Name: Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Poznaj metodę analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroprzepływowego chipu z powłoką przeciwciałową. Technika umożliwia ilościowe oznaczanie białek wewnątrzkomórkowych przy użyciu fluorescencyjnych testów immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Tomowi Robinsonowi za korektę manuskryptu, C. Bärtschiemu i H. Benzowi za zbudowanie specjalnie zbudowanego systemu kontroli ciśnienia. Chcielibyśmy również podziękować za korzystanie z obiektu clean room FIRST i Centrum Mikroskopii Świetlnej (LMC), oba na Politechnice Federalnej w Zurychu. Prace zostały sfinansowane przez Merck Serono i Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach 7 Programu Ramowego (ERC Starting Grant, nr projektu 203428, nμLIPIDs).

1. Główna produkcja SU-8
Przygotuj obie główne formy dla kanałów (fluidic i control, schematy i wymiary patrz Rysunek 2) z następującym protokołem, ale z różnymi wzorami masek. Proces ten przedstawiono na rysunku 3a.
<ol>
	<li>Zacznij od podgrzania 4-calowej płytki krzemowej przez 10 minut w temperaturze 180 °C. Załaduj odwodnioną płytkę do maszyny do powlekania i użyj następującego protokołu do powlekania wirowego SU-8 2015:
	<ol>
		<li>Wirować wafel z prędkością 100 obr./min przez 20 sekund (otworzyć pokrywę wirówki, na tym etapie dozować SU-8, po dozowaniu zamknąć pokrywę).</li>
		<li>Wiruj wafel z prędkością 500 obr./min przez 10 sekund (spowoduje to rozprowadzenie oporu na całej płytce).</li>
		<li>Wiruj wafel z prędkością 1 750 obr./min przez 30 sekund (określa wysokość rezystu do 20 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń opór z krawędzi płytki za pomocą acetonu (użyj wacika), ponieważ w przeciwnym razie przyklei się on do płyty grzejnej w następnym kroku. Przenieś wafel na płytę grzejną w temperaturze 95 °C i podgrzewaj przez 4 minuty. Po miękkim wypieku naświetl rezystor przez fotomaskę przyklejoną taśmą do szkła sodalimowego w wyrównywaczu maski ze światłem UV (150 mJ/cm2, mierzone przy 365 nm).</li>
	<li>Po ekspozycji ponownie podgrzej wafel w temperaturze 95 °C przez 5 minut na płycie grzejnej. Schłodź wafel do temperatury RT, a następnie zanurz go w kąpieli wywoływacza SU-8 na 4 minuty. Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć nienaświetlony SU-8. Umyj wafel izopropanolem klasy do pomieszczeń czystych i wysusz suszarką z azotem. Sprawdź pod mikroskopem, czy rozwój się powiódł (zwłaszcza pułapki komórkowe). Jeśli pułapki komórkowe są całkowicie rozwinięte, odbicie płytki krzemowej powinno być widoczne. W razie potrzeby ponownie rozwijaj wafel przez kilka minut.</li>
	<li>Piecz wafel w piekarniku przez 2 godziny w temperaturze 180 °C, aby usunąć wszystkie pozostałości rozpuszczalnika. Sprawdź wysokość kanałów za pomocą profilera schodkowego. Jeśli wysokość różni się od żądanej, powtórz ten protokół, zaczynając od kroku 1.1 z nową płytką i zmień prędkość wirowania (krok 1.1.3). Zakończ wytwarzanie formy wzorcowej, silanizując płytkę za pomocą 1H,1H,2H,2H-perfluorodecylo-dimetylochloro-silanu w eksykatorze przez noc.</li>
</ol>
2. Mistrzowska produkcja dla druku mikrokontaktowego
<ol>
	<li>W celu przygotowania form wzorcowych do druku mikrokontaktowego, należy odwodnić płytkę silikonową przez 10 minut w temperaturze 180 °C. Na tę płytkę należy nałożyć 1 ml HDMS z prędkością 7 500 obr./min przez 30 sekund (rezystor lepiej przylega do silanizowanej powierzchni). Przędzić 2 ml dodatniego rezystu AZ1518 z tym protokołem:
	<ol>
		<li>Statyczne dozowanie rezystu na płytkę.</li>
		<li>Wiruj wafel przez 5 sekund z prędkością 500 obr./min.</li>
		<li>Wiruj wafel przez 60 sekund z prędkością 4000 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 50-sekundowym miękkim pieczeniu w temperaturze 100 °C na płycie grzejnej, wystaw rezystor na działanie światła UV (21 mJ/cm2 przy 365 nm) przez fotomaskę i na wyrównywacz maski. Rozwinąć rezystor w kąpieli AZ 726 przez 75 sekund. Opłukać rozwinięty wafel wodą DI i wysuszyć suszarką z azotem. Usunąć pozostałości rozpuszczalnika, ogrzewając wafel w temperaturze 115 °C przez 50 sekund. Sylanizuj wafel w próżni przez noc.</li>
</ol>
3. Produkcja chipa mikroprzepływowego
Do tych eksperymentów używany jest dwuwarstwowy projekt urządzenia. Obie warstwy są przygotowywane oddzielnie i łączone ze sobą, zanim chip zostanie ostatecznie przyklejony do szkiełka podstawowego (rysunek 3b). Ten krok opisuje produkcję warstw PDMS i stempla PDMS do druku mikrokontaktowego.
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę PDMS i utwardzacza w proporcji 10:1. Przygotuj w sumie około 80 g PDMS (korzystając z naszych projektów, da to 10 chipsów). Energicznie wymieszaj obie części i odgazuj PDMS, aż mieszanina będzie pozbawiona pęcherzyków (~30 min).</li>
	<li>Umieść wafel z warstwą kontrolną wewnątrz szalki Petriego i przyklej go do dna. Następnie wlej ~50 g PDMS na wierzch i wstaw wafel na co najmniej 2 godziny do piekarnika w temperaturze 80 °C, aby zapewnić całkowite utwardzenie PDMS. Powtórz tę samą procedurę dla mikrokontaktowej płytki drukarskiej, do tego potrzebne jest ~20 g PDMS.</li>
	<li>Powlekanie PDMS na płytce warstwą fluidyczną z prędkością obrotową 2 000 obr./min, aby utworzyć warstwę PDMS o wysokości około 40 μm. Utwardzać PDMS w piekarniku przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 80 °C.</li>
	<li>Po utwardzeniu obu części usuń warstwę kontrolną z wafla i pokrój na kawałki żyletką. Przebić otwory przyłączy ciśnieniowych za pomocą dziurkacza do biopsji 1 mm. Do przechowywania zaleca się nałożenie kawałka taśmy na kanały.</li>
	<li>Aby połączyć dwie warstwy, weź powlekaną wirowo płytkę i górną część i umieść je w czyszczalni plazmowej23. Po obróbce plazmowej szybko wyrównaj obie części pod mikroskopem z dużą odległością roboczą. Dodaj trochę zapasowego PDMS wokół umieszczonych górnych części. Ten krok nie jest obowiązkowy, jednak ułatwia usunięcie PDMS z płytki. Umieść wafel w piekarniku nagrzanym do 80 °C na co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby ostrożnie usunąć PDMS z płytki i przeciąć mikroczipy. Przebić otwory dostępowe do połączeń płynowych za pomocą dziurkacza do biopsji 1,5 mm.</li>
	<li>Chip PDMS jest teraz gotowy i może być przechowywany przez wiele miesięcy. Opcjonalnie: Jeśli chip jest używany ze zbiornikiem, odetnij górną część końcówki pipety o pojemności 200 μl i użyj zapasowej, częściowo utwardzonej PDMS, aby przykleić ją na wierzchu. Włóż frytki ponownie do piekarnika w temperaturze 80 °C na co najmniej 1 godzinę.</li>
</ol>
4. Klejenie do szkiełka
Aby użyć urządzenia do bezpośrednich testów enzymatycznych, jedynym krokiem wymaganym po klejeniu jest zablokowanie powierzchni. W przypadku tego protokołu przejdź do punktu A. Jednakże, aby użyć chipa mikroprzepływowego do testów immunologicznych lub ELISA, należy zapoznać się z protokołem B, aby ograniczyć miejsca wiązania tylko do szkiełka podstawowego (tj. w przypadku mikroskopii TIRF lub SPR). Jeśli to ograniczenie nie jest ważne, zapoznaj się z A, ale użyj biotynylowanych koniugatów w kroku 4.3 i kontynuuj krok 4.8 w protokole B, aby stworzyć w pełni funkcjonalną powierzchnię.
Przed wykonaniem protokołu A i B: Zaleca się przefiltrowanie wszystkich użytych roztworów białkowych przed wprowadzeniem ich do chipa. Szczątki i agregaty białkowe mogą w przeciwnym razie blokować pułapki komórkowe, zmniejszając w ten sposób liczbę komór, które można wykorzystać do analizy. W tym celu należy użyć niebiałkowej jednostki filtrującej adsorpcję, aby przefiltrować wszystkie roztwory przed wprowadzeniem ich do kanałów.
Protokół A (testy enzymatyczne)
<ol>
	<li>Aby sfinalizować urządzenie mikroprzepływowe, przymocuj części PDMS do szkiełka podstawowego. Aby to zrobić, najpierw wyczyść szklane szkiełko mydłem, wodą destylowaną i etanolem. Osuszyć szkiełko za pomocą strumienia azotu. Wyczyść część PDMS taśmą klejącą.</li>
	<li>Włóż część PDMS i oczyszczone szkło do myjki plazmowej na 45 sekund przy 18 W. Aby zapewnić ścisłe wiązanie, umieść wiór na płycie grzejnej (100 °C) na 5 minut.</li>
	<li>Po sklejeniu napełnij chip płynami. Łatwym sposobem na osiągnięcie tego celu jest użycie siły odśrodkowej. Odetnij dolną część końcówki pipety o pojemności 200 μl. W przypadku kanałów płynowych należy je wypełnić roztworem blokującym (albumina surowicy bydlęcej (4% w/v) lub poli-L-lizyna) szczepionym glikolem polietylenowym (0,05% w/v) i umieścić końcówki we wlotach. Napełnić wloty warstwy kontrolnej wodą lub roztworem izosmotycznym, np. PBS. Umieść wiór w wirówce (800 x g) na 5 minut. Kanały powinny być teraz całkowicie wypełnione płynem. Jeśli nie, powtórz ten krok.</li>
	<li>Inkubować roztwór blokujący przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Wypłukać roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS z szybkością przepływu 10 μl/min za pomocą pompy strzykawkowej. Urządzenie jest teraz gotowe do eksperymentów z komórkami.</li>
</ol>
Protokół B (testy immunologiczne)
Pełny przegląd modyfikacji powierzchni od kroku 4.7 wzwyż, proszę zapoznać się z Tabelą 1.
<ol start="5">
	<li>Inkubować stemple PDMS do drukowania mikrokontaktowego z roztworem bBSA/BSA (np. 1-100). Po 30 minutach należy dokładnie oczyścić stemple wodą destylowaną i wysuszyć stempel pod strumieniem azotu. Szybko umieść stemple na oczyszczonym szkiełku podstawowym (Rysunek 4).</li>
	<li>Szklane szkiełko ze stemplem należy wystawić wraz z górną częścią chipa mikroprzepływowego na działanie plazmy tlenowej przez 45 sekund przy maksymalnej mocy (18 W) w myjce plazmowej. Po obróbce plazmowej usuń stempel i wyrównaj zadrukowaną powierzchnię pod mikrokomorami urządzenia. Umieść frytki na 30 minut na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Aby zablokować pozostałą powierzchnię, wprowadź sterylnie przefiltrowany roztwór BSA (4% (w/v) w PBS) do chipa za pomocą wirówki (patrz krok 4.2). Inkubować przez 1 godzinę i wypłukać roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS (patrz krok 4.3). Chip może być następnie używany bezpośrednio lub przechowywany przez okres do 2 tygodni w temperaturze 4 °C w wilgotnym pudełku.</li>
	<li>Aby uzyskać w pełni funkcjonalną powierzchnię wiążącą, wprowadź awidynę (0,025% (w/v) w PBS) do zbiornika. Użyć natężenia przepływu 5 μl/min przez 30 minut, aby pobrać roztwór awidyny przez kanały płynu. Następnie spłukiwać PBS przez 10 minut. Dokładnie wypłucz zbiornik.</li>
	<li>Następnie dodaj białko G (0,0025% (w/v) w PBS) i spłukuj przez kolejne 30 minut. Następnie myj PBS przez kolejne 10 minut. Następnie dodaj interesujące Cię przeciwciało (0,0001% (w/v) w PBS) przez 10 minut. Po 10 minutach zatrzymaj przepływ na 15 minut, aby umożliwić wiązanie. Następnie myj PBS przez 10 minut.</li>
</ol>
5. Eksperymenty komórkowe
Protokół jest napisany ogólnie ze względu na różnorodność możliwych testów. Jako przykład podano odczynniki potrzebne do oznaczenia toksyczności G6PDH. Początkowa skuteczność wychwytywania komórek przez urządzenie wynosi około 2,5%, co oznacza, że 5 z 200 komórek zostanie uwięzionych. Ostateczne zajęcie pułapek komórkowych silnie zależy od użytej linii komórkowej, protokołu zawieszenia linii komórkowej i czasu przepłukiwania komórek przez kanał. W przypadku komórek naturalnie rosnących w zawiesinie (takich jak U937), pojedyncze komórki można znaleźć w około 75% komór po kilku minutach. Pozostałe komory albo nie są wypełnione, albo są zajęte przez dwie lub więcej komórek. Ogólnie rzecz biorąc, zajętość pojedynczej komórki jest mniejsza w przypadku przylegających linii komórkowych. W przypadku zastosowania przedstawionego tutaj dość łagodnego protokołu zawieszania, odsetek ten spada do około 30% (komórki HEK, MLT). Zajętość pojedynczych komórek można poprawić poprzez leczenie komórek trypsyną, ale może to również zmienić wyniki eksperymentów.
W zależności od docelowej cząsteczki, adsorpcja lub absorpcja do PDMS może mieć wpływ na wyniki. Adsorpcję można zmniejszyć, blokując powierzchnie za pomocą BSA lub PLL-g-PEG. Wchłanianie jest mało prawdopodobne w przypadku większości hydrofilowych biomolekuł, ale należy je sprawdzić pod kątem (małych) lipofilowych składników komórkowych.
<ol>
	<li>Przygotuj komórki zgodnie z określonym protokołem (np. dodawanie leku). W przypadku komórek zawiesinowych dodaj komórki bezpośrednio do chipa. W przypadku adhezyjnych linii komórkowych należy użyć bezenzymatycznego buforu dysocjacyjnego do wytworzenia zawiesiny komórkowej. Przefiltruj komórki przed wprowadzeniem ich do chipa, aby zmniejszyć liczbę klastrów komórek.</li>
	<li>Załaduj komórki do chipa za pomocą pompy strzykawkowej i przepływu do przodu, zamiast wycofywać zawiesinę ogniw. Stosować natężenie przepływu 5 μl/min dla linii komórek zawiesinowych i wyższe natężenie przepływu 10-20 μl/min dla komórek adhezyjnych, aby zmniejszyć niespecyficzne przyleganie komórek do ścianek kanału.</li>
	<li>Gdy pułapki zostaną napełnione, zamknij komory. Jeśli wiele komórek przylega niespecyficznie do powierzchni, spróbuj zmyć je buforem dysocjacyjnym komórek o natężeniu przepływu 10-30 μl/min.</li>
</ol>
Protokół A (testy enzymatyczne)
<ol start="4">
	<li>Wycofaj bufor lizy przez chip. W tym przykładzie ten bufor jest buforem hipoosmolarnym z dodanym Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v/v) Tween 20). W przypadku lizy należy szybko otwierać i zamykać komory (tj. 500 ms dla natężeń przepływu 10-50 μl/min 7,21). Do testu G6PDH dodać 2 mM glukozo-6-fosforanu, 0,5 mM NADP, 0,5 U/ml diaforazy i 0,3 mM rezazuryny do buforu do lizy. Rozpocznij monitorowanie reakcji kinetycznej natychmiast po lizie.</li>
</ol>
Uwaga: Wybierz dowolny bufor, który jest odpowiedni do testu, jednak pamiętaj, że silne detergenty (takie jak Triton, SDS) natychmiast powodują lizę komórek i doprowadzą do utraty analitu podczas otwierania komory.
Protokół B (testy immunologiczne)
Krótki opis eksperymentów z komórkami ELISA (natężenia przepływu, stan komory, itp.), proszę znaleźć w Tabeli 1.
<ol start="5">
	<li>W przypadku testu ELISA należy dodać wymagany odczynnik do wykrywania (np. przeciwciało drugorzędowe, antygen znakowany) bezpośrednio do buforu do lizy. Dodana animacja 20 zmniejsza niespecyficzną adsorpcję. Poddać komórki lizie zgodnie z krokiem 5.4. Inkubować mieszaninę przez 10-15 minut, aby umożliwić wiązanie (czas inkubacji zależy od użytego antygenu i przeciwciała).</li>
	<li>Koniugaty enzymatyczne przeciwciał, które niespecyficznie adsorbują się na ściankach kanału, mogą prowadzić do konwersji odczynnika detekcyjnego znajdującego się już w zbiorniku i kanałach. Aby zmniejszyć problemy związane z tą adsorpcją, należy przepłukać stały inhibitor użytego enzymu detekcyjnego przez chip w czasie inkubacji (komory zamknięte, przed dodaniem odczynnika wykrywającego). W przypadku HRP należy użyć 20 mM HCl w wodzie, aby trwale dezaktywować niespecyficznie zaadsorbowane enzymy.</li>
	<li>Po czasie inkubacji wprowadzić do chipa odczynnik detekcyjny (np. Amplex Red i nadtlenek wodoru do HRP). Ponownie krótko otworzyć komory, aby zmyć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe i dodać odczynnik wykrywający. Natychmiast rozpocznij monitorowanie reakcji kinetycznej.</li>
	<li>Kalibracja: Unieruchomić przeciwciało przeciwko obiektowi zainteresowania. Zamknij komory. Przygotuj różne stężenia analitu w buforze lub w lizacie komórkowym poza chipem. Nałóż stężenie na chip i szybko wymień objętość wewnątrz komór (czas otwarcia 500 ms). Ten czas otwarcia jest wystarczająco krótki, aby zapewnić, że w wyniku płukania analitu nie dojdzie do dodatkowej akumulacji i wykryta zostanie tylko określona liczba cząsteczek z objętości mikrokomory. Na podstawie znanego stężenia antygenu wewnątrz roztworu i objętości komory (625 pl) oblicz ilość wewnątrz komory. Następnie przejdź do kroku 5.5 i wprowadź ugrupowanie wykrywające.</li>
</ol>

<ol><li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li>
<li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells%3A+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).</li>
<li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity%2C+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li>
<li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li>
<li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li>
<li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Technologia mikrofluidyczna otworzyła nowe i fascynujące możliwości analizy pojedynczych komórek. W szczególności możliwość wychwytywania i unieruchamiania pojedynczych komórek za pomocą narzędzi mikroprzepływowych umożliwiła systematyczne krótko- i długoterminowe badania nad właściwościami i reakcją pojedynczych komórek. Dodatkowo, enkapsulacja komórek w mikrokropelkach o wysokiej częstotliwości, generowanych na mikrochipie, umożliwiła badania wydzielania pojedynczych komórek, których nie można przeprowadzić za pomocą k...

Wiele badań w przeszłości ujawniło różnice między komórkami w dużej populacji komórek1-3, w szczególności procesy sygnalizacyjne4, lub ilości wewnątrzkomórkowych biomolekuł, takich jak białka5,6, metabolity i kofaktory7,8. Uważa się, że te niejednorodności mają fundamentalne znaczenie dla adaptacji i ewolucji komórek9, ale odgrywają również kluczową rolę w powstawaniu i leczeniu chorób takich jak rak10-13. Dlatego badania na poziomie pojedynczych komórek cieszą się dużym zainteresowaniem w badaniach biologicznych i farmakologicznych, zwłaszcza jeśli badania te ujawniają różne reakcje komórek po leczeniu bioaktywnymi substancjami chemicznymi.
W ostatnich latach powstało wiele platform analitycznych, które ułatwiają analizę pojedynczych żywych komórek lub składu chemicznego zawartości komórek. Podczas gdy sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest złotym standardem w bardzo wysokoprzepustowej analizie pojedynczych żywych komórek, metoda ta nie może być stosowana do ilościowego oznaczania związków wewnątrzkomórkowych lub wydzielanych. Pojawienie się platform mikroprzepływowych dało nadzieję na opracowanie nowych strategii analitycznych w zakresie pozycjonowania, leczenia i obserwacji pojedynczych komórek. Kamień milowy w dziedzinie mikrofluidyki został osiągnięty dzięki integracji elastycznych zaworów PDMS zrealizowanej przez Quake'a i współpracowników14,15. Zawory te są przydatne, ponieważ mogą izolować regiony na chipie, np. oddzielać dwie kultury 16. Ponadto mają one szczególne zastosowanie do analizy pojedynczych komórek, a tym samym pomagają zmniejszyć problemy z rozcieńczaniem analitu. Moc tego podejścia do analizy pojedynczych komórek została niedawno zademonstrowana przez Hansena i współpracowników, którzy przeanalizowali ekspresję genów z setek pojedynczych komórek równolegle17.
Gdy skupiasz się na białkach i metabolitach, analiza jest bardzo trudna ze względu na brak odpowiednich metod amplifikacji, dużą liczbę różnych obecnych związków i ich różnice w naturze chemicznej. Ponadto oczekuje się, że większość biomolekuł wewnątrzkomórkowych będzie obecna w małej liczbie kopii rzędu kilku dziesięciu tysięcy18, stąd zastosowana metoda analityczna musi charakteryzować się wysoką czułością. Bardziej zaawansowane testy, takie jak testy immunologiczne i testy immunologiczne sprzężone z enzymami (ELISA), są trudne do zintegrowania z urządzeniami mikroprzepływowymi, ponieważ wymagają kilku etapów mycia i inkubacji, a także unieruchomienia powierzchni.
Ze względu na te wyzwania, nie jest zaskakujące, że zgłoszono tylko kilka przykładów, w których białka lub metabolity zostały określone ilościowo na poziomie pojedynczej komórki. Na przykład badania nad wydzielaniem związków fluorescencyjnych zostały opisane19,20. Niedawno przedstawiono implementację testu ELISA do analizy wydzielanych (niefluorescencyjnych) białek z hodowli komórkowej (komórki THP-1)21 i pojedynczych komórek (immunologicznych)10. Koncentrując się na białkach wewnątrzkomórkowych, Shi i in. opracowali urządzenie mikroprzepływowe, które ułatwiło identyfikację białek wewnątrzkomórkowych do analizy szlaków sygnałowych w komórkach nowotworowych za pomocą testu immunologicznego11. Jednak określono tylko względne ilości białek i nie zastosowano amplifikacji enzymatycznej w celu zwiększenia sygnału dla białek o niskiej obfitości.
Ostatnio udało nam się połączyć mikrourządzenie do wychwytywania pojedynczych komórek z testami fluorescencyjnymi8 i testami immunologicznymi22 (Rysunek 1). Komórki są pasywnie uwięzione w mikrorozmiarach strukturach barierowych, które umożliwiają dostarczanie i (szybką) wymianę pożywki i innych środków chemicznych bez żadnego ruchu komórek. Zawór w kształcie pierścienia wokół każdej pułapki umożliwia odizolowanie komórki w bardzo małej objętości ("mikrokomora"). Zastawka ta jest uruchamiana natychmiast po wprowadzeniu buforu lizującego komórki (hipoosmolarnego), zapobiegając w ten sposób dyfuzji cząsteczek wewnątrzkomórkowych lub wydzielanych cząsteczek. Co najważniejsze, ze względu na mały rozmiar objętości (625 pl) unika się dużego rozcieńczenia cząsteczek. Ponadto, ponieważ liza i analiza są przeprowadzane w tej samej pozycji w chipie, nie ma strat analitów w wyniku transportu. Opisana tutaj konstrukcja chipa składa się z 8 naprzemiennych rzędów po 7 lub 8 mikrokomór, co daje łącznie 60 mikrokomór. Komory są uruchamiane w rzędach, tak aby wykluczyć zanieczyszczenie krzyżowe wzdłuż linii.
Platforma może być używana w połączeniu z testami fluorescencyjnymi, jak również immunologicznymi (Rysunek 1d). Dla tych ostatnich ustaliliśmy protokoły immobilizacji przeciwciał, które są kompatybilne z procesem produkcji i montażu chipów. W związku z tym platforma otwiera drogę do czułych, wiarygodnych i wymiernych testów na poziomie pojedynczej komórki. Do tej pory używaliśmy tego urządzenia do analizy enzymów wewnątrzkomórkowych i wydzielanych (względna kwantyfikacja za pomocą testów enzymatycznych), kofaktorów wewnątrzkomórkowych, białek i małych cząsteczek (bezwzględna kwantyfikacja za pomocą testów końcowych lub ELISA). Poniżej opisano proces wytwarzania chipów za pomocą wielowarstwowej miękkiej litografii oraz protokoły modelowania przeciwciał za pomocą druku mikrokontaktowego i chemii powierzchni. Dodatkowo podano kilka przykładów użycia i operacji na chipach.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa firmy odczynnikowej</td> Numer <td></td><td>katalogowy</td><td>Komentarze (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>n.a.1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl-dimetylochloro-silan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-metylolumbelliferyl &beta;-D-N,N&prime;-diacetylchitobiozyd</td><td>hydrat Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Niemcy)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Niemcy)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 developer</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Niemcy)</td><td>n.d.</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Bufor dysocjacyjny komórek</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Heksametyldisilazan (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Niemcy)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Niemcy)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG szczepiony</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Szwajcaria)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>biotyna szczepiona</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, Szwajcaria)</td><td>n.d.Chlorek</td><td></td></tr> <tr><td>potasu</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Białko G, biotyna</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Si-Mat (Kaufering, Niemcy)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminomom</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nazwa materiału</td> Numer <td>katalogowy firmy</td><td></td><td>Komentarze (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy PES</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 1/1,5 mm</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Filtr komórkowy Trics 20 i mikro; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Płyta</td><td></td></tr> <tr><td>grzejna HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Saksofon, Szwajcaria</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>wyrównywacz maski</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>Mikroskop AZ100M</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, Wielka Brytania</td><td>n.d</td><td></td></tr>. <tr><td>Myjka plazmowa PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Powlekarka</td><td></td></tr> <tr><td>wirowa Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Moduły</td><td></td></tr> <tr><td>wirujące SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Szwajcaria</td><td>b.d.Profiler</td><td></td></tr> <tr><td>krokowy Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.Pompa</td><td></td></tr> <tr><td>strzykawkowa mesys</td><td>Cetoni</td><td>n.d.</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia ilościowe określanie wewnątrzkomórkowych biomolekuł w wielu pojedynczych komórkach równolegle. W tym celu komórki są pasywnie uwięzione w środku mikrokomory. Po aktywacji warstwy kontrolnej komórka jest izolowana od otaczającej objętości w małej komorze. Otaczająca objętość może być następnie wymieniana bez wpływu na izolowaną komórkę. Jednak po krótkim otwarciu i zamknięciu komory, roztwór w komorze może zostać wymieniony w ciągu kilkuset milisekund. Ze względu na odwracalność komór, komórki mogą być wystawiane na działanie różnych roztworów sekwencyjnie w wysoce kontrolowany sposób, np. w celu inkubacji, mycia i wreszcie lizy komórek. Szczelnie zamknięte mikrokomory umożliwiają zatrzymanie lizatu, minimalizują i kontrolują rozcieńczenie po lizie komórek. Ponieważ liza i analiza zachodzą w tym samym miejscu, zachowana jest wysoka czułość, ponieważ podczas transportu nie dochodzi do dalszego rozcieńczania lub utraty analitów. Konstrukcja mikrokomory umożliwia zatem wiarygodną i powtarzalną analizę bardzo małej liczby kopii cząsteczek wewnątrzkomórkowych (attomole, zeptomole) uwalnianych z pojedynczych komórek. Co więcej, wiele mikrokomór można ułożyć w formacie matrycy, co pozwala na analizę wielu komórek jednocześnie, pod warunkiem, że do monitorowania używane są odpowiednie instrumenty optyczne. Wykorzystaliśmy już platformę do badań potwierdzających słuszność koncepcji w celu analizy białek wewnątrzkomórkowych, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników w sposób względny lub bezwzględnie wymierny.

Nasza platforma umożliwia analizę różnych cząsteczek wewnątrzkomórkowych, a także wydzielanych, obecnych w pojedynczych komórkach lub przez nie produkowanych. W tej części chcielibyśmy przedstawić różne przykładowe badania, aby podkreślić różnorodność możliwych analiz. Przedstawimy przykład enzymu wydzielanego (Rycina 5a), enzymu wewnątrzkomórkowego (Rycina 5b) oraz białka (Ryciny 5c i d). Po więcej przykładów, takich jak kofaktory lub małe cząsteczki, p...

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza lizatów pojedynczych komórek z wykorzystaniem fluorescencji lub testów immunoologicznych. Realizuje się to poprzez wcześniejsze stworzenie urządzenia mikrofluidycznego i pokrycie wewnętrznej komory przeciwciałami. Następnie pojedyncze komórki są unieruchamiane w pułapkach, a w drugim kroku poddawane działaniu różnych odczynników w celu stymulacji odpowiedzi komórkowej.Pierścieniowy zawór zostaje szybko zamknięty, a następnie przez urządzenie przepływa bufor lizujący. Pierścieniowy zawór zostaje otwarty na krótki czas, co powoduje lizę komórek wewnątrz mikrokomory, umożliwiając uwolnionym białkom wiązanie się z przeciwciałami w wysokim stężeniu ze względu na małą objętość. Następnie pierścieniowy zawór zostaje otwarty.Komora zostaje przemyta, a do zamkniętej mikrokomory wprowadza się odczynniki detekcyjne. Wzrost intensywności fluorescencji jest monitorowany w czasie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego; wyniki demonstrują zdolność tego systemu do ilościowego i niezawodnego wykrywania interesującego anality uwalnianego z poszczególnych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie analizy pojedynczych komórek.W szczególności pozwoliło to na systematyczne badania odpowiedzi komórkowej na zmiany w środowisku chemicznym. Możemy zaobserwować zwiększenie lub zmniejszenie poziomu cząsteczek wewnątrzkomórkowych w wyniku bodźca chemicznego. Technika ta oferuje dwie główne zalety.Po pierwsze, możemy wystawić unieruchomione komórki na określone środowisko chemiczne, które jest stałe lub zmienia się okresowo. Po drugie, możemy przeprowadzić wysokoczułą i swoistą analizę stanu bez ryzyka kontaminacji krzyżowej lub utraty analitów podczas transportu. Aby rozpocząć, należy wykonać trzy różne matryce z SU-8, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Jedną warstwę wykorzysta się do stworzenia warstwy płynowej, drugą do warstwy kontrolnej, a trzecią do mikrostempla kontaktowego. Następnie należy wykonać chipy mikroprzepływowe, zaczynając od przygotowania mieszaniny PDMS i czynnika sieciującego w stosunku 10:1. Energicznie wymieszać obie części i odgazować roztwór przez 30 minut lub do momentu, aż mieszanina będzie pozbawiona pęcherzyków powietrza.Następnie umieść wafele z warstwą kontrolną w szalce Petriego i przyklej je taśmą do dna. Wlej na wierzch około 50 g PDMS, aby utworzyć warstwę o grubości od czterech do pięciu milimetrów, a następnie umieść wafele w piekarniku w temperaturze 80 °C na co najmniej dwie godziny, aby zapewnić całkowite utwardzenie PDMS. Powtórz tę samą procedurę dla wafla do mikrokontaktu, używając jednak około 20 g PDMS zamiast 50 g, co pozwoli uzyskać warstwę PDMS o grubości od czterech do pięciu milimetrów.Aby przygotować warstwę dolną, nanieś metodą spin coatingu warstwę PDMS o grubości 40 µm na wafer z warstwą mikrofluidyczną. Proces przeprowadź przy prędkości obrotowej 2000 RPM przez 60 sekund. Po utwardzeniu wszystkich elementów utwardź warstwę PDMS w piecu przez jedną godzinę w temperaturze 80 °C.Usuń warstwę kontrolną z wafla i potnij go na kawałki za pomocą ostrza do żyletki. Następnie wykonaj otwory połączeń ciśnieniowych, używając igły do biopsji o średnicy 1 mm, a kanały zaklej taśmą w celu przechowywania. W dalszej kolejności usuń PDMS z wafla do mikrodopełniania kontaktowego i przygotuj stempla o rozmiarze odpowiadającym powierzchni komory.Przechowywać je w szufladzie, chroniąc przed kurzem do momentu użycia. Następnie umieścić podłoże krzemowe pokryte warstwą naniesioną metodą spin-coatingu oraz warstwę kontrolną o grubości od czterech do pięciu milimetrów w oczyszczaczu plazmowym. Poddać próbki działaniu plazmy tlenowej przy mocy 18 W przez 45 s w ciśnieniu 0,75 mbar.Po obróbce plazmowej szybko wyrównaj obie warstwy pod mikroskopem o dużym dystansie roboczym. Dodaj nieco zapasowego PDMS wokół umieszczonych górnych części, aby ułatwić usuwanie PDMS z wafla. Następnie umieść wafel w piekarniku w temperaturze 80 °C na co najmniej jedną godzinę.Po utwardzeniu należy za pomocą skalpela ostrożnie oddzielić PDMS od wafla i wyciąć mikrochipy oraz wybić otwory dostępowe dla połączeń fluidycznych za pomocą biopsyjnej igły o średnicy 1,5 millimeter. Dodatkowo należy stworzyć zbiornik w mikrochipie, odcinając górną część końcówki pipety o pojemności 200 microliter i wykorzystując niewielką ilość częściowo utwardzonego PDMS. Należy przykleić go na górze.Następnie utwardzaj chip w piekarniku w temperaturze 80 °C przez co najmniej jedną godzinę. Rozpocznij od oczyszczenia szkiełka przedmiotowego oraz elementów z PDMS. Umyj szkiełko przedmiotowe przy użyciu mydła.Opłucz go wodą destylowaną, a następnie ponownie etanolem. Osusz szkiełko strumieniem azotu. Użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i cząsteczki kurzu z PDMS.Następnie umieść element z PDMS oraz oczyszczone szkło w urządzeniu do czyszczenia plazmowego na 45 sekund przy mocy 18 W, aby zapewnić szczelne połączenie. Po obróbce plazmą umieść chip na płycie grzejnej na pięć minut. Po związaniu odetnij dolną część kilku końcówek do pipety o pojemności 200 µL. Napełnij je od 10 do 15 µL przefiltrowanego PBS z dodatkiem 4% BSA i umieść w wlotach urządzenia.Następnie należy użyć odciętych końcówek z dodanymi 10–15 µL PBS i umieścić je w kanałach kontrolnych. Dalej, należy umieścić chipy w wirówce i wirować je przy 800 ×g przez pięć minut, aby wypełnić kanały cieczą. Jeśli w którymkolwiek z kanałów pozostanie powietrze, należy powtórzyć ten krok aż do całkowitego wypełnienia kanałów.Inkubuj roztwór blokujący przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wypłucz roztwór z warstwy płynnej za pomocą PBS przy szybkości przepływu 10 µL/min. Po zastosowaniu pompy strzykawki urządzenie jest gotowe do eksperymentów komórkowych; aby przygotować szkiełko przedmiotowe do immunoanaliz, inkubuj stemple do mikrodo druku kontaktowego z PDMS w 0,5% biotinylowanej BSA w czystej płytce Petriego.Po pół godzinie dokładnie i szybko oczyść stempla wodą destylowaną, a następnie osusz go strumieniem azotu. Po wyschnięciu szybko umieść stempel na oczyszczonym szkiełku przedmiotowym, aby nanieść wzór biotynilowanego BSA. Nie przesuwaj stempla po jego umieszczeniu i upewnij się, że stempel styka się z szkiełkiem.Jeśli stempel nie przylega ściśle, należy go delikatnie uderzyć, unikając jednak silnego nacisku. Następnie umieścić stempel wraz z górną częścią chipu mikrofluidycznego w komorze plazmowej i poddać działaniu plazmy tlenowej o mocy 18 watts przez 45 sekund. Po zakończeniu obróbki plazmą zdjąć stempel z szkiełka przedmiotowego.Oddychanie na powierzchnię sprawi, że wzór stanie się widoczny. Dopasuj mikrokomory do nadrukowanej powierzchni. Po dopasowaniu umieść chip na płycie grzewczej w temperaturze 50 °C przez 30 minut, aby zablokować pozostałą powierzchnię, wprowadź do chipa 4% sterylnie filtrowany roztwór BSA w PBS za pomocą wirówki, jak pokazano wcześniej, inkubuj mikrochip przez co najmniej 30 minut, a następnie wypłucz roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS przy szybkości przepływu 10 µL/min.Używając pompy strzykawkowej, należy zastosować chip bezpośrednio po otrzymaniu lub przechowywany do dwóch tygodni w temperaturze 4 °C w wilgotnym pojemniku. Następnie, tworząc w pełni funkcjonalną powierzchnię wiążącą, wprowadź avadon w PBS do zbiornika. Przepłucz układ roztworem, aby przeciągnąć avadon przez kanały płynowe.Dokładnie wypłucz zbiornik i przemyj kanały roztworem PBS. Następnie dodaj proteinę G do zbiornika i przeciągnij ją przez kanały. Usuń nadmiar proteiny G, płucząc zbiornik i chip roztworem PBS.Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało do zbiornika i przeprowadź je przez kanały. Potem zatrzymaj przepływ, aby umożliwić wiązanie, a następnie przemyj kanały buforem PBS; w celu sprawdzenia jakości procesu drukowania przed wprowadzeniem komórek do kanałów można zastosować analogi znakowane fluorescencyjnie. Zbierz przywarte komórki, takie jak przedstawione tutaj komórki HE 2 9 3, używając buforu do dysocjacji bez enzymów, a następnie przefiltruj je w celu zmniejszenia liczby skupisk komórkowych. Po przefiltrowaniu wprowadź je do strzykawki.Przy stężeniu 300 000 komórek na mililitr, wprowadź komórki na chip, stosując przepływ w kierunku w przód za pomocą pompy strzykawkowej przez około trzy minuty z szybkością od 10 do 20 µL/min. W przypadku komórek adhezyjnych, takich jak te, należy postąpić w ten sposób, aby zapobiec nieswoistemu przywieraniu komórek podczas wypełniania pułapek. Następnie zamknij komory, przykładowo poprzez przyłożenie ciśnienia 3 barów do górnej warstwy. Po tym czasie obejrzyj komory pod mikroskopem. Jeśli stwierdzisz, że wiele komórek przywarło nieswoiście do powierzchni wewnątrz komór, szybko je otwórz i spróbuj wypłukać je buforem do dysocjacji komórek przy szybkości przepływu od 10 do 30 µL/min.W celu przeprowadzenia testu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PDH), do buforu lizującego należy dodać 2 mM glukozo-6-fosforanu, 0,5 mM NADP, 0,5 U/mL G6PDH oraz 0,3 mM RN i upewnić się, że roztwór został dobrze wymieszany. Po oczyszczeniu kanałów należy przepuścić bufor lizujący G6PDH przez chip z prędkością przepływu 30 µL/min. Podczas przepływu buforu lizującego należy szybko otwierać i zamykać komory, pozostawiając je otwarte przez 500 ms, aby umożliwić wniknięcie lizatu do komory, a bezpośrednio po rozpoczęciu lizy należy rozpocząć monitorowanie kinetyki reakcji.W tym przykładzie można monitorować produkt fluorescencyjny w czasie. Przedstawiono tutaj układ komór wypełnionych pomarańczowym barwnikiem spożywczym, które następnie zamknięto poprzez zwiększenie ciśnienia w warstwie sterującej nad mikrokomorami. Po zamknięciu komór przez kanały przepłukano zielony barwnik spożywczy, aby wykazać szczelność komór.Każda komora zawiera objętość zaledwie 625 picoliters cieczy, co pozwala utrzymać stężenie cząsteczek uwalnianych z lizowanych komórek na poziomie wystarczającym do przeprowadzenia analizy. Ponadto zawory mogą być otwierane i zamykane w sposób eliminujący kontaminację krzyżową między komorami. Wewnątrz tych komór możliwe jest pomiar analitytów, takich jak ilość lizosomów uwolnionych z pojedynczej komórki U 9 37 aktywowanej PMA, ponieważ katalizują one enzymatycznie produkcję fluorescencyjnej cząsteczki wewnątrz komory.Zielone linie przedstawiają zmianę intensywności fluorescencji w czasie dla komór zajętych przez jedną komórkę. Przedstawiono również intensywność fluorescencji dla komory bez komórek, oznaczoną czarną przerywaną linią. Dla porównania, badanie to pokazuje wpływ toksycznej cząsteczki na integralność błony poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego enzymu G6PDH.Czarna linia reprezentuje próbki kontrolne bez wpływu toksycznego, natomiast pomarańczowa linia reprezentuje komórki poddane działaniu pokazanej toksyny. Oto przykład immunoodkrywania dla białka wewnątrzkomórkowego. Przeciwciała anty-GFP zostały unieruchomione na powierzchni, a po lizie komórek kinetyka wiązania białek GFP została zwizualizowana za pomocą mikroskopii TIRF.Czas 0,1 oznacza moment dodania buforu do lizy; w czasie 0,2 GFP zaczyna gromadzić się na powierzchni, co oznacza, że nastąpiła liza komórek i GFP przemieściło się dyfuzyjnie na powierzchnię. Wiązanie GFP z przeciwciałami kończy się w czasie 0,3. W tym ostatnim przykładzie uwolniona GA DH związała się z przeciwciałami wychwytującymi na powierzchni, a następnie dodano przeciwciała detekcyjne sprzężone z HRP.Po wypłukaniu wszystkich niezwiązanych przeciwciał detekcyjnych wprowadzono odczynnik detekcyjny i przeprowadzono reakcję w określonym czasie. Poniżej przedstawiono porównanie ilości wcześniej wewnątrzkomórkowego GA DH w próbkach zwierzęcych pomiędzy komórkami U 9 37 i HEC 2 93, zmierzone przy użyciu tej metody. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania chipów mikroprzepływowych, modyfikacji powierzchni w celu umożliwienia przeprowadzenia immunoanaliz oraz końcowego zastosowania urządzenia do analizy pojedynczych komórek.Metodę tę można zastosować w celu udzielenia odpowiedzi na wiele kluczowych pytań w dziedzinie biologii pojedynczych komórek.

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikropłytka przepływowa do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Urządzenia milifluidyczne są wykorzystywane do kontrolowanej syntezy nanomateriałów, czasowo-rozdzielczej analizy mechanizmów reakcji i katalizy ciągłego przepływu.

Millifluidyka do syntezy chemicznej i czasowo-rozdzielczych badań mechanistycznych

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Prezentujemy dyskretny system wprowadzania próbek kropel do spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS). Opiera się na tanim i jednorazowym chipie mikroprzepływowym, który generuje wysoce monodyspersyjne kropelki w zakresie wielkości 40−60 μm przy częstotliwościach od 90 do 7 000 Hz.

Układ mikroprzepływowy do próbki ICPMS Wprowadzenie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj metodę analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroprzepływowego chipu z powłoką przeciwciałową. Technika umożliwia ilościowe oznaczanie białek wewnątrzkomórkowych przy użyciu fluorescencyjnych testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów