Name: Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli pojedynczych komórek na mikroprzepływowym chipie z wykorzystaniem łagodnego przepływu i siły grawitacji. Technika minimalizuje uszkodzenia komórek i znajduje zastosowanie w badaniach nad heterogenicznością komórkową oraz diagnostyce nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta grantem z National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

Uwaga: Projekty fotomasek do produkcji naszych urządzeń mikroprzepływowych zostały narysowane przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Projekty zostały następnie wykorzystane do produkcji chromowanych fotomasek za pomocą usługi komercyjnej. Urządzenia PDMS zostały wykonane technikami miękkiej litografii. 11
1. Wytwarzanie form wzorcowych metodą litografii
<ol>
	<li>Przed procesem fotolitografii12 należy użyć 4-calowych wafli krzemowych jako podłoża i odwodnić je w konwencjonalnym piecu w temperaturze 120 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Oczyść odwodnione płytki krzemowe za pomocą plazmy tlenowej o mocy 100 watów przez 30 sekund w odkurzaczu plazmowym.</li>
	<li>Rozgrzej dwie płyty grzejne odpowiednio w temperaturze 65 °C i 95 °C do następnego procesu pieczenia.</li>
	<li>Pokryć 5 g ujemnego fotorezystu (PR) na oczyszczonych płytkach krzemowych za pomocą powlekarki wirowej; wirować z prędkością 1200 obr./min (SU-8 50) przez 30 sekund, aby uzyskać warstwę mikrokanałową.</li>
	<li>Umieść wafel pokryty PR na rozgrzanej płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 12 minut i przenieś go na inną podgrzaną płytę grzejną w temperaturze 95 °C na 33 minuty (dla wzorów o grubości 100 μm), aby przeprowadzić proces pieczenia na miękko.</li>
	<li>Po upieczeniu umieść płytkę silikonową pokrytą PR na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównaj ją z przezroczystą fotomaską o rozdzielczości 25 400 dpi.</li>
	<li>Wystaw płytkę krzemową pokrytą PR na działanie światła UV (365 nm) w dawce 500 mJ/cm2, aby stworzyć wzór PR na płytce krzemowej.</li>
	<li>Wyjmij wafel z nakładki i umieść go na płycie grzejnej do pieczenia po upieczeniu w temperaturze 95 °C na 12 minut.</li>
	<li>Namocz wafle w roztworze wywoływacza SU-8 (octan eteru monometylowego glikolu propylenowego, PGMEA) w celu zmycia nieusieciowanego PR przez 12 minut i delikatnie osusz gazowym azotem, aby odsłonić ślady wyrównania.</li>
	<li>Ponownie pokryj 5 g ujemnego fotorezystu na płytkach za pomocą powlekarki wirowej; wiruj z prędkością 700 obr./min (SU-8 100) przez 30 sekund i 1,200 obr./min (SU-8 10) przez 30 sekund, aby uzyskać odpowiednio wzór o grubości 300 μm i wzór o grubości 27 μm, aby utworzyć warstwę mikrostudzienki.</li>
	<li>Umieścić płytkę pokrytą PR na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 4 minuty i w temperaturze 95 °C na 8 minut (dla warstwy studzienki wychwytującej o głębokości 27 μm); oraz w temperaturze 65 °C na 40 minut i w temperaturze 95 °C na 110 minut (dla warstwy dołka o głębokości 300 μm).</li>
	<li>Po schłodzeniu umieść wafel silikonowy pokryty PR na nakładce maski wyposażonej w światło UV.</li>
	<li>Wystaw płytkę krzemową pokrytą PR na działanie światła UV (365 nm) w dawce 250 mJ/cm2 (dla wzoru o grubości 27 μm) i 700 mJ/cm2 (dla wzoru o grubości 300 μm).</li>
	<li>Wafle pieczemy w temperaturze 95 °C odpowiednio przez 5 minut (wzór o grubości 27 μm) i 30 minut (wzór o grubości 300 μm).</li>
	<li>Nieusieciowany PR należy zmyć za pomocą PGMEA odpowiednio przez 6 minut (wzór o grubości 27 μm) i 25 minut (wzór o grubości 300 μm), a następnie wysuszyć je gazowym azotem.</li>
	<li>Zmierz wysokość cech wzoru na płytce za pomocą skanującego profilometru laserowego, umieszczając płytkę na stoliku xy skanującego profilometru laserowego.
	<ol>
		<li>Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby wyraźnie pokazać cechy wzoru na płytce, korzystając z trybu obserwacji "widok z kamery" pod obiektywem 20X.</li>
		<li>Przełącz tryb obserwacji z "widoku kamery" na "widok laserowy" i ustaw górną i dolną pozycję funkcji.</li>
		<li>Ustaw tryb pomiaru, obszar, jakość i podziałkę z odpowiednio na przezroczystość (góra), 1 linia (1 024 x 1), wysoka dokładność i 0.5 μm, a następnie naciśnij początek na dole, aby rozpocząć pomiar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzeń PDMS do izolacji pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Przed odlaniem PDMS należy sylianizować formy główne trichlorosilanem, aby uzyskać hydrofobową powierzchnię, która ułatwia odklejanie replik PDMS od form głównych.
	<ol>
		<li>Umieścić formy wzorcowe i łódkę ważącą zawierającą 200 μl trichlorosilanu w eksykatorze i stosować podciśnienie (-85 kPa) przez 15 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj próżnię, a następnie pozostaw formy wzorcowe w eksykatorze w celu silanizowania form wzorcowych w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Wyjąć formy wzorcowe z eksykatora i umieścić każdą formę wzorcową na szalce Petriego o średnicy 10 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj łączną ilość 17,6 g zestawu polimerów PDMS zawierającego bazę i utwardzacz w stosunku 10:1, a następnie wlej PDMS na formę wzorcową na szalce Petriego.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze i stosować podciśnienie (-85 kPa) przez 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z PDMS.</li>
	<li>Wyjąć szalkę Petriego z eksykatora i umieścić ją w tradycyjnym piekarniku w temperaturze 65 °C na 3-6 godzin w celu utwardzenia PDMS.</li>
	<li>Wyjmij utwardzone repliki PDMS z form wzorcowych i przebij dwa otwory jako wlot i wylot na dwóch końcach mikrokanału w replice PDMS z matrycą wychwytującą za pomocą dziurkacza o średnicy wewnętrznej 0,75 mm dla kanału płynowego (Rysunek 2A).</li>
	<li>Użyj taśmy, aby oczyścić powierzchnię replik PDMS, a następnie umieść repliki PDMS w czyszczarce plazmowej w celu krótkiej obróbki plazmą tlenową (100 watów przez 14 sekund).</li>
	<li>Usuń repliki PDMS z maszyny plazmy tlenowej.</li>
	<li>Ustawić ręcznie górną (zawierającą mikrostudzienki wychwytujące) i dolną replikę PDMS (zawierającą mikrostudzienki hodowlane) pod mikroskopem stereoskopowym i doprowadzić je do kontaktu.</li>
	<li>Umieść wyrównane repliki PDMS w piekarniku w temperaturze 65 °C na 24 godziny, aby uzyskać trwałe połączenie między replikami PDMS w celu utworzenia urządzenia końcowego.</li>
	<li>Zanurzyć urządzenie PDMS w pojemniku wypełnionym wodą dejonizowaną (DI) i umieścić pojemnik w eksykatorze pod próżnią (-85 kPa) na 15 minut w celu usunięcia powietrza z mikrokanalika urządzenia PDMS.</li>
	<li>Umieść urządzenie PDMS wypełnione wodą DI w kapturze do hodowli tkankowej i użyj światła UV (długość fali światła: 254 nm) do sterylizacji urządzenia przez 30 minut.</li>
	<li>Zastąp wodę DI w urządzeniu PDMS 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x roztworze PBS i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby zapobiec przywieraniu komórek do powierzchni PDMS. 
	Uwaga: Powłoka BSA ma kluczowe znaczenie dla poprawy wydajności transferu izolowanych komórek z dołka wychwytującego do dołka hodowlanego.</li>
	<li>Zastąp 5% roztwór BSA w urządzeniu PDMS wysterylizowanym roztworem 1x PBS.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
<ol>
	<li>Hodowla nerwowych komórek macierzystych KT98 oraz ludzkich komórek rakowych A549 i MDA-MB-435 na szalce Petriego w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w celu przygotowania komórek do eksperymentu komórkowego z urządzeniem PDMS.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć zużytą pożywkę hodowlaną (podłoże podstawowe DMEM zaopatrzone w 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków) z szalki hodowlanej z komórkami wyhodowanymi do zbiegu 70 - 80%.</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki trzykrotnie wysterylizowanym PBS.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić PBS i dodać 2 ml rekombinowanej mieszaniny enzymów o działaniu proteolitycznym, kolagenolitycznym i DNazy (szczegółowe informacje można znaleźć w Wykazie materiałów).</li>
	<li>Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie postukaj w szalkę hodowlaną, aby ułatwić odłączenie komórek.</li>
	<li>Dodać 4 ml wysterylizowanego PBS w celu rozproszenia komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić osad komórek w 1 ml wysterylizowanego PBS i policzyć liczbę żywych komórek przy użyciu standardowej metody wykluczania błękitu trypanowego13, 
	Uwaga: Ten etap ponownego zawieszania ma kluczowe znaczenie dla przygotowania dobrze zdysocjowanej zawiesiny pojedynczej komórki w celu poprawy wydajności izolacji pojedynczej komórki.</li>
</ol>
4. Izolacja pojedynczej komórki i hodowla klonalna
<ol>
	<li>Załadować 50 μl zawiesiny komórek o stężeniu 2,2 - 2,5 x106 komórek/ml do mikrokanalika urządzenia PDMS przez otwór wylotowy urządzenia za pomocą ręcznej pipety. 
	Uwaga: Pipeta ładująca zawiesinę komórek musi zostać zatrzymana i przytrzymana w pierwszej pozycji zatrzymania, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrokanału.</li>
	<li>Załaduj kolejne 50 μl zawiesiny komórek przez otwór wlotowy, aby równomiernie wypełnić cały mikrokanalik komórkami.</li>
	<li>Uszczelnij otwór wylotowy zatyczką (nylonowa żyłka o długości 3 mm i średnicy 1 mm), aby uniknąć przepływu wywołanego ciśnieniem hydrostatycznym z kropelek na otworach wlotowych i wylotowych. 
	Uwaga: Zatyczki zostały wysterylizowane promieniami UV w kapturze do hodowli tkankowych przed użyciem.</li>
	<li>Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml pożywką hodowlaną, usuń z niej pęcherzyki powietrza i umieść ją na pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Podłączyć średnio obciążoną strzykawkę do otworu wlotowego urządzenia PDMS za pomocą igły 23 G i rurki z politetrafluoroetenu (PTFE).</li>
	<li>Wyjmij wtyczkę z otworu wylotowego i odczekaj 2-minutowy odstęp czasu, aby komórki mogły osiąść w studzienkach wychwytywania pojedynczych komórek pod wpływem siły grawitacyjnej.</li>
	<li>Niewychwycone komórki przepłukać 300 μl pożywki hodowlanej o natężeniu przepływu 600 μl/min napędzanym przez pompę strzykawkową.</li>
	<li>Odczekaj 2 minuty, aby ustabilizować urządzenie i uszczelnij otwory wlotowe i wylotowe zatyczkami, aby utworzyć zamknięty system hodowli.</li>
	<li>Odwróć urządzenie ręcznie, aby przenieść uchwycone pojedyncze komórki do mikrodołków hodowlanych.</li>
	<li>Umieść urządzenie PDMS w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i dodaj 10 ml wysterylizowanego PBS wokół urządzenia, aby uniknąć parowania pożywki hodowlanej z mikrokanału.</li>
	<li>Przenieść naczynie hodowlane do konwencjonalnego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w celu hodowli klonalnej pojedynczych komórek.</li>
</ol>
5. Uzupełnienie podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>Po 1 d hodowli zastąp pożywkę hodowlaną w urządzeniu PDMS świeżą pożywką, aby poprawić proliferację komórek.</li>
	<li>Umieść dwie kropelki pożywki hodowlanej na górze urządzenia PDMS w pobliżu otworów wlotowych i wylotowych, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrokanału podczas wykonywania następnego kroku.</li>
	<li>Przebij dwa otwory od góry urządzenia PDMS w pobliżu dwóch końców mikrokanału jako wlot i wylot mikrokanału. 
	Uwaga: Nie przebijaj całych dwóch warstw urządzenia PDMS; zamiast tego po prostu przebij górną warstwę PDMS.</li>
	<li>Podłączyć plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą świeżą pożywkę do wlotu za pomocą igły 23 G i rurki z PTFE.</li>
	<li>Wlej 120 μl świeżej pożywki do urządzenia na 5 minut, aby zastąpić starą pożywkę.</li>
	<li>Włóż dwie zatyczki, aby uszczelnić otwory wlotowe i wylotowe, a następnie włóż urządzenie z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odświeżać pożywkę co 2 dni w okresie hodowli, usuwając zatyczki uszczelniające, a następnie powtarzając kroki 5.4-5.5.</li>
</ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li>
<li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li>
<li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997(2009).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Gen+Subjects%22%5BJournal%5D)">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li>
<li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li>
<li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays%3A+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Systemy urządzeń oparte na mikrostudzienkach6,14 zostały wykorzystane do manipulacji i analizy pojedynczych komórek, takich jak pułapki pojedynczych komórek na dużą skalę6 i proliferacja pojedynczych hematopoetycznych komórek macierzystych15. Chociaż rozmiar, liczbę i kształt studni można dostosować do konkretnych zastosowań, skuteczność izolacji pojedynczej komórki jest zawsze zagrożona, gdy zwiększa się rozmiar studni. 9,15
Aby przezwyciężyć to ogr...

Obecnie umieszczanie pojedynczych komórek pojedynczo w przestrzeni hodowlanej jest zwykle osiągane za pomocą ograniczania rozcieńczania lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Dla wielu laboratoriów ograniczenie rozcieńczenia jest wygodną metodą, ponieważ wymaga jedynie pipety i płytek do hodowli tkankowych, które są łatwo dostępne. W takim przypadku zawiesinę komórek rozcieńcza się seryjnie do odpowiedniej gęstości komórek, a następnie umieszcza w studzienkach hodowlanych za pomocą pipety ręcznej. Te podzielone na przedziały pojedyncze komórki są następnie wykorzystywane do analizy komórek, takiej jak badanie przesiewowe heterogenicznościgenetycznej 1 i tworzenie kolonii2. Jednak metoda ta jest niskoprzepustowa i pracochłonna, bez użycia ramienia robotycznego do pomocy, ponieważ charakter rozkładu Poissona metody ograniczającego rozcieńczanie ogranicza zdarzenia pojedynczej komórki do maksymalnego prawdopodobieństwa 37%3. Maszyny FACS ze zintegrowanym ramieniem robota mogą przezwyciężyć ograniczenia związane z dystrybucją Poissona poprzez dokładne umieszczanie jednej pojedynczej komórki w dołku hodowlanymna raz 4. Jednak wysokie mechaniczne naprężenia ścinające (a tym samym obniżona żywotność komórek)5 oraz koszty zakupu i eksploatacji maszyn ograniczyły ich zastosowanie w wielu laboratoriach.
Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowano urządzenia mikroskalowe, które bardzo efektywnie ładują pojedyncze komórki do mikrostudzienek6. Jednak mikrostudzienki nie zapewniają odpowiedniej przestrzeni do namnażania się załadowanych komórek, ze względu na konieczność zbliżenia rozmiaru każdej mikrostudzienki do wielkości pojedynczej komórki, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo obciążenia pojedynczej komórki. Ponieważ testy hodowlane są wymagane w wielu zastosowaniach opartych na komórkach (np. test klonogenny7), zastosowano również większe mikrostudzienki (o średnicy od 90 do 650 μm lub długości boku), aby umożliwić rozszerzone hodowle komórkowe. Jednak, podobnie jak metoda rozcieńczania ograniczającego, charakteryzują się one również niską wydajnością ładowania pojedynczych komórek, wynoszącą od 10 do 30%. 8,9 pkt.
Poprzednio opracowaliśmy wysokoprzepustową platformę mikroprzepływową do izolowania pojedynczych komórek w pojedynczych mikrodołkach i demonstrowania jej zastosowania w testach klonogenicznych izolowanych komórek. 10 Urządzenie zostało wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) i składa się z dwóch zestawów matryc mikrostudzienek o różnych rozmiarach mikrostudzienek, co może znacznie poprawić wydajność ładowania pojedynczej komórki do mikrostudzienki, której rozmiar jest znacznie większy niż komórka. Warto zauważyć, że ta koncepcja "podwójnej studzienki" pozwala na elastyczne dostosowanie wielkości obszaru hodowli bez wpływu na skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek, co ułatwia dostosowanie konstrukcji urządzenia do różnych typów komórek i zastosowań. Ta metoda o wysokiej skuteczności powinna być przydatna w długoterminowych eksperymentach z hodowlami komórkowymi do badań heterogeniczności komórek i tworzenia monoklonalnych linii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Nr części 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy&nbsp;</td><td>Korporacja Eltech</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Piec konwencjonalny</td><td>Firma YEONG-SHIN</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Czyszczarka plazmowa</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Stacjonarny system obróbki plazmowej</td></tr><tr><td>SU-8 50 ujemny fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 ujemny fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2 "~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Płyta grzejna</td><td>YOTEC firmy</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 deweloper</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego</td></tr><tr><td>Skaningowy profilometr laserowy</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl. Niebezpieczny. Działa żrąco na drogi oddechowe, gwałtownie reaguje z wodą.</td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Eksykator próżniowy oszczędzający miejsce 190&nbsp; mm biała podstawa</td></tr><tr><td>Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS)</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz Harris Uni-Core</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td> z taśmą usuwalną o <td>średnicy wewnętrznej 0,75 mm</td></tr> Firma <tr><td></td><td>3M Company</td><td>Taśma usuwalna Scotch 811</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>Microsystems Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Technologia Bersinga</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM podłoże podstawowe</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Thermo Hyclon</td><td>SH30071.03HI Antybiotyki</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamina-penicylina-Streptomycyna</td></tr><tr><td>Rekombinowana mieszanina enzymów</td><td>Innowacyjna technologia komórkowa</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) barwnik błony komórkowej</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Używany jako urządzenie do śledzenia komórek</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvarda</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Tworzywo sztuczne strzykawka (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>igły o rozmiarze 23 Ever</td><td>Sharp Technology, Inc.</td><td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z politetrafluoroetenu (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>średnica wewnętrzna, 0,51&nbsp; Mm; średnica zewnętrzna, 0,82&nbsp; Mm</td></tr></tbody></table>

platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Badanie heterogeniczności pojedynczych komórek jest kluczowe dla wielu zagadnień biologicznych, ale jest technicznie trudne. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prostą, ale wysokowydajną metodę przeprowadzania eksperymentów z hodowlami jednokomórkowymi. W tym miejscu przedstawiamy opartą na chipie mikroprzepływowym strategię wysokowydajnej izolacji pojedynczych komórek (~77%) i demonstrujemy jej zdolność do przeprowadzania długotrwałej hodowli pojedynczej komórki (do 7 d) i analizy heterogeniczności komórkowej przy użyciu testu klonogennego. Zastosowania te zademonstrowano z wykorzystaniem mysich nerwowych komórek macierzystych KT98 oraz ludzkich komórek nowotworowych A549 i MDA-MB-435. Wysoką wydajność izolacji pojedynczych komórek i długoterminową zdolność do hodowli uzyskuje się dzięki zastosowaniu różnych rozmiarów mikrostudzienek na górze i na dole kanału mikroprzepływowego. Mała matryca mikrodołkowa jest przeznaczona do precyzyjnego izolowania pojedynczych komórek, a duża matryca mikrostudzienkowa służy do hodowli klonalnej pojedynczych komórek w chipie mikroprzepływowym. Ta platforma mikroprzepływowa stanowi atrakcyjne podejście do zastosowań w hodowlach jednokomórkowych, ze względu na elastyczność regulowanych przestrzeni do hodowli komórkowych dla różnych strategii hodowli, bez zmniejszania wydajności izolacji.

Platforma mikrofluidyczna do izolacji i hodowli pojedynczych komórek składa się z mikrokanału (wysokość 20 µm) z dwoma zestawami macierzy mikrowykopalisk (Rysunek 2A). Dwa zestawy macierzy mikrowykopalisk określono jako studnie przechwytujące (średnica 25 µm i głębokość 27 µm) oraz studnie hodowlane (średnica 285 µm i głębokość 30 µm), służące odpowiednio do izolacji i hodowli pojedynczych komórek; każda studnia przechwytująca znajduje się w centrum studni hodowlanej w wi...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zademonstrowanie wytwarzania i działania chipa mikrofluidycznego, który umożliwia wysokowydajną izolację i hodowlę pojedynczych komórek. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie dla każdej dziedziny, w której pożyteczna byłaby izolacja i hodowla pojedynczych komórek. Główną zaletą tej techniki jest wysoka wydajność wprowadzania pojedynczych komórek do dużych macierzy mikrootworów.Dodatkowo, do obsługi urządzenia wykorzystuje się jedynie łagodny przepływ oraz siłę grawitacji, co minimalizuje uszkodzenia komórek. Zastosowanie tej techniki jest ukierunkowane na diagnostykę końcową chorób ludzkich, takich jak nowotwory, w których heterogeniczność komórkowa wpływa na odpowiedź komórek; pomysł opracowania tej metody pojawił się podczas tworzenia linii komórkowych w mikrowydłubach, ponieważ metoda rozcieńczeń ograniczających była bardzo czasochłonna i nieefektywna. Obecnie metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w analizę pojedynczych komórek.Metodę tę można zastosować również w innych zastosowaniach, takich jak tworzenie i długoterminowa obserwacja przebiegu życia oraz zachowania pojedynczych komórek. Aby rozpocząć, należy przygotować silanizowane form

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metodę izolacji i hodowli pojedynczych komórek na mikroprzepływowym chipie z wykorzystaniem łagodnego przepływu i siły grawitacji. Technika minimalizuje uszkodzenia komórek i znajduje zastosowanie w badaniach nad heterogenicznością komórkową oraz diagnostyce nowotworowej.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów