Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie właściwości synaptycznych i pobudliwości embrionalnej ryby pręgowanej, ust ich komórek. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie zarodka danio pręgowanego w celu odsłonięcia brzusznej powierzchni tylnej półmózgowia. Drugim krokiem jest umieszczenie wypreparowanego preparatu na stoliku mikroskopu z klamrą krosową i zidentyfikowanie jamy ustnej w ich komórkach.

Następna łatka. Zacisnąć się na komórkach M przy użyciu odpowiedniego trybu nagrywania i zarejestrować aktywność synaptyczną oraz właściwości pobudliwości. Ostatnim krokiem jest analiza zarejestrowanych danych w celu ustalenia właściwości synaptycznych lub pobudliwości.

Ostatecznie zaciskanie plastrów z tych komórek służy do pokazania właściwości receptorów synaptycznych w rozwijającym się organizmie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały dwa główne obszary trudności. Pierwszym z nich jest sekcja.

Druga formacja sceny koncertowej może być wyzwaniem. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy zdecydowałem się pracować nad preparatem danio pręgowanego, w którym tylny mózg był przyczepiony do rdzenia kręgowego, demonstrując, że procedura będzie Burram Roy, doktorant w moim laboratorium, Rozpocznij tę procedurę od przygotowania naczynia preparacyjnego wyłożonego Sardą. Najpierw przymocuj podkładki do suwaka za pomocą smaru.

Następnie dodaj płynną darń do środka pralki. Sarda zwykle utwardza się przez noc i tworzy małe okrągłe łoże na szklanym szkiełku, które staje się podstawą naczynia preparacyjnego. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na szkiełku, należy umieścić szkiełko w komorze rejestracyjnej, aby służyło jako podstawa do sekcji.

Następnie przygotuj wymagane roztwory. Roztwory zewnątrzkomórkowe należy pozostawić w temperaturze pokojowej, podczas gdy roztwory wewnątrzkomórkowe powinny być utrzymywane w sterylności. Można również dodać 0,1% luźnego dla żółtego do roztworu wewnątrzkomórkowego, tak aby wizualizacja morfologii komórek M mogła być wykonana na końcu eksperymentu w celu potwierdzenia tożsamości komórki.

Następnie hoduj zarodki danio pręgowanego typu dzikiego w wodzie z jajami w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza, a następnie zbierz i zainscenizuj zgodnie z poprzednią publikacją. W celu przeprowadzenia sekcji należy przenieść zarodki do naczynia sekcyjnego, które służy również jako komora rejestracyjna. Następnie znieczulaj je przez siedem do 10 minut.

W roztworze soli znieczulającej, który jest bardzo zbliżony do soli fizjologicznej, można określić, czy są one odpowiednio znieczulone, badając reakcję na delikatne uszczypnięcie ogona. Następnie przypnij zarodki przez no accord i umieść na misce linii ochronnej SIL za pomocą drutu wolframowego o średnicy 0,001 cala pod mikroskopem preparacyjnym o 25-krotnym powiększeniu. Dostosuj powiększenie lunety do preparacji na 40 do 50 x, aby przeprowadzić sekcję.

Teraz usuń szczękę, oczy i przodomózgowie za pomocą cienkiej pary kleszczy. Delikatnie oderwij tyłomózgowie od leżącego poniżej rdzenia węzłowego, ostrożnie przesuwając kleszcze między rdzeniem węzłowym a mózgiem. Następnie delikatnie odwróć tylną część mózgu tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry.

Takie umiejscowienie zapewnia dobry dostęp do komórek M, które zwykle znajdują się w odległości od 5 do 10 mikrometrów od powierzchni brzusznej u młodych zarodków i od 20 do 50 mikrometrów u starszych larw. Następnie ostrożnie przenieś preparat do konfiguracji nagrywania, w której można przeprowadzić eksperyment z zaciskiem krosowym. Komórki M są wizualizowane z różnicowym kontrastem interferencyjnym, chociaż inne tryby obrazowania mogą być również używane do przygotowania do zaciskania łat

Zacznij od wyciągnięcia kilku pipet CLA z cienkościennym szkłem krzemianowym. W przypadku pipety ciągnionej poziomo średnica końcówki wynosi około 0,2 do 0,4 mikrometra po wypolerowaniu ogniowym do gładkiej krawędzi, a stożek trzpienia ma długość około czterech milimetrów. Napełnij końcówkę pipety roztworem wewnątrzkomórkowym, zanurzając końcówkę w płynie wewnątrzkomórkowym.

Następnie wprowadzić igłę strzykawki do pipety i delikatnie usunąć roztwór wewnątrzkomórkowy ze strzykawki. Aby zakończyć napełnianie pipety, przymocuj pipetę do stopnia głowicy wzmacniacza W ustawieniach elektrofizjologii ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45 stopni do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia dla pipety, który jest odpowiedni do tworzenia uszczelek o wysokiej odporności z otworem w ich komórce tuż przed opuszczeniem pipety do roztworu kąpieli, Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki. Kontynuuj zbliżanie się do celi M z niewielką ilością dodatniego ciśnienia w pipecie.

Nadciśnienie delikatnie popycha komórkę z boku na bok, a po umieszczeniu bezpośrednio nad komórką tworzy mały wgłębienie w błonie komórkowej. Teraz pozostaw pipetę na miejscu na kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, aby można było uzyskać mocne uszczelnienie między pipetą a membraną. Następnie zwolnij nadciśnienie w pipecie, aby zainicjować uszczelnienie.

Niewielka ilość podciśnienia w połączeniu z ujemnym potencjałem pipet powoduje, że w ciągu kilku sekund tworzą się giga uszczelnienia. Następnie zmień potencjał podtrzymania we wzmacniaczu na minus 60 miliwoltów. Rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania.

Następnie natychmiast rejestruj potencjały membranowe i minimalizuj artefakty pojemności. Skompensuj pojemność ogniwa i rezystancję dostępu o 70 do 85%Rezystancja dostępu powinna być monitorowana co 30 sekund do minuty, a jeśli nastąpi zmiana o 20% lub więcej, przerwij eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu i zebraniu wystarczającej ilości danych, poświęć zarodek, usuwając tylną część mózgu za pomocą kleszczy.

Rysunek ten przedstawia reprezentatywne zapisy pobudzających prądów receptora A MPA i NMDA uzyskanych z 48 zarodków HPF. Oto spontaniczne PSC A MPA, ME zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymywania minus 60 miliwoltów. A to jest średnia ME PSC.

Oto spontaniczne PSC A MPA i NMDA me zarejestrowane z komórki M o potencjale utrzymywania 40 miliwoltów. I to jest średnia ME PSC glutaminianu me PSC zarejestrowano w obecności jednego mikromolowego TTX w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, pięciu mikromolowych ścisłych dziewięciu i 100 mikromolowych rytoksyn w celu zablokowania występowania glicyny i G. Oto spontaniczne PSC MI zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymywania minus 60 miliwoltów.

A średnie PSC MI MI PSC zarejestrowano w obecności jednego mikromolowego TTX w celu zablokowania potencjałów czynnościowych. Jeden milimolowy kwas chimeryczny blokuje aktywność receptora glutaminianu i 10 mikromolowych kwasu Qing blokuje występowanie GABA. Są to potencjały czynnościowe zarejestrowane z komórki M w tej konkretnej komórce.

Bodziec progowy o natężeniu 0,48 nanoampera wywołał kilka potencjałów czynnościowych, ale bodziec do progu powoduje tylko wytworzenie pojedynczego potencjału czynnościowego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak załatać zapis zaciskowy z komórek M i innych siatkowatych neuronów rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.