Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza lizatów pojedynczych komórek z wykorzystaniem fluorescencji lub testów immunoologicznych. Realizuje się to poprzez wcześniejsze stworzenie urządzenia mikrofluidycznego i pokrycie wewnętrznej komory przeciwciałami. Następnie pojedyncze komórki są unieruchamiane w pułapkach, a w drugim kroku poddawane działaniu różnych odczynników w celu stymulacji odpowiedzi komórkowej.

Pierścieniowy zawór zostaje szybko zamknięty, a następnie przez urządzenie przepływa bufor lizujący. Pierścieniowy zawór zostaje otwarty na krótki czas, co powoduje lizę komórek wewnątrz mikrokomory, umożliwiając uwolnionym białkom wiązanie się z przeciwciałami w wysokim stężeniu ze względu na małą objętość. Następnie pierścieniowy zawór zostaje otwarty.

Komora zostaje przemyta, a do zamkniętej mikrokomory wprowadza się odczynniki detekcyjne. Wzrost intensywności fluorescencji jest monitorowany w czasie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego; wyniki demonstrują zdolność tego systemu do ilościowego i niezawodnego wykrywania interesującego anality uwalnianego z poszczególnych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie analizy pojedynczych komórek.

W szczególności pozwoliło to na systematyczne badania odpowiedzi komórkowej na zmiany w środowisku chemicznym. Możemy zaobserwować zwiększenie lub zmniejszenie poziomu cząsteczek wewnątrzkomórkowych w wyniku bodźca chemicznego. Technika ta oferuje dwie główne zalety.

Po pierwsze, możemy wystawić unieruchomione komórki na określone środowisko chemiczne, które jest stałe lub zmienia się okresowo. Po drugie, możemy przeprowadzić wysokoczułą i swoistą analizę stanu bez ryzyka kontaminacji krzyżowej lub utraty analitów podczas transportu. Aby rozpocząć, należy wykonać trzy różne matryce z SU-8, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Jedną warstwę wykorzysta się do stworzenia warstwy płynowej, drugą do warstwy kontrolnej, a trzecią do mikrostempla kontaktowego. Następnie należy wykonać chipy mikroprzepływowe, zaczynając od przygotowania mieszaniny PDMS i czynnika sieciującego w stosunku 10:1. Energicznie wymieszać obie części i odgazować roztwór przez 30 minut lub do momentu, aż mieszanina będzie pozbawiona pęcherzyków powietrza.

Następnie umieść wafele z warstwą kontrolną w szalce Petriego i przyklej je taśmą do dna. Wlej na wierzch około 50 g PDMS, aby utworzyć warstwę o grubości od czterech do pięciu milimetrów, a następnie umieść wafele w piekarniku w temperaturze 80 °C na co najmniej dwie godziny, aby zapewnić całkowite utwardzenie PDMS. Powtórz tę samą procedurę dla wafla do mikrokontaktu, używając jednak około 20 g PDMS zamiast 50 g, co pozwoli uzyskać warstwę PDMS o grubości od czterech do pięciu milimetrów.

Aby przygotować warstwę dolną, nanieś metodą spin coatingu warstwę PDMS o grubości 40 µm na wafer z warstwą mikrofluidyczną. Proces przeprowadź przy prędkości obrotowej 2000 RPM przez 60 sekund. Po utwardzeniu wszystkich elementów utwardź warstwę PDMS w piecu przez jedną godzinę w temperaturze 80 °C.

Usuń warstwę kontrolną z wafla i potnij go na kawałki za pomocą ostrza do żyletki. Następnie wykonaj otwory połączeń ciśnieniowych, używając igły do biopsji o średnicy 1 mm, a kanały zaklej taśmą w celu przechowywania. W dalszej kolejności usuń PDMS z wafla do mikrodopełniania kontaktowego i przygotuj stempla o rozmiarze odpowiadającym powierzchni komory.

Przechowywać je w szufladzie, chroniąc przed kurzem do momentu użycia. Następnie umieścić podłoże krzemowe pokryte warstwą naniesioną metodą spin-coatingu oraz warstwę kontrolną o grubości od czterech do pięciu milimetrów w oczyszczaczu plazmowym. Poddać próbki działaniu plazmy tlenowej przy mocy 18 W przez 45 s w ciśnieniu 0,75 mbar.

Po obróbce plazmowej szybko wyrównaj obie warstwy pod mikroskopem o dużym dystansie roboczym. Dodaj nieco zapasowego PDMS wokół umieszczonych górnych części, aby ułatwić usuwanie PDMS z wafla. Następnie umieść wafel w piekarniku w temperaturze 80 °C na co najmniej jedną godzinę.

Po utwardzeniu należy za pomocą skalpela ostrożnie oddzielić PDMS od wafla i wyciąć mikrochipy oraz wybić otwory dostępowe dla połączeń fluidycznych za pomocą biopsyjnej igły o średnicy 1,5 millimeter. Dodatkowo należy stworzyć zbiornik w mikrochipie, odcinając górną część końcówki pipety o pojemności 200 microliter i wykorzystując niewielką ilość częściowo utwardzonego PDMS. Należy przykleić go na górze.

Następnie utwardzaj chip w piekarniku w temperaturze 80 °C przez co najmniej jedną godzinę. Rozpocznij od oczyszczenia szkiełka przedmiotowego oraz elementów z PDMS. Umyj szkiełko przedmiotowe przy użyciu mydła.

Opłucz go wodą destylowaną, a następnie ponownie etanolem. Osusz szkiełko strumieniem azotu. Użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i cząsteczki kurzu z PDMS.

Następnie umieść element z PDMS oraz oczyszczone szkło w urządzeniu do czyszczenia plazmowego na 45 sekund przy mocy 18 W, aby zapewnić szczelne połączenie. Po obróbce plazmą umieść chip na płycie grzejnej na pięć minut. Po związaniu odetnij dolną część kilku końcówek do pipety o pojemności 200 µL. Napełnij je od 10 do 15 µL przefiltrowanego PBS z dodatkiem 4% BSA i umieść w wlotach urządzenia.

Następnie należy użyć odciętych końcówek z dodanymi 10–15 µL PBS i umieścić je w kanałach kontrolnych. Dalej, należy umieścić chipy w wirówce i wirować je przy 800 ×g przez pięć minut, aby wypełnić kanały cieczą. Jeśli w którymkolwiek z kanałów pozostanie powietrze, należy powtórzyć ten krok aż do całkowitego wypełnienia kanałów.

Inkubuj roztwór blokujący przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wypłucz roztwór z warstwy płynnej za pomocą PBS przy szybkości przepływu 10 µL/min. Po zastosowaniu pompy strzykawki urządzenie jest gotowe do eksperymentów komórkowych; aby przygotować szkiełko przedmiotowe do immunoanaliz, inkubuj stemple do mikrodo druku kontaktowego z PDMS w 0,5% biotinylowanej BSA w czystej płytce Petriego.

Po pół godzinie dokładnie i szybko oczyść stempla wodą destylowaną, a następnie osusz go strumieniem azotu. Po wyschnięciu szybko umieść stempel na oczyszczonym szkiełku przedmiotowym, aby nanieść wzór biotynilowanego BSA. Nie przesuwaj stempla po jego umieszczeniu i upewnij się, że stempel styka się z szkiełkiem.

Jeśli stempel nie przylega ściśle, należy go delikatnie uderzyć, unikając jednak silnego nacisku. Następnie umieścić stempel wraz z górną częścią chipu mikrofluidycznego w komorze plazmowej i poddać działaniu plazmy tlenowej o mocy 18 watts przez 45 sekund. Po zakończeniu obróbki plazmą zdjąć stempel z szkiełka przedmiotowego.

Oddychanie na powierzchnię sprawi, że wzór stanie się widoczny. Dopasuj mikrokomory do nadrukowanej powierzchni. Po dopasowaniu umieść chip na płycie grzewczej w temperaturze 50 °C przez 30 minut, aby zablokować pozostałą powierzchnię, wprowadź do chipa 4% sterylnie filtrowany roztwór BSA w PBS za pomocą wirówki, jak pokazano wcześniej, inkubuj mikrochip przez co najmniej 30 minut, a następnie wypłucz roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS przy szybkości przepływu 10 µL/min.

Używając pompy strzykawkowej, należy zastosować chip bezpośrednio po otrzymaniu lub przechowywany do dwóch tygodni w temperaturze 4 °C w wilgotnym pojemniku. Następnie, tworząc w pełni funkcjonalną powierzchnię wiążącą, wprowadź avadon w PBS do zbiornika. Przepłucz układ roztworem, aby przeciągnąć avadon przez kanały płynowe.

Dokładnie wypłucz zbiornik i przemyj kanały roztworem PBS. Następnie dodaj proteinę G do zbiornika i przeciągnij ją przez kanały. Usuń nadmiar proteiny G, płucząc zbiornik i chip roztworem PBS.

Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało do zbiornika i przeprowadź je przez kanały. Potem zatrzymaj przepływ, aby umożliwić wiązanie, a następnie przemyj kanały buforem PBS; w celu sprawdzenia jakości procesu drukowania przed wprowadzeniem komórek do kanałów można zastosować analogi znakowane fluorescencyjnie. Zbierz przywarte komórki, takie jak przedstawione tutaj komórki HE 2 9 3, używając buforu do dysocjacji bez enzymów, a następnie przefiltruj je w celu zmniejszenia liczby skupisk komórkowych. Po przefiltrowaniu wprowadź je do strzykawki.

Przy stężeniu 300 000 komórek na mililitr, wprowadź komórki na chip, stosując przepływ w kierunku w przód za pomocą pompy strzykawkowej przez około trzy minuty z szybkością od 10 do 20 µL/min. W przypadku komórek adhezyjnych, takich jak te, należy postąpić w ten sposób, aby zapobiec nieswoistemu przywieraniu komórek podczas wypełniania pułapek. Następnie zamknij komory, przykładowo poprzez przyłożenie ciśnienia 3 barów do górnej warstwy. Po tym czasie obejrzyj komory pod mikroskopem. Jeśli stwierdzisz, że wiele komórek przywarło nieswoiście do powierzchni wewnątrz komór, szybko je otwórz i spróbuj wypłukać je buforem do dysocjacji komórek przy szybkości przepływu od 10 do 30 µL/min.

W celu przeprowadzenia testu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PDH), do buforu lizującego należy dodać 2 mM glukozo-6-fosforanu, 0,5 mM NADP, 0,5 U/mL G6PDH oraz 0,3 mM RN i upewnić się, że roztwór został dobrze wymieszany. Po oczyszczeniu kanałów należy przepuścić bufor lizujący G6PDH przez chip z prędkością przepływu 30 µL/min. Podczas przepływu buforu lizującego należy szybko otwierać i zamykać komory, pozostawiając je otwarte przez 500 ms, aby umożliwić wniknięcie lizatu do komory, a bezpośrednio po rozpoczęciu lizy należy rozpocząć monitorowanie kinetyki reakcji.

W tym przykładzie można monitorować produkt fluorescencyjny w czasie. Przedstawiono tutaj układ komór wypełnionych pomarańczowym barwnikiem spożywczym, które następnie zamknięto poprzez zwiększenie ciśnienia w warstwie sterującej nad mikrokomorami. Po zamknięciu komór przez kanały przepłukano zielony barwnik spożywczy, aby wykazać szczelność komór.

Każda komora zawiera objętość zaledwie 625 picoliters cieczy, co pozwala utrzymać stężenie cząsteczek uwalnianych z lizowanych komórek na poziomie wystarczającym do przeprowadzenia analizy. Ponadto zawory mogą być otwierane i zamykane w sposób eliminujący kontaminację krzyżową między komorami. Wewnątrz tych komór możliwe jest pomiar analitytów, takich jak ilość lizosomów uwolnionych z pojedynczej komórki U 9 37 aktywowanej PMA, ponieważ katalizują one enzymatycznie produkcję fluorescencyjnej cząsteczki wewnątrz komory.

Zielone linie przedstawiają zmianę intensywności fluorescencji w czasie dla komór zajętych przez jedną komórkę. Przedstawiono również intensywność fluorescencji dla komory bez komórek, oznaczoną czarną przerywaną linią. Dla porównania, badanie to pokazuje wpływ toksycznej cząsteczki na integralność błony poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego enzymu G6PDH.

Czarna linia reprezentuje próbki kontrolne bez wpływu toksycznego, natomiast pomarańczowa linia reprezentuje komórki poddane działaniu pokazanej toksyny. Oto przykład immunoodkrywania dla białka wewnątrzkomórkowego. Przeciwciała anty-GFP zostały unieruchomione na powierzchni, a po lizie komórek kinetyka wiązania białek GFP została zwizualizowana za pomocą mikroskopii TIRF.

Czas 0,1 oznacza moment dodania buforu do lizy; w czasie 0,2 GFP zaczyna gromadzić się na powierzchni, co oznacza, że nastąpiła liza komórek i GFP przemieściło się dyfuzyjnie na powierzchnię. Wiązanie GFP z przeciwciałami kończy się w czasie 0,3. W tym ostatnim przykładzie uwolniona GA DH związała się z przeciwciałami wychwytującymi na powierzchni, a następnie dodano przeciwciała detekcyjne sprzężone z HRP.

Po wypłukaniu wszystkich niezwiązanych przeciwciał detekcyjnych wprowadzono odczynnik detekcyjny i przeprowadzono reakcję w określonym czasie. Poniżej przedstawiono porównanie ilości wcześniej wewnątrzkomórkowego GA DH w próbkach zwierzęcych pomiędzy komórkami U 9 37 i HEC 2 93, zmierzone przy użyciu tej metody. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przygotowania chipów mikroprzepływowych, modyfikacji powierzchni w celu umożliwienia przeprowadzenia immunoanaliz oraz końcowego zastosowania urządzenia do analizy pojedynczych komórek.

Metodę tę można zastosować w celu udzielenia odpowiedzi na wiele kluczowych pytań w dziedzinie biologii pojedynczych komórek.