Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Niezwykle ważne jest skuteczne połączenie wydajności wychwytywania z dynamiczną obserwacją obrazu na żywo komórek, aby zrozumieć wpływ interakcji komórka-komórka na zachowanie komórek. Probówka ta może bardzo skutecznie wychwytywać wiele pojedynczych komórek w większej komorze i zapewniać wystarczającą bazę kultur do dynamicznego śledzenia wielu zachowań interakcji pojedynczych komórek. Zacznij od przygotowania urządzenia PDMS.

Umieścić formę waflową w naczyniu wagowym ze 100 mikrolitrami trichlorosilanu w eksykatorze i stosować próżnię przez 15 minut. Zatrzymaj próżnię i zasalizuj formę waflową w eksykatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku dziesięć do jednego, a następnie wlej łącznie 20 gramów mieszaniny na formę waflową w 15-centymetrowym naczyniu.

Umieść 15-centymetrowe naczynie w eksykatorze i zastosuj próżnię na półtorej minuty. Następnie wyjąć naczynie z eksykatora i usunąć resztki pęcherzyków powietrza w PDMS za pomocą gazowego azotu. Utwardź PDMS, umieszczając naczynie w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na dwie do czterech godzin.

Po zakończeniu wyjmij replikę PDMS z formy waflowej i przebij 1.5-milimetrowy wlot i 0.5-milimetrowy wylot na PDMS. Oczyść replikę PDMS i powierzchnię prowadnicy taśmą usuwalną. Potraktuj powierzchnię plazmą tlenową.

Następnie należy ręcznie wyrównać replikę PDMS z zamkiem i doprowadzić je do zetknięcia się ze sobą. Pozostaw szkiełko PDMS w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza na jeden dzień. Następnego dnia zanurz urządzenie PDMS w pojemniku wypełnionym PBS.

Umieść go w eksykatorze i zastosuj próżnię przez 15 minut. Przenieś urządzenie do okapu do hodowli komórkowej i sterylizuj je światłem UV przez 30 minut. Zastąp bufor urządzenia PDMS pożywką i inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden dzień.

Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, usuń pożywkę hodowlaną i delikatnie umyj je trzy razy pięcioma mililitrami PBS. Dodaj jeden mililitr pożywki DMEM/F-12 zawierającej jeden mikromolowy barwnik fluorescencyjny do komórek WNT5B sh4 i pLKO-GFP i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji delikatnie umyj komórki trzy razy pięcioma mililitrami sterylnego PBS, usuń PBS i dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny-EDTA.

Inkubuj komórki przez cztery minuty w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie postukaj w naczynie hodowlane, aby przyspieszyć oderwanie komórek. Dodaj cztery mililitry pożywki DMEM/F-12, aby zdyspersjonować komórki WNT5B sh4 i pLKO-GFP, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj je przy 300 xg przez trzy minuty. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze pożywki DMEM/F-12.

Przygotuj jeden mililitr zawiesiny komórkowej o stężeniu trzy razy dziesięć do pięciu komórek na mililitr i trzymaj go na lodzie, aby zapobiec agregacji komórek. Podłącz rurkę z politetrafluoroetylenu między wylotem urządzenia a pompą strzykawkową. Usunąć pożywkę i dodać jeden mikrolitr przygotowanej zawiesiny komórek do wlotu urządzenia PDMS.

Następnie załaduj zawiesinę ogniw do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,3 mikrolitra na minutę. Dodaj jeden mikrolitr pożywki DMEM/F-12 do wlotu urządzenia, a następnie załaduj pożywkę do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej. Załaduj 0,3 mikrolitra pożywki DMEM/F12 do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę.

Po załadowaniu komórek wyjmij probówkę i uszczelnij wlot i wylot taśmą poliolefinową, aby stworzyć zamknięty system hodowli. Przenieś urządzenie PDMS do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego i dodaj 10 mililitrów sterylnego PBS wokół urządzenia, aby uniknąć odparowania pożywki. Przenieś naczynie hodowlane do inkubatora w celu przeprowadzenia potrójnej hodowli jednokomórkowej.

Urządzenie PDMS ma trójwarstwową strukturę z miejscem wychwytywania, które łączy się z komorą hodowlaną i kanałem obejściowym. Różnica w oporach przepływu między komorą hodowlaną a kanałem obejściowym pozwala komórce przepłynąć do pozycji wychwytu, co powoduje, że następna komórka przechodzi przez kanał obejściowy do następnego miejsca wychwytywania. Etap refluksu służy do uwolnienia komórki z miejsca wychwytu i wysłania jej do komory hodowlanej.

Skuteczność wychwytywania komórek za pomocą tego protokołu oceniono na trzech różnych typach komórek. Ludzkie komórki śródbłonka limfatycznego lub LEC, ludzki rak płaskonabłonkowy jamy ustnej, komórki T2.6 eksprymujące krótkie RNA spinki do włosów specyficzne dla WNT5B oraz komórki kontrolne wektora pLKO-GFP. Skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek w trzech demonstrowanych komórkach wynosiła około 71% dla LEC, 74% dla komórek SH4 WNT5B i 78% dla komórek pLKO-GFP.

Potrójna skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek wyniosła 48%Metoda ta może być stosowana do wielu jednokomórkowych kokultur komórek śródbłonka limfatycznego i komórek raka płaskonabłonkowego, a proliferację i morfologię komórki można obserwować pod mikroskopem. Ważne jest, aby upewnić się, że przygotowane zawiesiny komórek mają minimalne agregaty komórkowe, ponieważ agregaty komórkowe nie tylko zmniejszają wydajność pojedynczego parowania, ale mogą również zatykać mikrokanały. Interakcja komórka-komórka między poszczególnymi komórkami odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu zachowań komórek.

Nasza metoda może stanowić skuteczne narzędzie, które pomoże naukowcom badać interakcje komórka-komórka na poziomie pojedynczej komórki, co może prowadzić do odkrycia nowych mechanizmów, których nie można łatwo uzyskać w badaniach populacyjnych.