Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

- Zacznij od umieszczenia komory rejestracyjnej zawierającej próbkę w roztworze kąpieli, którego skład odpowiada fizjologicznemu środowisku zewnątrzkomórkowemu lub cytoplazmie, na stoliku mikroskopowym. Przesuń mikropipetę rejestrującą, pipetę zawierającą srebrną elektrodę skąpaną w roztworze elektrolitu, która naśladuje warunki wewnątrzkomórkowe, w kierunku neuronu poprzez zastosowanie dodatniego ciśnienia i nawiąż kontakt z błoną komórkową.

Delikatnie przełącz ciśnienie z dodatniego na ujemne, aby uzyskać szczelne uszczelnienie między membraną a pipetą. Ustaw potencjał podtrzymania na amplifier, aby utrzymać ogniwo na stałym napięciu. Następnie rozerwać błonę komórkową w mikropipecie, stosując odsysanie.

Gdy błona komórkowa pęknie, potencjał zatrzymujący powoduje przepływ jonów przez kanały jonowe bramkowane napięciem, tworząc potencjał błonowy, który jest rejestrowany przez elektrodę rejestrującą. Natychmiast zarejestruj potencjał błony. Elektroda rejestrująca przekazuje sygnał do wzmacniacza sprzężenia zwrotnego, który odejmuje potencjał membrany od potencjału podtrzymującego - oscyloskopu, który przedstawia wizualny obraz potencjału membrany, oraz komputera. W poniższym protokole wykonamy pomiar klamry krosowej na komórce Mauthnera w zarodku danio pręgowanego.

- Aby przygotować się do zaciskania krosowego, zacznij od wyciągnięcia kilku pipet z zaciskiem krosowym z cienkościennym szkłem borokrzemianowym w poziomym ściągaczu. Średnice końcówek pipet wynoszą około 0,2 do 0,4 mikrometra po wypolerowaniu ogniowym do gładkiej krawędzi, a stożek trzpienia ma około 4 milimetry długości.

Napełnij końcówkę pipety roztworem wewnątrzkomórkowym, zanurzając końcówkę w płynie wewnątrzkomórkowym. Następnie włóż igłę strzykawki do pipety i delikatnie usuń roztwór wewnątrzkomórkowy ze strzykawki, aby zakończyć napełnianie pipety. Podłącz pipetę do amplifier głowica stage w konfiguracji elektrofizjologii. Ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45 stopni do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia dla pipety, który jest odpowiedni do tworzenia uszczelek o wysokiej rezystancji za pomocą kuwety Mauthnera.

Tuż przed opuszczeniem pipety do roztworu kąpieli należy zastosować niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki. Kontynuuj zbliżanie się do komórki M z niewielką ilością dodatniego ciśnienia w pipecie. Nadciśnienie delikatnie popycha komórkę z boku na bok, a po umieszczeniu bezpośrednio nad komórką tworzy mały wgłębienie na błonie komórkowej.

Teraz pozostaw pipetę na miejscu na kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, aby można było uzyskać mocne uszczelnienie między pipetą a membraną. Następnie zwolnij nadciśnienie w pipecie, aby zainicjować uszczelnienie. Niewielkie podciśnienie w połączeniu z ujemnym potencjałem pipet powoduje, że w ciągu kilku sekund tworzą się gigaomowe uszczelki.

Następnie zmień potencjał podtrzymania we wzmacniaczu na minus 60 miliwoltów. Rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania. Następnie natychmiast rejestruj potencjały membranowe i minimalizuj artefakty pojemności. Kompensacja pojemności ogniwa i rezystancji dostępu od 70% do 85%.

Opór dostępu powinien być monitorowany co 30 sekund do minuty, a jeśli nastąpi zmiana o 20% lub więcej, przerwij eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu i zebraniu wystarczającej ilości danych, poświęć zarodek, usuwając tyłomózgowie za pomocą kleszczy.