Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza lizatów pojedynczych komórek za pomocą testów fluorescencyjnych lub immunologicznych. Osiąga się to poprzez stworzenie najpierw urządzenia mikroprzepływowego i pokrycie wewnętrznej komory przeciwciałami. Następnie pojedyncze komórki są unieruchamiane w pułapkach i poddawane działaniu różnych odczynników w celu pobudzenia odpowiedzi komórkowej w drugim etapie.

Zawór pierścieniowy jest szybko zamykany, a bufor do lizy przepływa przez urządzenie. Zastawka w kształcie pierścienia jest otwierana na krótki czas, a komórki są poddawane lizie w mikrokomorze, co pozwala uwolnionym białkom wiązać się z przeciwciałami w wysokim stężeniu ze względu na małą objętość. Następnie otwiera się zawór w kształcie pierścienia.

Komora jest myta, a odczynniki detekcyjne wprowadzane są do zamkniętej mikrokomory. Wzrost intensywności fluorescencji jest monitorowany w czasie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyniki pokazują zdolność tego systemu do ilościowego i wiarygodnego wykrywania interesującego analitu uwalnianego z pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie analizy pojedynczych komórek A.

W szczególności prowadzono systematyczne badania nad reakcją komórek na zmiany w środowisku chemicznym. Możemy zaobserwować regulację cząsteczek wewnątrzkomórkowych w górę lub w dół w wyniku bodźca chemicznego. Istnieją dwie główne zalety tej techniki.

Pierwszym z nich jest to, że możemy wystawić unieruchomione komórki na działanie określonego środowiska chemicznego, które jest stałe lub okresowo się zmienia. Po drugie, możemy zreformować bardzo czułą i specyficzną analizę stanu bez żadnego zanieczyszczenia krzyżowego lub utraty analitów w wyniku transportu. Aby rozpocząć wytwarzanie trzech różnych płytek wzorcowych SU, należy je wyprodukować, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Jeden zostanie użyty do stworzenia warstwy fluidycznej, jeden do warstwy kontrolnej, a trzeci do stempla mikrokontaktowego. Następnie wyprodukuj chipy mikroprzepływowe, zaczynając od przygotowania mieszaniny PDMS i utwardzacza w proporcji 10 do jednego. Energicznie wymieszaj obie części i odgazowuj roztwór przez 30 minut lub do momentu, gdy mieszanina będzie pozbawiona pęcherzyków.

Następnie umieść wafel w warstwie kontrolnej wewnątrz szalki Petriego i przyklej go do dna. Wlej około 50 gramów PDMS na wierzch, aby utworzyć warstwę o grubości od czterech do pięciu milimetrów i umieść wafel na co najmniej dwie godziny w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby zapewnić całkowite utwardzenie PDMS. Powtórz tę samą procedurę dla płytki do drukowania mikrokontaktowego, ale użyj około 20 gramów PDMS zamiast 50, co daje warstwę PDMS o grubości od czterech do pięciu milimetrów.

Aby przygotować dolną warstwę, należy obtoczyć warstwę PDMS o grubości 40 mikronów na płytce warstwą mikroprzepływową. Przy użyciu prędkości obrotowej 2000 obr./min przez 60 sekund. Utwardź warstwę PDMS w piekarniku przez godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza, gdy wszystkie części się utwardzą.

Usuń warstwę kontrolną z wafla i pokrój ją na kawałki za pomocą żyletki. Następnie przebij otwory połączeń ciśnieniowych za pomocą jednomilimetrowego nakłucia biopsyjnego i przykryj kanały taśmą do przechowywania. Następnie wyjmij PDMS znad płytki drukarskiej mikrokontaktowej i przygotuj stemple o wielkości powierzchni komory.

Przechowuj je bez kurzu w szufladzie do czasu użycia. Następnie umieść wafel pokryty wirowaniem i warstwę kontrolną o grubości od czterech do pięciu milimetrów w czyszczalni plazmowej. Wystaw kawałki na 18 watów przez 45 sekund za pomocą plazmy tlenowej o ciśnieniu 0,75 milibara.

Po obróbce plazmowej szybko wyrównaj obie warstwy pod mikroskopem z dużą odległością roboczą. Dodaj trochę zapasowego PDMS wokół umieszczonych górnych części, aby ułatwić usunięcie PDMS z płytki. Następnie wstaw wafel do piekarnika nagrzanego do 80 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę.

Po utwardzeniu użyj skalpela, aby ostrożnie usunąć PDMS z płytki i wyciąć otwory dostępu do mikroczipów dla połączeń płynowych za pomocą 1,5-milimetrowego nakłucia biopsyjnego. Dodatkowo utwórz zbiornik w mikrochipie, przecinając górną część końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i używając zapasowego częściowo utwardzonego PDMS. Przyklej go na górze.

Następnie utwardź frytkę w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Zacznij od wyczyszczenia szkiełka i części PDMS. Wyczyść szklane szkiełko mydłem.

Opłucz go wodą destylowaną, a następnie ponownie etanolem. Osuszyć szkiełko za pomocą strumienia azotu. Użyj taśmy, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i cząsteczki kurzu z PDMS.

Następnie umieść część PDMS i oczyszczoną szybę. Wsuń do myjki plazmowej na 45 sekund przy mocy 18 watów, aby zapewnić ścisłe wiązanie, umieść chip na gorącej płycie na pięć minut po obróbce plazmowej Po klejeniu odetnij dolną część kilku końcówek pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Napełnij je 10 do 15 mikrolitrami przefiltrowanego PBS z 4% BSA i umieść je we wlotach urządzenia.

Następnie użyj ściętych końcówek z dodatkiem 10 do 15 mikrolitrów PBS i umieść je w kanałach kontrolnych. Następnie umieść wióry w wirówce i obracaj je pod kątem 800-krotności grawitacji przez pięć minut, aby napełnić kanały płynem. Jeśli w którymkolwiek z kanałów pozostanie powietrze, powtarzaj ten krok, aż kanały zostaną całkowicie wypełnione.

Inkubować roztwór blokujący przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wypłukać roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS z prędkością przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Za pomocą pompy strzykawkowej urządzenie jest teraz gotowe do eksperymentów komórkowych w celu wstępnego wydrukowania szklanego szkiełka do testów immunologicznych, inkubacji stempli do drukowania mikrokontaktowego PDMS z 0,5% biotynylowanym BSA na czystej szalce Petriego.

Po pół godzinie dokładnie i szybko wyczyść stemple wodą destylowaną i wysusz stempel pod strumieniem azotu. Po wyschnięciu szybko umieść stemple na oczyszczonym szkiełku, aby zdeponować wzorzyste biotynylowane BSA. Nie przesuwaj stempla po umieszczeniu i sprawdź, czy stempel styka się ze szkiełkiem.

Jeśli nie nieznacznie, dotknij stempla, ale nie dociskaj mocno. Następnie umieść stempel wraz z górną częścią chipa mikroprzepływowego w komorze plazmowej i wystawiaj je na działanie plazmy tlenowej o mocy 18 watów przez 45 sekund. Po obróbce plazmowej usunąć stempel ze szkiełka.

Oddychanie na powierzchni sprawi, że wzór będzie widoczny. Wyrównaj mikrokomory na wierzchu zadrukowanej powierzchni. Po wyrównaniu umieść chip na gorącej płycie w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 30 minut, aby zablokować pozostałą powierzchnię, wprowadź 4% sterylny przefiltrowany roztwór BSA w PBS do chipa za pomocą wirówki, jak pokazano wcześniej, inkubuj mikrochip przez co najmniej 30 minut, a następnie wypłucz roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS z prędkością przepływu 10 mikrolitrów na minutę.

Za pomocą pompy strzykawkowej użyj chipa bezpośrednio lub przechowuj go przez okres do dwóch tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnym pudełku. Następnie należy stworzyć w pełni funkcjonalną powierzchnię wiążącą, wprowadzając do zbiornika awadon w PBS. Przelej roztwór, aby następnie wciągnąć awadon przez kanały płynu.

Dokładnie wypłucz zbiornik i przepłucz kanały PBS. Następnie dodaj białko G do zbiornika i przeciągnij je przez kanały. Wypłucz nadmiar białka G, przepłukując zbiornik i chip PBS.

Następnie dodaj interesujące Cię przeciwciało do zbiornika i przepuść je przez kanały. Następnie zatrzymaj przepływ, aby umożliwić wiązanie przed umyciem kanałów fluorescencyjnym PBS, oznakowane analogi można użyć do sprawdzenia jakości procesu drukowania przed wprowadzeniem komórek do kanałów. Zbierz przylegające komórki, takie jak pokazane tutaj komórki HE 2 9 3, używając buforu dysocjacyjnego wolnego od enzymów, a następnie przefiltruj je, aby zmniejszyć liczbę klastrów komórek po przefiltrowaniu, załaduj je do strzykawki.

Przy 300 000 komórek na mililitr załaduj komórki na chip za pomocą przepływu do przodu na pompie strzykawkowej przez około trzy minuty z szybkością od 10 do 20 mikrolitrów na minutę w przypadku komórek adhezyjnych, takich jak te, aby zapobiec niespecyficznemu przyczepianiu się komórek po napełnieniu pułapek, zamknij komory, zwiększając ciśnienie w górnej warstwie za pomocą trzech prętów. Następnie zbadaj komory za pomocą mikroskopu. Jeśli okaże się, że wiele komórek niespecyficznie przylega do powierzchni wewnątrz komór, szybko je otwórz i spróbuj zmyć je buforem dysocjacyjnym komórek o natężeniu przepływu od 10 do 30 mikrolitrów na minutę.

W przypadku dehydrogenazy glukozowo-sześciofosforanowej lub testu G six PDH dodać dwie milimolowe glukozy, sześć 0,5 milimolowych i DP 0,5 jednostki na mililitr DIA i 0,3 milimolowego RIN do buforu do lizy i upewnić się, że jest dobrze wymieszany. Po oczyszczeniu kanałów przeciągnąć bufor do lizy G six PDH przez chip z natężeniem przepływu 30 mikrolitrów na minutę. Gdy bufor do lizy przepływa, szybko otwieraj i zamykaj komory, pozostawiając je otwarte przez 500 milisekund, aby liza mogła dostać się do komory natychmiast po rozpoczęciu lizy, aby monitorować reakcję kinetyczną.

W tym przykładzie produkt fluorescencyjny może być monitorowany w czasie. Pokazany tutaj jest szereg komór, które zostały wypełnione pomarańczowym barwnikiem spożywczym, a następnie zamknięte przez ciśnienie w warstwie kontrolnej nad mikrokomorami. Po zamknięciu komory przez kanały przepłukano zielony barwnik spożywczy, aby pokazać szczelność komór.

Każda komora zawiera objętość zaledwie 625 pikolitrów płynu, który utrzymuje stężenie cząsteczek uwalnianych z komórek lys wystarczająco wysokie do analizy. Ponadto zawory mogą być otwierane i zamykane w taki sposób, aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe między komorami. W tych komorach możliwy jest pomiar analitów, takich jak ilość lizosomu uwalnianego z pojedynczej komórki U 9 37 aktywowanej PMA, ponieważ enzymatycznie katalizuje on produkcję cząsteczki fluorescencji w komorze.

Zielone linie reprezentują zmianę intensywności fluorescencji w czasie dla komór zajmowanych przez jedną komórkę. Pokazano również intensywność fluorescencji dla komory bez komórek reprezentowanej przez czarną przerywaną linię. Dla porównania, test ten pokazuje wpływ toksycznej cząsteczki na integralność błony poprzez pomiar wewnątrzkomórkowego enzymu G six PDH.

linia reprezentuje próbki kontrolne bez wpływu toksycznego, podczas gdy pomarańczowa linia reprezentuje komórki, na które wpływ ma pokazana toksyna. Oto przykład testu immunologicznego dla białka wewnątrzkomórkowego. Przeciwciała GFP anty GFP unieruchomiono na powierzchni, a po lizie komórek kinetykę wiązania białek GFP uwidoczniono za pomocą mikroskopii darniowej.

Czas 0,1 oznacza wprowadzenie buforu do lizy w czasie 0,2 GFP zaczyna gromadzić się na powierzchni, co oznacza, że nastąpiła liza komórek i GFP dyfunduje na powierzchnię. Wiązanie GFP z przeciwciałami zostaje zakończone w czasie 0,3. W tym ostatnim przykładzie uwolniony GA DH związany w celu wychwycenia przeciwciał na powierzchni, a następnie dodano przeciwciała detekcyjne sprzężone z HRP.

Gdy wszystkie niezwiązane przeciwciała detekcyjne zostały wypłukane, wprowadzono odczynnik wykrywający i reakcja przebiegała w czasie. Poniżej przedstawiono porównanie ilości wcześniej wewnątrzkomórkowego GA DH w ilościach zwierzęcych między komórkami U 9 37 i HEC 2 93 mierzonymi tą metodą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować chipy mikroprzepływowe, jak zmodyfikować powierzchnię, aby umożliwić testy immunologiczne i wreszcie, jak używać urządzenia do analizy pojedynczej komórki.

Metoda ta może być zastosowana, aby pomóc odpowiedzieć na wiele pytań w dziedzinie biologii pojedynczej komórki.