Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie ekspresji białka aktywowanego mitogenem na poziomie pojedynczej komórki. Aby to osiągnąć, wygenerowano szczep drożdży z poczwórną Wenus reporterową o ekspresji fluorescencyjnej kontrolowaną przez promotor STL jeden i specyficzną dla aktywacji kinazy mapowej świni one. Ekspresję białek fluorescencyjnych można określić ilościowo za pomocą testu mikroskopowego żywych komórek, w którym komórki są naprężane bezpośrednio pod mikroskopem, aby ułatwić pojawienie się fluorescencji w czasie rzeczywistym, lub za pomocą cytometrii przepływowej, w którym to przypadku komórki są zestresowane w mikroprobówce, a synteza białek jest blokowana w określonym czasie.

Dzięki dodaniu cyclo heide, tylko kilka komórek na raz może być analizowanych za pomocą mikroskopii żywych komórek, ale los poszczególnych komórek może być bezpośrednio obserwowany i korelowany z innymi właściwościami komórkowymi Cytometria przepływowa z drugiej strony, pozwala również na ocenę ekspresji białka aktywowanego mitogenem na dużej liczbie komórek jednocześnie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji, takie jak to, które białka są zaangażowane w regulację ekspresji genów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w szlak drożdży, może być również stosowana do innych kaskad sygnalizacyjnych, w zależności od dostępności właściwej ekspresji. Reporter.

Aby przygotować komórki do mikroskopii żywych komórek, zacznij od zaszczepienia pięciu mililitrów syntetycznej pożywki drożdżami, a następnie hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka zmierz OD 600 w nocnej hodowli, a następnie rozcieńcz nocną kulturę w pięciu mililitrach syntetycznego podłoża do OD 600 0,05. Hoduj rozcieńczoną kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny.

Następnie przefiltruj około 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu conna value do szkiełka studziennego. Po 30 minutach usuń roztwór i dodaj 150 mikrolitrów wody do studni. Teraz usuń wodę i pozwól studzience wyschnąć, podczas gdy komórki są przygotowane.

Ponownie zmierz OD 600 w hodowli komórkowej, a następnie rozcieńczyć komórki, aby uzyskać 300 mikrolitrów kultury komórkowej przy OD 600 0,02 i mikroprobówce 1,5 mililitra. Sonikuj komórki w łaźni wodnej przez 45 sekund. Krótko zawiruj mikrorurki, a następnie ponownie wykonaj sonikę i wiruj komórki.

Teraz dodaj 200 mikrolitrów komórek do szkiełka podstawowego, a następnie po pozostawieniu komórki na dnie studzienki przez około 30 minut, umieść szkiełko na mikroskopie. Następnie wybierz ustawienia oświetlenia dla ich kanału fluorescencyjnego, który ma być rejestrowany, oraz dla dwóch obrazów w jasnym polu, dostosowując jedno z ustawień jasnego pola około trzech mikronów poniżej płaszczyzny ogniskowej, aby umożliwić prawidłową segmentację komórek. Następnie ustaw przedziały czasowe dla pomiarów poklatkowych i wybierz pola widzenia do obrazowania.

Teraz rozpocznij akwizycję na kilka klatek, a następnie przerwij akwizycję, aby dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej 0,6-molowej pożywki chlorku sodu i wznów obrazowanie, aby przygotować komórki do pomiaru za pomocą cytometrii przepływowej. Zacznij od zaszczepienia drożdży w pięciu mililitrach syntetycznej pożywki i hoduj komórki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka zmierz OD 600 z nocnej hodowli, a następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek w pięciu mililitrach pożywki syntetycznej do OD 600 0,1.

Hoduj kulturę przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby osiągnąć OD 600 od 0,2 do 0,4. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,6-molowego chlorku sodu do 1,5 mililitrowej mikroprobówki dla każdego punktu czasowego, który ma być mierzony w czasie zero. Dodaj 200 mikrolitrów komórek do każdej mikroprobówki i inkubuj kultury, wytrząsając w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie w każdym z eksperymentalnych punktów czasowych dodaj 30 mikrolitrów świeżo przygotowanej cyclo heide do jednej z mikroprobówek. Podczas inkubacji mikroprobówek dodaj 400 mikrolitrów PBS do jednej odpowiedniej probówki faksowej dla każdej mikroprobówki. Po inkubacji, krótko zawirować mikrorurki, a następnie poddać sonikacji komórki i dodać łaźnię wodną na jedną minutę, jak pokazano.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów kultury komórkowej z każdej mikroprobówki do odpowiadającej jej rurki faksowej na przepływie cytometru. Załaduj odpowiednie ustawienia wzbudzenia i detekcji oraz przetestuj próbki bez ekspresji i w pełni wyrażające się, aby sprawdzić, czy mieszczą się w zakresie czułości detektora. Na koniec, zmierz 10 000 komórek dla każdej próbki na tych obrazach, komórki drożdży zawierające poczwórne białko żylne reporterowe ekspresji pod kontrolą promotora TL one i przymocowane do dna szkiełka studziennego były stymulowane przez bezpośrednią edycję podłoża stresowego.

Jak właśnie wykazano, komórki były monitorowane przez około dwie godziny w 10-minutowych odstępach, a obrazy uzyskano zarówno przed, jak i po edycji bodźca. Zwróć uwagę, fluorescencyjną ekspresję raportu podczas aktywacji komórek. Aby wyodrębnić informacje ilościowe zawarte w tych obrazach, należy przeprowadzić złożony proces analizy obrazu.

Przedstawiono wynik uzyskany za pomocą platformy do analizy ilościowej drożdży. Każdy czerwony ślad reprezentuje czasową ewolucję średniej intensywności fluorescencji pojedynczej komórki. Niebieska linia ilustruje medianę ponad 500 komórek, które zostały podzielone na segmenty i śledzone w 20 klatkach pięciu filmów poklatkowych uzyskanych z pięciu różnych pól widzenia z tej samej studni, jasnoniebieski obszar reprezentuje 25. i 75. percentyl wszystkich intensywności zmierzonych w danym punkcie czasowym w celu zbadania dynamiki ekspresji tego samego reportera za pomocą cytometrii przepływowej Do drożdży dodano cykloheksymid hodowle komórkowe w różnych punktach czasowych w odstępach od pięciu do 10 minut.

Lek blokuje syntezę nowych białek, ale dojrzewanie już wyrażonego białka fluorescencyjnego nie jest zaburzone. W związku z tym ekspresja białka uwidoczniona przez przemieszczenie histogramu w prawo może być określona ilościowo w czasie edycji Cycl H, omijając problemy związane z dojrzewaniem białek fluorescencyjnych. Na tym wykresie porównano dynamikę reportera ekspresji mierzoną za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej, podczas gdy sygnał fluorescencyjny wzrasta od 30 do 40 minut po edycji ośrodka stresu, jak mierzono za pomocą mikroskopii, pomiary cytometrii przepływowej wyraźnie wskazują, że białka są już wytwarzane między 10 a 15 minutami po bodźcu, co wskazuje na powolne dojrzewanie białek fluorescencyjnych.

Obie techniki umożliwiają dostęp do informacji o pojedynczej komórce dla tych prostych eksperymentów, zmienność między trzema kontrpróbami biologicznymi jest niewielka w porównaniu z dużą zmiennością obserwowaną w odpowiedziach pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej. Postępując zgodnie z tymi procedurami, można wykonać inne metody, takie jak pomiary odpowiedzi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, jaki jest próg ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć ekspresję białka na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopu cytometrii przepływowej.