluorescencji jąder barwionych FITC przez kanał FL-1 (506 nm) ustawiony w skali logarytmicznej na 400.</li>
</ol>

<ol><li>Sendo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neutrophil+apoptosis%3A+its+biological+significance+in+inflammation+and+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response.</a> Human Cell. 9, 215-222 (1996).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li>
<li>Naussef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+human+neutrophils+kill+and+degrade+microbes.+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view.</a> Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).</li>
<li>Scapini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+as+a+cellular+source+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The neutrophil as a cellular source of chemokines.</a> Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).</li>
<li>Hamilton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+stimulus-specific+mechanisms+for+post-transcriptional+control+of+neutrophil+chemokine+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).</li>
<li>Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+apoptosis+pathways+and+their+modifications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation.</a> Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neutrophil+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neutrophil apoptosis.</a> FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+neutrophil+apoptosis%3A+new+players+enter+the+game%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game.</a> Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+NF-%CE%BAB+in+T+cell+activation%3A+life+at+the+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge.</a> Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).</li>
<li>Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+JNK+signaling+to+NF-%CE%BAB%3A+a+key+to+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival.</a> J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).</li>
<li>Valente, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+increases+camptothecin-induced+apoptosis+by+inhibition+of+NF-%CE%BAB%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB.</a> Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).</li>
<li>Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NF-%CE%BAB+by+a+TAT-NEMO-binding+domain+peptide+accelerates+constitutive+apoptosis+and+abrogates+LPS-delayed+neutrophil+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis.</a> Blood. 102, 2259-2267 (2003).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+neutrophil+apoptosis+by+type+1+IFN+depends+on+cross-talk+between+phosphoinositol+3-kinase%2C+protein+kinase+C-d%2C+and+NF-%CE%BAB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways.</a> J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+activation+by+Fc%CE%B3R+in+human+peripheral+blood+neutrophils+detected+by+a+novel+flow+cytometry-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method.</a> J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIA+and+Fc%CE%B3RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda oczyszczania pozwala na wyizolowanie w krótkim czasie niestymulowanych neutrofili (PMN) o czystości większej niż 95% (ocenianej na podstawie obserwacji mikroskopowej). Czasami neutrofile mogą być zanieczyszczone przez erytrocyty, jeśli te ostatnie nie są całkowicie zlizowane. Zwykle nie ma to wpływu na technikę, ponieważ erytrocyty i PMN można łatwo odróżnić jako odrębne populacje komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Wyizolowany PMN może być następnie stymulowany poprzez sieciowanie określonych...

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi obwodowej 1. Podczas stanu zapalnego i infekcji neutrofile są pierwszymi komórkami, które pojawiają się w dotkniętym chorobą miejscu, gdzie działają jako pierwsza linia obrony 2. Neutrofile posiadają kilka mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych 3 w tym fagocytozę, wytwarzanie reaktywnych form tlenu, uwalnianie enzymów litycznych przez degranulację i wytwarzanie cytokin prozapalnych 4,5. Neutrofile to krótkotrwałe komórki, które szybko ulegają aktywacji poprzez sygnalizację z różnych receptorów na powierzchni komórki. Chociaż neutrofile są uważane za komórki terminalne ze względu na ich krótkie życie i dlatego, że ulegają apoptozie, chyba że zostaną aktywowane podczas procesu zapalnego 6, obecnie jest jasne, że mogą również modyfikować swój fenotyp poprzez zmianę poziomu transkrypcji poszczególnych genów. Produkcja cytokin 5 i hamowanie apoptozy 7,8 to dwie ważne, zależne od aktywacji funkcje komórkowe regulowane na poziomie transkrypcji w neutrofilach. Czynnik jądrowy κB (NF-κB) uczestniczy w transkrypcyjnej kontroli produkcji cytokin 4 oraz w regulacji przeżycia i apoptozy komórek 9-11 w różnych typach komórek.
Szlaki sygnałowe, które prowadzą do aktywacji czynnika jądrowego, są zazwyczaj badane za pomocą testów genów reporterowych lub testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA). Ponieważ jednak neutrofile są komórkami krótkożywymi, badanie odpowiedzi regulowanych transkrypcją w tych komórkach nie może być przeprowadzone za pomocą testów genów reporterowych, ponieważ nie ma skutecznych technik transfekcji neutrofili. Testy EMSA zostały wykorzystane w neutrofilach do zbadania aktywacji czynników jądrowych 12,13; Metodologia ta jest jednak skomplikowana i kosztowna, ponieważ wiąże się z wykorzystaniem materiału radioaktywnego. Nukleofekcja to kolejna technika, która jest z powodzeniem stosowana do transfekcji monocytów 14. Tak więc, przynajmniej w teorii, aktywacja czynnika jądrowego może być wykryta w neutrofilach przez transfekcję (pomimo niskiej wydajności). Technika ta byłaby jednak droższa, bardziej czasochłonna i prawdopodobnie mniej ilościowa. Analiza mikroskopowa komórek wybarwionych immunologicznie może być również wykorzystana do wykrycia czynników jądrowych w jądrze. Rzeczywiście, wykryliśmy w ten sposób translokację NF-κB do jądra 15. Niestety, technika ta jest również czasochłonna, mniej ilościowa i podatna na stronniczość obserwatora.
Tutaj prezentujemy prostą i efektywną metodę, która pozwala na wykrywanie i kwantyfikację czynników jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach za pomocą cytometrii przepływowej. Opisujemy techniki izolowania neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, stymulowania tych komórek za pomocą integryn lub receptorów Fc z przeciwciałami antyreceptorowymi, izolowania jąder i immunoetykietowania oraz analizowania jąder za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 1). Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do wykrywania czynników jądrowych NF-κB 15 i Elk-1 16 w jądrach neutrofili. Czułość tej metody pozwala na wykrycie niewielkich zmian w poziomach czynników jądrowych w jądrze. Metoda ta może być również stosowana do analizy poziomu czynników transkrypcyjnych w jądrach innych typów komórek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Heparyna </td><td>PiSA (Meksyk)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstran T500</td><td>Pharmacosmos A/S (Holbaek, Dania)</td><td>T1-Dekstran T500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Pharmacia</td><td>17-0320-01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu </td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Frakcja Cohna V</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td> Chlorek potasu Sigma P9541 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu bezwodny </td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DL- ditiotreitol (DTT) </td><td>Sigma</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy (0,4 % roztwór)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 </td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne IV.3</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>025-1</td><td>Przeciwciało monoklonalne anty-FcRII (CD32) </td></tr> specyficzne dla człowieka <tr><td>3G8</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>028-2</td> Przeciwciało monoklonalne <td>anty-FcRIII (CD16) </td></tr><tr><td>specyficzne dla człowieka TS2/16</td><td>Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)</td><td>Podarowane przez dr Martina Hemlera</td><td>Anty-&#946 specyficzne dla człowieka; 1 integryna (CD29)</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne IB4</td><td>Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco</td><td>Podarowane przez dr Erica J. Browna</td><td>Anty-&#946 specyficzne dla człowieka; 2 integryna (CD18)</td></tr><tr><td>F(ab')2 kozia anty-mysia </td><td>kapsułka IgG (Aurora, OH)</td><td>55468</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 kozia anty-mysia</td><td>kapsułka IgG (Aurora, OH)</td><td>55522</td><td></td></tr> kozia <tr><td>anty-królicza kapsułka IgG przeciw królikowi</td> (<td>Aurora, OH)</td><td>55665</td><td></td></tr><tr><td>anty-NF-&#954; B p50</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornia)</td><td>sc-114</td><td>Królicze przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>anty-NF-&#954; B p65</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-109</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr> poliklonalne królika<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>15-ml probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Wirówka 430291</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning, Sorvall Tabletop</td><td>Dupont Instruments</td><td>RT 6000D</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Corning</td><td>340</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pipetman P-20</td><td>Pipeta Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Pipeta Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td></td> Hemocytometr <td>Gilson</td> F123602 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110 Mikroskop Nikon</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Eclipse E600</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td></td> Inkubator kąpieli wodnej Nikon <td>TMS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrowirówka Fisher Scientific</td><td>2IS-M</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5414C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)</td><td>FACScalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi obwodowej. Komórki te jako pierwsze pojawiają się w miejscach zapalenia i infekcji, stając się w ten sposób pierwszą linią obrony przed inwazyjnymi mikroorganizmami. Neutrofile pełnią ważne funkcje przeciwdrobnoustrojowe, takie jak fagocytoza, uwalnianie enzymów litycznych i produkcja reaktywnych form tlenu. Oprócz tych ważnych funkcji obronnych, neutrofile wykonują inne zadania w odpowiedzi na infekcję, takie jak produkcja cytokin prozapalnych i hamowanie apoptozy. Cytokiny rekrutują inne leukocyty, które pomagają usunąć infekcję, a hamowanie apoptozy pozwala neutrofilom żyć dłużej w miejscu infekcji. Funkcje te są regulowane na poziomie transkrypcji. Ponieważ jednak neutrofile są komórkami krótkożywymi, badanie odpowiedzi regulowanych transkrypcją w tych komórkach nie może być przeprowadzone za pomocą konwencjonalnych metod genów reporterowych, ponieważ nie ma skutecznych technik transfekcji neutrofili. W tym artykule przedstawiamy prostą i skuteczną metodę, która pozwala na detekcję i kwantyfikację czynników jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach za pomocą cytometrii przepływowej. Opisujemy techniki izolowania czystych neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej, stymulowania tych komórek przeciwciałami antyreceptorowymi, izolowania i znakowania immunologicznego jąder oraz analizy jąder za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana do wykrywania czynników jądrowych NF-κB i Elk-1 w jądrach neutrofili i innych typów komórek. W związku z tym metoda ta stanowi opcję analizy aktywacji czynników transkrypcyjnych w izolowanych jądrach z różnych typów komórek.

Opisana tutaj metoda oczyszczania zazwyczaj pozwala na uzyskanie niepobudzonych neutrofilów (PMN) o czystości przekraczającej 95% (Rysunek 1A). Wyizolowane PMN mogą następnie zostać pobudzone poprzez sieciowanie konkretnych receptorów za pomocą specyficznych przeciwciał monoklonalnych. W naszej pracy pobudzaliśmy PMN poprzez receptory Fc oraz integryny (Rysunek 1B). Po pobudzeniu PMN poddaje się lizie, a jądra komórkowe izoluje z wysoką wydajnością. Następnie jądra są znakowane immunolog...

Neutrofile to najliczniejsze leukocyty we krwi. Neutrofile pełnią funkcje regulowane transkrypcją, takie jak produkcja cytokin prozapalnych i hamowanie apoptozy. Funkcje te można badać za pomocą przedstawionej tutaj metody, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację czynników jądrowych za pomocą cytometrii przepływowej w izolowanych jądrach

Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

W tym doświadczeniu wykorzystano cytometrię przepływową do detekcji i kwantyfikacji białek jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach neutrofili po uprzednim oczyszczeniu neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej. Erytrocy usunięto za pomocą dekstryny, a następnie przeprowadzono wirowanie plazmy w gradiencie gęstości. Następnie, przy użyciu przeciwciał przeciwreceptorowych, stymulowano oczyszczone neutrofile poprzez integryny lub receptory FC.Następnie należy wyizolować jądra i utrwalić próbki do immunoznakowania specyficznymi przeciwciałami przeciwko interesującemu czynnikowi jądrowemu NU. Na przykład NF-κB, a następnie przeanalizować jądra za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia niewielkich zmian w aktywacji czynnika jądrowego. Uzyskane wyniki wykazują, że stymulacja neutrofili poprzez ich integryny prowadzi do zwiększenia koncentryjacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB w jądrach. Szlaki sygnalizacyjne prowadzące do aktywacji czynników jądrowych są zazwyczaj badane za pomocą testów z genem reporterowym lub testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) w komórkach pierwotnych.Często metody te nie są odpowiednie. Cytometria przepływowa umożliwia szybką detekcję i kwantyfikację białek jądrowych w izolowanych jądrach komórkowych. Należy rozpocząć od 10 mililitrów świeżo pobranej krwi od zdrowych, dorosłych ochotników.Do stożkowej probówki wiriówek o pojemności 15 ml pipetuj dwa mililitry 6% roztworu dekstryny T 500. Następnie dodaj 10 ml krwi, wymieszaj poprzez odwrócenie probówki dwa lub trzy razy i odstaw na 45 minut w celu sedymentacji erytrocytów pod wpływem grawitacji w nowej stożkowej probówce wiriówek o pojemności 15 ml. Odmień pięć mililitrów do opakowania FI fial pack.Zebrać osocze bogate w leukocyty, które utworzyło się nad osadem erytrocytów. Ostrożnie nanieść je warstwowo na wierzch fiolki z adsorbentem (fial pack), aby utworzyć dwie fazy, a następnie odwirować z prędkością 516 Gs przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć nadsącz i rozbić osad komórkowy, uderzając probówką o stojak.Następnie resuspendować komórki w 10 ml zimnego PBS. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 290 Gs przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozbić osad komórkowy w opisany wcześniej sposób i dodać 10 ml zimnego roztworu hipotonicznego w celu lizy erytrocytów.Wymieszaj, delikatnie obracając probówkę przez dokładnie jedną minutę. Następnie dodaj 10 milliliters zimnej mieszaniny roztworu hipertonicznego i przechowuj w lodzie. Teraz dokonaj zliczenia komórek po osadzeniu neutrofili poprzez wirowanie.Resuspendujemy PMN w stężeniu 10⁷ komórek na ml. Komórki w zimnym PBS należy przechowywać na lodzie. Do probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml odpipujemy po 100 µl zawiesiny PMN.Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało monoklonalne w stężeniu 10 µg/mL i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Aby wypłukać komórki, dodaj 1 mL zimnego PBS, odwiruj i odessij nadsącz. Następnie delikatnie rozbij pellet komórkowy i wypłucz go dwukrotnie ponownie za pomocą PBS.Aby usunąć niezwiązane przeciwciała, ponownie zawiesić przemyte PMN w tej samej początkowej objętości ciepłego PBS zawierającego 60 µg/mL przeciwciał goat anti-mouse IgG i inkubować w temperaturze 37 °C przez od 1 do 20 minut, w zależności od badanego czynnika jądrowego. Następnie dodać 1 ml zimnego PBS. Po osadzeniu komórek przez wirowanie, usunąć nadsącz i natychmiast zamrozić pellety komórkowe w kąpieli z suchego lodu i etanolu. Dla każdej próbki wyjąć probówkę z kąpieli z suchego lodu i etanolu, wytrzeć do czystości i ponownie zawiesić.Resuspend zamrożone pellety PMN w 100 µL zimnego roztworu hipotonicznego. Umieść wszystkie próbki na lodzie, aby monitorować integralność jąder. Zabarw alikwot zawiesiny jąder błękitem trypanowym.Jeśli zawiesina jąder zawiera wiele nienaruszonych komórek lub debris, lepiej jest odrzucić preparat i rozpocząć procedurę z innymtą próbką. Po osadzeniu jąder poprzez wirowanie, bardzo ostrożnie usunąć nadsącz, a następnie utrwalić jądra w 100 µL zimnego, 4% roztworu paraformaldehydu i inkubować jądra na lodzie. Po osadzeniu jąder ostrożnie usunąć nadsącz, dodać 100 µL zimnego buforu do permeabilizacji i inkubować próbki na lodzie przez 10 minut.Następnie odwirować jądra komórkowe w celu ich zebrania. Na tym etapie osad z jąder nie przylega dobrze do dna probówki. Zaleca się ponowne odwirowanie.Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, zawiesza się jądra w 500 µL zimnej, 4% surowicy płodowej bydlęcej (FBS) w PBS i inkubuje na lodzie przez 20 minut. Jądra należy osadzić poprzez wirowanie, a następnie ponownie zawiesić jądra w 100 µL zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 2,5 µg/mL przeciwciała monoklonalnego przeciwko badanemu czynnikowi jądrowemu. Próbki inkubuje się na lodzie przez 20 minut. Po dwukrotnym przemyciu próbek 500 µL zimnego PBS z 4% FBS, jądra zawiesza się w 100 µL zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 10 µg/mL odpowiadającego przeciwciała wtórnego znakowanego FZ i inkubuje na lodzie przez 20 minut. Po dwóch przemyciach jądra ponownie zawiesza się w 400 µL zimnego 4% Paraldehydu w PBS.Przeanalizuj immunoznakowane jądra w cytometrze przepływowym, takim jak FACSCan lub podobnym urządzeniu. Dostosuj parametry akwizycji: FSC w skali logarytmicznej na poziomie 10⁻¹, SSC w skali logarytmicznej na poziomie 196 i wyznacz bramkę dla jąder na wykresie kropkowym. Należy pobrać dane dla 10 000 jąder na próbkę.Następnie należy przeanalizować fluorescencję jąder barwionych fitsy w jednym kanale FL ustawionym w skali logarytmicznej na 400. Ta metoda oczyszczania PMN zazwyczaj dostarcza niestymulowane neutrofile o czystości powyżej 95%; jądra PMN są izolowane z wysoką wydajnością, a po izolacji do postaci jąder mogą być łatwo rozpoznane jako odrębna populacja od nienaruszonych PMN w cytometrze przepływowym na wykresie kropkowym po stymulacji. Poprzez sieciowanie integryn beta one dochodzi do translokacji NF kappa B do jądra, a ten przyrost jądrowego NF kappa B jest wykrywany jako wzrost fluorescencji.Podobnie, stymulacja PMN poprzez sieciowanie integryn beta 2 również indukuje aktywację NF kappa B, co objawia się zwiększeniem fluorescencji. Czułość tej metody pozwala na wykrycie niewielkich zmian w poziomach czynnika jądrowego, co potwierdza fakt, że integryny beta 1, które wiążą białka macierzy pozakomórkowej, takie jak fibronektyna, indukują silniejszą aktywację NF kappa B niż integryny beta 2, które wiążą się z cząsteczkami adhezyjnymi innych komórek. Metoda ta wykazuje dużą elastyczność, ponieważ można zastosować wiele różnych fluorochromów oraz przygotować jądra różnych typów komórek; to proste i ekonomiczne podejście jest przydatne w badaniach transdukcji sygnału obejmujących zmiany poziomów białek w jądrach różnorodnych typów komórek.

a-simple-efficient-method-to-detect-nuclear-factor-activation-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prosta metoda wykrywania aktywacji czynników jądrowych w neutrofilach ludzkich za pomocą cytometrii przepływowej

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Testy o wysokiej przepustowości są prezentowane, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania uwalniania NET z ludzkich neutrofili.

Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania obecności neutrofili w stałych/permeabilizowanych odcinkach histologicznych i oceny stanu aktywacji żywych, oczyszczonych neutrofili. W szczególności peptyd MUB40 wiąże laktoferynę obecną w ziarnistościach specyficznych dla neutrofili i trzeciorzędowych. Ekspozycja zawartości granulek poprzez przepuszczalność lub aktywację neutrofili pozwala na znakowanie neutrofili.

Peptyd MUB40 do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę wykrywania aktywacji czynników jądrowych w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta pozwala na szybką analizę poziomu białek jądrowych, w tym NF kappa B.

Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów