Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Mikrośrodowisko umożliwia bardzo złożone i dynamiczne procesy, w tym ciągle zmieniające się cytokiny, stężenie ligandów i skład. Stworzenie podobnego środowiska hodowlanego ma kluczowe znaczenie dla badań in vitro nad złożonymi mechanizmami życiowymi, takimi jak różnicowanie komórek macierzystych, odpowiedzi immunologiczne i rozwój narządów na platformach chipowych. Jednak generowanie i dostarczanie sygnałów chemicznych o objętości nanolitrów i milisekundach jest trudne przy użyciu konwencjonalnych metod biomedycznych, takich jak pipetowanie.

Aby sprostać tym wyzwaniom, istnieje duże zapotrzebowanie na platformę kulturową, która jest w stanie naprzemiennie generować obrazy dynamicznego sygnału kombinatorycznego i sekwencyjnego. W niniejszym protokole przedstawiono procedurę projektowania i wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego. Proponowany chip mikroprzepływowy składa się z 1500 jednostek hodowlanych, zestawu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu.

Pokazujemy, że platforma nadaje się do badań na pojedynczych komórkach, dwuwymiarowych populacjach komórek i trójwymiarowych sferach neuronowych. Złożone i dynamiczne warunki środowiskowe na chipie mają ogromny wpływ na różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i samoodnawianie. Szczegóły procedur projektowania i produkcji są następujące.

Projekt chipa został wykonany przy użyciu oprogramowania AutoCAD. Aby dopasować rozmiar uchwytu płytki pod mikroskopem, chip mikroprzepływowy ma wymiary około siedmiu na pięć centymetrów i składa się z 1 500 komór hodowlanych. Jedną z ważnych cech jest to, że posiada pompę perystaltyczną, która składa się z ośmiu kanałów przepływowych i kanałów sterujących o szerokości 200 mikrometrów.

Zwiększenie nakładającego się obszaru między kanałem sterującym a kanałem przepływowym wzrosło 16-krotnie w porównaniu z pompą perystaltyczną, zaproponowaną przez Stephena Quake'a w 2002 roku, do około 15 nanolitrów cieczy na cykl pompowania i wystarcza do utrzymania 1500 niezależnych warunków środowiskowych równolegle na chipie. Kolejną ważną częścią urządzenia jest dwuwarstwowa komora hodowlana, która może utrzymać środowisko hodowli bez ścinania. Niepożądanym naprężeniom ścinającym zapobiega się poprzez szybkie przeprowadzenie go przez wierzchnią warstwę.

Komórki, tkanki i kluczowa pożywka warunkowa pozostają nietknięte w dolnej warstwie. Symulacja numeryczna sugeruje, że gdy ciecze są kierowane przez komory hodowlane, od lewej do prawej. Siłom tnącym można skutecznie zapobiec.

Nawet przy wejściowym natężeniu przepływu wynoszącym 10 milimetrów na sekundę komórki lub tkanki o wielkości mikrometra pozostają nienaruszone na dnie jednostki hodowli. Wykonaliśmy replikę formy lub wafla krzemowego przy użyciu litografii UV. Kanały przepływowe o wysokości 25 mikrometrów i wadze 100 mikrometrów są wytwarzane przy użyciu ujemnego fotorezystu SU-8 3025.

Komory hodowlane o wysokości 75 mikrometrów i 150 mikrometrów zostały wykonane przy użyciu fotorezystu SU-8 3075. Dodatni fotorezystor AZ50X służy do okrągłych elementów studni, które nakładają się na kanały sterujące, aby zapewnić dobre połączenie. Aby wyprodukować chip mikrofludyczny, wzorzyste i puste płytki krzemowe zostały najpierw poddane obróbce TMCS.

Różne ilości PDMS 10 do 1 stosunku monomeru do katalizatora dokładnie wymieszano i odbąbelkowano przez jedną do dwóch godzin w komorze próżniowej przy minus 0,85 megapaskala. Warstwę kontrolną uzyskano przez powlekanie wirowe PDMS przy 2 200 obr./min. Wafle krzemowe przeniesiono następnie do inkubatora i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Różne warstwy zostały wyrównane i połączone ze sobą za pomocą niestandardowego urządzenia optycznego i maszyny do trawienia plazmowego. Otwory wlotowe zostały następnie przebite po kolejnych dwóch godzinach klejenia termicznego w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Chip został przyklejony do szkiełka nakrywkowego pokrytego PDMS, które jest tego samego rozmiaru co płytka 96-dołkowa i utwardzany przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 80 stopni dośrodkowych przed użyciem.

Do pracy kanały sterujące zostały podłączone do miniaturowych pneumatycznych zaworów elektromagnetycznych za pomocą plastikowych rurek. Toczenie wszystkich studni penumatycznych było kontrolowane przez niestandardowy program MATLAB za pośrednictwem graficznego interfejsu użytkownika. Optymalne ciśnienia zamykania zaworów membranowych push-up PDMS zostały określone indywidualnie dla każdego chipa, które zwykle wahają się od 25 do 30 PSI.

Obracając wszystkie serie studni, na chipie można dynamicznie generować kombinatoryczne i sekwencyjne dane wejściowe. Komórki zebrano przy 80% konfluencji i ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej DMEM o gęstości około 10 do potęgi sześć na mililitr, które następnie załadowano do chipa poprzez zwiększenie ciśnienia w komórce zawierającej roztwór. Zarówno w przypadku hodowli adherentnej, jak i zawiesinowej neurokomórek macierzystych, pobrano komórki, a kulki zostały bezpośrednio załadowane do chipa.

Do akwizycji obrazu wykorzystano mikroskop odwrócony z automatycznym stolikiem translacyjnym oraz cyfrową kamerę półprzewodnikową z komplementarnym tlenkiem metalu. Stolik i akwizycja obrazu były kontrolowane za pomocą oprogramowania, które pokazuje górny lewy róg i prawy dolny róg jako punkty wyboru i przesuwają etap translacyjny do punktów uporządkowanych, aby uzyskać wstępne obrazowanie za pomocą soczewki obiektywowej 4x. Wymień soczewkę obiektywu 4x na soczewkę 20x i dostosuj parametry obrazowania, w tym natężenie światła, czas ekspozycji i tak dalej.

Następnie zlokalizuj punkty wyboru tak, aby położenie każdej komory opuszczało matrycę komory 13 na 15 lub zostało zdefiniowane przez program automatycznie. Po określeniu współrzędnych komór, etap translacyjny przenosi się do każdej komory, w której można precyzyjnie dostroić płaszczyznę ogniskową X, Y, Z. Ustaw interwał i czas trwania cyklu obrazowania.

Zapisz ścieżkę, a następnie rozpocznij obrazowanie. System ten jest dostępny do różnych dynamicznych śledzenia celów, takich jak różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w jasnym polu i pole fluorescencyjne procesu tworzenia się sfery nerwowych komórek macierzystych. Analiza danych.

Zmień format w nd2 na Tif za pomocą niestandardowego programu MATLAB. I podziel dane według punktów. Wybierz obiekt do analizy, który ma być analizowany, to komórka lub tkanka.

Wprowadź próg, rozmiar obiektu, rozmiar szumu do analizy. Możesz też wybrać analizę krok po kroku do optymalnych parametrów. A potem analizowanie wszystkich danych.

Po zapisaniu wyniku w formacie MAT, używając wykresu do narysowania wyników lub śladów. W artykule opisano protokół i hodowlę wysokoprzepustowego mikroprzepływowego systemu chipowego opartego na technologii fotolitografii do dynamicznej kontroli mikrośrodowiska żywej komórki. Opisaliśmy również niektóre parametry, które należy dokładnie kontrolować, takie jak ciśnienie zamykania zaworów membranowych PDMS i regulacja wirowania płynu równolegle do komory.

W tradycyjnej hodowli komórkowej in vitro obróbka środowiska hodowli komórkowej odbywa się ręcznie, co jest czasochłonne i pracochłonne, a napełnianie płynem nie jest łatwe do standardowej kontroli. Szczególnie minuty roztworu. Istnieją pewne problemy, takie jak generowanie danych wejściowych, stężenie leków immunologicznych i duże spożycie.

Jednak przy użyciu naszego systemu mikroprzepływowego możliwe jest powtórzenie go jako stymulatora przy ustalonej dawce pojedynczego płynu o równym stężeniu, porównanie różnych kultur w różnych komorach hodowlanych w tym samym czasie. Różni się od jakiegoś miniaturowego bodźca wstecznego rozdzielczości czasowej i z podstawaniem rozdzielczości poprzez regulację płynu. Ponadto nasz system może uzyskać dużą liczbę porównawczych wyników eksperymentalnych za pomocą prostych operacji.

Nasz system opiera się na zasadzie dyfuzji, powoduje minimalne zakłócenia mechaniczne w mikrośrodowisku komórkowym. Aby uzyskać bardziej stabilne chipy mikrośrodowiska komórkowego, można zwiększyć listę warstwy buforowej jako głębokość warstwy hodowlanej lub zmniejszyć płyn wejściowy wymiany pożywki, czyli zmniejszyć ciśnienie, co będzie tutaj dla badań nad zachowaniem komórki. Należy zauważyć, że w tym badaniu zbadano tylko hodowlę komórek 3T3 i NSC.

W przypadku innych komórek lub linii komórkowych warunki hodowli są porównywalne z naszymi parametrami, aby je dostosować.