Name: Metody oceny zachowania Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metody oceny zachowania Drosophila melanogaster, w tym testy pełzania, pierścienia i godów. Te wysokoprzepustowe testy pozwalają badać wpływ czynników genetycznych i środowiskowych na funkcje motoryczne oraz koordynację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Astha Maltare za zgromadzenie danych dotyczących pełzania larw. Dziękujemy dr. Nicholasowi Lansonowi Jr. za uwagi do manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Robert Packard Center for ALS at Johns Hopkins (dla UBP) oraz Amyotrophic Lateral Sclerosis Association (UBP); a także przez grant R01MH083689 z National Institutes of Mental Health (CDN).

1. Test pełzania larw
1. Zbieranie larw
<ol>
	<li>Przygotuj butelkę o pojemności 8 uncji z muchami (10-15 samców + 10-15 samic).</li>
	<li>Pozostaw muchy do składania jaj przez 24 godziny, a następnie usuń dorosłe osobniki z butelki. (Przenieś dorosłe muchy do nowej butelki i powtórz czynność w razie potrzeby).</li>
	<li>Inkubuj butelkę przez 3-4 dni lub do momentu pojawienia się larw w trzecim stadium rozwojowym.</li>
	<li>Do butelki z larwami dodaj 50 - 100 ml 20% sacharozy i odstaw na 20 minut. Larwy wypłyną na powierzchnię.</li>
	<li>Zbierz larwy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml z odciętym końcem i umieść je w koszyku z siatki.</li>
	<li>Przemyj larwy w koszyku dwukrotnie dejonizowaną wodą H2O. Larwy są teraz gotowe do eksperymentów.</li>
</ol>
2. W celu podania leku larwom
<ol>
	<li>Za pomocą pędzla przenieś odpowiednią liczbę larw do zlewki o pojemności 5 ml zawierającej roztwór 5% sacharozy z dodatkiem leku.</li>
	<li>Pozostaw larwy do żerowania przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Przelej larwy poddane działaniu leku do koszyka z siatki i przepłucz. Są one teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
3. Test lokomocyjny (pomiar całkowitego przebytego dystansu lub skurczów ścian ciała)
<ol>
	<li>Za pomocą pędzla przenieś poszczególne larwy do:
	<ol>
		<li>15 cm szalki Petriego zawierającej 2% agarozę (wcześniej wlanej i zestalonej) umieszczonej na papierze milimetrowym z siatką 0,2 cm2.
		<ol>
			<li>Policz liczbę przekroczonych linii siatki w ciągu 1 minuty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>dołka szklanej korytka sekcyjnego zawierającego rozcieńczony roztwór pasty drożdżowej.
		<ol>
			<li>Policz skurcze perystaltyczne (pełny ruch z przedniej do tylnej części ciała = 1 skurcz) w ciągu jednej minuty, obserwując larwę pod stereomikroskopem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzaj procedurę, aż zostanie policzona pożądana liczba larw.</li>
</ol>
2. Protokół szybkiego iteracyjnego negatywnego geotaksji (RING)
Analiza ta została pierwotnie opisana przez Gargano et al5.
<ol>
	<li>Zebrać nowo wylęgłe dorosłe męskie muchy pod lekką anestezją CO2 i umieścić je w standardowej fiolce zawierającej pożywkę (lub pożywkę + lek).</li>
	<li>Utrzymywać muchy w temperaturze pokojowej (na blacie, ~22 °C) przez 2-3 dni, aby umożliwić regenerację po CO2 (oraz osiągnięcie stanu stacjonarnego stężenia leku, jeśli dotyczy).</li>
	<li>Przenieść około 25 much bez podawania anestezji do przygotowanych fiolek polistyrenowych.</li>
	<li>Zamocować fiolki z muchami w aparaturze RING (Rysunek 1).</li>
	<li>Pozostawić muchy w spokoju na 15-20 minut, aby zaadaptowały się do środowiska.</li>
	<li>W tym czasie umieścić aparat cyfrowy w odległości ~1 m przed aparaturą (na platformie, jeśli jest to konieczne, aby wyrównać środek obiektywu z połową wysokości fiolek), ustawić ostrość i zoom aparatu na aparaturę oraz ustawić czasomierz na 3,0 sekundy.</li>
	<li>Ostrożnie chwycić aparaturę RING lewą ręką, tak aby nie płoszyć much, a w prawej ręce trzymać czasomierz.</li>
	<li>Trzykrotnie energicznie uderzyć aparaturą o powierzchnię blatu, upewniając się, że uderzenie jest wystarczająco silne, aby wszystkie muchy spadły na dno fiolek.</li>
	<li>Jednocześnie z zakończeniem trzeciego uderzenia uruchomić 3-sekundowe odliczanie czasomierza.</li>
	<li>Po trzech sekundach wykonać zdjęcie.</li>
	<li>Zresetować czasomierz na 1 minutę i uruchomić. W tym czasie zresetować aparat, ustawić ostrość na aparaturze oraz ustawić kolejny kanał czasomierza na trzy sekundy.</li>
	<li>Po 1 minucie powtórzyć kroki 1.7-1.10.</li>
	<li>Po wykonaniu łącznie 5-6 prób przesłać obrazy na komputer i za pomocą preferowanej przeglądarki obrazów otworzyć je oraz ocenić średnią wysokość wspinaczki dla każdej fiolki.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę statystyczną dla różnych grup, porównując średnią wysokość wspinaczki.</li>
</ol>
3. Test zalotów i kopulacji
<ol>
	<li>Pierwszą czynnością rano jest przygotowanie butelek z rozwiniętymi muchami, które będą wykorzystane w doświadczeniu.</li>
	<li>W ciągu dnia (co 3-4 godziny) należy zbierać nowo wyklute, naiwne seksualnie samce i samice:
	<ol>
		<li>Samce należy umieszczać pojedynczo w probówkach z podłożem.</li>
		<li>Samice należy umieszczać po 5-6 osobników w jednej probówce.</li>
		<li>Zebrane muchy należy izolować w temperaturze 25 °C przy cyklu światła i ciemności 12 hr przez 5 dni.</li>
		<li>Przenieść jedną samicę do komory koła kopulacyjnego.</li>
		<li>Przenieść jednego samca do komory koła kopulacyjnego.</li>
		<li>Obserwować parę pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem następujących zachowań:
		<ol>
			<li>Orientacja (samiec orientuje się w stronę samicy)</li>
			<li>Stukanie (samiec stuka w samicę)</li>
			<li>Pieśń skrzydłowa (samiec rozpościera i wibruje jednym skrzydłem)</li>
			<li>Lizanie (samiec liże genitalia samicy)</li>
			<li>Podwijanie (samiec podwija odwłok pod siebie)</li>
			<li>Próba kopulacji (aktywność podwijania podczas próby wejścia na samicę)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwację prowadzić przez 10 minut lub do momentu udanej kopulacji, odnotowując czas wystąpienia każdego zachowania (latencja), całkowity czas poświęcony na zachowania godowe do momentu kopulacji (w celu obliczenia indeksu zalotów) oraz liczbę par, które z sukcesem wykonały dane zachowanie (częstotliwość). 100% par typu dzikiego zazwyczaj kopuluje w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Obliczyć indeks zalotów (CI), dzieląc czas spędzony na zalotach przez całkowity czas do momentu kopulacji. Dla par typu dzikiego wartość ta zazwyczaj mieści się w przedziale 0,6-0,8.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Test pełzania
Normalne larwy typu dzikiego poruszają się z prędkością ~3 cm/minutę i wykazują ~40-50 skurczów ściany ciała w ciągu jednej minuty. Opracowaliśmy niedawno model Drosophila dla stwardnienia zanikowego bocznego związanego z FUS/TLS, który wykazuje defekt pełzania larw, skróconą długość życia oraz upośledzenie zdolności wspinania się osobników dorosłych6. Skierowaliśmy ekspresję form dzikich i zmutowanych FUS/TLS do neuronów ruchowych (driver OK-371-gal4) i przeprowadziliśmy test pełzania larw. Jak pokazano poniżej, larwy typu dzikiego pełzają do 12 cm, podczas gdy ekspresja dzikiego typu FUS zmniejszyła zdolność pełzania larw do około 6 cm. Zwierzęta wykazujące mutację R521C w FUS/TLS, powodującą ALS, wykazują bardzo silne upośledzenie ruchu pełzania (Rysunek 1), pełzając z prędkością zaledwie około 1 cm/minutę.
Test RING oceniający negatywny geotaksyz
Młode dorosłe muchy typu dzikiego powinny osiągać średnią wysokość wspinania wynoszącą ~4-5 cm w czasie 3 sekund (czas ten można zmodyfikować z 3 sekund, aby dostosować go do różnych szczepów lub poziomów aktywności, w celu zdefiniowania średniej wysokości dla danego szczepu/obróbki). Muchom, które pozostają na dnie, przypisuje się wartość 0. Nie zaleca się używania więcej niż 25 much na probówkę, ponieważ utrudnia to określenie położenia każdej poszczególnej muchy w celu pomiaru wysokości. Nie zaobserwowano desensytyzacji przy zastosowaniu do 6 kolejnych prób w odstępach 1 minuty. Kluczowe jest, aby NIE używać ponownie polistyrenowych probówek testowych w tym teście po zebraniu pierwszych zestawów danych, ponieważ nowe muchy umieszczone w używanych probówkach nie będą wspinać się w takim stopniu, jak w świeżych probówkach.
<img alt="Schemat i zdjęcie układu do wirowania z probówkami, skalą i kamerą do sedymentacji cząstek." src="/files/ftp_upload/3795/3795fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ do analizy RING. Aparat cyfrowy umieszczono w odległości ~1 m przed aparaturą zawierającą muchy w probówkach polistyrenowych; należy ustawić ostrość i zoom aparatu na aparaturę oraz ustawić czas naświetlania na 3,0 sekundy.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący aktywność lokomocyjną; Driver Alone vs. UAS-FUS WT/R521C; wynik eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/3795/3795fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2. Reprezentatywne dane z testu pełzania larw much ektopowo eksponujących UAS-FUS WT oraz UAS-FUS R521C pod kontrolą promotora neuronów ruchowych (OK371-gal4).

<ol><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Mar%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).</li>
<li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).</li>
<li>Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutathione+Stransferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).</li>
<li>Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+FUS-related+neurodegeneration+reveals+genetic+interaction+between+FUS+and+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).</li>
<li>Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+1+is+required+for+autophagy%2C+protein+clearance%2C+and+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).</li>
<li>Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+mutant+human+parkin-induced+toxicity+demonstrates+selective+loss+of+dopaminergic+neurons+and+dependence+on+cellular+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine.</a> J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).</li>
<li>Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+glial+glutamate+transporter+Eaat1+is+regulated+by+fringe-mediated+notch+signaling+and+is+essential+for+larval+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion.</a> J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).</li>
<li>Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialyltransferase+regulates+nervous+system+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).</li>
<li>Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialyltransferase+regulates+nervous+system+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).</li>
<li>Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+functions+of+the+androgen+receptor+are+essential+to+pathogenesis+in+a+Drosophila+model+of+spinobulbar+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy.</a> Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).</li>
<li>Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrin+mutations+that+cause+spinocerebellar+ataxia+type+5+impair+axonal+transport+and+induce+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).</li>
<li>Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS-associated+proteins+FUS+and+TDP-43+function+together+to+affect+Drosophila+locomotion+and+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span.</a> J. Clin. Invest. , (2011).</li>
<li>Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+GSS+syndrome+suggests+defects+in+active+zones+are+responsible+for+pathogenesis+of+GSS+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome.</a> Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).</li>
<li>Ruan, H., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interaction-mediated+lifespan+extension+of+Drosophila+Cu%2FZn+superoxide+dismutase+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).</li>
<li>Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+video+tracking+of+locomotion+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li>
<li>Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serotonin+5-HT7+Dro+receptor+is+expressed+in+the+brain+of+Drosophila%2C+and+is+essential+for+normal+courtship+and+mating%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating.</a> PLoS One. 6 (6), e20800(2011).</li>
<li>Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+5-HT%282%29+and+5-HT%281A%29-like+receptors+differentially+modulate+aggressive+behaviors+in+Drosophila+melanoga-+ster%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster.</a> Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).</li>
<li>Bastock, M., Manning, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Courtship+of+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">The Courtship of Drosophila Melanogaster.</a> Behaviour. , 85-111 (1955).</li>
<li>Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Courtship in Drosophila.</a> Annu. Rev. Genet. 34, 205-232 (2000).</li>
<li>Villella, A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenetics+of+courtship+and+mating+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila.</a> Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Drosophila zachowanie jest ściśle regulowane przez czynniki genetyczne i środowiskowe. My oraz inni badacze wykorzystaliśmy wcześniej opisane tutaj testy do gromadzenia danych w celu zbadania genów związanych z zachowaniem muszek oraz chorób neurodegeneracyjnych człowieka modelowanych u Drosophila5-19. W przypadku testu pełzania krytycznym krokiem jest staranny dobór larw w 3rd stadium rozwojowym. Jeśli stosowany jest lek, osiągnięcie maksymalnego efektu przy dobrej rozpuszczalnośc...

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 6 oz</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel malarski (#1)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>11859</td><td></td></tr><tr><td>Mączka kukurydziana</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9109741</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Melasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9349176</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Acros Organics</td><td>14930-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-107</td><td></td></tr></tbody></table>

metody oceny zachowania drosophila

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, muszka owocowa, jest wykorzystywana do badania mechanizmów molekularnych szerokiej gamy ludzkich schorzeń, takich jak nowotwory, choroby układu sercowo-naczyniowego oraz różne choroby neurologiczne1. Zoptymalizowaliśmy proste i niezawodne testy behawioralne służące do określania lokomocji larw, zdolności wspinania się osobników dorosłych (test RING) oraz zachowań godowych Drosophila. Testy behawioralne te znajdują szerokie zastosowanie w badaniu wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na zachowanie much. Zdolność pełzania larw może być wiarygodnie wykorzystana do określania wczesnych zmian w sprawności ruchowej larw Drosophila, a także do badania wpływu leków lub genów chorób ludzkich (u much transgenicznych) na ich lokomocję. Test pełzania larw staje się szczególnie przydatny, gdy ekspresja lub usunięcie genu powoduje letalność w stadium poczwarki lub osobnika dorosłego, ponieważ muchy te nie dożywają wieku dorosłego, w którym mogłyby zostać poddane ocenie. Ten podstawowy test może być również stosowany w połączeniu z silnym światłem lub stresem, aby zbadać dodatkowe reakcje behawioralne larw Drosophila. Zachowania godowe są szeroko wykorzystywane do badania genetycznych podstaw zachowań seksualnych, a mogą być również stosowane do badania aktywności i koordynacji, a także uczenia się i pamięci. Zachowania godowe Drosophila obejmują wymianę różnorodnych bodźców sensorycznych, w tym sygnałów wizualnych, słuchowych i chemosensorycznych między samcami a samicami, co prowadzi do złożonej serii dobrze scharakteryzowanych zachowań motorycznych kulminujących w udanej kopulacji. Tradycyjne testy wspinania się osobników dorosłych (geotaksja ujemna) są żmudne, pracochłonne i czasochłonne, wykazując znaczną zmienność między poszczególnymi próbami2-4. Szybki iteracyjny test geotaksji ujemnej (RING)5 posiada wiele zalet w porównaniu do powszechniej stosowanych protokołów, zapewniając powtarzalne, czułe i wysokoprzepustowe podejście do ilościowego określania lokomocji osobników dorosłych oraz zachowań geotaksji ujemnej. W teście RING można jednocześnie badać kilka genotypów lub terapii lekowych z wykorzystaniem dużej liczby zwierząt, a podejście wysokoprzepustowe sprawia, że jest on bardziej odpowiedni do eksperymentów przesiewowych.

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

*Drosophila melanogaster*, muszka owocówka, jest wykorzystywana do badania mechanizmów molekularnych szerokiej gamy ludzkich schorzeń, takich jak nowotwory, choroby układu sercowo-naczyniowego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metod badania zachowań sensorycznych i koordynacyjnych związanych z motoryką u muszek owocówek drosophila. Cel ten zostanie osiągnięty poprzez ocenę funkcji motorycznych larw za pomocą testu pełzania, ocenę funkcji motorycznych dorosłych osobników za pomocą testu pierścienia oraz ocenę zdolności sensorycznych i koordynacyjnych dorosłych osobników za pomocą testu zalotów. W efekcie ten zestaw testów behawioralnych pozwala wykazać, w jaki sposób czynniki genetyczne i zewnętrzne, takie jak podawanie leków, mogą wpływać na aktywność i koordynację.Intra sophala. Główną zaletą tego testu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak negative geo axis, jest wyższa przepustowość i większa czułość testu pierścieniowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak wczesne wykrywanie defektów lokomocyjnych.Analizę tę zaprezentuje dr Jamie Becknell, pracownik postdoktorski w moim laboratorium. Test pełzania larw służy do pomiaru wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na ruchliwość. Aby rozpocząć, należy przygotować krzyżówkę składającą się z 10-15 samców oraz 10-15 dziewiczych samic w standardowej butelce. Po 24 godzinach zdrowe osobniki dorosłe złożą wystarczającą liczbę jaj, aby zasiedlić butelkę, co pozwoli zachować populację o jednolitym wieku 24 godzin.Przenieś osobniki dorosłe do nowej butelki i powtórz proces. Inkubuj butelkę do momentu zaobserwowania larw w trzecim stadium w pożywce w butelce. Dodaj 50 do 100 ml 20% sacharozy i odstaw na 20 minut.Larwy wypłyną na powierzchnię; należy je zebrać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml z odciętą końcówką i umieścić w koszyczku z siatki. Larwy w koszyczku należy przemyć dwukrotnie wodą dejonizowaną. Są one teraz gotowe do przeprowadzenia eksperymentów.Aby poddać larwy działaniu leku, należy za pomocą pędzelka przenieść odpowiednią liczbę larw do zlewki o pojemności pięciu mililitrów zawierającej 5% roztwór sacharozy oraz badany lek. Pozostawić je do odżywiania się roztworem cukru z lekiem przez 15 minut, a następnie przelać je z powrotem przez koszyczek z siatką, opłukać i przystąpić do pomiaru wpływu leku na motylność. Za pomocą pędzelka przenieść pojedynczą larwę do 15 centymetrowej płytki Petri zawierającej 2% agar.Umieść nad arkuszem papieru milimetrowego. Teraz zbierz dane. Po prostu policz liczbę linii siatki, które lawa przekroczy w ciągu jednej minuty.Następnie, używając pędzelka, przenieś larwy do dołka szklanego naczynia sekcyjnego zawierającego rozcieńczony roztwór pasty drożdżowej; pod mikroskopem sekcyjnym, w ciągu jednej minuty, policz skurcze Percys. Pojedynczy skurcz jest liczony jako pełny ruch od końca tylnego do przedniego. Powtarzaj czynność, aż zostanie policzona pożądana liczba larw.Protokół pierścieniowy mierzy prędkość lokomocyjną dorosłych zwierząt. Zbierz nowo wyklute dorosłe męskie muchy pod lekką anestezją i przenieś je do standardowych probówek zawierających pokarm normalny lub z dodatkiem leku. Umieść około 25 much w każdej probówce. Przechowuj muchy w temperaturze pokojowej przez dwa do trzech dni, aby zapewnić pełne wybudzenie z narkozy oraz osiągnięcie stacjonarnego poziomu leku w organizmie.Następnie przenieś około 25 much bez znieczulenia do probówek polistyrenowych z formowanymi zatyczkami i umieść probówki w jednej lub więcej aparatach pierścieniowych. Pozostaw muchy do odpoczynku na 15 do 20 minut, ustawiając w tym czasie aparat cyfrowy do fotografowania probówek z widoku bocznego; przygotuj stoper i ustaw go na pożądany czas trwania testu. Zazwyczaj test trwa trzy sekundy.Trzymając aparat pierścieniowy w jednej ręce w sposób, który nie niepokoi much, a w drugiej ręce wyzwalacz czasowy kamery, uderz trzy razy aparatem o blat stołu, aby ogłuszyć muchy, i jednocześnie uruchom odliczanie czasomierza w kamerze. Powtarzaj badanie raz na minutę, aż zostanie wykonanych pięć lub sześć prób.Kluczowe jest, aby nie używać ponownie polistyrenowych fiolek testowych po zebraniu początkowych zestawów danych. Nowe muchy umieszczone w używanych fiolkach nie będą wspinać się w takim stopniu, jak muchy umieszczone w świeżych fiolkach. Aby zebrać dane za pomocą przeglądarki obrazów, należy ocenić średnią wysokość wspinania się poszczególnych grup.Do przeprowadzenia tego testu wymagane są przygotowane krzyżówki genetyczne w butelkach, które produkują liczne potomstwo, aby umożliwić pobranie much do analizy. W ciągu kilku godzin od subiektywnego świtu zwierząt oczyść butelki, zbierając wszystkie dorosłe osobniki w odstępach trzech do czterech godzin. Zbierz nowo wyklute, seksualnie naiwne samce i samice; samce umieść pojedynczo w fiolkach lub probówkach z pożywką, natomiast samice w grupach po pięć do sześciu osobników.Do analizy w podobnych klatkach wymagana jest równa liczba samców i samic. Po odizolowaniu zebranych much przez pięć dni należy przygotować je do umieszczenia w kole do kojarzenia i przeprowadzić badanie. Następnie, pod mikroskopem stereologicznym, należy ostrożnie przenieść jedną samicę i jednego samca do komory koła do kojarzenia.Obserwuj parę przez 10 minut lub do momentu udanego kopulowania w tym czasie. Zapisuj, kiedy po raz pierwszy zaobserwowano każde z kilku określonych zachowań. Zapisuj, kiedy samiec po raz pierwszy odwrócił się w stronę samicy.Zapisz moment, w którym samiec po raz pierwszy dotyka samicy odnóżem, moment, w którym samiec po raz pierwszy rozpościera i wibruje skrzydłem, oraz moment, w którym samiec po raz pierwszy liże narządy kopulacyjne samicy. Zapisz, kiedy samiec po raz pierwszy podwija odwłok pod siebie. Zapisz, kiedy samiec po raz pierwszy próbuje wejść na samicę. Na koniec zapisz całkowity czas trwania zachowań godowych aż do momentu kopulacji.W przypadku zwierząt typu dzikiego dzieje się to niemal zawsze w ciągu od 5 do 10 minut; dane zbierane są według trzech różnych parametrów. Po pierwsze, latencja zachowania to czas, jaki upływa do momentu jego pierwszego zaobserwowania. Po drugie, częstotliwość zachowania określa, czy zostało ono zaobserwowane, czy nie.Po trzecie, indeks zalotów to czas spędzony na zalotach podzielony przez całkowity czas do momentu kopulacji w eksperymencie z udziałem zwierząt. Obecność mutacji w genie F-U-S-T-L-S związany z boczno rdzeniowym stwardnieniem mięśniowym. Mutanty genów z insercją w centrum wykazywały połowę zdolności pełzania w porównaniu do kontroli typu dzikiego (po lewej), a mutacja missense R 5 21 C obniżyła prędkość pełzania do zaledwie około 1 cm/min.Test pierścieniowy przeprowadzony na młodych dorosłych muchach typu dzikiego wykazał średnią wysokość wspinaczki wynoszącą od trzech do pięciu centymetrów w czasie trzech sekund. W tym badaniu nie zaobserwowano desensytyzacji w ciągu pięciu następujących po sobie prób przeprowadzanych w odstępach minutowych podczas wykonywania testu pierścieniowego. Należy pamiętać o zachowaniu jak największej precyzji w zakresie pomiaru czasu.Po opanowaniu techniki, test zagęszczenia larw może zostać przeprowadzony w czasie od 30 do 40 minut w celu zaobserwowania 10 prób dla jednego genotypu, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo również posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu obserwacji i oceny zachowań godowych u muchy.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody badania zachowania Drosophila

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Agresja jest wrodzonym zachowaniem, a wcześniejsze doświadczenie w walce wpływa na strategię walki i wynik późniejszych zawodów w muchach. Ten film opisuje test używany do badania agresywnego zachowania Drosophila. Przykładowy protokół obejmuje test wykonywany w konfiguracji, która eliminuje obsługę much, a tym samym zmniejsza stres u zwierząt, który w przeciwnym razie wpłynąłby na wydajność badanych.

Drosophila Test agresji: metoda badania plastyczności behawioralnej u much

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj metody oceny zachowania Drosophila melanogaster, w tym testy pełzania, pierścienia i godów. Te wysokoprzepustowe testy pozwalają badać wpływ czynników genetycznych i środowiskowych na funkcje motoryczne oraz koordynację.

Metody oceny zachowania Drosophila

Przeglądaj więcej filmów