Name: Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do ustanawiania kokultur pojedynczych komórek z wysoką wydajnością parowania. Technika ta umożliwia dynamiczną obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z Ministerstwa Nauki i Technologii (105-2628-E-400-001-MY2) oraz program doktorancki z inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, National Chung Hsing University i National Health Research Institutes.

1. Wykonanie formy waflowej metodą miękkiej litografii
UWAGA: Dane dotyczące wzoru maski są dostępne w naszej poprzedniej publikacji14.
<ol>
	<li>Odwodnić 4-calową wafel krzemową w piekarniku o temperaturze 120 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Wiruj 4 g ujemnego fotorezystu SU-8 2 na 4-calowej płytce krzemowej z prędkością 1,000 obr./min przez 30 s, aby utworzyć warstwę o grubości 5 μm (warstwa #1).</li>
	<li>Piecz miękką warstwę #1 na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie przenieś warstwę #1 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 3 minuty.</li>
	<li>Schłodź warstwę #1 do temperatury pokojowej, umieść ją na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównaj z chromowaną fotomaską z warstwy #1 (warstwa miejsca przechwytywania).</li>
	<li>Warstwę #1 naświetlić światłem UV o długości fali 365 nm w dawce 150 mJ/cm2.</li>
	<li>Usuń warstwę #1 z nakładki i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 1 minutę. Przenieś warstwę #1 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 1 minutę.</li>
	<li>Schłodzić warstwę #1 do temperatury pokojowej. Zanurzyć w roztworze octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego w celu zmycia nieusieciowanego fotorezystu na 2 minuty. Delikatnie osusz azotem, aby odsłonić znak wyrównania warstwy #1.</li>
	<li>Przykryj znak wyrównania warstwy #1 taśmą samoprzylepną, obróć 4 g negatywnego fotorezystu SU-8 10 na warstwę #1 z prędkością 1,230 obr./min przez 30 sekund, aby utworzyć warstwę #2 o grubości 25 μm.</li>
	<li>Zdejmij taśmę, delikatnie ułóż warstwę #2 na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie przenieś warstwę #2 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 7 minut.</li>
	<li>Schłodzić warstwę #2 do temperatury pokojowej, umieścić warstwę #2 na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównać chromowaną fotomaskę warstwy #2 (warstwa kanału obejściowego) do znaku wyrównania warstwy #1.</li>
	<li>Nasyć warstwę #2 światłem UV o długości fali 365 nm w dawce 200 mJ/cm2.</li>
	<li>Usuń warstwę #2 z nakładki i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie przenieś warstwę #2 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 3 minuty.</li>
	<li>Schłodzić warstwę #2 do temperatury pokojowej i przykryć znak wyrównania warstwy #1 taśmą klejącą. Przędzić 4 g negatywnego fotorezystu SU-8 2050 na warstwę #2 z prędkością 1,630 obr./min przez 30 s, aby utworzyć warstwę #3 o grubości 100 μm.</li>
	<li>Zdejmij taśmę, delikatnie upiecz warstwę #3 na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie przenieś warstwę #3 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 20 minut.</li>
	<li>Schłodzić warstwę #3 do temperatury pokojowej, umieścić warstwę #3 na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównać chromowaną fotomaskę warstwy #3 (warstwa komory hodowlanej) do znaku wyrównania warstwy #1.</li>
	<li>Wystaw warstwę #3 ze światłem UV o długości fali 365 nm w dawce 240 mJ/cm2.</li>
	<li>Usuń warstwę #3 z nakładki i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 5 minut. Przenieś warstwę #3 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 10 minut.</li>
	<li>Schłodzić warstwę #3 do temperatury pokojowej. Zanurzyć w roztworze octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego w celu wypłukania nieusieciowanego fotorezystu na 10 minut i delikatnie osuszyć gazowym azotem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia PDMS do przechwytywania wielu pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Umieścić formę waflową i naczynie wagowe zawierające 100 μl trichlorosilanu w eksykatorze (tylko do silanizacji) i zastosować podciśnienie (-85 kPa) przez 15 min. 
	UWAGA: Sylianizować powierzchnię wafla za pomocą trichlorosilanu, aby uzyskać hydrofobowe właściwości powierzchni przed odlaniem PDMS, aby można ją było bez wysiłku oderwać od formy PDMS wafla</li>.
	<li>Zatrzymać podciśnienie, a następnie sylianizować formę waflową w eksykatorze (tylko do silanizacji) w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Wymieszać bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10:1. Wlej łącznie 20 g zmieszanego PDMS na foremkę waflową w naczyniu o średnicy 15 cm.</li>
	<li>Umieścić 15-centymetrowe naczynie w eksykatorze i stosować podciśnienie (-85 kPa) przez 1,5 minuty. Następnie wyjąć 15 cm naczynie z eksykatora. Przechowywać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec usuń resztki pęcherzyków powietrza w PDMS za pomocą gazowego azotu.</li>
	<li>Naczynie o średnicy 15 cm wstawić do piekarnika w temperaturze 65 °C na 2-4 godziny, aby utwardziło PDMS.</li>
	<li>Wyjmij replikę PDMS z formy waflowej, a następnie przebij wlot 1,5 mm i wylot 0,5 mm na PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy wewnętrznej 1,5 mm i średnicy wewnętrznej 0,5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Oczyść replikę PDMS i powierzchnię prowadnicy taśmą usuwalną, a następnie potraktuj powierzchnię plazmą tlenową (100 W przez 14 s).</li>
	<li>Ręcznie wyrównaj repliki PDMS z zamkiem i doprowadź je do kontaktu ze sobą.</li>
	<li>Umieść szkiełko PDMS w piekarniku o temperaturze 65 °C na 1 dzień. 
	UWAGA: Trwałe połączenie zamka z repliką PDMS uzyskuje się w celu uformowania urządzenia.</li>
	<li>Zanurzyć urządzenie PDMS w pojemniku wypełnionym solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i umieścić w eksykatorze. Następnie zastosuj podciśnienie (-85 kPa) przez 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieść urządzenie PDMS w kapturze do hodowli komórkowych i sterylizuj urządzenie światłem UV (długość fali światła: 254 nm) przez 30 minut.</li>
	<li>Zastąp bufor urządzenia PDMS pożywką (pożywka podstawowa DMEM-F12 zawierająca 1% antybiotyku i 10% płodowej surowicy bydlęcej) i inkubuj urządzenie PDMS w temperaturze 4 °C przez 1 dzień. Zapobiega to przyleganiu komórek do powierzchni PDMS.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
UWAGA: Typy komórek obejmują ludzkie komórki śródbłonka limfatycznego (LEC), ludzkie komórki OSCC TW2.6 wyrażające shRNA specyficzne dla WNT5B (WNT5B sh4) i kontrolę wektorową (pLKO-GFP), które uzyskano z naszego poprzedniego badania15. Zapoznaj się z naszą poprzednią publikacją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat etapów uprawy.
<ol>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną, gdy komórki osiągną 70-80% zbieżności. Następnie delikatnie umyj komórki trzykrotnie 5 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki DMEM-F12 zawierającej 1 μM barwnika fluorescencyjnego do komórek WNT5B sh4 i pLKO-GFP (użyć pożywki MV2 dla LEC), a następnie inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: LEC barwiono zielonym barwnikiem dioctanu chlorometylofluoresceiny (CMFDA), komórki sh4 WNT5B barwiono niebieskim barwnikiem 7-amino-4-chlorometylokoumaryny (CMAC), a komórki pLKO-GFP barwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym Dil.</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki trzykrotnie 5 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny-EDTA dla LEC).</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 4 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie postukaj w naczynie do hodowli tkankowej, aby przyspieszyć oderwanie komórek.</li>
	<li>Dodaj 4 ml pożywki DMEM-F12, aby zdyspersjonować komórki WNT5B sh4 i pLKO-GFP (w przypadku LEC użyj 3 ml pożywki MV2 i 1 ml roztworu neutralizatora trypsyny). Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 300 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki DMEM-F12. Policz liczbę żywych komórek w hemocytometrze, używając standardowej metody wykluczania błękitu trypanowego16. Przygotuj 1 ml zawiesiny komórek o stężeniu 3 x 105 komórek/ml w pożywce DMEM-F12, a następnie utrzymuj komórki na lodzie, aby zapobiec agregacji komórek. 
	UWAGA: Aby poprawić skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek, wymagane jest staranne przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z dobrze zdysocjowanymi.</li>
</ol>
4. Wielokrotne przechwytywanie pojedynczych komórek i potrójna hodowla jednokomórkowa
<ol>
	<li>Podłącz rurkę z politetrafluoroetenu (PTFE) między wylotem urządzenia a pompą strzykawkową. Usunąć pożywkę i dodać 1 μl zawiesiny komórek o stężeniu 3 x 105 komórek/ml do wlotu urządzenia PDMS.</li>
	<li>Załaduj zawiesinę komórek do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,3 μL/min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Kierunek przepływu odbywa się od wlotu do wylotu. 
	UWAGA: Załaduj natychmiast po dodaniu zawiesiny komórek do wlotu, aby zapobiec sedymentacji komórek.</li>
	<li>Dodać 1 μl pożywki DMEM-F12 do wlotu urządzenia PDMS po kroku 4.2.Załaduj pożywkę DMEM-F12 do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,3 μL/min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Kierunek przepływu płynął od wlotu do wylotu.</li>
	<li>Załaduj 0,3 μl medium DMEM-F12 do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 10 μL/min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Kierunek przepływu płynął od wylotu do wlotu.</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.1 do 4.4, aby załadować inne typy komórek do urządzenia.</li>
	<li>Po zakończeniu przechwytywania komórek użyj mikroskopu z soczewką 4x, aby zobrazować każdą komorę hodowlaną. 
	UWAGA: Emisje fluorescencji komórek wykorzystano do identyfikacji i policzenia liczby pojedynczych komórek w każdej komorze hodowlanej.</li>
	<li>Wyjmij rurkę PTFE i uszczelnij wlot i wylot taśmą poliolefinową, aby stworzyć zamknięty system hodowli.</li>
	<li>Przenieś urządzenie PDMS do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i dodaj 10 ml sterylnego PBS wokół urządzenia PDMS, aby uniknąć parowania pożywki z urządzenia.</li>
	<li>Przenieś naczynie hodowlane do inkubatora (37 ° C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w celu potrójnej hodowli jednokomórkowej.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem i fotografuj wzrost komórek co 12 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poisson+distribution+and+beyond%3A+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804(2008).</li>
<li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li>
<li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li>
<li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503(2016).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li>
<li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li>
<li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Interakcje międzykomórkowe różnych komórek w mikrośrodowisku guza odgrywają ważną rolę w progresji guza17. Aby zrozumieć mechanizm interakcji komórka-komórka, jako powszechną metodę analityczną stosuje się systemy kohodowli. Jednak mnogość typów komórek i niejednorodność samych komórek doprowadziły do złożoności eksperymentalnej i trudności analitycznych.
Hydrodynamiczny chip wahadłowy umożliwia wielokrotne ładowanie pojedynczych komórek w komorze hodowlanej metodą dete...

Efektywne przechwytywanie różnych typów pojedynczych komórek i zapewnienie wystarczającej przestrzeni do hodowli jest potrzebne do eksperymentów z kokulturą pojedynczych komórek wielu typów pojedynczych komórek1. Ograniczenie rozcieńczenia jest najczęściej stosowaną metodą przygotowania pojedynczych komórek do takich eksperymentów, ze względu na niski koszt wymaganego sprzętu. Jednak ze względu na ograniczenie rozkładu Poissona, maksymalne prawdopodobieństwo przejęcia pojedynczej komórki wynosi tylko 37%, co sprawia, że operacja eksperymentalna jest pracochłonna i czasochłonna2. W przeciwieństwie do tego, użycie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) może przezwyciężyć ograniczenie rozkładu Poissona, aby wysoce efektywnie przygotować pojedyncze komórki3. Jednak FACS może nie być dostępny dla niektórych laboratoriów ze względu na drogie oprzyrządowanie i koszty konserwacji. Mikrofabrykowane urządzenia zostały niedawno opracowane do chwytania pojedynczych komórek4, parowania pojedynczych komórek5 i hodowli pojedynczych komórek. Urządzenia te są korzystne ze względu na ich zdolność do dokładnego manipulowania pojedynczymi komórkami6, przeprowadzania eksperymentów o wysokiej przepustowości lub zmniejszania zużycia próbek i odczynników. Jednak przeprowadzanie eksperymentów z kokulturą pojedynczych komórek z wieloma typami komórek za pomocą obecnych urządzeń mikroprzepływowych jest nadal trudne ze względu na ograniczenia rozkładu Poissona1,7,8, lub niezdolność urządzeń do przechwytywania więcej niż dwóch typów pojedynczych komórek4,5,6,9,10.
Na przykład, Yoon et al. opisali urządzenie mikroprzepływowe do badania interakcji komórka-komórka11. To urządzenie wykorzystuje metodę probabilistyczną do parowania komórek w jednej komorze. Jednak może osiągnąć parowanie tylko dwóch różnych typów ogniw ze względu na ograniczenia geometryczne w strukturze urządzenia. W innym raporcie Lee i in. zademonstrowano deterministyczną metodę przechwytywania i parowania pojedynczych komórek12. To urządzenie zwiększa wydajność parowania metodą deterministyczną, ale jest ograniczona przez wydłużony czas pracy wymagany do sparowania komórek. W szczególności przechwycenie drugiej komórki można przeprowadzić dopiero po przyczepieniu pierwszej przechwyconej komórki do powierzchni po 24 godzinach. Zhao i in. opisali urządzenie mikroprzepływowe oparte na kropelkach, które wychwytywało dwa typy pojedynczej komórki13. Możemy stwierdzić, że urządzenie mikroprzepływowe oparte na kropelkach jest nadal ograniczone do rozkładu Poissona i może być stosowane tylko na komórkach nieprzyłączonych i nie jest możliwa zmiana roztworu hodowlanego podczas procesu hodowli.
Poprzednio opracowaliśmy mikroprzepływowy "hydrodynamiczny układ wahadłowy", który wykorzystuje deterministyczne siły hydrodynamiczne do przechwytywania wielu typów pojedynczych komórek do komory hodowlanej, a następnie może przeprowadzać eksperyment z kokulturą komórkową w celu analizy indywidualnych zachowań migracji komórek w interakcjach komórka-komórka14. Hydrodynamiczny układ wahadłowy składa się z ustawionych w szeregu zestawów jednostek, z których każda zawiera serpentynowy kanał obejściowy, miejsce przechwytywania i komorę hodowlaną. Wykorzystując różnicę w oporach przepływu między kanałem obejściowym serpentyny a komorą hodowlaną oraz specjalnie zaprojektowaną procedurę operacyjną, różne typy pojedynczych komórek mogą być wielokrotnie wychwytywane w komorze hodowlanej. Warto zauważyć, że duża przestrzeń w komorze hodowlanej może nie tylko zapobiec wypłukaniu komórki podczas wychwytywania komórki, ale także zapewnić wystarczającą przestrzeń dla komórek do rozprzestrzeniania się, proliferacji i migracji, co pozwala na obserwację żywych interakcji pojedynczych komórek. W tym artykule skupimy się na produkcji tego urządzenia i szczegółowych krokach protokołu.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowana mikroprzepływowa taśma medyczna 3M do diagnostyki poliolefin</td><td>3M Company</td><td>9795R</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamina-penicylina-streptomycyna</td></tr><tr><td>Oprogramowanie AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Nr części 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Niebieski barwnik CMAC CellTracke</td><td>Invitrogen</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Zielony barwnik CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Piec konwencjonalny</td><td>YEONG-SHIN firma</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Oszczędzający miejsce eksykator próżniowy 190 mm biała podstawa</td></tr><tr><td>DiIC12(3) barwnik błony komórkowej</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Używany jako tracker komórek</td></tr><tr><td>DMEM-F12 medium</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 700 series Szklana strzykawka ( 0,1 ml )</td> <td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 &micro; L, Model 710 RN SYR, Mały zdejmowany NDL, 22s ga, 2 cale, styl punktowy 2</td></tr><tr><td>Dziurkacz Harris Uni-Core</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15075</td><td>z</td></tr><tr><td>dziurkaczem Harris Uni-Core</td> o średnicy wewnętrznej 1,5 mm <td>Ted Pella Inc.</td><td>15071</td> z płytą grzejną <td>o średnicy wewnętrznej 0,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>Firma YOTEC</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>Plazma tlenowa</td><td>NORDSON MARCH</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Stacjonarny system obróbki plazmowej</td></tr><tr><td>Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS)</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Politetrafluoroeten (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>średnica wewnętrzna, 0,51 mm; średnica zewnętrzna, 0,82 mm</td></tr><tr><td>Taśma usuwalna</td><td>3M Company</td><td>Scotch Remizable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>Wafel silikonowy</td><td>SPE0039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Eltech Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 fotorezystor ujemny</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 fotorezystu ujemny</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 fotorezystu</td><td>MicroChem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 deweloper</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvarda</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl. Niebezpieczny. Działa żrąco na drogi oddechowe, gwałtownie reaguje z wodą.</td></tr><tr><td>Roztwór neutralizatora trypsyny</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Testy kohodowli komórkowych były szeroko stosowane do badania interakcji komórka-komórka między różnymi typami komórek, aby lepiej zrozumieć biologię chorób, w tym raka. Wyjaśnienie złożonego mechanizmu interakcji międzykomórkowych w wysoce heterogenicznych populacjach komórek przy użyciu konwencjonalnych systemów kohodowli jest jednak trudne, ponieważ niejednorodność subpopulacji komórek jest przesłonięta średnimi wartościami; Konwencjonalne systemy kohodowli mogą być używane tylko do opisywania sygnału populacji, ale nie są w stanie śledzić zachowania poszczególnych komórek. Co więcej, konwencjonalne metody eksperymentalne z pojedynczymi komórkami mają niską skuteczność w manipulacji komórkami ze względu na rozkład Poissona. Mikrofabrykowane urządzenia są nową technologią do badań jednokomórkowych, ponieważ mogą dokładnie manipulować pojedynczymi komórkami przy wysokiej przepustowości i mogą zmniejszyć zużycie próbek i odczynników. W tym miejscu opisujemy koncepcję i zastosowanie chipa mikroprzepływowego do wielu kokultur jednokomórkowych. Chip może skutecznie wychwytywać wiele typów pojedynczych komórek w komorze hodowlanej (~46%) i ma wystarczającą przestrzeń do hodowli przydatną do badania zachowania komórek (np. migracji, proliferacji itp.) w interakcji komórka-komórka na poziomie pojedynczej komórki. Komórki śródbłonka limfatycznego i raka płaskonabłonkowego jamy ustnej wykorzystano do przeprowadzenia eksperymentu z kohodowlą pojedynczych komórek na platformie mikroprzepływowej do badań interakcji wielu pojedynczych komórek na żywo.

Urządzenie posiada strukturę trójwarstwową, co przedstawia fotografia przekroju przeciętego urządzenia z PDMS (Rysunek 1A). Pierwsza warstwa zawiera miejsce wychwytu (o szerokości 6,0 µm i wysokości 4,6 µm), które łączy komorę hodowlaną z kanałem obejściowym. Różnica w oporze przepływu między komorą hodowlaną a kanałem obejściowym sprawia, że komórki wpływają do pozycji wychwytu i wypełniają wejście do wąskiego przejścia. Po przechwyceniu kom...

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Niezwykle ważne jest skuteczne połączenie wydajności wychwytywania z dynamiczną obserwacją obrazu na żywo komórek, aby zrozumieć wpływ interakcji komórka-komórka na zachowanie komórek. Probówka ta może bardzo skutecznie wychwytywać wiele pojedynczych komórek w większej komorze i zapewniać wystarczającą bazę kultur do dynamicznego śledzenia wielu zachowań interakcji pojedynczych komórek. Zacznij od przygotowania urządzenia PDMS.Umieścić formę waflową w naczyniu wagowym ze 100 mikrolitrami trichlorosilanu w eksykatorze i stosować próżnię przez 15 minut. Zatrzymaj próżnię i zasalizuj formę waflową w eksykatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku dziesięć do jednego, a następnie wlej łącznie 20 gramów mieszaniny na formę waflową w 15-centymetrowym naczyniu.Umieść 15-centymetrowe naczynie w eksykatorze i zastosuj próżnię na półtorej minuty. Następnie wyjąć naczynie z eksykatora i usunąć resztki pęcherzyków powietrza w PDMS za pomocą gazowego azotu. Utwardź PDMS, umieszczając naczynie w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na dwie do czterech godzin.Po zakończeniu wyjmij replikę PDMS z formy waflowej i przebij 1.5-milimetrowy wlot i 0.5-milimetrowy wylot na PDMS. Oczyść replikę PDMS i powierzchnię prowadnicy taśmą usuwalną. Potraktuj powierzchnię plazmą tlenową.Następnie należy ręcznie wyrównać replikę PDMS z zamkiem i doprowadzić je do zetknięcia się ze sobą. Pozostaw szkiełko PDMS w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na jeden dzień. Następnego dnia zanurz urządzenie PDMS w pojemniku wypełnionym PBS.Umieść go w eksykatorze i zastosuj próżnię przez 15 minut. Przenieś urządzenie do okapu do hodowli komórkowej i sterylizuj je światłem UV przez 30 minut. Zastąp bufor urządzenia PDMS pożywką i inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden dzień.Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, usuń pożywkę hodowlaną i delikatnie umyj je trzy razy pięcioma mililitrami PBS. Dodaj jeden mililitr pożywki DMEM/F-12 zawierającej jeden mikromolowy barwnik fluorescencyjny do komórek WNT5B sh4 i pLKO-GFP i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji delikatnie umyj komórki trzy razy pięcioma mililitrami sterylnego PBS, usuń PBS i dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny-EDTA.Inkubuj komórki przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie postukaj w naczynie hodowlane, aby przyspieszyć oderwanie komórek. Dodaj cztery mililitry pożywki DMEM/F-12, aby zdyspersjonować komórki WNT5B sh4 i pLKO-GFP, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj je przy 300 xg przez trzy minuty. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze pożywki DMEM/F-12.Przygotuj jeden mililitr zawiesiny komórkowej o stężeniu trzy razy dziesięć do pięciu komórek na mililitr i trzymaj go na lodzie, aby zapobiec agregacji komórek. Podłącz rurkę z politetrafluoroetylenu między wylotem urządzenia a pompą strzykawkową. Usunąć pożywkę i dodać jeden mikrolitr przygotowanej zawiesiny komórek do wlotu urządzenia PDMS.Następnie załaduj zawiesinę ogniw do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,3 mikrolitra na minutę. Dodaj jeden mikrolitr pożywki DMEM/F-12 do wlotu urządzenia, a następnie załaduj pożywkę do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej. Załaduj 0,3 mikrolitra pożywki DMEM/F12 do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę.Po załadowaniu komórek wyjmij probówkę i uszczelnij wlot i wylot taśmą poliolefinową, aby stworzyć zamknięty system hodowli. Przenieś urządzenie PDMS do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego i dodaj 10 mililitrów sterylnego PBS wokół urządzenia, aby uniknąć odparowania pożywki. Przenieś naczynie hodowlane do inkubatora w celu przeprowadzenia potrójnej hodowli jednokomórkowej.Urządzenie PDMS ma trójwarstwową strukturę z miejscem wychwytywania, które łączy się z komorą hodowlaną i kanałem obejściowym. Różnica w oporach przepływu między komorą hodowlaną a kanałem obejściowym pozwala komórce przepłynąć do pozycji wychwytu, co powoduje, że następna komórka przechodzi przez kanał obejściowy do następnego miejsca wychwytywania. Etap refluksu służy do uwolnienia komórki z miejsca wychwytu i wysłania jej do komory hodowlanej.Skuteczność wychwytywania komórek za pomocą tego protokołu oceniono na trzech różnych typach komórek. Ludzkie komórki śródbłonka limfatycznego lub LEC, ludzki rak płaskonabłonkowy jamy ustnej, komórki T2.6 eksprymujące krótkie RNA spinki do włosów specyficzne dla WNT5B oraz komórki kontrolne wektora pLKO-GFP. Skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek w trzech demonstrowanych komórkach wynosiła około 71% dla LEC, 74% dla komórek SH4 WNT5B i 78% dla komórek pLKO-GFP.Potrójna skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek wyniosła 48%Metoda ta może być stosowana do wielu jednokomórkowych kokultur komórek śródbłonka limfatycznego i komórek raka płaskonabłonkowego, a proliferację i morfologię komórki można obserwować pod mikroskopem. Ważne jest, aby upewnić się, że przygotowane zawiesiny komórek mają minimalne agregaty komórkowe, ponieważ agregaty komórkowe nie tylko zmniejszają wydajność pojedynczego parowania, ale mogą również zatykać mikrokanały. Interakcja komórka-komórka między poszczególnymi komórkami odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu zachowań komórek.Nasza metoda może stanowić skuteczne narzędzie, które pomoże naukowcom badać interakcje komórka-komórka na poziomie pojedynczej komórki, co może prowadzić do odkrycia nowych mechanizmów, których nie można łatwo uzyskać w badaniach populacyjnych.

establishing-single-cell-based-co-cultures-deterministic-manner-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Poznaj metodę mikroprzepływową do ustanawiania kokultur pojedynczych komórek z wysoką wydajnością parowania. Technika ta umożliwia dynamiczną obserwację interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów