Metody oceny zachowania Drosophila

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metod badania zachowań sensorycznych i koordynacyjnych związanych z motoryką u muszek owocówek drosophila. Cel ten zostanie osiągnięty poprzez ocenę funkcji motorycznych larw za pomocą testu pełzania, ocenę funkcji motorycznych dorosłych osobników za pomocą testu pierścienia oraz ocenę zdolności sensorycznych i koordynacyjnych dorosłych osobników za pomocą testu zalotów. W efekcie ten zestaw testów behawioralnych pozwala wykazać, w jaki sposób czynniki genetyczne i zewnętrzne, takie jak podawanie leków, mogą wpływać na aktywność i koordynację.

Intra sophala. Główną zaletą tego testu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak negative geo axis, jest wyższa przepustowość i większa czułość testu pierścieniowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak wczesne wykrywanie defektów lokomocyjnych.

Analizę tę zaprezentuje dr Jamie Becknell, pracownik postdoktorski w moim laboratorium. Test pełzania larw służy do pomiaru wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na ruchliwość. Aby rozpocząć, należy przygotować krzyżówkę składającą się z 10-15 samców oraz 10-15 dziewiczych samic w standardowej butelce. Po 24 godzinach zdrowe osobniki dorosłe złożą wystarczającą liczbę jaj, aby zasiedlić butelkę, co pozwoli zachować populację o jednolitym wieku 24 godzin.

Przenieś osobniki dorosłe do nowej butelki i powtórz proces. Inkubuj butelkę do momentu zaobserwowania larw w trzecim stadium w pożywce w butelce. Dodaj 50 do 100 ml 20% sacharozy i odstaw na 20 minut.

Larwy wypłyną na powierzchnię; należy je zebrać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml z odciętą końcówką i umieścić w koszyczku z siatki. Larwy w koszyczku należy przemyć dwukrotnie wodą dejonizowaną. Są one teraz gotowe do przeprowadzenia eksperymentów.

Aby poddać larwy działaniu leku, należy za pomocą pędzelka przenieść odpowiednią liczbę larw do zlewki o pojemności pięciu mililitrów zawierającej 5% roztwór sacharozy oraz badany lek. Pozostawić je do odżywiania się roztworem cukru z lekiem przez 15 minut, a następnie przelać je z powrotem przez koszyczek z siatką, opłukać i przystąpić do pomiaru wpływu leku na motylność. Za pomocą pędzelka przenieść pojedynczą larwę do 15 centymetrowej płytki Petri zawierającej 2% agar.

Umieść nad arkuszem papieru milimetrowego. Teraz zbierz dane. Po prostu policz liczbę linii siatki, które lawa przekroczy w ciągu jednej minuty.

Następnie, używając pędzelka, przenieś larwy do dołka szklanego naczynia sekcyjnego zawierającego rozcieńczony roztwór pasty drożdżowej; pod mikroskopem sekcyjnym, w ciągu jednej minuty, policz skurcze Percys. Pojedynczy skurcz jest liczony jako pełny ruch od końca tylnego do przedniego. Powtarzaj czynność, aż zostanie policzona pożądana liczba larw.

Protokół pierścieniowy mierzy prędkość lokomocyjną dorosłych zwierząt. Zbierz nowo wyklute dorosłe męskie muchy pod lekką anestezją i przenieś je do standardowych probówek zawierających pokarm normalny lub z dodatkiem leku. Umieść około 25 much w każdej probówce. Przechowuj muchy w temperaturze pokojowej przez dwa do trzech dni, aby zapewnić pełne wybudzenie z narkozy oraz osiągnięcie stacjonarnego poziomu leku w organizmie.

Następnie przenieś około 25 much bez znieczulenia do probówek polistyrenowych z formowanymi zatyczkami i umieść probówki w jednej lub więcej aparatach pierścieniowych. Pozostaw muchy do odpoczynku na 15 do 20 minut, ustawiając w tym czasie aparat cyfrowy do fotografowania probówek z widoku bocznego; przygotuj stoper i ustaw go na pożądany czas trwania testu. Zazwyczaj test trwa trzy sekundy.

Trzymając aparat pierścieniowy w jednej ręce w sposób, który nie niepokoi much, a w drugiej ręce wyzwalacz czasowy kamery, uderz trzy razy aparatem o blat stołu, aby ogłuszyć muchy, i jednocześnie uruchom odliczanie czasomierza w kamerze. Powtarzaj badanie raz na minutę, aż zostanie wykonanych pięć lub sześć prób.

Kluczowe jest, aby nie używać ponownie polistyrenowych fiolek testowych po zebraniu początkowych zestawów danych. Nowe muchy umieszczone w używanych fiolkach nie będą wspinać się w takim stopniu, jak muchy umieszczone w świeżych fiolkach. Aby zebrać dane za pomocą przeglądarki obrazów, należy ocenić średnią wysokość wspinania się poszczególnych grup.

Do przeprowadzenia tego testu wymagane są przygotowane krzyżówki genetyczne w butelkach, które produkują liczne potomstwo, aby umożliwić pobranie much do analizy. W ciągu kilku godzin od subiektywnego świtu zwierząt oczyść butelki, zbierając wszystkie dorosłe osobniki w odstępach trzech do czterech godzin. Zbierz nowo wyklute, seksualnie naiwne samce i samice; samce umieść pojedynczo w fiolkach lub probówkach z pożywką, natomiast samice w grupach po pięć do sześciu osobników.

Do analizy w podobnych klatkach wymagana jest równa liczba samców i samic. Po odizolowaniu zebranych much przez pięć dni należy przygotować je do umieszczenia w kole do kojarzenia i przeprowadzić badanie. Następnie, pod mikroskopem stereologicznym, należy ostrożnie przenieść jedną samicę i jednego samca do komory koła do kojarzenia.

Obserwuj parę przez 10 minut lub do momentu udanego kopulowania w tym czasie. Zapisuj, kiedy po raz pierwszy zaobserwowano każde z kilku określonych zachowań. Zapisuj, kiedy samiec po raz pierwszy odwrócił się w stronę samicy.

Zapisz moment, w którym samiec po raz pierwszy dotyka samicy odnóżem, moment, w którym samiec po raz pierwszy rozpościera i wibruje skrzydłem, oraz moment, w którym samiec po raz pierwszy liże narządy kopulacyjne samicy. Zapisz, kiedy samiec po raz pierwszy podwija odwłok pod siebie. Zapisz, kiedy samiec po raz pierwszy próbuje wejść na samicę. Na koniec zapisz całkowity czas trwania zachowań godowych aż do momentu kopulacji.

W przypadku zwierząt typu dzikiego dzieje się to niemal zawsze w ciągu od 5 do 10 minut; dane zbierane są według trzech różnych parametrów. Po pierwsze, latencja zachowania to czas, jaki upływa do momentu jego pierwszego zaobserwowania. Po drugie, częstotliwość zachowania określa, czy zostało ono zaobserwowane, czy nie.

Po trzecie, indeks zalotów to czas spędzony na zalotach podzielony przez całkowity czas do momentu kopulacji w eksperymencie z udziałem zwierząt. Obecność mutacji w genie F-U-S-T-L-S związany z boczno rdzeniowym stwardnieniem mięśniowym. Mutanty genów z insercją w centrum wykazywały połowę zdolności pełzania w porównaniu do kontroli typu dzikiego (po lewej), a mutacja missense R 5 21 C obniżyła prędkość pełzania do zaledwie około 1 cm/min.

Test pierścieniowy przeprowadzony na młodych dorosłych muchach typu dzikiego wykazał średnią wysokość wspinaczki wynoszącą od trzech do pięciu centymetrów w czasie trzech sekund. W tym badaniu nie zaobserwowano desensytyzacji w ciągu pięciu następujących po sobie prób przeprowadzanych w odstępach minutowych podczas wykonywania testu pierścieniowego. Należy pamiętać o zachowaniu jak największej precyzji w zakresie pomiaru czasu.

Po opanowaniu techniki, test zagęszczenia larw może zostać przeprowadzony w czasie od 30 do 40 minut w celu zaobserwowania 10 prób dla jednego genotypu, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo również posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu obserwacji i oceny zachowań godowych u muchy.