Metody detekcji fluorescencji dla mikroprzepływowych platform kropelkowych

Cześć, jestem Jersey. Cześć, nazywam się Shabi i oboje jesteśmy doktorantami w Imperial College of London, pracującymi z profesorem Andrew Di Melo i dr Joshem Delem nad mikroprzepływowymi platformami kropelkowymi. Platformy mikroprzepływowe oparte na kropelkach są obiecującymi kandydatami do eksperymentów o wyższej przepustowości, ponieważ mogą być generowane przy bardzo dużych, precyzyjnie zdefiniowanych objętościach, a ich konkurencja, częstotliwość generowania może sięgać nawet kilku kilogramów.

Co więcej, ponieważ obszar zainteresowania może być zamknięty w komorach nawet o pojemności kilku litrów, można wyeliminować zarówno przesłuchy, jak i dyspersję, a procesy analityczne można śledzić z większą dokładnością. W naszej grupie z sukcesem wdrożyliśmy już platformy mikrokropelkowe do wielu aplikacji. Na przykład reakcja łańcuchowa polimerazy, synteza nanocząstek i test pojedynczej komórki molekularnej.

Duże ilości informacji generowanych w tych systemach muszą być skutecznie wydobywane, wykorzystywane i wykorzystywane. W związku z tym wybrana metoda wykrywania powinna być właściwa, zapewniać wysoką czułość i niskie granice wykrywalności, mieć zastosowanie do szeregu gatunków molekularnych, być nieniszcząca i umożliwiać łatwą integrację z urządzeniami mikroprzepływowymi. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy zestaw narzędzi i protokołów eksperymentalnych, które umożliwiają ekstrakcję dużych ilości informacji fizycznych ze środowisk o małej objętości i mają zastosowanie do analizy szerokiego zakresu czynników fizycznych, chemicznych i biologicznych.

W tym protokole przedstawimy metody, które są stosowane do wykrywania pojedynczych komórek i mapowania procesów mieszania w Dropbox. Chipy mikroprzepływowe są tradycyjnie wytwarzane z polidimetylu Sloane PGMS przy użyciu metod fotolitografii. Proces ten powinien być przeprowadzony w pomieszczeniu czystym w celu uzyskania kanałów mikroprzepływowych Spinco, SU eight 50 na miękkim waflu krzemowym wypiekać na płycie grzejnej w temperaturze 65 stopni i 95 stopni, aby odparować rozpuszczalnik i zagęścić folię po schłodzeniu, naświetlić SU ósemkę, oprzeć się promieniowaniu UV pod odpowiednią maską, A następnie pieczemy wafelek w 65 stopniach i 95 stopniach po schłodzeniu.

Rozwinąć nienaświetlone obszary za pomocą odpowiedniego roztworu rozwijającego, mieszając. Użyj świeżego rozpuszczalnika EC do wypłukania wafla, a następnie wysusz go pod gazem, aby uzyskać czystą powierzchnię. Potraktuj wafel myjkami z heksanem i metanolem.

Ponadto, aby zakończyć proces wytwarzania esate master, odparuj środek zacierający na powierzchnię w postaci osuszacza przez 40 minut. Aby utworzyć strukturalne podłoża mikroprzepływowe, mieszamy S guard 1 8 4 w stosunku 10 do jednego środka sieciującego żywicę i naciągamy go na wzorzec. Odgazuj to w osuszaczu i utwardź urządzenie w temperaturze 65 stopni.

Odetnij utwardzony PDMS i oderwij go od wzorca. Wykonaj otwory dostępowe do przewodów płynowych za pomocą stempla do biopsji. Utwardź kolejną warstwę PDMS przez 20 minut w temperaturze 65 stopni.

Ułóż przygotowaną wierzchnią warstwę na dolnej warstwie i utwardź przez noc w temperaturze 65 stopni. Obierz frytki z szalki Petriego i pokrój je w kostkę. Po wyprodukowaniu chipów są one gotowe do użycia poprzez zaparzanie interesujących ich roztworów.

Napełnić strzykawki wymaganymi roztworami, upewniając się, że w żadnej części rurki nie pozostały pęcherzyki powietrza. Do wytwarzania kropelek stosuje się dwie fazy. Wodna faza zdyspergowana zawiera odczynniki będące przedmiotem zainteresowania.

Faza olejowa działa jak rurka z fazą ciągłą o tej samej średnicy wewnętrznej, co końcówki igły strzykawki na jednym końcu igieł, do igieł należy zamontować strzykawki na pompie strzykawkowej i określić żądane natężenie przepływu zaparzania. Dla każdej fazy zaleca się minimalny stosunek natężenia przepływu oleju w roztworze wodnym wynoszący jeden, aby uniknąć zwilżenia PDMS przez fazę wodną, co prowadziłoby do niestabilnego tworzenia się kropel. Podłącz drugie końce rurki bezpośrednio do otworów wybitych w podłożu PDMS.

W przypadku bardziej złożonych rozwiązań można również zastosować krzemionkę, porty kapilarne lub złącza. Podłącz port wylotowy chipa do rurki i skieruj do kolektora w celu zbierania odpadów lub dalszego przetwarzania analizy. Po ustawieniu tego istnieją dwie główne konfiguracje mikrokanałów do generowania ogniskowania przepływu kropel lub formatu złącza T w wyniku samych sił, które powstają w wyniku użycia tych geometrii do zbliżenia dwóch dopuszczalnych płynów i kolejnych wejść kapilarnych, które rozwijają się w interfejsie.

Jedna lub rozproszona kropelka o wielkości zaledwie kilku femtolitrów jest generowana spontanicznie. Po wygenerowaniu kropel można je badać za pomocą układu optycznego. Układ optyczny jest skonfigurowany przy użyciu następującego protokołu.

Użyj mikroskopu konfokalnego z automatyczną zdolnością pozycjonowania submikronowego i lasera działającego na długości fali, która odpowiada absorpcji danych opadów fluoru. Aby je wzbudzić, użyj lasera impulsowego działającego z częstotliwością powtarzania kilku megaherców do obrazowania czasu życia fluorescencji. Eksperymenty flegma wykorzystują zwierciadła sterujące wiązką i optykę do kontrolowania wysokości wiązki, a także kierunku wiązki.

Użyj lustra dichroicznego, aby odbić wiązkę lasera do soczewki obiektywu. Jeśli dwa lasery są używane jednocześnie, można zainstalować dwupasmowe lustro diagnostyczne. Aby umożliwić odbicie dwóch wiązek laserowych, użyj obiektywu mikroskopowego NA o wysokiej aperturze numerycznej z korekcją nieskończoności, aby ustawić światło lasera na ciasnym ognisku w kanale mikroprzepływowym.

Zebrać fluorescencję emitowaną przez próbkę w kanale mikroprzepływowym, używając tego samego obiektywu o wysokim NA i przesyłaną przez to samo zwierciadło dichroiczne. Usuń wszelkie szczątkowe światło wzbudzenia za pomocą jedno- lub dwupasmowego filtra emisyjnego. Skoncentruj emisję fluorescencji na otworze o średnicy 75 mikrometrów.

Korzystanie z soczewki wypukłej plano. Umieść otwór w płaszczyźnie konfokalnej obiektywu mikroskopu. Użyj innego lustra dichroicznego, aby rozdzielić sygnał fluorescencyjny na dwa detektory.

Przefiltruj fluorescencję odbitą przez zwierciadło dichroiczne za pomocą filtra emisyjnego i zogniskuj ją za pomocą zwykłej wypukłej soczewki na pierwszym detektorze. W przypadku eksperymentów z udziałem wtórnego czerwonego fluoru, przefiltruj fluorescencję transmitowaną przez zwierciadło diiczne za pomocą innego filtra emisyjnego, a następnie zogniskuj ją za pomocą innej wypukłej soczewki płaskiej na drugim detektorze. Do wykrywania fotonów fluorescencyjnych należy używać fotodiod lawinowych.

W celu akwizycji danych fluorescencyjnych należy połączyć sygnał elektroniczny z detektora fotodiody lawinowej z wielofunkcyjnym urządzeniem DAQ do rejestrowania danych działającym na komputerze osobistym. Do eksperymentów flegma użyj lasera impulsowego i podłącz detektory do skorelowanej czasowo karty TCS PC zliczającej pojedyncze fotony działającej na oddzielnym komputerze. Karta ta pozwala na uzyskanie danych o żywotności świetlówek.

Korzystanie z metodologii TCS PC. Każdy wykryty foton fluorescencyjny jest skorelowany z padającym impulsem laserowym i dlatego każdemu wyemitowanemu fotonowi fluorescencyjnemu przypisuje się czas opóźnienia. Dane te można dopasować do pojedynczej lub wielokrotnej krzywej rozpadu wykładniczego, aby uzyskać oszacowanie szybkości promieniowania fluoroforów.

Obecnie wiemy, że komórki są wysoce niejednorodne zarówno z biologicznego, fizycznego, jak i chemicznego punktu widzenia. Dlatego idealnie byłoby, gdybyśmy analizowali każdą komórkę na raz. Jednak testy powinny być wykonywane z większą przepustowością, abyśmy mogli zebrać wystarczającą ilość informacji ilościowych, aby dojść do wiarygodnych i znaczących wniosków.

Tutaj mamy przykład kapsułkowania komórek E. coli w pojedynczą kroplę, tak aby można było wykonać to, co jest. Użyj szczepu E coli top 10, który został wyhodowany przez noc. Aby wykryć żywotność komórek, użyj cyto nine i jodku propidyny.

Oba barwniki są barwnikami łączącymi DNA, a ich intensywność fluorescencji wzrasta ponad 20-krotnie. Po związaniu się z DNA cyto dziewięć jest zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, który jest przepuszczalny dla błony i jodkiem propidyny. Jest to czerwony barwnik fluorescencyjny, który jest nieprzepuszczalny dla membrany.

W ten sposób żywe komórki fluoryzują na zielono, podczas gdy martwe komórki wykazują zarówno zielone, jak i czerwone emisje. Tutaj możemy zobaczyć wytwarzanie kropelek i enkapsulację pojedynczej komórki ze złączem T. Ten film został nagrany za pomocą szybkiej kamery, ale kropelki mogą być generowane z szybkością tysięcy na sekundę.

Podczas kapsułkowania komórek należy upewnić się, że hodowla komórek jest rozcieńczona, aby wytwarzanych komórek było mniej niż kropel, aby komórki nie ulegały sedymentacji, która może wystąpić w strzykawce lub rurce. Użyj mieszadła magnetycznego wewnątrz strzykawki, aby utrzymać równomierne rozprowadzenie komórek w roztworze. Użyj bardzo cienkiej rurki o średnicy 50 mikrometrów, aby podłączyć strzykawkę do mikroczipa.

Zapewnia to szybkie natężenie przepływu wewnątrz rurki, a tym samym zapobiega sedymentacji komórek. Oto typowe przykłady zliczania zdjęć w funkcji czasu w eksperymentach opartych na komórkach. Do mapowania procesów mieszania w kropelkach.

Kropelki mogą być generowane przy użyciu dwóch różnych czwórek fluorowych o różnej żywotności. Wewnątrz przepływającej kropli generowane jest pole przepływu, które ostatecznie miesza dwa pierwotnie oddzielone roztwory, aby usprawnić proces mieszania. Symetrię pola przepływu można zmienić za pomocą kanałów uzwojenia.

W celu zbadania kropel należy skupić objętość sondy optycznej na połowie wysokości mikrokanału, wzdłuż którego przepływają kropelki, zaczynając od jednej strony kanału, każdy eksperyment należy przeprowadzić na całej szerokości kanału. W odstępach jednego mikrometra. Zaimplementuj algorytm do odróżniania pojedynczych impulsów związanych z kropelkami od tła szumu fazy olejowej i do ustalenia czasu trwania każdego impulsu.

Zaimplementuj drugi algorytm, aby wyodrębnić wartości czasu opóźnienia i intensywności wzdłuż długości każdej kropli na określonej szerokości, na której przeprowadzono eksperyment. Następnie użyj algorytmu MLE estymatora maksymalnego prawdopodobieństwa, aby ocenić czas życia fluorescencji każdej kropli w eksperymencie. Uśrednienie wartości czasu życia dla wszystkich kropel w eksperymencie zmniejsza ostateczny błąd obliczeń MLE.

Im więcej kropel jest sondowanych, tym mniejszy jest błąd po uzyskaniu trajektorii czasu użytkowania. Dla każdej szerokości połącz wszystkie trajektorie na mapie 2D. Ponieważ każda wartość życiowa jest powiązana z określoną mieszaniną dwóch czwórek flory, można w ten sposób uzyskać mapę stężenia lub mieszania.

Opisaliśmy wytwarzanie mikrourządzenia i konfiguracji eksperymentalnej oraz związane z tym protokoły tworzenia mikrokropelek i enkapsulacji regionu oraz optycznego wykrywania procesu, kropel. W dwóch przykładach wybrano detekcję pojedynczych komórek w kropelkach oraz mapowanie procesów mieszania. Wewnątrz przepływającej kropli znajdują się typowe zastosowania, które są obecnie badane za pomocą mikrofluidyki kropelkowej.

Jak pokazują przedstawione eksperymenty, zastosowanie kropelkowych platform mikroprzepływowych ma pewne atrakcyjne cechy, takie jak wysoka przepustowość, doskonała izolacja i wyższa odtwarzalność. Duża ilość wytwarzanych informacji i największa prędkość, z jaką te informacje są generowane. DU wymagało zastosowania szybkich metod detekcji o najwyższej rozdzielczości przestrzennej czasowej, aby w pełni wykorzystać tę zminiaturyzowaną platformę.

W tym przypadku pokazujemy, że jest to możliwe przy użyciu wysoce precyzyjnych technik spektroskopowej fluoru.