Name: Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Poznaj metodę projektowania i wytwarzania wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego do dynamicznej kontroli mikrośrodowiska komórkowego. Platforma umożliwia precyzyjne badania różnicowania i samoodnawiania się komórek macierzystych nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie techniczne ze strony Zhifeng Cheng z Chansn Instrument (China) LTD. Praca ta była wspierana przez granty (Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych,51927804).

1. Projektowanie układów mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Zaprojektuj multiplekser mikroprzepływowy składający się z 18 wlotów, z których każdy jest sterowany przez indywidualny zawór i pompę perystaltyczną. Aby zwiększyć objętość cieczy napędzaną na cykl pompowania, pompa perystaltyczna powinna składać się z 3 kanałów sterujących, które zostały celowo poszerzone do 200 μm, oraz 10 połączonych przewodów przepływowych.</li>
	<li>Zaprojektuj komorę hodowlaną bez ścinania. Replikacja 2-poziomowej jednostki hodowli składa się z dolnej komory hodowli komórkowej (400 μm x 400 μm x 150 μm) i wyższej warstwy buforowej (400 μm x 400 μm x 75 μm), która zapobiega niepożądanym naprężeniom ścinającym na komórkach podczas wymiany pożywki (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Projektowanie funkcji o wysokiej przepływności. Zduplikuj jednostkę hodowli, aby utworzyć układ matrycy 30 x 50, zajmujący powierzchnię o wymiarach około 7 cm na 5 cm.</li>
</ol>
2. Produkcja i eksploatacja chipów
<ol>
	<li>Wykonanie odlewu repliki z wykorzystaniem litografii UV 
	UWAGA: Formowanie repliki zostało wykonane na płytce krzemowej zgodnie ze standardowym protokołem fotolitografii8.
	<ol>
		<li>Wykonanie konstrukcji kanałów
		<ol>
			<li>Fotorezystor wirujący: Odwiruj 5 ml ujemnego fotorezystu SU-8 3025 na płytce krzemowej z prędkością 500 obr./min przez 10 s i 3000 obr./min przez 30 s.</li>
			<li>Miękkie pieczenie: Połóż wafel na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 2 minuty, a następnie 95 °C na 10 minut, Schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
			<li>Wyrównanie i utwardzenie: Zamocuj wafel i maskę na uchwycie nakładki i włącz źródło światła na 18 sekund, aby utwardzić naświetlony fotorezyst</li>.
			<li>Pieczenie przed ekspozycją: Rozgrzej wafel do 95°C przy 110°C/h od temperatury pokojowej i trzymaj go przez co najmniej 40 minut do wyjęcia.</li>
			<li>Wywoływanie: Zanurz płytkę w roztworze wywołującym (wywoływacz SU-8) i mieszaj ją przez 2,5 minuty, aby zmyć zbędny fotorezyst i uzyskać strukturę kanału o wysokości 25 μm.</li>
			<li>Pieczenie na twardo: Przykryj wafel szklaną szalką Petriego i piecz w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie zwiększ do 160 °C w temperaturze 120 °C/h i przechowuj przez 3 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonanie komory hodowli komórkowej z warstwą buforową
		<ol>
			<li>Użyj parametrów kroku 2.1.1.1, aby odwirować 7 ml ujemnego fotorezystu SU-8 3075 na powyższej płytce.</li>
			<li>Upiecz na miękko (opisany w kroku 2.1.1.2) wafel i zmień maskę, aby dobrze wyrównała się z markerami na wafli. Następnie włącz źródło światła na 24 s, aby utwardzić naświetlony fotorezyst.</li>
			<li>Zanurz płytkę w roztworze rozwijającym (wywoływacz SU-8) i mieszaj go przez 4 minuty i 40 sekund, aby zmyć zbędny fotorezyst i uzyskać strukturę warstwową o wysokości 75 μm, która wokół struktury kanałowej o wysokości 25 μm została wcześniej wytworzona. Upiecz na twardo (opisany w kroku 2.1.1.6) wafel, aby wzmocnić złożoną strukturę.</li>
			<li>Powtórz kroki 2.1.2.1-2.1.2.3, aby wytworzyć strukturę komory o wysokości 75 μm, która układa się na strukturze warstwy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonanie konstrukcji zaworów
		<ol>
			<li>Korzystając z parametru kroku 2.1.1.1, odwirować powłokę 5 ml dodatniego fotorezystu AZ 50x na powyższej płytce.</li>
			<li>Miękkie upieczenie (opisane w kroku 2.1.1.2) wafla i wyrównanie maski z markerami na płytce, a następnie pozostawienie źródła światła włączonego przez 20 s i natychmiastowego wyłączenia na 30 s. Powtórz procedurę włączania/wyłączania światła w 5 okręgach, aby utwardzić naświetlony fotorezyst</li>.
			<li>Zanurz wafel w dopasowanym wywoływaczu i mieszaj go przez około 8 minut, aby zmyć zbędny fotorezyst i uzyskać okrągłe zawory, które zachodzą na kanały sterujące, aby zapewnić dobre połączenie. Wypiekamy na twardo (opisaną w kroku 2.1.1.6) wzorzystą wafelkę, aby cały model był mocniejszy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja chipów mikroprzepływowych z wykorzystaniem miękkiej litografii
	<ol>
		<li>Wzorzyste i puste płytki krzemowe należy traktować rymetylochlorosilanem przez 15 minut.</li>
		<li>Przygotować 3 porcje żelu PDMS (stosunek monomeru do katalizatora 10:1) odpowiadające odpowiednio 50 g warstwy płynięcia, 20 g warstwy kontrolnej 2 i 20 g membrany.</li>
		<li>Odlej 50 g żelu PDMS na wzorzystą płytkę krzemową i odgazowuj je przez 1-2 godziny w komorze próżniowej przy -0,85 MPa, aby skopiować warstwę przepływu.</li>
		<li>Odgazuj 2 porcje 20 g PDMS i obracaj je na wzorzystej płytce i czystej płytce krzemowej z prędkością 2000-2800 obr./min przez 30 s, aby przygotować warstwę kontrolną i warstwę membrany.</li>
		<li>Umieścić wafle pokryte PDMS w piecu wentylacyjnym na 60 minut w temperaturze 80 °C w celu inkubacji.</li>
		<li>Wyrównaj i połącz ze sobą różne warstwy za pomocą niestandardowego urządzenia optycznego (powiększenie 100x) i maszyny do trawienia plazmowego. Następnie przechowuj go w piekarniku wentylacyjnym przez 2 godziny w temperaturze 80 °C, aby poprawić wiązanie wióra.</li>
		<li>Przebić otwory wlotowe w chipie, a następnie przymocować go do szkiełka nakrywkowego pokrytego PDMS i utwardzać przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 80 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Operacja na wiórach
	<ol>
		<li>Podłącz miniaturowe pneumatyczne zawory elektromagnetyczne do warstwy sterującej układu scalonego i otwórz niestandardowy graficzny interfejs użytkownika MATLAB8, aby połączyć i sterować przełącznikiem.</li>
		<li>Ustawić ciśnienie zamykania zaworów membranowych push-up PDMS na 25 psi.</li>
		<li>Dostarczaj dynamicznie zmieniające się kombinatoryczne/sekwencyjne dane wejściowe do wyznaczonych komór (<silna klasa="xfig">Rysunek 2d) poprzez terminowe włączanie i wyłączanie zaworów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generowanie dynamicznych danych wejściowych w mikrośrodowiskach komórkowych
<ol>
	<li>Obróbka wiórów i ładowanie komórek
	<ol>
		<li>Utrzymać standardowe warunki hodowli (37 °C, 5% CO2 ) pod mikroskopem przez co najmniej 5 godzin.</li>
		<li>Napełnić zrębek pożywką powlekającą (tj. wymienioną w UWAGA) i inkubować go w standardowych warunkach hodowli (opisanych w kroku 3.1.1) przez co najmniej jedną godzinę.</li>
		<li>Przepłukać chip solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub pożywką do hodowli komórkowych (pożywką Modified Eagle firmy Dulbecco, DMEM), aby zbudować zdrowe środowisko hodowlane.</li>
		<li>Zbierz komórki przy 80% zbiegu i ponownie zawieś komórki za pomocą pożywki hodowlanej (DMEM) o gęstości ~ 106/ml. Następnie załaduj ogniwa do chipa, zwiększając ciśnienie w roztworze zawierającym ogniwa. 
		UWAGA: Hodowla różnych linii komórkowych na chipie wymaga odpowiedniego podłoża powlekającego do traktowania komory hodowli komórkowej. Zazwyczaj w przypadku eksperymentów na fibroblastach 3T3 i adherentnej hodowli kur wszystkie zawory sterujące komorami hodowlanymi są otwarte, komórki przepływają do wszystkich komór hodowlanych w tej samej kolumnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja do obrazowania na żywo o wysokiej przepustowości 
	UWAGA: Do akwizycji obrazu użyto odwróconego mikroskopu z automatycznym stolikiem translacyjnym oraz cyfrowej kamery CMOS (Complementary metal-oxide semiconductor). Scena i akwizycja obrazu były kontrolowane za pomocą dostosowanego do potrzeb oprogramowania.
	<ol>
		<li>Wizualizuj matrycę komór hodowlanych za pomocą soczewki obiektywowej 10x w jasnym polu, aby potwierdzić i zdefiniować współrzędne lokalizacji każdej komory matrycy komorowej o wymiarach 30 na 50</li>.
		<li>Przekształć soczewkę obiektywu na 20x lub 40x, a następnie wybierz współrzędne lokalizacji żądanej komory, a etap translacyjny przesuwa się do przypisanej pozycji po potwierdzeniu. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej x, y, z, aby uzyskać optymalny obraz.</li>
		<li>Optymalne natężenie światła, czas naświetlania i inne parametry obrazowania określano indywidualnie dla każdego kanału (tj. obrazowanie w jasnym polu i fluorescencyjne).</li>
		<li>Ustaw interwał i czas trwania cyklu obrazowania, zapisz ścieżkę, a następnie rozpocznij obrazowanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+platform+for+quantitative+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A robotic platform for quantitative high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).</li>
<li>Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+automation+using+elastomeric+valves+and+droplets%3A+reducing+reliance+on+external+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers.</a> Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).</li>
<li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%3A+the+evolution+of+design+rules+for+biological+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).</li>
<li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).</li>
<li>Junkin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+quantification+of+single-cell+immune+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-content quantification of single-cell immune dynamics.</a> Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).</li>
<li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+origin%2C+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li>
<li>Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+neural+stem+cells+by+bHLH+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors.</a> Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-multiplexed+analysis+of+single-cell+dynamics+reveals+logic+rules+in+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
<li>Quake, S. R., Scherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+micro-to+nanofabrication+with+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">From micro-to nanofabrication with soft materials.</a> Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).</li>
<li>Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOkandan%2C+M+%22Microfluidics+and+BioMEMS%22">Microfluidics and BioMEMS</a>. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%2C+Sixth+Edition%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition</a>. , (1983).</li>
<li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+reprograms+resident+astrocytes+into+neural+progenitors+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).</li>
<li>Sarkar, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+differentiated+%CE%B2-endorphin+neurons+promote+immune+function+and+prevent+prostate+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).</li>
<li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-induced+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+into+astrocytes+is+mediated+via+the+%CE%B2+isoform+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase.</a> C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).</li>
<li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+PACAP-induced+differentiation+of+neural+stem+cells+into+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
<li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+analysis+on+a+droplet-in-oil+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array.</a> Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).</li>
<li>Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+microwell+device+for+immunomagnetic+single-cell+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16(2018).</li>
<li>Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+big+thing+of+a+small+cell-recent+advances+in+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis.</a> Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).</li>
<li>Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microfluidics%3A+opportunity+for+bioprocess+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development.</a> Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).</li>
<li>Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+H+%22Optimization+in+Drug+Discovery%22">Optimization in Drug Discovery</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).</li>
<li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+water+collection+on+integrative+bioinspired+surfaces+with+star-shaped+wettability+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns.</a> Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).</li>
<li>Zhao, J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+or+against+topographic+wettability+gradient%3A+movements+of+droplets+on+a+micropatterned+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface.</a> Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).</li>
<li>Theberge, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+combinatorial+synthesis+in+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+ceramic+microspheres+by+diffusion-induced+sol-gel+reaction+in+double+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).</li>
<li>Moerman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+in+nanoliter+wells+by+prefilling+of+wells+using+electrospray+deposition+followed+by+sample+introduction+with+a+coverslip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method.</a> Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).</li>
<li>Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+dispensing+method+by+degassed+poly+%28dimethylsiloxane%29+microchannels+and+its+application+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization.</a> Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowano różne urządzenia mikroprzepływowe do wykonywania multipleksowanych i złożonych eksperymentów 17,18,19,20. Na przykład mikrostudzienki wykonane z szeregu wgłębień topologicznych mogą uwięzić pojedyncze komórki bez użycia siły zewnętrznej, wykazując korzystne cechy, w tym mały rozmiar próbki, równoległość, niższy koszt materiału, szybszą reakcję, wysoką czułość 21,22,23,24.<sup class="...

Techniki o wysokiej przepustowości są kluczowe dla badań biomedycznych i klinicznych. Przeprowadzając równolegle miliony testów chemicznych, genetycznych lub testów żywych komórek i organoidów, naukowcy mogą szybko zidentyfikować geny, które modulują szlak biomolekularny i dostosować sekwencyjne wprowadzanie leków do konkretnych potrzeb. Robotics1 i chipy mikroprzepływowe w połączeniu z programem do sterowania urządzeniami pozwalają na automatyzację złożonych procedur eksperymentalnych, obejmujących manipulację komórkami/tkankami, obsługę cieczy, obrazowanie i przetwarzanie danych/kontrolę2,3. W związku z tym setki i tysiące warunków eksperymentalnych mogą być utrzymywane na jednym chipie, zgodnie z pożądaną przepustowością4,5. 
W tym protokole opisaliśmy proces projektowania i produkcji urządzenia mikroprzepływowego, które składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. 2-poziomowa komora do hodowli komórkowych zapobiega niepotrzebnemu ścinaniu podczas wymiany pożywki, co zapewnia niezakłócone środowisko hodowli do długotrwałego obrazowania żywych komórek. Badania wykazują, że proponowane urządzenie mikroprzepływowe jest odpowiednią platformą do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi mechanizmami życia. Co więcej, zaawansowane funkcje chipa mikroprzepływowego umożliwiają automatyczne odtwarzanie wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo, takich jak ciągle zmieniające się kompozycje cytokin i ligandów6,7, których ukończenie zajmuje miesiące w przypadku konwencjonalnych platform, takich jak płytka 96-dołkowa.

<table><tbody><tr><td>2713 Loker Avenue West</td><td>Torrey pines scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ-50X</td><td>AZ Electronic Materials, Luksemburg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator chlorotrimetylosililanu (TMCS) 92360-25 ml</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 HP151</td><td>Heal Force</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desktop Dziurkacz do chipów PDMS WH-CF-14</td><td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (L-glutamina, wysoka glukoza, czerwień henolowa)</td> <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna UTP-313 Max: 600 g, e: 0,1 g, d: 0,01 g</td><td>Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co., LTD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronection 0,25 mg / ml</td><td>milipore, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td> Inkubator grzewczy <td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BGG-9240A</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Model Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep 10 jednostek/ml Penicylina 10 ug/ml Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy PDC-002</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polidimetylosiloksan(PDMS)</td><td>Momentive</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polilizyna 0,01%</td><td>Powlekarka Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin ARE-310</td><td>Awatori Rentaro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa TDZ5-WS</td><td>Powlekarka Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin WH-SC-01</td><td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem, Westborough, MA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3075</td><td>MicroChem, Westborough, MA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Naśladowanie warunków środowiskowych in vivo jest kluczowe dla badań in vitro nad złożonymi maszyneriami życia. Jednak obecne techniki ukierunkowane na żywe komórki i narządy są albo bardzo drogie, jak robotyka, albo brakuje im dokładności w nanolitrach i milisekundach w manipulacji cieczami. Przedstawiamy projekt i wykonanie systemu mikroprzepływowego, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Aby zademonstrować możliwości urządzenia mikroprzepływowego, w proponowanym systemie utrzymywane są sfery nerwowych komórek macierzystych (NSC). Zaobserwowaliśmy, że gdy sfera NSC jest wystawiona na działanie CXCL w dniu 1 i EGF w dniu 2, okrągła konformacja jest dobrze zachowana. Zmienność kolejności wprowadzania 6 leków powoduje zmiany morfologiczne w sferze NSC i reprezentatywnym dla poziomu ekspresji markera pnia NSC (tj. Hes5 i Dcx). Wyniki te wskazują, że dynamiczne i złożone warunki środowiskowe mają ogromny wpływ na różnicowanie i samoodnawianie się NSC, a proponowane urządzenie mikroprzepływowe jest odpowiednią platformą do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia.

Konwencjonalna pompa perystaltyczna na chipie została po raz pierwszy opisana przez Stephena Quake'a w 2000 roku, w której perystaltyka była aktywowana sekwencją 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Liczby 0 i 1 oznaczają odpowiednio stan „otwarty” i „zamknięty” 3 poziomych linii sterujących. Zgłaszano również badania z wykorzystaniem więcej niż 3 zaworów (np. pięciu)11. Mimo że pompa perystaltyczna składająca się z 3 linii sterujących i 3 l...

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Mikrośrodowisko umożliwia bardzo złożone i dynamiczne procesy, w tym ciągle zmieniające się cytokiny, stężenie ligandów i skład. Stworzenie podobnego środowiska hodowlanego ma kluczowe znaczenie dla badań in vitro nad złożonymi mechanizmami życiowymi, takimi jak różnicowanie komórek macierzystych, odpowiedzi immunologiczne i rozwój narządów na platformach chipowych. Jednak generowanie i dostarczanie sygnałów chemicznych o objętości nanolitrów i milisekundach jest trudne przy użyciu konwencjonalnych metod biomedycznych, takich jak pipetowanie.Aby sprostać tym wyzwaniom, istnieje duże zapotrzebowanie na platformę kulturową, która jest w stanie naprzemiennie generować obrazy dynamicznego sygnału kombinatorycznego i sekwencyjnego. W niniejszym protokole przedstawiono procedurę projektowania i wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego. Proponowany chip mikroprzepływowy składa się z 1500 jednostek hodowlanych, zestawu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu.Pokazujemy, że platforma nadaje się do badań na pojedynczych komórkach, dwuwymiarowych populacjach komórek i trójwymiarowych sferach neuronowych. Złożone i dynamiczne warunki środowiskowe na chipie mają ogromny wpływ na różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i samoodnawianie. Szczegóły procedur projektowania i produkcji są następujące.Projekt chipa został wykonany przy użyciu oprogramowania AutoCAD. Aby dopasować rozmiar uchwytu płytki pod mikroskopem, chip mikroprzepływowy ma wymiary około siedmiu na pięć centymetrów i składa się z 1 500 komór hodowlanych. Jedną z ważnych cech jest to, że posiada pompę perystaltyczną, która składa się z ośmiu kanałów przepływowych i kanałów sterujących o szerokości 200 mikrometrów.Zwiększenie nakładającego się obszaru między kanałem sterującym a kanałem przepływowym wzrosło 16-krotnie w porównaniu z pompą perystaltyczną, zaproponowaną przez Stephena Quake'a w 2002 roku, do około 15 nanolitrów cieczy na cykl pompowania i wystarcza do utrzymania 1500 niezależnych warunków środowiskowych równolegle na chipie. Kolejną ważną częścią urządzenia jest dwuwarstwowa komora hodowlana, która może utrzymać środowisko hodowli bez ścinania. Niepożądanym naprężeniom ścinającym zapobiega się poprzez szybkie przeprowadzenie go przez wierzchnią warstwę.Komórki, tkanki i kluczowa pożywka warunkowa pozostają nietknięte w dolnej warstwie. Symulacja numeryczna sugeruje, że gdy ciecze są kierowane przez komory hodowlane, od lewej do prawej. Siłom tnącym można skutecznie zapobiec.Nawet przy wejściowym natężeniu przepływu wynoszącym 10 milimetrów na sekundę komórki lub tkanki o wielkości mikrometra pozostają nienaruszone na dnie jednostki hodowli. Wykonaliśmy replikę formy lub wafla krzemowego przy użyciu litografii UV. Kanały przepływowe o wysokości 25 mikrometrów i wadze 100 mikrometrów są wytwarzane przy użyciu ujemnego fotorezystu SU-8 3025.Komory hodowlane o wysokości 75 mikrometrów i 150 mikrometrów zostały wykonane przy użyciu fotorezystu SU-8 3075. Dodatni fotorezystor AZ50X służy do okrągłych elementów studni, które nakładają się na kanały sterujące, aby zapewnić dobre połączenie. Aby wyprodukować chip mikrofludyczny, wzorzyste i puste płytki krzemowe zostały najpierw poddane obróbce TMCS.Różne ilości PDMS 10 do 1 stosunku monomeru do katalizatora dokładnie wymieszano i odbąbelkowano przez jedną do dwóch godzin w komorze próżniowej przy minus 0,85 megapaskala. Warstwę kontrolną uzyskano przez powlekanie wirowe PDMS przy 2 200 obr./min. Wafle krzemowe przeniesiono następnie do inkubatora i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Różne warstwy zostały wyrównane i połączone ze sobą za pomocą niestandardowego urządzenia optycznego i maszyny do trawienia plazmowego. Otwory wlotowe zostały następnie przebite po kolejnych dwóch godzinach klejenia termicznego w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Chip został przyklejony do szkiełka nakrywkowego pokrytego PDMS, które jest tego samego rozmiaru co płytka 96-dołkowa i utwardzany przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 80 stopni dośrodkowych przed użyciem.Do pracy kanały sterujące zostały podłączone do miniaturowych pneumatycznych zaworów elektromagnetycznych za pomocą plastikowych rurek. Toczenie wszystkich studni penumatycznych było kontrolowane przez niestandardowy program MATLAB za pośrednictwem graficznego interfejsu użytkownika. Optymalne ciśnienia zamykania zaworów membranowych push-up PDMS zostały określone indywidualnie dla każdego chipa, które zwykle wahają się od 25 do 30 PSI.Obracając wszystkie serie studni, na chipie można dynamicznie generować kombinatoryczne i sekwencyjne dane wejściowe. Komórki zebrano przy 80% konfluencji i ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej DMEM o gęstości około 10 do potęgi sześć na mililitr, które następnie załadowano do chipa poprzez zwiększenie ciśnienia w komórce zawierającej roztwór. Zarówno w przypadku hodowli adherentnej, jak i zawiesinowej neurokomórek macierzystych, pobrano komórki, a kulki zostały bezpośrednio załadowane do chipa.Do akwizycji obrazu wykorzystano mikroskop odwrócony z automatycznym stolikiem translacyjnym oraz cyfrową kamerę półprzewodnikową z komplementarnym tlenkiem metalu. Stolik i akwizycja obrazu były kontrolowane za pomocą oprogramowania, które pokazuje górny lewy róg i prawy dolny róg jako punkty wyboru i przesuwają etap translacyjny do punktów uporządkowanych, aby uzyskać wstępne obrazowanie za pomocą soczewki obiektywowej 4x. Wymień soczewkę obiektywu 4x na soczewkę 20x i dostosuj parametry obrazowania, w tym natężenie światła, czas ekspozycji i tak dalej.Następnie zlokalizuj punkty wyboru tak, aby położenie każdej komory opuszczało matrycę komory 13 na 15 lub zostało zdefiniowane przez program automatycznie. Po określeniu współrzędnych komór, etap translacyjny przenosi się do każdej komory, w której można precyzyjnie dostroić płaszczyznę ogniskową X, Y, Z. Ustaw interwał i czas trwania cyklu obrazowania.Zapisz ścieżkę, a następnie rozpocznij obrazowanie. System ten jest dostępny do różnych dynamicznych śledzenia celów, takich jak różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w jasnym polu i pole fluorescencyjne procesu tworzenia się sfery nerwowych komórek macierzystych. Analiza danych.Zmień format w nd2 na Tif za pomocą niestandardowego programu MATLAB. I podziel dane według punktów. Wybierz obiekt do analizy, który ma być analizowany, to komórka lub tkanka.Wprowadź próg, rozmiar obiektu, rozmiar szumu do analizy. Możesz też wybrać analizę krok po kroku do optymalnych parametrów. A potem analizowanie wszystkich danych.Po zapisaniu wyniku w formacie MAT, używając wykresu do narysowania wyników lub śladów. W artykule opisano protokół i hodowlę wysokoprzepustowego mikroprzepływowego systemu chipowego opartego na technologii fotolitografii do dynamicznej kontroli mikrośrodowiska żywej komórki. Opisaliśmy również niektóre parametry, które należy dokładnie kontrolować, takie jak ciśnienie zamykania zaworów membranowych PDMS i regulacja wirowania płynu równolegle do komory.W tradycyjnej hodowli komórkowej in vitro obróbka środowiska hodowli komórkowej odbywa się ręcznie, co jest czasochłonne i pracochłonne, a napełnianie płynem nie jest łatwe do standardowej kontroli. Szczególnie minuty roztworu. Istnieją pewne problemy, takie jak generowanie danych wejściowych, stężenie leków immunologicznych i duże spożycie.Jednak przy użyciu naszego systemu mikroprzepływowego możliwe jest powtórzenie go jako stymulatora przy ustalonej dawce pojedynczego płynu o równym stężeniu, porównanie różnych kultur w różnych komorach hodowlanych w tym samym czasie. Różni się od jakiegoś miniaturowego bodźca wstecznego rozdzielczości czasowej i z podstawaniem rozdzielczości poprzez regulację płynu. Ponadto nasz system może uzyskać dużą liczbę porównawczych wyników eksperymentalnych za pomocą prostych operacji.Nasz system opiera się na zasadzie dyfuzji, powoduje minimalne zakłócenia mechaniczne w mikrośrodowisku komórkowym. Aby uzyskać bardziej stabilne chipy mikrośrodowiska komórkowego, można zwiększyć listę warstwy buforowej jako głębokość warstwy hodowlanej lub zmniejszyć płyn wejściowy wymiany pożywki, czyli zmniejszyć ciśnienie, co będzie tutaj dla badań nad zachowaniem komórki. Należy zauważyć, że w tym badaniu zbadano tylko hodowlę komórek 3T3 i NSC.W przypadku innych komórek lub linii komórkowych warunki hodowli są porównywalne z naszymi parametrami, aby je dostosować.

generation-dynamical-environmental-conditions-using-high-throughput

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Ten protokół przedstawia system mikrofluidyczny do badania mikrobiologiczne precipitacji minerałów tlenku manganu. Powstawanie biomineralu jest mierzone in situ za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. To podejście może być dostosowane do badania precipitacji innych charakterystycznie zabarwionych biogenicznych minerałów w środowiskach porowatych.

Mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

Poznaj metodę projektowania i wytwarzania wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego do dynamicznej kontroli mikrośrodowiska komórkowego. Platforma umożliwia precyzyjne badania różnicowania i samoodnawiania się komórek macierzystych nerwowych.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów