Metody oceny zachowania Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metod badania zachowań motorycznych, sensorycznych i koordynacyjnych drosophila. Osiąga się to poprzez pierwszą ocenę funkcji motorycznych lawy, za pomocą testu pełzania, ocenę funkcji motorycznych dorosłych, za pomocą testu pierścieniowego oraz ocenę koordynacji i zdolności sensorycznych osoby dorosłej za pomocą testu zalotów. Ostatecznie ten panel testów behawioralnych może pokazać, w jaki sposób czynniki genetyczne i zewnętrzne, takie jak leczenie farmakologiczne, mogą wpływać na aktywność i koordynację.

Intra sophala. Główną zaletą tego testu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ujemna oś geograficzna, jest to, że test pierścieniowy ma wyższą przepustowość i jest bardziej czuły. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak wczesne wykrywanie wad lokomotywy.

Zademonstruje ten test dr Jamie Becknell, adiunkt w moim laboratorium. Test pełzania larw służy do pomiaru wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na ruchliwość, aby rozpocząć krzyżówkę 10 do 15 samców i 10 do 15 dziewic w standardowej butelce. Po 24 godzinach zdrowi dorośli złożą wystarczającą ilość jaj, aby wypełnić butelkę, aby utrzymać wiek populacji dopasowany do 24 godzin.

Wyczyść dorosłe osobniki do świeżej butelki i powtórz proces. Teraz inkubuj butelkę, aż w pokarmie do butelki zostaną zaobserwowane trzecie larwy gwiazdy. Dodaj 50 do 100 mililitrów 20% sacharozy i pozostaw na 20 minut.

Larwy unoszą się na górze, zbierają larwy za pomocą 25-mililitrowej pipety serologicznej z odciętą końcówką i umieszczają w siatkowym koszu. Umyj larwy w siatkowym koszu dwukrotnie wodą dejonizowaną. Teraz można na nich eksperymentować.

Aby potraktować larwy lekiem, użyj pędzla, aby przetransportować żądaną liczbę larw do pięciomililitrowej zlewki zawierającej roztwór 5% sacharozy i interesujący lek. Pozwól im żywić się odurzonym roztworem cukru przez 15 minut, a następnie przelej je z powrotem przez siatkowy kosz, opłucz je i przystąp do pomiaru wpływu leku na ruchliwość. Użyj pędzla, aby przetransportować pojedynczą lawę na 15-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 2% aros.

Umieść na arkuszu papieru do szczepienia. Teraz zbierz dane. Po prostu policz liczbę linii siatki, które lawa przecina w ciągu jednej minuty.

Następnie użyj pędzla, aby przenieść lawę do studzienki szklanego naczynia preparacyjnego zawierającego rozcieńczony roztwór pasty drożdżowej pod mikroskopem preparacyjnym przez okres jednej minuty, policz skurcze Percysa. Pojedynczy skurcz jest liczony jako pełny ruch od tyłu do przodu. Powtarzaj, aż pożądana liczba larw zostanie policzona.

Protokół pierścieniowy mierzy prędkość lokomotywy dorosłych zwierząt: zbiera nowo pojawiające się dorosłe samce much w lekkim znieczuleniu i przenosi je do standardowego pliku zawierającego normalny lub odurzony pokarm. Umieścić około 25 much w jednej fiolce. Utrzymuj muchy w temperaturze pokojowej przez dwa do trzech dni, aby uzyskać pełne znieczulenie, powrót do zdrowia i akumulację poziomów leku w stanie stacjonarnym.

Następnie przenieś około 25 much bez znieczulenia do polistyrenowych fiolek z uformowanymi zatyczkami i złóż fiolki w jeden lub więcej aparatów pierścieniowych. Pozwól muszkom odpocząć przez 15 do 20 minut, jednocześnie ustawiając aparat cyfrowy, aby sfotografować fiolki z boku, przygotuj timer i ustaw go na żądany czas trwania testu. Zazwyczaj trzy sekundy na wykonanie testu.

Trzymaj aparat pierścieniowy w jednej ręce, nie przeszkadzając muchom, a w drugiej trzymaj ostro timer aparatu. Dotknij trzykrotnie urządzenia na ławce, aby strącić muchy i jednocześnie uruchomić odliczanie czasu w aparacie. Powtarzaj esej raz na minutę, aż zostanie przeprowadzonych pięć lub sześć prób.

Bardzo ważne jest, aby nie używać ponownie fiolek testowych z polistyrenu po zebraniu wstępnych zestawów danych. Ponieważ nowe muchy umieszczone w zużytych fiolkach nie będą wspinać się w takim samym stopniu, jak muchy umieszczone w świeżych fiolkach. Aby zebrać dane za pomocą przeglądarki obrazów, oceń średnią wysokość, wspinaj się według różnych grup.

Test ten wymaga przygotowanych krzyżówek genetycznych w butelkach, które produkują obfite potomstwo, w celu zebrania much do testu. W ciągu kilku godzin od subiektywnego odczucia zwierzęcia, świt oczyszcza butelki, aby zebrać wszystkie dorosłe osobniki w odstępach trzy- do czterogodzinnych. Zbieraj nowo pojawiające się niedojrzałe seksualnie samce i samice trzymają samce pojedynczo w fiolkach lub probówkach z jedzeniem, przechowuj samice w grupach od pięciu do sześciu.

W podobnych pomieszczeniach do testu wymagana jest równa liczba samców i samic. Po izolowaniu zebranych much przez pięć dni przygotuj się do załadowania ich do koła współpracującego i przeprowadzenia testu. Następnie ostrożnie przenieś jedną samicę i jednego samca do komory koła współpracującego pod mikroskopem preparacyjnym.

Obserwuj parę przez 10 minut lub do momentu, gdy w tym czasie pomyślnie kopulują. Rejestruj, kiedy każde z kilku zachowań jest obserwowane po raz pierwszy. Rejestruj, kiedy samiec po raz pierwszy zwraca się w stronę żeńskiego rekordu.

Kiedy samiec po raz pierwszy dotyka samicy nogą, kiedy samiec po raz pierwszy wysuwa się i wibruje skrzydłem, zapis gdy samiec po raz pierwszy liże żeńskie genitalia, zapis Kiedy samiec po raz pierwszy zwija brzuch pod sobą. Rejestruj, kiedy mężczyzna po raz pierwszy próbuje zamontować żeński adres e-mail. Na koniec zapisz całkowity czas zaangażowany w zaloty, aż do kopulacji.

W przypadku zwierząt typu dzikiego prawie zawsze trwa to od pięciu do 10 minut, zbieraj dane według trzech różnych parametrów. Po pierwsze, opóźnienie zachowania to czas, jaki upływa, zanim zostanie po raz pierwszy zaobserwowany. Po drugie, częstotliwość zachowania polega na tym, czy jest ono obserwowane, czy nie.

I po trzecie, indeks zalotów to czas spędzony na zalotach podzielony przez całkowity czas i do kopulacji w eksperymencie na zwierzętach. Mutacje w F-U-S-T-L-S wiązały się ze stwardnieniem zanikowym bocznym. Mutanty genów z centrum insercji wykazywały o połowę mniejszą zdolność pełzania niż grupa kontrolna typu dzikiego, a mutacja missense R 5 21 C zmniejszyła prędkość pełzania do zaledwie około jednego centymetra na minutę.

Testy pierścieniowe młodych dorosłych much typu dzikiego wykazały średnią wysokość, która wspinała się od trzech do pięciu centymetrów w ciągu trzech sekund. W tym teście nie zaobserwowano odczulania, ponieważ do pięciu kolejnych prób oddalonych od siebie o jedną minutę podczas próby testu pierścieniowego. Ważne jest, aby pamiętać, aby być tak precyzyjnym, jak to tylko możliwe, jeśli chodzi o czas.

Po opanowaniu, esej o stłoczeniu larw można wykonać w ciągu 30 do 40 minut, aby obserwować 10 prób dla jednego genotypu, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś również dobrze zrozumieć, jak obserwować i oceniać zachowania związane z zalotami w locie.