Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

W tym doświadczeniu wykorzystano cytometrię przepływową do detekcji i kwantyfikacji białek jądrowych w izolowanych i znakowanych immunologicznie jądrach neutrofili po uprzednim oczyszczeniu neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej. Erytrocy usunięto za pomocą dekstryny, a następnie przeprowadzono wirowanie plazmy w gradiencie gęstości. Następnie, przy użyciu przeciwciał przeciwreceptorowych, stymulowano oczyszczone neutrofile poprzez integryny lub receptory FC.

Następnie należy wyizolować jądra i utrwalić próbki do immunoznakowania specyficznymi przeciwciałami przeciwko interesującemu czynnikowi jądrowemu NU. Na przykład NF-κB, a następnie przeanalizować jądra za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia niewielkich zmian w aktywacji czynnika jądrowego. Uzyskane wyniki wykazują, że stymulacja neutrofili poprzez ich integryny prowadzi do zwiększenia koncentryjacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB w jądrach. Szlaki sygnalizacyjne prowadzące do aktywacji czynników jądrowych są zazwyczaj badane za pomocą testów z genem reporterowym lub testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) w komórkach pierwotnych.

Często metody te nie są odpowiednie. Cytometria przepływowa umożliwia szybką detekcję i kwantyfikację białek jądrowych w izolowanych jądrach komórkowych. Należy rozpocząć od 10 mililitrów świeżo pobranej krwi od zdrowych, dorosłych ochotników.

Do stożkowej probówki wiriówek o pojemności 15 ml pipetuj dwa mililitry 6% roztworu dekstryny T 500. Następnie dodaj 10 ml krwi, wymieszaj poprzez odwrócenie probówki dwa lub trzy razy i odstaw na 45 minut w celu sedymentacji erytrocytów pod wpływem grawitacji w nowej stożkowej probówce wiriówek o pojemności 15 ml. Odmień pięć mililitrów do opakowania FI fial pack.

Zebrać osocze bogate w leukocyty, które utworzyło się nad osadem erytrocytów. Ostrożnie nanieść je warstwowo na wierzch fiolki z adsorbentem (fial pack), aby utworzyć dwie fazy, a następnie odwirować z prędkością 516 Gs przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć nadsącz i rozbić osad komórkowy, uderzając probówką o stojak.

Następnie resuspendować komórki w 10 ml zimnego PBS. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 290 Gs przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozbić osad komórkowy w opisany wcześniej sposób i dodać 10 ml zimnego roztworu hipotonicznego w celu lizy erytrocytów.

Wymieszaj, delikatnie obracając probówkę przez dokładnie jedną minutę. Następnie dodaj 10 milliliters zimnej mieszaniny roztworu hipertonicznego i przechowuj w lodzie. Teraz dokonaj zliczenia komórek po osadzeniu neutrofili poprzez wirowanie.

Resuspendujemy PMN w stężeniu 10⁷ komórek na ml. Komórki w zimnym PBS należy przechowywać na lodzie. Do probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml odpipujemy po 100 µl zawiesiny PMN.

Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało monoklonalne w stężeniu 10 µg/mL i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Aby wypłukać komórki, dodaj 1 mL zimnego PBS, odwiruj i odessij nadsącz. Następnie delikatnie rozbij pellet komórkowy i wypłucz go dwukrotnie ponownie za pomocą PBS.

Aby usunąć niezwiązane przeciwciała, ponownie zawiesić przemyte PMN w tej samej początkowej objętości ciepłego PBS zawierającego 60 µg/mL przeciwciał goat anti-mouse IgG i inkubować w temperaturze 37 °C przez od 1 do 20 minut, w zależności od badanego czynnika jądrowego. Następnie dodać 1 ml zimnego PBS. Po osadzeniu komórek przez wirowanie, usunąć nadsącz i natychmiast zamrozić pellety komórkowe w kąpieli z suchego lodu i etanolu. Dla każdej próbki wyjąć probówkę z kąpieli z suchego lodu i etanolu, wytrzeć do czystości i ponownie zawiesić.

Resuspend zamrożone pellety PMN w 100 µL zimnego roztworu hipotonicznego. Umieść wszystkie próbki na lodzie, aby monitorować integralność jąder. Zabarw alikwot zawiesiny jąder błękitem trypanowym.

Jeśli zawiesina jąder zawiera wiele nienaruszonych komórek lub debris, lepiej jest odrzucić preparat i rozpocząć procedurę z innymtą próbką. Po osadzeniu jąder poprzez wirowanie, bardzo ostrożnie usunąć nadsącz, a następnie utrwalić jądra w 100 µL zimnego, 4% roztworu paraformaldehydu i inkubować jądra na lodzie. Po osadzeniu jąder ostrożnie usunąć nadsącz, dodać 100 µL zimnego buforu do permeabilizacji i inkubować próbki na lodzie przez 10 minut.

Następnie odwirować jądra komórkowe w celu ich zebrania. Na tym etapie osad z jąder nie przylega dobrze do dna probówki. Zaleca się ponowne odwirowanie.

Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, zawiesza się jądra w 500 µL zimnej, 4% surowicy płodowej bydlęcej (FBS) w PBS i inkubuje na lodzie przez 20 minut. Jądra należy osadzić poprzez wirowanie, a następnie ponownie zawiesić jądra w 100 µL zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 2,5 µg/mL przeciwciała monoklonalnego przeciwko badanemu czynnikowi jądrowemu. Próbki inkubuje się na lodzie przez 20 minut. Po dwukrotnym przemyciu próbek 500 µL zimnego PBS z 4% FBS, jądra zawiesza się w 100 µL zimnego PBS zawierającego 4% FBS i 10 µg/mL odpowiadającego przeciwciała wtórnego znakowanego FZ i inkubuje na lodzie przez 20 minut. Po dwóch przemyciach jądra ponownie zawiesza się w 400 µL zimnego 4% Paraldehydu w PBS.

Przeanalizuj immunoznakowane jądra w cytometrze przepływowym, takim jak FACSCan lub podobnym urządzeniu. Dostosuj parametry akwizycji: FSC w skali logarytmicznej na poziomie 10⁻¹, SSC w skali logarytmicznej na poziomie 196 i wyznacz bramkę dla jąder na wykresie kropkowym. Należy pobrać dane dla 10 000 jąder na próbkę.

Następnie należy przeanalizować fluorescencję jąder barwionych fitsy w jednym kanale FL ustawionym w skali logarytmicznej na 400. Ta metoda oczyszczania PMN zazwyczaj dostarcza niestymulowane neutrofile o czystości powyżej 95%; jądra PMN są izolowane z wysoką wydajnością, a po izolacji do postaci jąder mogą być łatwo rozpoznane jako odrębna populacja od nienaruszonych PMN w cytometrze przepływowym na wykresie kropkowym po stymulacji. Poprzez sieciowanie integryn beta one dochodzi do translokacji NF kappa B do jądra, a ten przyrost jądrowego NF kappa B jest wykrywany jako wzrost fluorescencji.

Podobnie, stymulacja PMN poprzez sieciowanie integryn beta 2 również indukuje aktywację NF kappa B, co objawia się zwiększeniem fluorescencji. Czułość tej metody pozwala na wykrycie niewielkich zmian w poziomach czynnika jądrowego, co potwierdza fakt, że integryny beta 1, które wiążą białka macierzy pozakomórkowej, takie jak fibronektyna, indukują silniejszą aktywację NF kappa B niż integryny beta 2, które wiążą się z cząsteczkami adhezyjnymi innych komórek. Metoda ta wykazuje dużą elastyczność, ponieważ można zastosować wiele różnych fluorochromów oraz przygotować jądra różnych typów komórek; to proste i ekonomiczne podejście jest przydatne w badaniach transdukcji sygnału obejmujących zmiany poziomów białek w jądrach różnorodnych typów komórek.