Name: Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj technikę patch clamp do rejestracji aktywności neuronów Mauthnera w embrionach Danio rerio. Ta metoda umożliwia badanie prądów synaptycznych i właściwości kanałów jonowych w rozwijającym się układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Canadian Foundation for Innovation (CFI) dla DWA.

1. Przygotowanie i rozbiór
<ol>
	<li>Przygotuj naczynie preparacyjne wyłożone Sylgardem. Komory nagraniowe firmy WPI (Sarasota, Floryda, USA; Dostawcy są wymienieni w tabeli 2) są używane jako naczynia preparacyjne (rysunek 1). Komory są przystosowane do umieszczania szklanych szkiełek, a małe plastikowe podkładki służą jako formy do Sylgarda. Podkładki najpierw mocuje się do suwaka za pomocą smaru, a na środek podkładki dodaje się płyn Sylgard. Sylgard utwardza się przez noc, a gdy to robi, tworzy małe, okrągłe łoże na szkiełku podstawowym, które staje się podstawą naczynia preparacyjnego. Szkiełko umieszcza się w komorze zapisu i służy jako podstawa komory, do której mocowany jest preparat (rys. 1).</li>
	<li>Przygotować roztwory wymienione w tabeli 3. Roztwory zewnątrzkomórkowe należy pozostawić w temperaturze pokojowej, podczas gdy roztwory wewnątrzkomórkowe powinny być utrzymywane w sterylności. Można również dodać żółcień Lucyfera (0,1%) do roztworu wewnątrzkomórkowego, aby można było przeprowadzić wizualizację morfologii komórek M pod koniec eksperymentu. Służy to potwierdzeniu tożsamości komórki (ryc. 2).</li>
	<li>Hodować zarodki danio pręgowanego typu dzikiego w wodzie z jajami w temperaturze 28,5 °C, a następnie zbierać i etapizować zgodnie z Kimmel i wsp. 10. W celu przeprowadzenia sekcji należy przenieść zarodki do naczynia sekcyjnego, które służy również jako komora rejestracyjna. Znieczulać przez 7-10 minut w znieczulającym roztworze soli (0,02% tricainy; roztwór 1, tabela 3), który jest bardzo zbliżony do fizjologicznej soli fizjologicznej. Można określić, czy są one odpowiednio znieczulone, badając reakcję na delikatne uszczypnięcie ogona.</li>
	<li>Przypnij zarodki przez strunę grzbietową i umieść na szalce wyłożonej Sylgardem drutem wolframowym 0,001" (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) przy użyciu 25-krotnego powiększenia pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1). Drut wolframowy można łatwo ciąć na małe segmenty za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych.</li>
	<li>Dostosuj powiększenie lunety do sekcji na 40-50X, aby przeprowadzić sekcję. Po przypięciu zarodka do naczynia, szczęka, oczy i przodomózgowie są usuwane za pomocą cienkiej pary kleszczy (Dumont #5).</li>
	<li>Tyłomózgowie jest delikatnie odrywane od leżącej poniżej struny grzbietowej poprzez ostrożne przesuwanie kleszczy między struną grzbietową a mózgiem. Tyłomózgowie jest następnie delikatnie odwracane tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry. Takie ustawienie zapewnia dobry dostęp do komórek M, które zwykle znajdują się w odległości 5-10 μm od powierzchni brzusznej u młodych zarodków i ~20-50 μm u starszych larw (ryc. 2A).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś preparat do konfiguracji nagrywania, w której można przeprowadzić eksperyment z zaciskiem krosowym. Komórki M są wizualizowane za pomocą Nomarskiego Differential Interference Contrast (DIC), chociaż można również stosować inne tryby obrazowania (np. kontrast modulacyjny Hoffmana lub gradientowe obrazowanie kontrastowe Dodt firmy Luigs i Neumann z Niemiec).</li>
</ol>
2. Nagrywanie z użyciem zacisku krosowego (tryb całej komórki)
<ol>
	<li>Wszystkie nagrania wykonywane są w trybie clampu krosowego całego ogniwa11. Komory rejestracyjne umieszcza się na stoliku mikroskopowym w układzie elektrofizjologicznym. Nasze stoliki są zamocowane, a pionowy mikroskop z zaciskiem krosowym jest przykręcony do ruchomej platformy mikroskopu lub translatora mikroskopowego.</li>
	<li>Pipety z zaciskiem krosowym są naciągane na poziomy ściągacz (P-97; Sutter Instruments Co.) z cienkościennego, borokrzemianowego szkła otrzymywanego z WPI. Średnice końcówek pipet są rzędu 0,2-0,4 μm po wypolerowaniu ogniowym do gładkiej krawędzi, a stożek trzpienia ma długość ~4 mm.</li>
	<li>Podłącz pipetę do amplifier head-stage w konfiguracji elektrofizjologii. Ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45° do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia pipety, który jest odpowiedni do tworzenia uszczelek o wysokiej rezystancji na kuwecie Mauthnera.</li>
	<li>Tuż przed wejściem do roztworu do kąpieli należy przyłożyć niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zabrudzenia końcówki. Podczas rejestrowania mEPSC, roztwory do kąpieli zawierają 1 μM TTX do blokowania potencjałów czynnościowych, 5 μM strychniny do blokowania receptorów glicyny i 10 μM bicukuliny lub 100 μM pikrotoksyny do blokowania receptorów GABAA. Podczas rejestrowania mIPSC, roztwory do kąpieli zawierają 1 μM TTX, kwas kynureninowy i bikukulinę lub strychninę, w zależności od aktywności receptora będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Zbliżyć się do M-cell z niewielką ilością dodatniego ciśnienia w pipecie. Nadciśnienie delikatnie popycha komórkę z boku na bok, a po umieszczeniu bezpośrednio nad komórką tworzy mały wgłębienie na błonie komórkowej. Pozostaw pipetę na miejscu na kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, aby można było utworzyć mocne uszczelnienie między pipetą a membraną. Uwolnienie nadciśnienia w pipecie pozwala na zainicjowanie zgrzewu, a niewielka ilość podciśnienia w połączeniu z ujemnym potencjałem pipety powoduje powstanie zgrzewów GigaΩ w ciągu kilku sekund.</li>
	<li>Zmień potencjał podtrzymania na wzmacniaczu na -60 mV. Rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania. Natychmiast rejestruj potencjały membranowe i minimalizuj artefakty pojemności. Kompensacja pojemności ogniwa (CM) i rezystancji dostępu (szeregowego) (Ra) o 70-85%. Ra powinien być rutynowo monitorowany, co 30 sekund do minuty, a jeśli nastąpi zmiana o 20% lub więcej, przerwać eksperyment.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu i zebraniu wystarczającej ilości danych, preparat poświęca się poprzez usunięcie tyłomózgowia za pomocą kleszczy. W tym momencie można rozpocząć analizę danych.</li>
</ol>

<ol><li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner+cell+half+a+century+later%3A+a+neurobiological+model+for+decision-making%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li>
<li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li>
<li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S+.A%22%5BJournal%5D)">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).</li>
<li>Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphants%3A+a+new+systematic+vertebrate+functional+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.</a> Yeast. 17, 302-306 (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Tallafuss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+gene+function+ON+and+OFF+using+sense+and+antisense+photo-morpholinos+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish.</a> Development. 139, 1691-1699 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. 1, 5, University of oregon Press. (2007).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).</li>
<li>Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li>
<li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany powyżej protokół pozwala na łatanie rekordu zaciskowego z komórek M i ich homologów. Technika jest trudna i należy zachować ostrożność w kilku kluczowych obszarach podczas całej procedury. Omówimy teraz niektóre z tych obszarów i udzielimy pomocnych wskazówek, które zapewnią sukces.
Konstrukcja komory prosektoryjnej/rejestracyjnej jest kluczowym aspektem eksperymentu. Komórki M są trudne do zobaczenia, chyba że stosuje się kontrast interferencyjny. Nomarski DIC działa najlepiej z czystymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, ale stwierdziliśmy, że bardzo cienka warstwa Sylgard (~1-2 mm) nie zniekształci DIC do tego stopnia, że zakłóci identyfikację komórek M. Dlatego używamy komory nagraniowej, która ma cienkie szklane szkiełko nakrywkowe na dnie, na którym umieszcza się małą plastikową podkładkę (średnica ~5 mm). Mieszamy Sylgard 184 na szalce Petriego i ostrożnie dodajemy płynny Sylgard do wnętrza myjki za pomocą pipety Pasteura. Sylgard można utwardzać w temperaturze pokojowej przez kilka dni lub można go podgrzać w celu szybkiego utwardzenia. Myjkę można wyjąć po utwardzeniu Sylgardu, chociaż nie jest to konieczne. Po wykonaniu komory preparcyjnej/rejestracyjnej można jej używać przez kilka tygodni, zanim potrzebne będzie świeże szkiełko wyłożone Sylgardem.
Kolejnym krokiem w procedurze jest sporządzenie wszystkich odpowiednich roztworów w dniu doświadczenia (Tabela 3). Roztwory wewnątrzkomórkowe zawierające wszystko oprócz ATP i GTP są przygotowywane z wyprzedzeniem i przechowywane w podwielokrotnościach o pojemności 5 ml w temperaturze -20 °C. W dniu rejestracji podwielokrotność rozmraża się do temperatury pokojowej i dodaje świeże ATP i GTP. Roztwór dostosowuje się do 280 mOsm i pH 7,4. W naszych rękach widzimy, że codzienne dodawanie świeżego ATP i GTP skutkuje dobrymi nagraniami. Wszystkie roztwory muszą być utrzymywane w sterylności, aby mieć największe szanse na sukces.
Roztwory wewnątrzkomórkowe muszą być filtrowane przez filtr 0,22 μm (Sigma) w celu usunięcia małych cząstek i zanieczyszczeń, które mogą mieć wpływ na zapis. Aby to zrobić, najpierw pobieramy roztwór wewnątrzkomórkowy do strzykawki o pojemności 1 ml, przymocowujemy filtr do końca strzykawki i dodajemy plastikową końcówkę pipety, która została podgrzana i pociągnięta do drobnej końcówki, do końca filtra. Dzięki temu możemy nanieść przefiltrowany roztwór wewnątrzkomórkowy bezpośrednio do wnętrza pipet ze szklanymi plastrami.
Po przygotowaniu roztworów zarodek można znieczulić i wypreparować. Przed przystąpieniem do sekcji należy zadbać o odpowiednią ocenę wieku organizmu. Każdy zarodek w lęgu starzeje się w nieco innym tempie. Dlatego przy ocenie wieku organizmu ważne jest, aby robić to zgodnie z ustalonymi procedurami 10,13, wykorzystując wskazówki fenotypowe, takie jak liczba somitów, ogólny kształt ciała i czas zapłodnienia jaj. Wszystkie sekcje są wykonywane za pomocą cienkiej pary kleszczy Dumont #5. Muszą być ostre i w dobrym stanie technicznym, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie usunąć skórę pokrywającą tyłomózgowie i tkankę łączną na brzusznej powierzchni tyłomózgowia. Często musimy naostrzyć kleszcze po kilku tygodniach użytkowania i zrobić to sami za pomocą kamienia do ostrzenia.
Aby przypiąć rybę do cienkiej warstwy sylgardu, używamy szpilek wykonanych z cienkiego drutu wolframowego o średnicy 0,001 cala. Szpilki są wycinane starymi nożyczkami do mikropreparacji pod mikroskopem preparacyjnym i są na tyle małe, że mieszczą się w strunie grzbietowej. Przypinanie zarodków w jakimkolwiek innym miejscu nie unieruchamia ich i sprawia, że sekcje są prawie niemożliwe do wykonania. Kiedy po raz pierwszy uczysz się wykonywać nagrania, może być trudno zidentyfikować komórkę M na podstawie jej homologów (szczególnie MiD2 cm, która znajduje się w sąsiednim rombomerze - rombomerze 5). W niektórych zarodkach te dwie pary komórek wydają się mieć podobną wielkość. Otolity stanowią wygodny punkt orientacyjny, który pomaga w identyfikacji komórek M. Przy 48 hpf komórki M znajdują się tuż obok otolitów i mimo że otolity są usuwane podczas sekcji, pozostawiają lekko uszkodzony boczny obszar tyłomózgowia, który służy jako marker ich pierwotnej pozycji. Transgeniczne ryby, które wykazują ekspresję GFP lub innego markera fluorescencyjnego w komórce M, stanowią doskonałe przygotowanie dla nowych eksperymentatorów. W naszych rękach komórki M mają pojemność błony około 18-24 pF przy 48 hpf, podczas gdy mniejsze homologi są bliższe 12-14 pF. Ogniwa o większej powierzchni mają większe wartości pojemności błony (mierzone w pico Faradach (pF)) w porównaniu z mniejszymi ogniwami. W ten sposób pojemność membrany może być używana jako przybliżony wskaźnik wielkości komórki, przy czym większe ogniwa mają większe wartości pojemności. Ta cecha elektrofizjologiczna służy jako kolejna właściwość, dzięki której komórkę M można zidentyfikować na podstawie jej homologów. Wreszcie, często używamy żółtego Lucyfera w naszych rozwiązaniach do nagrywania (wewnątrzkomórkowego), co pozwala nam na przeprowadzenie pewnej identyfikacji badanego typu komórki za pomocą obrazowania fluorescencyjnego po zakończeniu nagrań.
Rezystancje końcówek pipet w zakresie 3,5-4,5 MΩ są najlepszym kompromisem pomiędzy rozmiarem końcówki a niską rezystancją dostępu, która zwykle wynosi od 8 do 15 MΩ. Jest to szczególnie ważne w przypadku zdarzeń z szybką kinetyką; ~0,1 ms (20-80%) czasy narastania i ~0,5 ms wykładnicze rozpady 12,14,15 (rys. 3A i 3B). Dane są pozyskiwane z szybkością digitalizacji 50-100 kHz i filtrowane z częstotliwością dolnoprzepustową 5-10 kHz. Jeśli chodzi o pipety z plastrami, stwierdziliśmy, że nie muszą one być polerowane ogniowo, aby uzyskać nagranie, ale anegdotycznie wydaje się, że oferują nieco większą szansę na uzyskanie dobrych uszczelnień w porównaniu z pipetami niepolerowanymi. Ponieważ końcówki pipet są stosunkowo duże, nie dodajemy zbyt dużego nadciśnienia do pipety przed wprowadzeniem do roztworu. Wymaga to praktyki w decydowaniu o odpowiedniej ilości nadciśnienia, które należy zastosować, ponieważ nadmierne ciśnienie zbyt mocno przesunie komórkę i zapobiegnie tworzeniu się uszczelnienia. Może również uszkodzić kontakty synaptyczne, ponieważ komórka jest delikatnie przemieszczana z pierwotnej pozycji. Z drugiej strony, zbyt mały nacisk powoduje zabrudzenie końcówek i nie czyści powierzchni ogniwa na tyle dobrze, aby utworzyć dobre uszczelnienia. Złoty środek można osiągnąć tylko dzięki znacznej praktyce i doświadczeniu. Tworzenie uszczelnień można usprawnić poprzez zastosowanie ujemnych napięć w pipecie. Zazwyczaj mamy uszczelki o mocy 1,2-2 GΩ, które doskonale nadają się do przełamywania w trybie całego ogniwa.
Gdy konieczne jest zastosowanie środków farmakologicznych do cytoplazmy komórki, włączamy je do roztworu wewnątrzkomórkowego przed napełnieniem pipety. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania roztworów pipet, aby uniknąć utraty środków w wyniku związania ich z filtrem 0,22 μm. Dlatego najpierw filtrujemy pożywkę wewnątrzkomórkową, a następnie ostrożnie dodajemy środek farmakologiczny do przefiltrowanego roztworu. Zastosowanie związków do kompartmentu wewnątrzkomórkowego wiąże się z unikalnym zestawem wyzwań. Na przykład dodanie leków do pożywki wewnątrzkomórkowej zwykle zmniejsza szanse na utworzenie uszczelki GΩ, ale nie do tego stopnia, aby stanowiło główną przeszkodę w eksperymencie.
Należy zdawać sobie sprawę, że zastosowanie środków farmakologicznych w ten sposób nie pozwala eksperymentatorowi na zarejestrowanie najwłaściwszej kontroli, ponieważ czynnik ma natychmiastowy dostęp do komórki od początku całej konfiguracji komórki. Dlatego, chociaż rejestrujemy dane w tego typu eksperymencie, należy mieć świadomość, że następną najlepszą kontrolą jest wewnątrzkomórkowe zastosowanie nieaktywnej formy środka. W wielu przypadkach przybiera to postać związku inaktywowanego termicznie, zaszyfrowanego peptydu lub nieaktywnego izomeru otrzymanego od dostawcy.
Pozyskujemy dane w postaci prądów synaptycznych (mPSC), prądów bramkowanych napięciem oraz potencjałów czynnościowych. Prądy miniaturowe mogą być analizowane przez kilka doskonałych programów (pClamp, Axograph itp.), chociaż my wolimy używać Axograph X (John Clements). Axograph X działa zarówno na platformach Windows, jak i Macintosh i może być używany zarówno do pozyskiwania, jak i analizy danych elektrofizjologicznych. mEPC są pozyskiwane za pomocą wybranego przez eksperymentatora szablonu, uzyskanego z samego zapisu. Poszczególne zdarzenia mogą być analizowane pod kątem takich właściwości, jak czas narastania, amplituda, połowa szerokości i czas zaniku itp. Eksportujemy arkusz kalkulacyjny z danymi do Kaleidagraph (Synergy Software), gdzie możemy wyprodukować liczby, w tym kopie śladów zdarzeń z Axograph X.
Jednym z trudniejszych aspektów eksperymentu jest ustalenie, czy zapis został wykonany na tyle dobrze, aby dostarczyć czystych, wiarygodnych danych. Na przykład mogą wystąpić problemy z zaciśnięciem przestrzeni podczas rejestrowania mPSC z komórek M, które mają duże aksony i rozległe procesy dendrytyczne. Podczas zaciskania napięcia można na ogół dość dobrze kontrolować napięcie na końcówce pipety (zwłaszcza jeśli rezystancja dostępu(Ra) jest niska), ale może nie być właściwej kontroli potencjału membrany w procesach dendrytycznych lub aksonach znajdujących się daleko od końcówki pipety. Jedną z metod określenia, czy komórka była prawidłowo zaciśnięta przestrzennie, jest utworzenie wykresu punktowego czasu narastania w funkcji amplitudy zarejestrowanych mPSC. Korelacja między danymi sugeruje niewystarczające ograniczenie przestrzeni. Innymi słowy, jeśli zacisk przestrzenny jest słaby, wówczas mPSC, które występują w pobliżu pipety, będą miały krótsze czasy narastania i większe amplitudy niż zdarzenia zachodzące w pewnej odległości od pipety. Jeśli korelacja istnieje, dane są problematyczne i nie można ich wykorzystać.
Innym aspektem zapisów elektrofizjologicznych, którym należy się zająć, są prądy upływowe. Jest to szczególnie ważne, gdy ogniwo jest zaciskane napięciem w celu rejestrowania prądów bramkowanych napięciem, takich jak prądy Na+ lub K+ . Gdy potencjał membranowy jest odchylony od spoczynku, prądy upływowe mogą być rejestrowane wraz z aktywnością bramkowaną napięciem. Prądy upływowe (IL), kombinacja prądu potasu (IK), sodu (INa) i chlorku (ICl) przepływające przez kanały bramkowane napięciem zaciemnią interesującą nas aktywność i muszą zostać odjęte od zapisu. Wzmacniacz jest w stanie wykonywać tę funkcję w trybie online podczas nagrywania, uruchamiając to, co zwykle nazywa się protokołem P/N. Podczas protokołu P/N wzmacniacz przeprowadzi kilka małych depolaryzacji (lub hiperpolaryzacji) ze spoczynku i zarejestruje wynikający z tego prąd upływu, który wystąpi. Ważne jest, aby używać wystarczająco małych impulsów, które nie aktywują kanałów bramkowanych napięciem. Prądy, które występują podczas tych impulsów, są rejestrowane i uśredniane, dzięki czemu te prądy upływowe można odjąć od aktywności kanału bramkowanego napięciem.
Na koniec należy wziąć pod uwagę potencjał połączeniowy, który występuje na końcu elektrody między roztworami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi. Roztwory wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe zazwyczaj składają się z różnych jonów o różnej aktywności i ruchliwości. Większe jony o mniejszej ruchliwości będą oferować większą oporność na ruch jonów niż mniejsze, co może skutkować niewielką, ale znaczącą różnicą potencjałów na styku roztworów. Ten potencjał złączowy musi być brany pod uwagę przy określaniu odpowiednich napięć doświadczanych przez ogniwo.
Przedstawiona tu technika jest stosowana przez nasze laboratorium od wielu lat. Istnieją jednak alternatywne metody nagrywania z komórki M. Przede wszystkim Joseph Fetcho i współpracownicy opracowali doskonały preparat, w którym można rejestrować z komórek M starszych larw (w wieku 4-5 dni) w sposób mniej inwazyjny niż przedstawiony tutaj, gdzie do komórki M zbliża się od powierzchni grzbietowej16. Próbowaliśmy podobnej techniki, ale okazało się, że łatwiej jest zbliżyć się do komórki M od brzusznej strony tyłomózgowia, gdzie komórka jest bliżej powierzchni mózgu, szczególnie u młodych ryb (tj. 24 hpf do 72 hpf). Co więcej, podejście od powierzchni grzbietowej zwykle wymaga użycia linii transgenicznej, która wyraża znacznik fluorescencyjny w komórce M, co może wprowadzić dodatkowe zmienne do zapisu. Ten problem nie występuje w przypadku używania ryb typu dzikiego. Jednak w przypadku przedstawionej tutaj techniki jesteśmy ograniczeni do badania młodszych zwierząt (od 24 hpf do 72 hpf). Każde podejście ma więc swoje zalety i ograniczenia.
Test t Studenta może być używany do porównywania dwóch grup danych, podczas gdy analiza wariancji (ANOVA) może być używana do porównywania wielu grup. Należy dołożyć starań, aby wybrać odpowiednie badanie post hoc dla danych parametrycznych i nieparametrycznych.

Jedno z nierozstrzygniętych pytań w neurobiologii rozwojowej dotyczy roli zjawisk plastyczności synaptycznej podczas dojrzewania synaptycznego. Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów plastyczności, które leżą u podstaw rozwoju synaptycznego, a ogólnym celem jest zrozumienie zachowania zwierząt w kontekście rozwoju synaptycznego. W tym celu opracowaliśmy w dużej mierze nienaruszony preparat w organizmie (danio pręgowany, Danio rerio), który pod koniec lat 90. zyskał znaczną popularność w badaniach rozwojowych. 
 Danio pręgowany oferuje kilka wyraźnych zalet w badaniach neurorozwojowych. Na przykład jego genom jest sekwencjonowany i można wykonywać knockdowny morfolino i nokauty nukleazy palca cynkowego, aby wyciszyć aktywność genów i ekspresję białka. Można również wykonywać badania nadekspresji i konstruować linie transgeniczne7-9. Zarodki są stosunkowo łatwe i obfite do pozyskania, a przezroczysta natura zarodka dobrze nadaje się do badań obrazowych i optogenetycznych. Dodatkowo można przeprowadzić analizę behawioralną i przeprowadzić eksperymenty elektrofizjologiczne na włóknach mięśniowych, neuronach rdzenia kręgowego i neuronach tyłomózgowia w w dużej mierze nienaruszonych organizmach, co pozwala na zbadanie funkcji komórkowych in vivo. Co ważne, jesteśmy w stanie badać aktywność synaptyczną nie tylko w tej samej klasie komórek, ale w tej samej parze neuronów, od przygotowania do przygotowania. Innymi słowy, jest to jeden z nielicznych preparatów kręgowców, w którym można powrócić do tego samego neuronu, in situ, aby zbadać jego rozwój. 
 Aby utrzymać obwody neuronalne tak żywotne, jak to tylko możliwe, opracowaliśmy preparat, w którym tyłomózgowie i rdzeń kręgowy pozostały nienaruszone, podczas gdy łaty zaciskały się na komórkach M. W tym preparacie oczy, szczęka i skóra pokrywające mózg są delikatnie usuwane, a tyłomózgowie jest odklejane od struny grzbietowej, umożliwiając dostęp do brzusznej powierzchni tyłomózgowia. Neurony siateczkowo-rdzeniowe znajdują się na głębokości kilku mikrometrów i są stosunkowo łatwo dostępne. Po 48 godzinach od zapłodnienia (hpf; niektóre skróty podano w tabeli 1) komórki są elektrycznie zwarte i można z nich wiernie rejestrować aktywność synaptyczną (zarówno prądy pobudzające, jak i hamujące), prądy bramkowane napięciem i potencjały czynnościowe. 
 Nasze odkrycia sugerują, że wiele aspektów rozwoju i dojrzewania synaps występuje w ciągu 24 godzin przed wykluciem, dlatego większość naszej uwagi skupia się na organizmach w wieku od 24 hpf do 72 hpf. Jednak przy 72 hpf ogniwa M są mniej kompaktowe elektrycznie i trudno jest je prawidłowo rozmieścić. Technika ta może być wykorzystana do nagrywania nie tylko z komórek M, ale także z ich homologów, MiD2 cm i MiD3 cm. Teoretycznie można również wykonać podwójne nagrania, z neuronu rdzenia kręgowego, takiego jak pierwotny neuron ruchowy, oraz z komórki M, ale jest to trudne i można argumentować, że korzyści uzyskane z tak trudnej techniki mogą nie być warte nadzwyczajnego wysiłku, który jest wymagany.

<table><tbody><tr><td>Naczynie preparacyjne</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0291</td><td></td></tr><tr><td>0,001" Drut wolframowy</td><td>Scientific Instruments Services Inc.</td><td>W406</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige Group</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop zaciskowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMLFSA</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Siskiyou Inc.</td><td>MX7500</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1322A</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>200B</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>pClamp9</td><td></td></tr><tr><td>Aksograf X</td><td>Aksograf</td><td>X</td><td></td></tr></tbody></table>

nagrania patch clamp z embrionalnych komórek mauthnera danio pręgowanego

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Komórki Mauthnera (komórki M) to duże neurony siateczkowo-rdzeniowe zlokalizowane w tyłomózgowiu ryb teleost. Są to kluczowe neurony zaangażowane w charakterystyczne zachowanie znane jako reakcja C-start lub ucieczka, która występuje, gdy organizm dostrzega zagrożenie. Limfocyt M był szeroko badany u dorosłych złotych rybek, gdzie wykazano, że otrzymuje szeroki zakres sygnałów pobudzających, hamujących i neuromodulujących1. Badaliśmy aktywność komórek M u embrionalnego danio pręgowanego w celu zbadania aspektów rozwoju synaptycznego w preparacie kręgowców. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych Ali i jego współpracownicy opracowali preparat do rejestracji klamry krosowej z komórek M w zarodkach zebry danio pręgowanego, w których OUN był w dużej mierze nienaruszony2,3,4. Celem w tamtym czasie było zarejestrowanie aktywności synaptycznej neuronów tyłomózgowia, neuronów rdzenia kręgowego i mięśni szkieletowych tułowia przy jednoczesnym utrzymaniu funkcjonalnych połączeń synaptycznych w nienaruszonym preparacie mózg-rdzeń kręgowy. Preparat ten jest stosowany w naszym laboratorium do dziś. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw plastyczności synaptycznej rozwoju, rejestrujemy pobudzające (za pośrednictwem AMPA i NMDA)5,6 i hamujące (GABA i glicyna) prądy synaptyczne od rozwijających się komórek M. Co ważne, ten unikalny preparat pozwala nam powrócić do tej samej komórki (M-komórki) z przygotowania na preparat, aby dokładnie zbadać plastyczność synaptyczną i rozwój neurologiczny w organizmie embrionalnym. Korzyści płynące z tego preparatu to m.in. 1) nienaruszone, funkcjonalne połączenia synaptyczne z komórką M, 2) stosunkowo niedrogie preparaty, 3) duża ilość łatwo dostępnych zarodków, 4) zdolność do powrotu do tego samego typu komórki (tj. komórki M) w każdym preparacie, dzięki czemu rozwój synaps na poziomie pojedynczej komórki może być badany od ryby do ryby, oraz 5) obrazowanie całych preparatów ze względu na przezroczysty charakter zarodków.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell z neuronów siatczysto-rdzeniowych u rybek zebrafish, skupiając się w szczególności na komórkach M. Oczywiście możliwe jest również rejestrowanie w innych konfiguracjach patch-clamp, takich jak cell-attached, inside-out oraz outside-out. Rodzaj danych, które można uzyskać, nie ogranicza się do tych zaprezentowanych tutaj, jednak staramy się przedstawić przykład zarówno aktywności synaptycznej (pobudzającej i hamującej) w trybie voltage-clamp, jak i potencjałów czynnościowych w trybie current-clamp. W miarę starzenia się organizmu i rozwoju bardziej rozbudowanych i złożonych dendrytów komórek M, zdolność do odpowiedniego clampowania napięcia (voltage clamp) i przestrzeni (space clamp) w komórce ulega pogorszeniu, a tryb current-clamp staje się preferowaną metodą rejestracji.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne zapisy pobudzających prądów receptorów AMPA i NMDA uzyskane z zarodków w 48 hpf w obecności TTX (1 μM) oraz czynników farmakologicznych blokujących receptory GABA i glicynowe. Gdy komórki M są poddane clampowaniu napięciowemu przy -60 mV, prądy synaptyczne wynikają z aktywacji receptorów AMPA (Rysunek 3A). Rejestracja i analiza tych zdarzeń pozwala na wyznaczenie parametrów takich jak czas narastania, czas zaniku, amplituda oraz częstotliwość. Zdarzenia AMPA charakteryzują się zazwyczaj krótkim czasem narastania (czas narastania 20-80% wynoszący ~0,1 msec) i czasu zaniku (~0,5 msec) oraz wykazują średnią amplitudę wynoszącą około 25 pA. Gdy komórki M są clampowane przy +40 mV, wynikające z tego prądy wychodzące są spowodowane aktywnością receptorów AMPA i NMDA (Rysunki 3C oraz 3D). Prądy receptorów NMDA wykazują dłuższy przebieg czasowy niż prądy receptorów AMPA i muszą być rejestrowane przy potencjałach dodatnich lub w roztworze wolnym od Mg, aby usunąć blokadę receptorów NMDA przez Mg2,6. Średni mEPSC pokazany na Rysunku 3D reprezentuje mieszane prądy AMPA i NMDA zarejestrowane przy +40 mV.
Rycina 4 przedstawia reprezentatywne wyniki podczas rejestracji mIPSCs z komórek Mauthnera. Zdarzenia te wystąpiły w obecności TTX (1 μM) i kwasu kynurenowego (1 mM) w celu zablokowania receptorów AMPA i NMDA. Zdarzenia te wykazują stosunkowo szybką kinetykę narastania i zaniku w 48 hpf i występują na tyle często, że pozwala to na zarejestrowanie wielu z nich podczas 2-3 minutowego pomiaru3. Rycina 5 przedstawia potencjały czynnościowe zarejestrowane w wyniku wstrzyknięcia prądu depolaryzującego do komórki. Komórki M embrionów w 48 hpf zazwyczaj generują pojedynczy potencjał czynnościowy (Rycina 5B), choć czasami generują wiele AP po podaniu bodźców ponadprogowych (Rycina 5A).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Skrót</td>
			<td>Pełne imię i nazwisko</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>mPSC</td>
			<td>Miniaturowe prądy postsynaptyczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>mEPSC</td>
			<td>miniaturowy pobudzeniowy prąd postsynaptyczny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>mIPSC</td>
			<td>Miniaturowy hamujący prąd postsynaptyczny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>MΩ</td>
			<td>Megaom (jednostka oporu; 10^6 Ω)6 Om)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>GΩ</td>
			<td>Gigaom (jednostka oporu; 109 om)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>MOsm</td>
			<td>miliosmoli (jednostka osmolarności; 10-3 osmol/l)-3 osmoli)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>TTX</td>
			<td>tetrodotoksyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>ATP</td>
			<td>trifosforan adenozyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>GTP</td>
			<td>trifosforan guanozyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.</td>
			<td>GFP</td>
			<td>Zielone białko fluorescencyjne</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Nazwa sprzętu</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>Kuweta anatomiczna</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>Drut wolframowy 0,001"</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Mikroskop stereoskopowy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>Wytciągacz pipet</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>Mikrokucie</td>
			<td>Grupa Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>Mikroskop do techniki patch-clamp w układzie pionowym</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>Mikromanipulator</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.</td>
			<td>Dane cyfrowe</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.</td>
			<td>Wzmacniacz</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9.</td>
			<td>Oprogramowanie akwizycyjne</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.</td>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td > </td>
			<td >Nazwa roztworu</td>
			<td >Odczynnik i stężenie (mM)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1.</td>
			<td >Roztwór do sekcji</td>
			<td >134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozy i 0.02% Tricaine</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2.</td>
			<td >Zewnątrzkomórkowy roztwór mPSC</td>
			<td >134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozy i 0.001 TTX</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3.</td>
			<td >Wewnątrzkomórkowy roztwór mPSC</td>
			<td >134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na2-ATP, 0.4 Li-GTP</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >4.</td>
			<td >Zewnątrzkomórkowy roztwór do potencjałów czynnościowych</td>
			<td >137 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 HEPES i 10 glukozy (z dodatkiem 10 μM D-tubocurarine)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >5.</td>
			<td >Wewnątrzkomórkowy roztwór do potencjałów czynnościowych</td>
			<td >130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4Mg-ATP i 0.4 Li-GTP.</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3. Wszystkie roztwory zewnątrzkomórkowe są dostosowane do 290 mOsm i pH 7.8. Wszystkie roztwory wewnątrzkomórkowe są dostosowane do 280 mOsm i pH 7.4.
<img alt="Układ do mikroiniekcji u danio pręgowanego z opisanymi elementami; obraz mikroskopowy przedstawiający embrion danio pręgowanego." src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Szalka do sekcji i nienaruszony preparat ródmózgu i rdzenia kręgowego. (A) Szalka do sekcji i rejestracji uzyskana z WPI. Cienka podkładka jest starannie uszczelniona na szkiełku przedmiotowym na dnie szalki, a do wgłębienia naniesiono Sylgard. (B) Preparat ródmózgu i rdzenia kręgowego w 48 hpf. Brzuszna powierzchnia ródmózgu jest skierowana do góry, a komórka M znajduje się tuż pod powierzchnią tkanki na poziomie zaznaczonego grotu strzałki.
<img alt="Identyfikacja komórek M w mikroskopii: porównanie technik obrazowania w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym." src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. (A) Obraz komórki M uzyskany za pomocą dyferencjalnego kontrastu fazowego Nomarskiego z zarodka w 2 dpf krótko po wykluciu. Obraz wykonano po zarejestrowaniu spontanicznej pobudzającej aktywności synaptycznej komórki M. (B) Komórka została wypełniona barwnikiem Lucifer yellow w trakcie eksperymentu. Adaptacja z12 za zgodą autora.
<img alt="Schematy mEPSC AMPA/NMDA; aktywność kanałów jonowych przy -60mV/+40mV, analiza transmisji synaptycznej." src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. (A) Spontaniczne mEPSC AMPA zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymania -60 mV. (B) Średnie mEPSC uzyskane z rejestracji przedstawionej w (A). (C) Spontaniczne mEPSC AMPA i NMDA (groty strzałek) zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymania +40 mV. (D) Średnie mEPSC uzyskane z rejestracji przedstawionej w (C). Glutaminianowe mEPSC rejestrowano w obecności TTX (1 μM) w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, strychniny (5 μM) oraz picrotoksyny (100 μM) w celu zablokowania prądów glicynowych i GABA.
<img alt="Wykres przebiegu mIPSC glicynowych przy -60 mV; pomiar aktywności neuronalnej; wyniki elektrofizjologiczne." src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. (A) Spontaniczne mIPSC zarejestrowane z komórki M przy potencjale trzymania -60 mV. (B) Średnie mEPSC uzyskane z rejestracji w (A). mIPSC rejestrowano w obecności TTX (1 μM) w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, kwasu kynurenowego (1 mM) w celu zablokowania aktywności receptorów glutaminianowych oraz bikukuliny (10 μM) w celu zablokowania prądów GABA.
<img alt="Wykresy kształtu potencjałów czynnościowych neuronów i schemat analizy prądu; badanie elektrofizjologiczne." src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Potencjały czynnościowe zarejestrowane z komórki M. W tej konkretnej komórce bodziec ponadprogowy (0.48 nA) wywołał kilka potencjałów czynnościowych (A), natomiast bodziec progowy spowodował powstanie tylko jednego potencjału czynnościowego (B). (C) Protokoły prądowe dla śladów przedstawionych w punktach A i B.

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja właściwości synaptycznych i pobudliwości komórek Mauthnera w embrionach danio pręgowanego. Jest to realizowane poprzez najpierw przeprowadzenie sekcji embrionu danio pręgowanego w celu odsłonięcia powierzchni brzusznej tylnego mózgowia. Drugim krokiem jest umieszczenie tak przygotowanego preparatu na stoliku mikroskopu do techniki patch clamp oraz zidentyfikowanie komórek Mauthnera.Kolejna partia. Podłącz elektrody do komórek M, korzystając z odpowiedniego trybu rejestracji, a następnie zarejestruj aktywność synaptyczną oraz właściwości pobudliwości. Ostatnim krokiem jest analiza zarejestrowanych danych w celu ustalenia właściwości synaptycznych lub pobudliwości.W ostateczności metoda patch-clamp stosowana w tych komórkach służy do wykazania właściwości receptorów synaptycznych w rozwijającym się organizmie. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają dwie główne trudności. Pierwszą z nich jest preparatyka tkankowa.Drugie formowanie sceny do prezentacji może być trudne. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł zastosowania tej metody, gdy zdecydowałem się opracować preparat rybki zebrafish, w którym tylny mózg był połączony z rdzeniem kręgowym; procedurę tę zademonstruje Burram Roy, doktorant w moim laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania naczynia do sekcji wyłożonego materiałem typu Sard. Najpierw przymocuj podkładki do szkiełka za pomocą smaru.Następnie należy nanieść płynny sard na środek myjki. Sard zazwyczaj utwardza się przez noc, tworząc na szkiełku przedmiotowe małe okrągłe podłoże, które stanie się podstawą naczynia do sekcji. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego na preparat, należy umieścić szkiełko w komorze rejestracyjnej, aby służyło jako podstawa do sekcji.Następnie należy przygotować wymagane roztwory. Roztwory zewnątrzkomórkowe powinny pozostawać w temperaturze pokojowej, natomiast roztwory wewnątrzkomórkowe należy przechowywać w warunkach sterylnych. Do roztworu wewnątrzkomórkowego można dodać 0,1% loose for yellow, aby na koniec eksperymentu przeprowadzić wizualizację morfologii komórki M w celu potwierdzenia tożsamości komórek.Następnie hoduj zarodki danio pręgowanego typu dzikiego w wodzie jajowej w temperaturze 28,5 °C, a następnie zbierz je i określ stopień ich rozwoju zgodnie z poprzednią publikacją. Do sekcji przenieś zarodki do naczynia sekcyjnego, które służy jednocześnie jako komora rejestracyjna. Następnie znieczul je przez 7 do 10 minut.W anestetyzującym roztworze soli, który ściśle odpowiada soli fizjologicznej, można określić, czy organizmy są odpowiednio znieczulone, badając reakcję na delikatne ściśnięcie ogona. Następnie, przy użyciu mikroskopu stereotypowego z 25-krotnym powiększeniem, przypnij zarodki przez obszar no accord do naczynia z linią ochronną SIL, używając wolframowego drutu o grubości 0,001 cala. Aby przeprowadzić sekcję, zwiększ powiększenie mikroskopu stereotypowego do 40–50 x.Następnie, używając precyzyjnej pęsety, usuń oczy żuchwowe i przedmózgowie. Delikatnie oddziel rzutmózgowie od leżącego pod nim sznura węzłów, ostrożnie przesuwając pęsetą pomiędzy sznurem węzłów a mózgiem. Następnie delikatnie obróć rzutmózgowie tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana ku górze.Takie ustawienie zapewnia dobry dostęp do komórek M, które w młodych embrionach znajdują się zazwyczaj w odległości od 5 do 10 micrometers od powierzchni brzusznej, a u starszych larw od 20 do 50 micrometers. Następnie ostrożnie przenieś preparat do układu rejestracyjnego, w którym można przeprowadzić eksperyment patch clamp. Komórki M wizualizuje się za pomocą kontrastu interferencyjnego różnicowego, choć do przygotowania do techniki patch clamp można wykorzystać również inne tryby obrazowania.Rozpocznij od przygotowania pipet do patch-clampu z cienkościennego szkła borokrzemianowego. W przypadku wyciągania poziomego średnice końcówek pipet wynoszą około 0,2 do 0,4 µm po wypaleniu krawędzi w celu jej wygładzenia, a stożek trzonu ma długość około 4 mm. Napełnij końcówkę pipety roztworem wewnątrzkomórkowym, zanurzając ją w płynie wewnątrzkomórkowym.Następnie wprowadź igłę strzykawki do pipety i delikatnie wypchnij z niej roztwór wewnątrzkomórkowy. Aby zakończyć napełnianie pipety, podłącz ją do wejścia wzmacniacza (head stage). W układzie elektrofizjologicznym ważne jest utrzymanie wejścia wzmacniacza pod kątem około 45 stopni względem osi poziomej, co zapewnia odpowiedni kąt wprowadzenia pipety, umożliwiający utworzenie wysokoporowych uszczelnień (seals) z otworem komórkowym. Tuż przed zanurzeniem pipety w roztworze kąpieli, przyłóż do niej niewielkie ciśnienie dodatnie, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki. Kontynuuj zbliżanie się do komórki M, utrzymując niewielkie ciśnienie dodatnie w pipecie.Nadciśnienie delikatnie przesuwa komórkę z boku na bok, a gdy pipeta znajdzie się bezpośrednio nad nią, tworzy się niewielkie wgłębienie w błonie komórkowej. Następnie należy pozostawić pipetę w tej pozycji przez kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, co umożliwi utworzenie szczelnego połączenia między pipetą a błoną. Po tym czasie należy zwolnić nadciśnienie w pipecie, aby zainicjować uszczelnienie.Niewielka wartość podciśnienia w połączeniu z ujemnym potencjałem pipety prowadzi do utworzenia giga-uszczelnienia (giga seal) w ciągu kilku sekund. Następnie należy zmienić potencjał podtrzymujący w wzmacniaczu na −60 mV. Przerwij błonę komórkową za pomocą serii krótkich impulsów ssania.Następnie niezwłocznie zarejestruj potencjały błonowe i zminimalizuj artefakty pojemnościowe. Skompensuj pojemność komórki oraz oporność dostępową w zakresie od 70 do 85%. Oporność dostępu powinna być monitorowana co 30 sekund do jednej minuty; w przypadku zmiany wynoszącej 20% lub więcej należy przerwać eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu i zgromadzeniu wystarczającej ilości danych, utylizuj embrion, usuwając móżdżek za pomocą pęsety.Rycina ta przedstawia reprezentatywne zapisy pobudzających prądów receptorowych AMPA i NMDA uzyskane z embrionów w 48 HPF. Przedstawione są tutaj spontaniczne ME PSC dla receptorów AMPA, zarejestrowane z komórki M przy potencjale holdingowym minus 60 mV. Tutaj natomiast widoczne są średnie ME PSC.Oto spontaniczne AMPA i NMDA mEPSCs zarejestrowane z komórki M przy potencjale trzymania 40 mV. A tutaj przedstawiono średnie mEPSCs; mEPSCs dla glutaminianu rejestrowano w obecności 1 µM TTX w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, 5 µM strychniny oraz 100 µM rycyny w celu zablokowania receptorów glicyny i GABA, co pokazano na wykresie. Oto spontaniczne mIPSCs zarejestrowane z komórki M przy potencjale trzymania -60 mV.Średnie wartości MI PSCs zarejestrowano w obecności 1 µM TTX w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, 1 mM kwasu chimerycznego w celu zablokowania aktywności receptorów glutaminianu oraz 10 µM bikuculiny w celu zablokowania aktywności GABA. Są to potencjały czynnościowe zarejestrowane z komórki M w tej konkretnej komórce.Bodziec progowy SRA o natężeniu 0,48 nano amps wywołał kilka potencjałów czynnościowych, jednak stymulacja dokładnie do poziomu progu skutkuje powstaniem pojedynczego potencjału czynnościowego. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od dwóch do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat rejestracji metodą patch clamp z komórek M oraz innych siatkowatych neuronów rdzeniowych w embrionach rybek zebrafish.

patch-clamp-recordings-from-embryonic-zebrafish-mauthner-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje Patch Clamp z komórek Mauthnera zarodkowych ryb cebra

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

W tym filmie pokażemy, jak rejestrować aktywność elektryczną z zidentyfikowanych pojedynczych neuronów w całym preparacie mózgu, który zachowuje złożone obwody neuronowe. Używamy transgenicznych ryb, u których neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) są genetycznie znakowane białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji w nienaruszonym preparacie mózgu.

Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Poznaj technikę patch clamp do rejestracji aktywności neuronów Mauthnera w embrionach Danio rerio. Ta metoda umożliwia badanie prądów synaptycznych i właściwości kanałów jonowych w rozwijającym się układzie nerwowym.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów