Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego
10 września 2013
Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.
Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie właściwości synaptycznych i pobudliwości embrionalnej ryby pręgowanej, ust ich komórek. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie zarodka danio pręgowanego w celu odsłonięcia brzusznej powierzchni tylnej półmózgowia. Drugim krokiem jest umieszczenie wypreparowanego preparatu na stoliku mikroskopu z klamrą krosową i zidentyfikowanie jamy ustnej w ich komórkach.
Następna łatka. Zacisnąć się na komórkach M przy użyciu odpowiedniego trybu nagrywania i zarejestrować aktywność synaptyczną oraz właściwości pobudliwości. Ostatnim krokiem jest analiza zarejestrowanych danych w celu ustalenia właściwości synaptycznych lub pobudliwości.
Ostatecznie zaciskanie plastrów z tych komórek służy do pokazania właściwości receptorów synaptycznych w rozwijającym się organizmie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały dwa główne obszary trudności. Pierwszym z nich jest sekcja.
Druga formacja sceny koncertowej może być wyzwaniem. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy zdecydowałem się pracować nad preparatem danio pręgowanego, w którym tylny mózg był przyczepiony do rdzenia kręgowego, demonstrując, że procedura będzie Burram Roy, doktorant w moim laboratorium, Rozpocznij tę procedurę od przygotowania naczynia preparacyjnego wyłożonego Sardą. Najpierw przymocuj podkładki do suwaka za pomocą smaru.
Następnie dodaj płynną darń do środka pralki. Sarda zwykle utwardza się przez noc i tworzy małe okrągłe łoże na szklanym szkiełku, które staje się podstawą naczynia preparacyjnego. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na szkiełku, należy umieścić szkiełko w komorze rejestracyjnej, aby służyło jako podstawa do sekcji.
Następnie przygotuj wymagane roztwory. Roztwory zewnątrzkomórkowe należy pozostawić w temperaturze pokojowej, podczas gdy roztwory wewnątrzkomórkowe powinny być utrzymywane w sterylności. Można również dodać 0,1% luźnego dla żółtego do roztworu wewnątrzkomórkowego, tak aby wizualizacja morfologii komórek M mogła być wykonana na końcu eksperymentu w celu potwierdzenia tożsamości komórki.
Następnie hoduj zarodki danio pręgowanego typu dzikiego w wodzie z jajami w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza, a następnie zbierz i zainscenizuj zgodnie z poprzednią publikacją. W celu przeprowadzenia sekcji należy przenieść zarodki do naczynia sekcyjnego, które służy również jako komora rejestracyjna. Następnie znieczulaj je przez siedem do 10 minut.
W roztworze soli znieczulającej, który jest bardzo zbliżony do soli fizjologicznej, można określić, czy są one odpowiednio znieczulone, badając reakcję na delikatne uszczypnięcie ogona. Następnie przypnij zarodki przez no accord i umieść na misce linii ochronnej SIL za pomocą drutu wolframowego o średnicy 0,001 cala pod mikroskopem preparacyjnym o 25-krotnym powiększeniu. Dostosuj powiększenie lunety do preparacji na 40 do 50 x, aby przeprowadzić sekcję.
Teraz usuń szczękę, oczy i przodomózgowie za pomocą cienkiej pary kleszczy. Delikatnie oderwij tyłomózgowie od leżącego poniżej rdzenia węzłowego, ostrożnie przesuwając kleszcze między rdzeniem węzłowym a mózgiem. Następnie delikatnie odwróć tylną część mózgu tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry.
Takie umiejscowienie zapewnia dobry dostęp do komórek M, które zwykle znajdują się w odległości od 5 do 10 mikrometrów od powierzchni brzusznej u młodych zarodków i od 20 do 50 mikrometrów u starszych larw. Następnie ostrożnie przenieś preparat do konfiguracji nagrywania, w której można przeprowadzić eksperyment z zaciskiem krosowym. Komórki M są wizualizowane z różnicowym kontrastem interferencyjnym, chociaż inne tryby obrazowania mogą być również używane do przygotowania do zaciskania łat
.Zacznij od wyciągnięcia kilku pipet CLA z cienkościennym szkłem krzemianowym. W przypadku pipety ciągnionej poziomo średnica końcówki wynosi około 0,2 do 0,4 mikrometra po wypolerowaniu ogniowym do gładkiej krawędzi, a stożek trzpienia ma długość około czterech milimetrów. Napełnij końcówkę pipety roztworem wewnątrzkomórkowym, zanurzając końcówkę w płynie wewnątrzkomórkowym.
Następnie wprowadzić igłę strzykawki do pipety i delikatnie usunąć roztwór wewnątrzkomórkowy ze strzykawki. Aby zakończyć napełnianie pipety, przymocuj pipetę do stopnia głowicy wzmacniacza W ustawieniach elektrofizjologii ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45 stopni do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia dla pipety, który jest odpowiedni do tworzenia uszczelek o wysokiej odporności z otworem w ich komórce tuż przed opuszczeniem pipety do roztworu kąpieli, Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki. Kontynuuj zbliżanie się do celi M z niewielką ilością dodatniego ciśnienia w pipecie.
Nadciśnienie delikatnie popycha komórkę z boku na bok, a po umieszczeniu bezpośrednio nad komórką tworzy mały wgłębienie w błonie komórkowej. Teraz pozostaw pipetę na miejscu na kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, aby można było uzyskać mocne uszczelnienie między pipetą a membraną. Następnie zwolnij nadciśnienie w pipecie, aby zainicjować uszczelnienie.
Niewielka ilość podciśnienia w połączeniu z ujemnym potencjałem pipet powoduje, że w ciągu kilku sekund tworzą się giga uszczelnienia. Następnie zmień potencjał podtrzymania we wzmacniaczu na minus 60 miliwoltów. Rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania.
Następnie natychmiast rejestruj potencjały membranowe i minimalizuj artefakty pojemności. Skompensuj pojemność ogniwa i rezystancję dostępu o 70 do 85%Rezystancja dostępu powinna być monitorowana co 30 sekund do minuty, a jeśli nastąpi zmiana o 20% lub więcej, przerwij eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu i zebraniu wystarczającej ilości danych, poświęć zarodek, usuwając tylną część mózgu za pomocą kleszczy.
Rysunek ten przedstawia reprezentatywne zapisy pobudzających prądów receptora A MPA i NMDA uzyskanych z 48 zarodków HPF. Oto spontaniczne PSC A MPA, ME zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymywania minus 60 miliwoltów. A to jest średnia ME PSC.
Oto spontaniczne PSC A MPA i NMDA me zarejestrowane z komórki M o potencjale utrzymywania 40 miliwoltów. I to jest średnia ME PSC glutaminianu me PSC zarejestrowano w obecności jednego mikromolowego TTX w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, pięciu mikromolowych ścisłych dziewięciu i 100 mikromolowych rytoksyn w celu zablokowania występowania glicyny i G. Oto spontaniczne PSC MI zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymywania minus 60 miliwoltów.
A średnie PSC MI MI PSC zarejestrowano w obecności jednego mikromolowego TTX w celu zablokowania potencjałów czynnościowych. Jeden milimolowy kwas chimeryczny blokuje aktywność receptora glutaminianu i 10 mikromolowych kwasu Qing blokuje występowanie GABA. Są to potencjały czynnościowe zarejestrowane z komórki M w tej konkretnej komórce.
Bodziec progowy o natężeniu 0,48 nanoampera wywołał kilka potencjałów czynnościowych, ale bodziec do progu powoduje tylko wytworzenie pojedynczego potencjału czynnościowego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak załatać zapis zaciskowy z komórek M i innych siatkowatych neuronów rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia metodę rejestracji aktywności elektrycznej neuronów Mauthnera oraz komórek retikulospinalnych w embrionach danio pręgowanego z wykorzystaniem nienaruszonego preparatu mózgu i rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia analizę prądów synaptycznych, aktywności kanałów sterowanych napięciem oraz potencjałów czynnościowych w rozwijających się neuronach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Zarodki ryb zebrafish są cenne w badaniach nad rozwojem neuronalnym.
- Neurony Mauthnera odgrywają krytyczną rolę w reakcji ucieczkowej.
- Techniki patch clamp są niezbędne do badania właściwości synaptycznych.
- Zrozumienie aktywności synaptycznej jest kluczowe dla poznania obwodów neuronalnych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody rejestracji aktywności neuronalnej w embrionach danio pręgowanego.
- Zbadanie pobudzających i hamujących prądów synaptycznych w kluczowych neuronach.
- Analiza właściwości receptorów synaptycznych podczas rozwoju embrionalnego.
Zastosowane metody
- Disekcja embrionów danio pręgowanego w celu odsłonięcia tylnego mózgu.
- Zastosowanie mikroskopii z metodą patch clamp do rejestracji z neuronów Mauthnera.
- Aplikacja specyficznych roztworów do środowisk wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych.
- Analiza danych w celu określenia właściwości synaptycznych i pobudliwości.
Główne wyniki
- Pomyślne rejestracje pobudzających i hamujących prądów synaptycznych.
- Charakterystyka aktywności kanałów bramkowanych napięciowo w rozwijających się neuronach.
- Identyfikacja właściwości receptorów synaptycznych u embrionalnych rybek danio pręgowanych.
- Wykazanie skuteczności metody dla przyszłych badań elektrofizjologicznych.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w badaniu aktywności neuronalnej w embrionach rybek danio pręgowanych.
- Uzyskane informacje mogą poszerzyć wiedzę na temat rozwoju układu nerwowego.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania nad mechanizmami synaptycznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rejestracja metodą patch clamp z komórek Mauthnera embrionalnych rybek danio umożliwia bezpośredni pomiar funkcji receptorów synaptycznych w rozwijającym się układzie nerwowym kręgowca. Podejście to wspomaga walidację celów terapeutycznych, dostarczając ilościowych danych na temat pobudzającej i hamującej neurotransmisji w krytycznych oknach neurorozwoju. Nienaruszony preparat mózgu i rdzenia kręgowego zachowuje natywne obwody neuronalne, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach mechanistycznych nad plastycznością synaptyczną i farmakologią receptorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar prądów pobudzających zależnych od AMPA i NMDA oraz prądów hamujących zależnych od GABA/glicyny w rozwijających się komórkach Mauthnera.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie biologicznej redukcji ryzyka poprzez funkcjonalną walidację ekspresji i aktywności receptorów synaptycznych w natywnym kontekście komórkowym.
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej poprzez śledzenie rozwoju synaptycznego na poziomie pojedynczej komórki w różnych preparatach, co redukuje zmienność w interpretacjach mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowych amplitud i kinetyki prądów synaptycznych w neuronach embrionalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki spójnym protokołom sekcji, rejestracji i analizy, które utrzymują funkcjonalne połączenia synaptyczne.
- Wartość naukowa: Wykazanie gotowości do przesiewu i możliwości ponownego wykorzystania platformy poprzez umożliwienie powrotu do tego samego typu komórek (komórki Mauthnera) w różnych preparatach na potrzeby podłużnych badań rozwoju synaptycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia dla przebiegu choroby oraz zgodności z biomarkerami translacyjnymi poprzez powiązanie pomiarów prądów synaptycznych z procesami neurorozwojowymi istotnymi dla modeli zaburzeń neurologicznych.
- Wartość operacyjna: Opisanie ciągłości procesu od fazy odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wykorzystanie embrionów danio pręgowanego jako systemu istotnego dla danej jednostki chorobowej w badaniach nad wczesnym angażowaniem celu terapeutycznego.
- Wartość naukowa: Skupienie się na wartości w zakresie predykcyjnej minimalizacji ryzyka poprzez charakterystykę aktywności kanałów bramkowanych napięciem oraz właściwości receptorów synaptycznych, co umożliwia prowadzenie przesiewu związków w oparciu o mechanizm działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej fazy odkrywania (Early Discovery) do identyfikacji związku wiodącego (Lead Identification), dostarczając odczytów elektrofizjologicznych, które informują o zaangażowaniu celu oraz mechanizmie działania w rozwijających się układach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnienie, w jaki sposób metoda ta wspomaga testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych lub ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rejestrację właściwości synaptycznych i pobudliwości komórek Mauthnera w nienaruszonej preparacji rdzenia przedłużonego i rdzenia kręgowego.
- Przesiewanie: Opis gotowości testu, powtarzalności lub wyników ilościowych, jeśli wynikają one z treści artykułu, poprzez pomiar spontanicznych i wywołanych pobudzających oraz hamujących prądów postsynaptycznych w warunkach izolacji farmakologicznej.
- Analityka: Wskazanie pomiarów, odczytów lub wyników statystycznych, które pomagają zespołom porównywać warunki poprzez analizę potencjałów błonowych, pojemności, rezystancji dostępu oraz amplitud i kinetyki prądów synaptycznych.
- Badania translacyjne: Powiązanie metody z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów wyłącznie w przypadku, gdy wynika to ze źródła, umożliwiając badanie rozwoju synaptycznego w modelu kręgowca mającym znaczenie dla rozwoju układu nerwowego u ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawienie metody jako wielokrotnie wykorzystywalnej kompetencji, a nie techniki jednorazowej, poprzez podkreślenie możliwości powrotu do preparacji tego samego typu komórek (komórek Mauthnera) po przygotowaniu w celu przeprowadzenia spójnej analizy podłużnej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji receptorów synaptycznych podczas rozwoju.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zdefiniowanym etapom dyssekcji, rejestracji i analizy, które utrzymują nienaruszone połączenia synaptyczne.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki umożliwieniu wczesnej oceny wpływu związków na rozwijającą się pobudliwość neuronalną i transmisję synaptyczną.
- Wpływ na portfolio: Usprawnione decyzje dotyczące priorytetyzacji i rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, dzięki ilościowym danym o prądach synaptycznych, co zmniejsza ryzyko związane z celami zaangażowanymi w szlaki neurorozwojowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu neurodysekcji, elektrofizjologii patch-clamp oraz farmakologicznej izolacji prądów synaptycznych.
- Potrzeby w zakresie instrumentacji i infrastruktury analitycznej, w tym mikroskopu do techniki patch-clamp, wzmacniacza, systemu perfuzji oraz optyki kontrastu interferencyjnego (DIC).
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie etapowania embrionów, techniki dysekcji oraz kryteriów tworzenia uszczelnienia (seal), aby zapewnić porównywalność danych między eksperymentami.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych ze względu na różnice w wielkości neuronów, dostępności oraz składzie synaptycznym między embrionami zebrafish a preparatami innych kręgowców.
- Praktyczne ograniczenia wynikające z materiału źródłowego, w tym wyzwania techniczne związane z dysekcją i tworzeniem gigaseal, szczególnie dla badaczy rozpoczynających pracę z tą metodą.
