Name: Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę oceny konkurencyjności plemników u Drosophila melanogaster poprzez eksperymenty podwójnego kojarzenia. Analiza markerów genetycznych w potomstwie pozwala określić ojcostwo i porównać zdolności reprodukcyjne samców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują NSF (MCB-1157876) za dofinansowanie. Dziękujemy również Alberto Civetcie, Johnowi Roote'owi i dwóm anonimowym recenzentom za ich komentarze.

Eksperymenty na małą skalę powinny być przeprowadzane, aby zapoznać się z całą procedurą.
1. Kolekcjonowanie dziewiczych samic i naiwnych mężczyzn
Najprostsza wersja opisanego eksperymentu składa się z czterech typów początkowych krzyżówek, które obejmują następującą kombinację dorosłych: a) w1118 osobników w celu zebrania dziewiczych samic; b) osobniki z Oregonu-R w celu zebrania naiwnych samców referencyjnych; c) homozygotyczne samce i dziewicze samice P{sw} z linii kontrolnej, która przenosi organizację typu dzikiego Sdic w celu zebrania naiwnych eksperymentalnych samców (Typ I); oraz d) homozygotyczne samce P{sw} i dziewicze samice przenoszące delecję Sdic-sw w celu zebrania naiwnych eksperymentalnych samców, które są nosicielami niedoboru Sdic-sw (typ II).
<ol>
	<li>Ustaw wiele fiolek zawierających 8-10 samic i 5 samców każda. Pozwól samicom złożyć jaja i przenieś dorosłe osobniki do nowych fiolek co 3-5 dni. W razie potrzeby używaj butelek zamiast fiolek i zawsze używaj świeżej żywności. Wymagana liczba fiolek będzie zależała od liczby eksperymentalnych typów męskich badanych oraz liczby osób szacowanej jako niezbędna do wykrycia różnic (Tabela 1). Więcej niż 10 samic w jednej fiolce może powodować nadmierne stłoczenie podczas wzrostu larw, co może powodować różnice w płodności potomstwa. Przechowywać fiolki w temperaturze 25 °C w komorze o kontrolowanej temperaturze.</li>
	<li>Zacznij zbierać dziewicze samice i naiwnych samców w dniach 11 i 12 po ustawieniu początkowych krzyżówek. Okres oczekiwania różni się w zależności od temperatury; Niższe temperatury powodują wydłużenie czasu rozwoju, co opóźnia zbieranie osobników. Kolejnym czynnikiem wpływającym na czas do eklozji jest rodzaj medium. Pożywny pokarm, jakim jest pożywka z mąki kukurydzianej i drożdży 29, zapewnia prawidłowy rozwój dorosłego układu rozrodczego, co ułatwia krycie. Zbieraj niekryte muchy co 4-6 godzin. Podczas pobierania znieczulij muchy, wprowadzając CO2 do fiolki, postukaj muchy w dół i seksuj je pod mikroskopem stereoskopowym (ryc. 2). Umieść pożądane muchy w różnych fiolkach według płci i fenotypu i odpowiednio oznacz fiolki.</li>
</ol>
Uwaga 1. Rutyna zbierania rozpoczyna się rano od wyrzucenia dorosłych osobników, które pojawiły się poprzedniej nocy. Zbieraj dziewicze samice i naiwnych samców raz lub dwa razy w ciągu dnia. Zazwyczaj samce D. melanogaster osiągają dojrzałość płciową 8 godzin po eklozji w temperaturze 25 °C 30. Jeśli muchy są utrzymywane w cyklach światła/ciemności o godzinie 12:12, spodziewane są dwa szczyty eklozji: w ciągu pierwszych 1-2 godzin po włączeniu światła i w ciągu 2 godzin przed wyłączeniem światła. Eklozja następuje w ciągu 24 godzin po ciemnieniu poczwarki.
Uwaga 2. Nie więcej niż 10 samic należy umieścić w tej samej fiolce, aby zapobiec nadmiernemu zatłoczeniu. Ogranicza to również utratę samic w przypadku, gdy muszą zostać odrzucone, ponieważ co najmniej jedna z nich nie jest dziewicza.
Uwaga 3. W celu zebrania odpowiedniej liczby dziewiczych samic i niedoświadczonych samców w krótkim czasie można zastosować następujące środki. Ustaw 15-20 fiolek w1118 do eksperymentów z udziałem dwóch typów eksperymentalnych samców (Tabela 1). Lekko posyp powierzchnię podłoża i dodaj kilka suszonych granulek aktywnych drożdży, aby ułatwić składanie jaj. Rodzice przeniesieni co najmniej 4 razy w ciągu kolejnych dni. Aby zwiększyć dostępną powierzchnię do przepoczwarzania w każdej fiolce, należy włożyć wielokrotnie złożony papier (7 x 5 cm) w ciągu4 lub 5 dnia po przeniesieniu rodziców do innej fiolki (ryc. 3). Jeśli liczba dorosłych osobników wyłonionych z początkowych krzyżówek jest niewystarczająca, odczekaj jeszcze kilka dni i zbierz osobniki z fiolek ustawionych w różnych terminach. Zaplanuj przeprowadzanie eksperymentów przez kilka kolejnych dni, aby wyrównać obciążenie pracą.
2. Eksperymenty z podwójnym kryciem
Rysunek 4 pokazuje główne etapy eksperymentów z podwójnym kryciem przeprowadzonych w 14.
<ol>
	<li>Rankiem pierwszego dnia ustaw pierwsze krycie. Samce Oregon-R są pierwszymi, które łączą się w pary w teście ofensywnym.
	<ol>
		<li>Za pomocą aspiratora ustaw fiolki zawierające 10 4-5-dniowych białookich 1118 dziewiczych samic i 10 czerwonookich nieleczonych samców Oregon-R każdy. Dwie do trzech fiolek ustawia się codziennie przez 5 kolejnych dni. Liczba fiolek, które należy ustawić, może się różnić w zależności od liczby dostępnych osób. Pozwól muchom łączyć się w pary przez 2 godziny.</li>
		<li>Odrzuć samce Oregon-R i umieść każdą samicę w nowej fiolce za pomocą aspiratora (ryc. 5). Identyfikację płci można osiągnąć poprzez oględziny kilku różnic morfologicznych (ryc. 2). Każdą fiolkę należy odpowiednio oznaczyć i pozostawić samicę w fiolce na 2 dni (dalej "v1").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 3 ustaw drugie krycie. Selekcja samców i krzyżówka powinny być przeprowadzane losowo, aby zminimalizować potencjalne uprzedzenia w stosunku do któregokolwiek z eksperymentalnych typów samców.
	<ol>
		<li>Dwie godziny przed wyłączeniem światła ponownie przenieś samicę do nowej fiolki z aspiratorem. Oznaczyć nową fiolkę w odpowiedni sposób (zwaną dalej "v2").</li>
		<li>Wprowadź trzy 5-6-dniowe eksperymentalne samce o tym samym genotypie do v2.</li>
		<li>Powtórzyć czynności 2.2.1 i 2.2.2 dla każdej samicy.</li>
		<li>W dniu 4, dwie godziny tuż przed włączeniem światła (tj. nie więcej niż 12 godzin po ppkt 2.2.1), odrzuć samce za pomocą aspiratora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 6 należy ponownie przenieść każdą samicę do innej nowej fiolki. Oznaczyć nowe fiolki odpowiednio (dalej "v3").</li>
	<li>W dniu 10 odrzuć w1118 samicach.</li>
	<li>Zbadaj potomstwo w wersji 2 i 3. Pierwsze badanie wykonuje się po 13-15 dniach od wprowadzenia samicy do v2 (lub v3), np. w 17 dniu po pierwszym rozpoczęciu składania jaj przez samicę w v2. Drugi przegląd wykonywany jest dokładnie po 17 dniach. Ten przedział czasowy stanowi bezpieczną górną granicę czasową, która gwarantuje, że w tej samej fiolce nie ma drugiej generacji. Dwie kontrole zapobiegają nadmiernemu zatłoczeniu, ułatwiając jednocześnie liczenie potomstwa.
	<ol>
		<li>W dniu 17 należy sprawdzić v1 i upewnić się, że obecne jest w nim potomstwo o czerwonych oczach; jeśli nie, należy odpowiednio oznaczyć fiolkę. Obecność potomstwa białookiego wskazuje, że samica nie była dziewicą w czasie pierwszego krycia, podczas gdy brak potomstwa wskazuje, że krycie z samcami referencyjnymi lub doświadczalnymi nie miało miejsca.</li>
		<li>W dniu 17 przeprowadź pierwszą inspekcję wersji 2. Znieczulenie pojawiło się potomstwo w v2 z CO2 i posortuj je według koloru oczu i płci. Rekordowa liczba potomstwa spłodzonego przez pierwszego i drugiego samca. Rycina 6 przedstawia oczekiwane fenotypy u potomstwa każdego schematu krycia. W tym konkretnym eksperymencie 14 tylko potomstwo płci żeńskiej może być jednoznacznie przypisane jako spłodzone przez odniesienie lub doświadczalne samce, a zatem tylko informacje od córek mogą być wykorzystane do obliczenia P2. Jeśli za pomocą innych markerów można jednoznacznie przypisać ojcostwo męskiego potomstwa, w dalszych obliczeniach można wykorzystać liczbę potomstwa obu płci. Odrzuć potomstwo, ale zachowaj v2 do drugiej kontroli.</li>
		<li>W dniu 20 postępować jak w ppkt 2.5.2 z nowo pojawiającym się potomstwem w wersji 2, a następnie wyrzucić fiolkę.</li>
		<li>W dniu 20 po raz pierwszy sprawdź pojawiło się potomstwo w wersji 3 i wykonaj krok 2.5.2.</li>
		<li>W dniu 23 postępuj tak jak w 2.5.3 z nowo powstałym potomstwem w wersji 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga 1: Ze względu na potencjalny efekt zawyżania wyników P, jaki może mieć wielokrotne kojarzenie (2.2.2 i 2.2.3), krycie może być ograniczone do określonego przedziału czasowego. Ramy czasowe będą zależeć od częstotliwości rekultywacji związanej z genotypem użytej samicy i samców. Prawdopodobieństwo wielokrotnego krycia jest szczególnie zmniejszone w nocy 11.
Uwaga 2: Nie dodawaj żywych granulek drożdży, ponieważ może to spowodować problemy z powodu potencjalnego przerostu drożdży, gdy liczba dorosłych much jest niska.
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Rejestrowane liczenie potomstwa powinno być odpowiednio zorganizowane, aby ułatwić kontrolę wzrokową i efektywną analizę, za pomocą odpowiedniego pakietu statystycznego (np. JMP z SAS Institute) lub bezpłatnych narzędzi internetowych (np. <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a>).</li>
	<li>Zdolność konkurencyjna plemników. Dodaj liczby z wersji 2 i 3. Samice much, które nie dały żadnego potomstwa lub dały bardzo ograniczone potomstwo (np. <10), padły w trakcie zabiegu lub zostały skutecznie zapłodnione tylko przez jednego z dwóch samców, uznaje się za nieinformacyjne i wyłącza się je z wszelkich dalszych analiz statystycznych (2.5.1 i tabela 2). Oblicz wynik P2 dla każdej kobiety posiadającej informacje.</li>
	<li>Sprawdź, czy istnieją statystycznie istotne różnice w wartościach P2 między porównywanymi mężczyznami doświadczalnymi. Można to zrobić za pomocą testów parametrycznych (np. HSD Tukeya) lub nieparametrycznych (np. Steel-Dwass) w zależności od kilku czynników, w tym skośności rozkładu wartościP2 i zależności między wariancją a średnią. Transformacja kątowa jest powszechnie stosowana do proporcji takich jak P2 przed zastosowaniem testów parametrycznych 31.</li>
	<li>Różnice w szybkości krycia (opcjonalnie). Dla każdego eksperymentalnego typu samca oblicz liczbę podwójnie pokrytych samic i tych, które kojarzyły się tylko z pierwszym samcem (samiec referencyjny w teście ofensywnym i samiec doświadczalny w teście obronnym). Korzystając z dwustronnego dokładnego testu Fishera (dostępnego pod adresem <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a>), określ, czy istnieją statystycznie istotne różnice między tymi dwoma typami eksperymentalnych samców.</li>
	<li>Stosunek płci (opcjonalnie). Dla każdego doświadczalnego samca należy użyć testu chi-kwadrat, aby określić, czy stosunek płci u potomstwa każdej samicy odbiega od oczekiwanego stosunku 1:1.</li>
</ol>

<ol><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarwin%2C+C+%22The+descent+of+man+and+selection+in+relation+to+sex%22">The descent of man and selection in relation to sex</a>. , John Murray. (1871).</li>
<li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).</li>
<li>Birkhead, T. R., Møller, A. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirkhead%2C+TR+%22Sperm+competition+and+sexual+selection%22">Sperm competition and sexual selection</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>Jones, B., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+sperm+competition+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Bayesian sperm competition estimates.</a> Genetics. 163, 1193-1199 (2003).</li>
<li>Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mating+and+sperm+displacement+in+natural+populations+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster.</a> Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).</li>
<li>Jonsson, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transfer%2C+storage%2C+displacement%2C+and+utilization+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 47, 1719-1736 (1962).</li>
<li>Boorman, E., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+%28ejaculate%29+competition+in+Drosophila+melanogaster%2C+and+the+reproductive+value+of+females+to+males+in+relation+to+female+age+and+mating+status%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status.</a> Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).</li>
<li>Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGromko%2C+MH+%22Sperm+Competition+and+the+Evolution+of+Animal+Mating+Systems%22">Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems</a>. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).</li>
<li>Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+sperm+displacement+and+its+association+with+accessory+gland+protein+loci+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 139, 189-201 (1995).</li>
<li>Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+x+male+interactions+in+Drosophila+sperm+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Female x male interactions in Drosophila sperm competition.</a> Science. 283, 217-220 (1999).</li>
<li>Civetta, A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+effects+on+male+and+female+components+of+sperm+precedence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila.</a> Genet. Res. 75, 143-151 (2000).</li>
<li>Greenspan, L., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+variation+in+X+chromosome+male+reproductive+genes+and+sperm+competitive+ability+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster.</a> Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280(2011).</li>
<li>Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+male+accessory+gland+protein+Acp36DE+in+sperm+competition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).</li>
<li>Yeh, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evidence+that+a+recently+evolved+Drosophila+sperm-specific+gene+boosts+sperm+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).</li>
<li>Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+multiple+kinds+of+female+sperm-storage+organs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila.</a> Evolution. 53, 1804-1822 (1999).</li>
<li>Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ejaculate-female+coevolution+in+Drosophila+mojavensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis.</a> Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).</li>
<li>Nonidez, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+phenomenon+of+reproduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The internal phenomenon of reproduction in Drosophila.</a> Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).</li>
<li>Miller, G. T., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-female+coevolution+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sperm-female coevolution in Drosophila.</a> Science. 298, 1230-1233 (2002).</li>
<li>Manier, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+mechanisms+of+competitive+fertilization+success+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster.</a> Science. 328, 354-357 (2010).</li>
<li>Simmons, L., Siva-Jothy, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimmons%2C+L+%22Sperm+competition+and+sexual+selection%22">Sperm competition and sexual selection</a>. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826(1998).</li>
<li>Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+remating%2C+sperm+competition+and+sexual+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila.</a> Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).</li>
<li>Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+investigation+of+the+mating+system+of+Drosophila+hydei%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei.</a> Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).</li>
<li>Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+history+of+Drosophila+buzzatii.+XVII.+Double+mating+and+sperm+predominance%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Sel.+Evol%22%5BJournal%5D)">The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance.</a> Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).</li>
<li>Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+sperm+competition+and+sperm+storage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila.</a> Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).</li>
<li>Turner, M. E., Anderson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+predominance+among+Drosophila+pseudoobscura+karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes.</a> Evolution. 38, 983-995 (1984).</li>
<li>Harshman, L. G., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+sperm+competition+from+broods+of+field-caught+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila.</a> Evolution. , 1334-1341 (1998).</li>
<li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).</li>
<li>Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+competition+between+Drosophila+males+involves+both+displacement+and+incapacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation.</a> Nature. 400, 449-452 (1999).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).</li>
<li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).</li>
<li>Clark, A. G., Begun, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+genotypes+affect+sperm+displacement+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila.</a> Genetics. 149, 1487-1493 (1998).</li>
<li>Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontransitivity+of+sperm+precedence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila.</a> Evolution. 54, 1030-1035 (2000).</li>
<li>Wigby, S., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sperm competition.</a> Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).</li>
<li>Pizzari, T., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPizzari%2C+T+%22Sperm+biology%3A+an+evolutionary+perspective%22">Sperm biology: an evolutionary perspective</a>. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674(2008).</li>
<li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminar+influences%3A+Drosophila+Acps+and+the+molecular+interplay+between+males+and+females+during+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction.</a> Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).</li>
<li>Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sperm+competition+and+sperm+competition+avoidance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisaliśmy projekt eksperymentalny w celu oceny różnic we względnym udziale genetycznie odrębnego D. samce melanogastrów do potomstwa w kontrolowanych doświadczeniach podwójnego krycia 7,8. Zostało to zrobione w kontekście czynnika genetycznego, który hipotetycznie wpływa na zdolność konkurencyjną plemników i zostało to zilustrowane w teście ofensywnym, chociaż podobna procedura ma zastosowanie do testu obronnego (ryc. 1). Ten eksperymentalny projekt może być modyfikowany w celu zbad...

Odkąd Geoff Parker zauważył powszechność konkurencji plemników u owadów i jej ewolucyjne implikacje 2, nastąpił gwałtowny wzrost badań nad Drosophila i innymi gatunkami, które próbowały rzucić nieco światła na to zjawisko na wielu różnych poziomach. Niektóre przykłady obszarów zainteresowania to badanie jego zmienności w naturalnych populacjach 9,10, jego architektura genetyczna i znaczenie podstawowych czynników genetycznych 11-14 oraz jego rola w napędzaniu koewolucji między płciami 15,16. W D. Samice melanogaster, ograniczona pojemność wyspecjalizowanych narządów do przechowywania nasienia, pary spermateki i pojemnika nasiennego 6,17, przyczynia się do konkurencji plemników pochodzących od różnych samców. Około 1,500 plemników jest przenoszonych podczas krycia do samicy, ale tylko ~500 może być zmieszczonych we wspomnianych narządach 18,19. W laboratorium kontrolowane eksperymenty z podwójnym kryciem z udziałem referencyjnego samca i jednego lub więcej samców będących przedmiotem zainteresowania były szeroko stosowane do oceny zdolności konkurencyjnej plemników 7,8.	
	Zdolność konkurencyjna plemników jest szacowana jako proporcja potomstwa spłodzonego przez eksperymentalnego samca w eksperymentach podwójnego krycia w stosunku do całego potomstwa, tj. zarówno od eksperymentalnych, jak i referencyjnych samców. Zdolność konkurencyjna plemników składa się z dwóch elementów, z których każdy jest oceniany w osobnym teście. W teście ofensywnym ocenia się zdolność eksperymentalnego plemnika męskiego do wyparcia plemnika z pierwszego samca, tj. samca referencyjnego. I odwrotnie, w teście obronnym ocenia się zdolność eksperymentalnego plemnika męskiego do opierania się przemieszczeniu lub zmniejszania powodzenia zapłodnienia referencyjnego plemnika męskiego. W zależności od rodzaju testu, obrony lub ataku, zdolność konkurencyjną plemników szacuje się na podstawie wyników odpowiednio P1 lub P2. P1 i P2 mogą przyjmować tylko wartości z zakresu od 0 do 1. Wartości pośrednie są zwykle interpretowane jako pośrednie dowody na mieszanie się plemników, co sugeruje fizjologiczny scenariusz obejmujący bezpośrednią konkurencję plemników. Kierując się tym samym rozumowaniem, wartości ekstremalne mogą być interpretowane jako dowód na silną różnicową zdolność konkurencyjną plemników. Wczesne badania wykazały, że P2 u D. melanogaster wzrasta o ponad 0,8 wraz z wydłużeniem czasu między dwoma kryciami 7. Ten sam eksperymentalny projekt został zastosowany u innych gatunków Drosophila, przy czym P2 jest powszechnie stosowaną statystyką w badaniach oceniających zdolność konkurencyjną plemników 20. W przypadku większości gatunków wartości P2 badanych szczepów są wyższe niż 0,6 21. Niemniej jednak kilka innych mechanizmów niezwiązanych z bezpośrednią konkurencją między plemnikami różnych samców może dawać identyczne wyniki (patrz Dyskusja).	
	Odróżnienie potomstwa spłodzonego przez pierwszego lub drugiego samca jest możliwe dzięki użyciu łatwych do zidentyfikowania markerów. We wczesnych badaniach jeden z samców został napromieniowany subletalnymi dawkami, na przykład promieni rentgenowskich, tak że praktycznie wszystkie komórki jajowe zapłodnione napromieniowanymi plemnikami nie wykluły się 7. W związku z tym najczęściej stosowanymi markerami są mutacje zmieniające pigmentację oczu lub kształt skrzydeł. Przykładami tych pierwszych są mutacje bw (brązowy) 9, cn (cynobr)22 i w (biały) 23, podczas gdy mutacja Cy (kędzierzawy) 24 odpowiada drugiemu typowi fenotypów; Niektóre z tych mutacji zostały połączone u tej samej osoby, np. CN BW. W mniejszym stopniu wykorzystano również allozymy 25 i mikrosatelity 26,27 o znanych wzorcach dziedziczenia.	
	Eksperymentalny projekt testowania różnic w zdolności konkurencyjnej plemników opisany tutaj jest zasadniczo zgodny z projektem Clarka i wsp. 9. Wyniki uzyskane z tych doświadczeń dostarczają informacji wyłącznie o zróżnicowanym ojcostwie badanych eksperymentalnych typów męskich. Testy, które uwzględniają również różnice w dopasowaniu po zapłodnieniu 14,28 i technikach wizualizacji plemników 24, umożliwiają interpretację różnic w wynikach P1 (lub P2) jako różnic w kompetencjach plemników.	
	Rysunek 1 przedstawia uzasadnienie zarówno testów ofensywnych, jak i defensywnych. Aby zilustrować logistykę tego procesu, szczegółowo wyjaśniony zostanie eksperyment ofensywny przeprowadzony na D. melanogaster 14. Ten konkretny test ofensywny został wykorzystany do zbadania mierzalnego wpływu wielogenowego łańcucha pośredniego dyneiny specyficznego dla plemników (Sdic) na zdolność konkurencyjną plemników. Wszyscy członkowie tej wielogenowej rodziny żyją w tandemie na chromosomie X. Samce nokautujące zostały wygenerowane przez usunięcie klastra Sdic. Ponieważ usunięty segment zawierał również niezbędny gen krótkiego skrzydła (sw), a celem badania była ocena znaczenia Sdic, samce z delecją Sdic-sw zostały uratowane przez transgeniczną kopię sw (symbolizowaną jako P{sw}, która również zawierała mini-biały gen reporterowy) na chromosomie 2. Kolor oczu był używany jako widoczny marker do identyfikacji ojcostwa. Wszystkie muchy były na białym zmutowanym tle, z wyjątkiem tych ze szczepu Oregon-R, które były używane jako referencyjne samce.

<table><tbody><tr><td>Bursztynowa rurka lateksowa</td><td>VWR</td><td>62996-473</td><td>1/4 cala ID, 1/6 cala Ścianka</td></tr><tr><td>1 ml stopniowane końcówki filtrujące XL</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td>Można użyć dowolnej końcówki do pipety o pojemności 1 ml, ale półprzezroczyste i długie końcówki są lepsze jako odbiornik muchy. Jeśli używane są końcówki filtra, wyjmij i wyrzuć filtr za pomocą igły po przycięciu końcówki</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P-7793</td><td></td></tr><tr><td>Tkanina</td><td></td><td></td> siatkowa <td>Cienka i gładka</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Zbiornik</td><td>Airgas</td><td>CD-50</td><td>Użyj FlyNap (Carolina Biological Supply Company) jako alternatywy, jeśli CO2 nie jest dostępny</td></tr><tr><td>Zawór stopowy FlyStuff, kompletny system</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-121C</td><td>Nie jest to konieczne, jeśli używany jest FlyNap</td></tr><tr><td>Fiolki plastikowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>Dostarczane są tace z tektury, które można ponownie wykorzystać do przechowywania fiolek</td></tr><tr><td>Waciki</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-212</td><td></td></tr><tr><td>Aktywne suche drożdże</td><td>Red Star</td><td></td><td>Znalezione w sklepie spożywczym</td></tr><tr><td>Markery</td><td></td><td></td> Sharpie <td>Do oznaczania różnych genotypów można używać różnych kolorów</td></tr></tbody></table>

ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u drosophila

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Konkurencja między samcami tego samego gatunku o zapłodnienie komórek jajowych jest jednym z mechanizmów doboru płciowego, tj. selekcji, która działa na maksymalizacji liczby udanych kryć, a nie na maksymalizacji przetrwania i żywotności 1. Konkurencja plemników reprezentuje konkurencję między samcami po kopulacji z tą samą samicą 2, w której ich plemniki są przypadkowe w czasie i przestrzeni. Zjawisko to zostało opisane u wielu gatunków roślin i zwierząt 3. Na przykład dziko żyjące samice D. melanogaster zwykle zawierają plemniki od 2-3 samców 4. Plemniki są przechowywane w wyspecjalizowanych narządach o ograniczonej zdolności magazynowania, co może prowadzić do bezpośredniej konkurencji plemników pochodzących od różnych samców 2,5.
Porównanie zdolności konkurencyjnej plemników różnych interesujących mężczyzn (eksperymentalnych typów męskich) zostało przeprowadzone poprzez kontrolowane eksperymenty z podwójnym kryciem w laboratorium 6,7. Krótko mówiąc, pojedyncza samica jest wystawiana kolejno na dwa różne samce, jednego eksperymentalnego samca i jednego samca referencyjnego krzyżowego. Ten sam schemat krycia jest następnie stosowany przy użyciu innych eksperymentalnych typów samców, ułatwiając w ten sposób pośrednie porównanie zdolności konkurencyjnej ich plemników poprzez wspólne odniesienie. Odsetek osobników spłodzonych przez samców doświadczalnych i referencyjnych jest identyfikowany za pomocą markerów, co pozwala oszacować zdolność konkurencyjną plemników za pomocą prostych wyrażeń matematycznych 7,8. Ponadto zdolność konkurencyjną plemników można oszacować w dwóch różnych scenariuszach w zależności od tego, czy eksperymentalny samiec jest drugim, czy pierwszym do krycia (odpowiednio test ataku i obrony) 9, co zakłada się, że odzwierciedla różne atrybuty kompetencji.
Tutaj opisujemy podejście, które pomaga badać rolę różnych czynników genetycznych, które przypuszczalnie leżą u podstaw zjawiska konkurencyjnej zdolności plemników u D. melanogaster.

Tabela 2 podsumowuje istotne cechy dwóch eksperymentów ofensywnych (testy 1 i 2), w których porównano eksperymentalne samce D. melanogaster z funkcjonalnym klastrem Sdic oraz bez niego (odpowiednio Typ I i II) 14. Po uwzględnieniu różnych częstotliwości występowania w niektórych powtórzeniach stwierdzono, że 58-83% samic było informatywnymi osobnikami, a zatem liczbę ojcostw ich potomstwa można było wykorzystać do obliczenia P2. Wyniki testów nieparametrycznych by...

Różnicowa zdolność konkurencyjna plemników wśród samców Drosophila o różnych genotypach może być stwierdzona poprzez eksperymenty z podwójnym kryciem. Każdy z tych eksperymentów obejmuje jednego z interesujących samców i samca referencyjnego. Łatwe do zidentyfikowania markery w potomstwie pozwalają na wnioskowanie o frakcji osobników spłodzonych przez każdego samca.

Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie różnic w zdolności do konkurencji plemników u samców Drosophila melanogaster o różnych genotypach. Osiąga się to poprzez śledzenie widocznych markerów genetycznych, które pozwalają zidentyfikować ojcostwo potomstwa samicy kopulującej z dwoma różnymi samcami. W tym badaniu samice najpierw kopulują z samcem referencyjnym, a następnie z samcem eksperymentalnym. Odsetek potomstwa zapłodnionego przez samca eksperymentalnego określa się na podstawie analizy koloru oczu potomstwa.Wyniki pozwalają na pośrednie porównanie zdolności konkurencyjnej eksperymentalnych plemników samca poprzez odniesienie ich wydajności do plemników samca referencyjnego. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki i ewolucji w biologii, takie jak ocena wpływu czynnika genetycznego na zdolność konkurencyjną SPR; prezentowana procedura zostanie zaprezentowana studentom studiów magisterskich i licencjackich z naszego laboratorium. Poniższy protokół ilustruje analizę czynnika genetycznego o nazwie sic, który prawdopodobnie koduje białko zaangażowane w ruchliwość plemników.Zacznij od przygotowania od 15 do 20 probówek. Posyp lekko podł

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Ten protokół opisuje prosty, ekonomiczny sposób indywidualnej identyfikacji Drosophila lub innych owadów. Dane demonstracyjne badające sukces godowy trzech gatunków Drosophila pokazują, że metoda ta jest porównywalna lub lepsza niż zastosowanie znieczulenia CO2 .

Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila

Podczas walk muszek owocowych, obserwowane wzorce zachowań, dynamika walki oraz związane z nią uczenie się i pamięć są pod wpływem warunków eksperymentalnych. Przedstawiony tutaj protokół opisuje nowatorską procedurę, która całkowicie eliminuje obchodzenie się z muchami podczas eksperymentów. Poprawia to dynamikę walki i pozwala na tworzenie silnych efektów "przegranych".

Nowe podejście, które eliminuje postępowanie w celu badania agresji i efektu "przegranego" u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia.  Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.

Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster

Ten artykuł opisuje test behawioralny, który wykorzystuje popęd godowy samców u Drosophila melanogaster do badania motywacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą wykorzystać zaawansowane techniki neurogenetyczne much, aby odkryć mechanizmy genetyczne, molekularne i komórkowe, które leżą u podstaw tej motywacji.

Pomiar i zmiana popędu godowego u samca Drosophila melanogaster

Pokazujemy test do analizy środowiskowych i genetycznych wskazówek, które wpływają na zachowania godowe muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Metoda badania wpływu sygnałów środowiskowych na zachowania godowe u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test uczenia się i zapamiętywania u Drosophila zwany warunkowaniem zalotów. Ten klasyczny test opiera się na zmniejszeniu zachowań związanych z zalotami samców po odrzuceniu seksualnym przez niepodatną samicę z premfetem. Ta naturalna forma plastyczności behawioralnej może być wykorzystana do testowania uczenia się, pamięci krótkotrwałej i pamięci długotrwałej.

Drosophila Warunkowanie zalotów jako miara uczenia się i pamięci

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

Poznaj metodę oceny konkurencyjności plemników u Drosophila melanogaster poprzez eksperymenty podwójnego kojarzenia. Analiza markerów genetycznych w potomstwie pozwala określić ojcostwo i porównać zdolności reprodukcyjne samców.

Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów