Name: Metody detekcji fluorescencji dla mikroprzepływowych platform kropelkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Poznaj metody detekcji fluorescencji dla mikroprzepływowych platform kropelkowych w celu analizy pojedynczych komórek i mapowania procesów mieszania. Techniki te umożliwiają wysokoprzepustową analizę z dużą czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie następującym radom badawczym i grantom: EPSRC, HFSP, National Research Foundation of Korea (numer grantu R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

<ol><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li>
<li>Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid%2FLiquid%2FGas+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li>
<li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplets%3A+A+sea+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li>
<li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li>
<li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+%CE%BCs+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li>
<li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li>
<li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li>
<li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisaliśmy proces wykonania urządzenia mikroprzepływowego, konfigurację eksperymentalną oraz powiązane protokoły formowania mikrokropli, enkapsulacji odczynników i detekcji optycznej przetworzonych kropli. Wybrane dwa przykłady (detekcja pojedynczych komórek w kroplach oraz mapowanie procesów mieszania wewnątrz płynących kropli) reprezentują powszechne zastosowania, które są obecnie badane przy użyciu mikroprzepływów kropelkowych.
Jak pokazują przedstawione eksperymenty, wykorzystanie mikrofluidycznych platform kropelkowych oferuje pewne atrakcyjne cechy, takie jak wysoka przepustowość, niemal idealne zamknięcie oraz wysoka powtarzalność... Jednak ogromna ilość generowanych danych i wysoka prędkość ich powstawania wymagają zastosowania szybkich metod detekcji o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, aby w pełni wykorzystać zalety tych zminiaturyzowanych platform. W niniejszym przypadku wykazujemy, że jest to możliwe dzięki zastosowaniu precyzyjnych technik spektroskopii fluorescencyjnej. W szczególności technika detekcji FLIM (wykorzystująca laser impulsowy z okresami powtarzania rzędu zaledwie kilku ns) pozwala na błyskawiczne pozyskiwanie informacji z szybko przepływających kropli (około 200 na sekundę). W tym przypadku rozdzielczość czasowa wykrywanych zdarzeń wynosiła nawet 1 μs. Jeśli chodzi o ograniczenia dotyczące wielkości kropli i stężeń, zastosowanie soczewek o większej aperturze numerycznej oraz laserów o większej mocy pozwoliłoby z łatwością na detekcję stężeń rzędu nM w kroplach o wielkości nawet 5 μm (przy czym ograniczenia w wielkości kropli wynikają z rozdzielczości procesu wytwarzania fotolitograficznego oraz stopnia pozycjonowania submikronowego). 
Krople mikroprzepływowe są idealnymi nośnikami do przeprowadzania szeroko zakrojonych eksperymentów z użyciem niewielkich ilości odczynników, aż do poziomu pojedynczego celu lub zdarzenia. Obecne ograniczenia tej technologii wiążą się z trudnością w wysokoprzepustowym generowaniu kropel z bardzo wielu (dziesiątek lub setek) różnych źródeł. Ponadto trudności w celowaniu i manipulowaniu każdą pojedynczą wygenerowaną kroplą nakładają poważne ograniczenia na praktyczną aplikowalność tych technik. W związku z tym kwestie te znajdują się w centrum istotnych wysiłków badawczych, których celem jest opracowanie niezbędnych rozwiązań technologicznych, które pozwolą platformom mikroprzepływowym opartym na kroplach stać się standardową metodą referencyjną badań i analiz w zastosowaniach wysokoprzepustowych.

<table><tbody><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-Alexa Fluor 488</td><td>Odczynnik</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorodekalina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-perfluorooktanol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Odczynnik</td><td>Premier Farnell UK LTD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>auramina-O</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861030</td><td></td></tr><tr><td>Impulsowy laser diodowy 485 nm</td><td>Sprzęt</td><td>PicoQuant</td><td>LDH-P-C-485</td><td></td></tr><tr><td>Karta TCSPC</td><td>Sprzęt</td><td>PicoQuant</td><td>TimeHarp 100</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Sprzęt</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>z488rdc,</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy</td><td>Sprzęt</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa</td><td>Sprzęt</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>AQR-141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli szczep top 10</td><td>Komórki</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr></tbody></table>

metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Rozwój platform mikrofluidycznych do prowadzenia badań z zakresu chemii i biologii był w dużej mierze napędzany szeregiem potencjalnych korzyści związanych z miniaturyzacją systemów. Zalety te obejmują możliwość efektywnego przetwarzania objętości próbek od nano- do femtolitrów, łatwą integrację komponentów funkcjonalnych, naturalną predyspozycję do szeroko zakrojonej multipleksacji, zwiększoną przepustowość analityczną, lepszą kontrolę oraz zmniejszenie rozmiarów aparatury.1
W ostatnich latach dużą uwagę poświęcono rozwojowi mikrofluidycznych systemów opartych na kropelkach (lub przepływie segmentowym) oraz ich potencjałowi jako platform w eksperymentach wysokoprzepustowych.2-4 W takich układach emulsje typu woda w oleju tworzą się samoistnie w kanałach mikrofluidycznych w wyniku niestabilności kapilarnych między dwiema niemieszalnymi fazami. Co istotne, mikrokropelki o precyzyjnie określonych objętościach i składach mogą być generowane z częstotliwością kilku kHz. Ponadto, poprzez enkapsulację interesujących odczynników w odizolowanych przedziałach oddzielonych ciągłą fazą niemieszalną, można wyeliminować zarówno wzajemne przenikanie się próbek (cross-talk), jak i dyspersję (dyfuzyjną oraz dyspersję Taylora), co prowadzi do minimalnego zanieczyszczenia krzyżowego i umożliwia bardzo dokładne kontrolowanie czasu procesów analitycznych. Dodatkowo, ponieważ nie zachodzi kontakt między zawartością kropelek a ściankami kanału (które są zwilżane przez fazę ciągłą), zapobiega się absorpcji i utracie odczynników na ściankach kanału.
Po wygenerowaniu i przetworzeniu kropli tego rodzaju konieczne jest wyodrębnienie wymaganych informacji analitycznych. W tym względzie preferowana metoda detekcji powinna być szybka, zapewniać wysoką czułość i niskie granice wykrywalności, być stosowalna dla różnych gatunków molekularnych, niedestrukcyjna oraz umożliwiać łatwą integrację z urządzeniami mikroprzepływowymi. Aby sprostać tym potrzebom, opracowaliśmy zestaw narzędzi i protokołów eksperymentalnych, które umożliwiają pozyskanie obszernych informacji fotofizycznych z środowisk o małej objętości i znajdują zastosowanie w analizie szerokiego zakresu parametrów fizycznych, chemicznych i biologicznych. W niniejszej pracy przedstawiono dwa przykłady tych metod, zastosowane do detekcji pojedynczych komórek oraz mapowania procesów mieszania wewnątrz kropli o objętości picoliter. Opisujemy cały proces eksperymentalny, w tym wykonanie chipa mikroprzepływowego, układ optyczny oraz proces generowania i detekcji kropli.

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Rozwój platform mikrofluidycznych do prowadzenia badań z zakresu chemii i biologii był w dużej mierze napędzany szeregiem potencjalnych korzyści, które ...

Witajcie, jestem Jersey. Cześć, nazywam się Shabi. Oboje jesteśmy pracownikami naukowymi na stopniu postdoctoral w Imperial College London, gdzie współpracujemy z profesorem Andrew Di Melo i dr. Joshem Delem w zakresie mikrofluidycznych platform kropelkowych. Mikrofluidyczne platformy oparte na kropelkach są obiecującymi narzędziami do eksperymentów o wysokiej przepustowości, ponieważ kropelki mogą być generowane w bardzo wysokich, precyzyjnie określonych objętościach, a częstotliwość ich powstawania może osiągać kilka kiloherców.Ponadto, ponieważ obszar zainteresowania może zostać zamknięty w przedziałach o objętości zaledwie kilku litrów, można wyeliminować zarówno interferencje (crosstalk), jak i dyspersję, a procesy analityczne mogą być czasowane z większą dokładnością. W naszej grupie z sukcesem wdrożyliśmy już platformy mikro kroplowe w wielu zastosowaniach. Na przykład w reakcji łańcuchowej polimerazy, syntezie nanocząsteczek oraz w analizach pojedynczych cząsteczek w komórce.Duże ilości informacji generowanych w obrębie tych systemów muszą być efektywnie wyodrębniane, pozyskiwane i wykorzystywane. W związku z tym wybrana metoda detekcji powinna być odpowiednia, zapewniać wysoką czułość i niskie granice wykrywalności, być stosowalna dla szerokiego zakresu gatunków molekularnych, nieniszcząca oraz umożliwiać łatwą integrację z urządzeniami mikroprzepływowymi. Aby sprostać tym potrzebom, opracowaliśmy zestaw narzędzi i protokołów eksperymentalnych, które umożliwiają wyodrębnianie dużych ilości informacji fizycznych z środowisk o małej objętości i znajdują zastosowanie w analizie szerokiego zakresu obiektów fizycznych, chemicznych i biologicznych.W niniejszym protokole przedstawimy dwie metody stosowane do detekcji pojedynczych komórek oraz mapowania procesów mieszania w kroplach. Chip mikrofluidyczne są tradycyjnie wytwarzane z poli(dimetylosiloksanu) PDMS przy użyciu metod fotolitografii. Proces ten powinien być przeprowadzany w pomieszczeniu typu clean room w celu uzyskania kanałów mikrofluidycznych: nanosi się SU-8 50 na wafer krzemowy metodą spin-coatingu, a następnie przeprowadza soft bake na płycie grzewczej w 65 °C i 95 °C, aby odparować rozpuszczalnik i zagęścić film; po ochłodzeniu naświetla się rezyst SU-8 promieniowaniem UV przez odpowiednią maskę, a następnie wypala wafer w 65 °C i 95 °C po uprzednim schłodzeniu.Wywołaj nienaświetlone obszary, używając odpowiedniego roztworu wywołującego podczas mieszania. Użyj świeżego rozpuszczalnika EC do opłukania wafla, a następnie wysusz go strumieniem gazu, aby uzyskać czystą powierzchnię. Płucz wafelek heksanem i metanolem.Aby zakończyć proces wytwarzania matrycy głównej, należy napać agent wiążący na powierzchnię w eksykatorze przez 40 minut. W celu utworzenia ustrukturyzowanych podłoży mikrofluidycznych, mieszamy S guard 1 8 4 w stosunku 10:1 żywicy do sieciującego i nakładamy tę mieszaninę na matrycę główną. Następnie odgazowujemy próbkę w eksykatorze i utwardzamy urządzenie w temperaturze 65 °C.Wytnij utwardzony PDMS i oddziel go od matrycy. Za pomocą wycinaka do biopsji wykonaj otwory dostępu dla przewodów fluidycznych. Utwardź kolejną warstwę PDMS przez 20 minut w temperaturze 65°C.Umieść przygotowaną warstwę górną na warstwie dolnej i utwardzaj przez noc w temperaturze 65 stopni. Oderwij płytki od szalki Petriego i pokrój w kostkę. Po wytworzeniu płytki są gotowe do użycia poprzez wprowadzenie interesujących rozwiązań.Napełnij strzykawki wymaganymi roztworami, upewniając się, że w żadnych częściach przewodów nie pozostały pęcherzyki powietrza. Do generowania kropel wykorzystuje się dwie fazy. Wodna faza rozproszona zawiera interesujące badacza odczynniki.Faza olejowa pełni rolę fazy ciągłej. Dopasuj rurki o tej samej średnicy wewnętrznej co końcówki igieł strzykawkowych do jednego końca igieł, zamontuj strzykawki w pompie strzykawkowej i ustaw żądany przepływ infuzyjny. Dla każdej fazy zaleca się minimalny stosunek przepływów fazy olejowej do wodnej równy jeden, aby uniknąć zwilżania PDMS przez fazę wodną, co prowadziłoby do niestabilnego tworzenia się kropel. Podłącz pozostałe końce rurek bezpośrednio do otworów wykonanych w podłożu z PDMS.W przypadku bardziej złożonych rozwiązań można zastosować krzemionkę, porty kapilarne lub złącza. Należy połączyć port wyjściowy chipa z rurką i skierować ją do pojemnika na odpady lub do dalszej analizy. Po przygotowaniu układu można zastosować dwie główne konfiguracje mikrokanałów do generowania kropel: ogniskowanie przepływu lub złącze w kształcie litery T, co wynika z sił ścinania powstających przy wykorzystaniu tych geometrii do doprowadzenia dwóch dopuszczalnych cieczy oraz następującego po tym rozwoju niestabilności kapilarnych na ich styku.Krople o objętości zaledwie kilku femtolitrów są generowane spontanicznie. Po ich wygenerowaniu można je badać za pomocą układu optycznego. System optyczny jest konfigurowany zgodnie z poniższym protokołem.Należy użyć mikroskopu konfokalnego z automatycznym pozycjonowaniem submikronowym i laserem pracującym na długości fali odpowiadającej absorpcji stosowanych fluoroforów. W celu ich wzbudzenia należy zastosować laser impulsowy pracujący z częstotliwością powtarzania rzędu kilku megaherców do obrazowania czasu życia fluorescencji. W eksperymentach z plwociną wykorzystuje się lustra sterujące wiązką oraz optykę do kontroli wysokości oraz kierunku wiązki.Użyj lustra dichroicznego, aby skierować wiązkę lasera do obiektywu. W przypadku jednoczesnego użycia dwóch laserów można zainstalować lustro dichroiczne dwupasmowe. Aby umożliwić odbicie obu wiązek laserowych, należy zastosować obiektyw mikroskopowy z korekcją do nieskończoności o wysokiej aperturze numerycznej NA, co pozwoli na uzyskanie wąskiego ogniska światła laserowego wewnątrz kanału mikroprzepływowego.Zbierz fluorescencję emitowaną przez próbkę w kanale mikrofluidycznym, używając tego samego obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i transmitując ją przez to samo lustro dichroiczne. Usuń wszelkie pozostałości światła wzbudzenia za pomocą filtra emisyjnego pojedno- lub dwupasmowego. Skupuj emisję fluorescencji na otworze przypadkowym (pinhole) o średnicy 75 µm.Przy użyciu soczewki plano-konweksyjnej. Należy umieścić otwór w płaszczyźnie konfokalnej obiektywu mikroskopu. Do rozdzielenia sygnału fluorescencyjnego na dwa detektory należy użyć drugiego lustra dichroicznego.Przefiltruj fluorescencję odbitą od lustra dichroicznego za pomocą filtra emisyjnego i skup ją za pomocą soczewki plano-konweksyjnej na pierwszym detektorze. W przypadku eksperymentów z wykorzystaniem wtórnego fluoroforu czerwonego przefiltruj fluorescencję przenikającą przez lustro dichroiczne za pomocą innego filtra emisyjnego, a następnie skup ją za pomocą kolejnej soczewki plano-konweksyjnej na drugim detektorze. Do detekcji fotonów fluorescencji zastosuj fotodiody lawinowe.W celu akwizycji danych fluorescencji należy sprzęgnąć sygnał elektroniczny z detektora fotodiody lawinowej z wielofunkcyjnym urządzeniem DAQ do rejestracji danych, obsługiwanym przez komputer osobisty. W przypadku eksperymentów z plwociną należy użyć lasera impulsowego i podłączyć detektory do karty PC do czasowo skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCS), zainstalowanej w osobnym komputerze. Karta ta umożliwia uzyskanie danych dotyczących czasu życia fluorescencji.Stosując metodologię TCS PC, każdy wykryty foton fluorescencyjny jest korelowany z padającym impulsem laserowym, w związku z czym każdemu wyemitowanemu fotonowi fluorescencyjnemu przypisuje się czas opóźnienia. Dane te można dopasować do pojedynczej lub wielokrotnej wykładniczej krzywej zaniku, aby uzyskać szacunkową wartość szybkości radiacyjnej fluoroforów.Obecnie wiemy, że komórki są wysoce heterogeniczne pod względem biologicznym, fizycznym oraz chemicznym. W związku z tym w idealnym przypadku powinniśmy analizować każdą komórkę z osobna. Jednak analizy powinny być przeprowadzane przy zastosowaniu wysokiej przepustowości, abyśmy mogli zebrać wystarczającą ilość informacji ilościowych, pozwalających na sformułowanie wiarygodnych i istotnych wniosków.Poniżej przedstawiono przykład enkapsulacji komórek e coli w pojedynczych kroplach w celu przeprowadzenia tej procedury. Należy użyć szczepu e coli top 10 hodowanego przez noc. Do oznaczenia żywotności komórek należy zastosować cyto nine oraz jodek propidyny.Oba barwniki są interkalatorami DNA, a ich intensywność fluorescencji wzrasta ponad 20-krotnie. Po związaniu z DNA cyto nine jest zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, który przenika przez błony komórkowe, natomiast jodek propidynyum to czerwony barwnik fluorescencyjny, który nie przenika przez błony komórkowe.W związku z tym żywe komórki fluorescują na zielono, natomiast martwe komórki wykazują emisję zarówno zieloną, jak i czerwoną. Tutaj możemy zobaczyć generowanie kropel oraz enkapsulację pojedynczej komórki za pomocą złącza T. Film ten został nagrany kamerą wysokich prędkości, jednak krople mogą być generowane z częstotliwością tysięcy na sekundę.Podczas enkapsulacji komórek należy upewnić się, że hodowla komórkowa jest rozcieńczona w taki sposób, aby liczba komórek była mniejsza niż liczba generowanych kropli, oraz że zapobieżono sedymentacji komórek, która może wystąpić w strzykawce lub przewodach. Wewnątrz strzykawki należy zastosować magnetyczny mieszadło, aby utrzymać równomierny rozkład komórek w roztworze. Do połączenia strzykawki z mikroczipem należy użyć bardzo cienkich przewodów o średnicy 50 micrometers.Zapewnia to szybki przepływ wewnątrz rurki, co zapobiega sedymentacji komórek. Poniżej przedstawiono typowe przykłady liczby fotonów w funkcji czasu dla eksperymentów z wykorzystaniem komórek. Służy to do mapowania procesów mieszania wewnątrz kropli.Krople można generować przy użyciu dwóch różnych fluoroforów o różnych czasach życia. Wewnątrz przepływającej kropli powstaje pole przepływu, które ostatecznie miesza dwa pierwotnie rozdzielone roztwory, aby usprawnić proces mieszania. Symetrię pola przepływu można zmienić, stosując kręte kanały.W celu zbadania kropli należy skupić objętość sondy optycznej na wysokości połowy mikrokanału, wzdłuż którego przepływają krople, zaczynając od jednej strony kanału i przeprowadzając każdy eksperyment wzdłuż całej szerokości kanału w odstępach jednego mikrometra. Należy wdrożyć algorytm pozwalający odróżnić pojedyncze impulsy związane z kroplami od tła szumów fazy olejowej oraz określić czas trwania każdego impulsu.Zaimplementuj drugi algorytm w celu wyodrębnienia wartości czasu opóźnienia oraz intensywności wzdłuż długości każdej kropli przy konkretnej szerokości, dla której przeprowadzono eksperyment. Następnie wykorzystaj algorytm estymacji największej wiarygodności (MLE), aby ocenić czas życia fluorescencji każdej kropli w eksperymencie. Uśrednienie wartości czasu życia dla wszystkich kropli w eksperymencie pozwala zredukować końcowy błąd obliczeń MLE.Im więcej kropli zostanie przebadanych, tym mniejszy będzie błąd po uzyskaniu trajektorii czasu życia. Dla każdej szerokości należy połączyć wszystkie trajektorie na mapie 2D. Ponieważ każda wartość czasu życia jest powiązana z konkretną mieszanką dwóch fluorescencji, można w ten sposób uzyskać mapę stężeń lub mieszania.Opisaliśmy wykonanie urządzenia mikroprzepływowego oraz zestawu eksperymentalnego wraz z powiązanymi protokołami tworzenia mikrokropli, enkapsulacji obszarowej oraz optycznej detekcji kropel w tym procesie. Wybrano dwa przykłady: detekcję pojedynczych komórek w kroplach oraz mapowanie procesów mieszania wewnątrz płynącej kropli, które stanowią typowe zastosowania obecnie badane w ramach mikrofluidyki kropelkowej.Jak pokazują przedstawione eksperymenty, zastosowanie platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach wykazuje pewne atrakcyjne cechy, takie jak wysoka przepustowość wynikająca z doskonałego ograniczenia przestrzennego oraz większa powtarzalność. Duża ilość generowanych informacji oraz najwyższa prędkość ich powstawania wymagają zastosowania szybkich metod detekcji o najwyższej rozdzielczości przestrzenno-czasowej, aby w pełni wykorzystać zalety tych zminiaturyzowanych platform.W tym przypadku wykazujemy, że jest to możliwe dzięki zastosowaniu wysoce precyzyjnych technik spektroskopii fluorowej.

fluorescence-detection-methods-for-microfluidic-droplet-platforms

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metody wykrywania fluorescencji dla platform kroplowych mikrofluidalnych

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Ta praca przedstawia prostą i wizualną metodę wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Dzięki proponowanej metodzie cały eksperyment, w tym manipulacja kropelkami i wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych, może być przeprowadzony w temperaturze około 23 °C bez pomocy zaawansowanych urządzeń.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.

Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metody detekcji fluorescencji dla mikroprzepływowych platform kropelkowych w celu analizy pojedynczych komórek i mapowania procesów mieszania. Techniki te umożliwiają wysokoprzepustową analizę z dużą czułością.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Przeglądaj więcej filmów