Name: Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metody kwantyfikacji ekspresji MAPK w pojedynczych komórkach drożdży za pomocą mikroskopii komórek żywych i cytometrii przepływowej. Techniki te umożliwiają badanie dynamiki ekspresji genów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Matthiasowi Peterowi i jego grupie w Instytucie Biochemii na ETH w Zurychu, gdzie te metody zostały opracowane. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki.

1. Pomiary mikroskopowe
<ol>
	<li>Zaszczepić 5 ml pożywki syntetycznej drożdżami.</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze 30 °C przez noc.</li>
	<li>Zmierz OD600 w nocnej kulturze następnego ranka.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc w 5 ml pożywki syntetycznej do OD600 0,05.</li>
	<li>Rozcieńczoną kulturę hodować w temperaturze 30 °C przez co najmniej 4 godziny.</li>
	<li>Przygotować 3-krotnie stężony (0,6 M) roztwór NaCl w podłożu syntetycznym.</li>
	<li>Przygotować roztwór 1 mg/ml konkanawaliny A (ConA) w PBS.</li>
	<li>Przefiltrować ~200 μl roztworu ConA do szkiełka studziennego.</li>
	<li>Odstawić na 30 min.</li>
	<li>Usuń roztwór ConA.</li>
	<li>Dodać 150 μl H2O do studzienki.</li>
	<li>UsunąćH2O.</li>
	<li>Zmierz OD600 hodowli komórkowej.</li>
	<li>Przygotować 300 μl kultury komórkowej o średnicyzewnętrznej 600 = 0,02 w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 45 sekund.</li>
	<li>Krótko przekręć mikrorurkę.</li>
	<li>Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 45 sekund.</li>
	<li>Krótko przekręć mikrorurkę.</li>
	<li>Dodaj 200 μl kultury komórkowej do studzienki.</li>
	<li>Odczekaj 30 minut, aby komórki osiadły na dnie studzienki.</li>
	<li>Umieść szkiełko studzienne na mikroskopie.</li>
	<li>Wybierz ustawienia oświetlenia dla kanału fluorescencyjnego, który ma być nagrywany.</li>
	<li>Wybierz ustawienia oświetlenia dla dwóch obrazów w jasnym polu (jeden lekko nieostry: 3 μm poniżej płaszczyzny ogniskowej, aby umożliwić prawidłową segmentację komórek).</li>
	<li>Wybierz przedziały czasowe dla pomiaru poklatkowego</li>
	<li>Wybierz pola widoku do obrazu.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie kilku klatek.</li>
	<li>Wstrzymaj akwizycję, aby dodać 100 μl 0,6 M Pożywki NaCl.</li>
	<li>Wznów obrazowanie.</li>
</ol>
2. Pomiary cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zaszczepić 5 ml pożywki syntetycznej drożdżami.</li>
	<li>Rośnie w temperaturze 30 °C przez noc.</li>
	<li>Zmierz OD600 w nocnej kulturze następnego ranka.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc w 5 ml pożywki syntetycznej do OD600 0,1.</li>
	<li>Rosnąć w temperaturze 30 °C przez co najmniej 4 godziny, aby osiągnąć OD600 0,2-0,4.</li>
	<li>Przygotować roztwór cykloheksymidu o stężeniu 1 mg/ml wH2O.</li>
	<li>Przygotować 3-krotnie stężony (0,6 M) roztwór NaCl w podłożu syntetycznym.</li>
	<li>Przygotować jedną mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml ze 100 μl 0,6 M pożywki NaCl dla każdego punktu pomiarowego.</li>
	<li>W czasie 0 dodaj 200 μl kultury komórkowej do każdej mikroprobówki.</li>
	<li>Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>W czasie T dodać 30 μl cykloheksymidu do mikroprobówki.</li>
	<li>Powtórz krok 2.11 dla wszystkich żądanych punktów czasowych.</li>
	<li>Inkubować wszystkie mikroprobówki przez co najmniej 45 minut i do 3 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Przygotować probówki FACS z 400 μl PBS.</li>
	<li>Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 1 min.</li>
	<li>Krótko przekręć mikrorurki.</li>
	<li>Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 1 min.</li>
	<li>Krótko przekręć mikrorurki.</li>
	<li>Dodaj 100 μl kultury komórkowej z każdej mikroprobówki do odpowiadającej jej probówki FACS.</li>
	<li>Wybierz laser wzbudzający 488 nm i filtr pasmowo-przepustowy 530/30 nm do wykrywania.</li>
	<li>Przetestuj próbkę bez ekspresji i w pełni wyrażającą, aby sprawdzić, czy mieszczą się w zakresie czułości detektora.</li>
	<li>Zmierz 10 000 komórek dla każdej pobranej próbki.</li>
</ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mikroskopia
Leczenie studni ConA jest niezbędnym krokiem do zapewnienia prawidłowego obrazowania komórek. Ponieważ ConA ma niską rozpuszczalność w PBS (5 mg/ml), proces filtracji pozwala na usunięcie dużych agregatów, które są obecne w niefiltrowanym roztworze i zakłócają obrazowanie. Komórki przyczepiają się stosunkowo silnie do leczonej powierzchni, a dodanie roztworu indukującego nie powinno zaburzać lokalizacji komórek, umożliwiając ciągłe śledzenie przed i po bodźcu. Zabieg ten może być równ...

Sygnalizacja poprzez kaskady transdukcji często kończy się ekspresją białek. Charakterystyka tego profilu ekspresji jest kluczowym elementem w zrozumieniu funkcji szlaków biologicznych. Identyfikacja spektrum białek regulowanych w górę i dynamika ich aktywacji może być osiągnięta za pomocą różnych technik, takich jak mikromacierze, northern blot lub western blot1-3. Jednak techniki te uśredniają odpowiedź całej populacji komórek. Aby zrozumieć precyzyjną regulację ekspresji białek, pożądane jest zebranie pomiarów na poziomie pojedynczej komórki. Idealnie byłoby, gdyby pomiary te dostarczyły również danych ilościowych umożliwiających opracowanie modeli matematycznych leżącej u podstaw szlaku.
Mikroskopia i cytometria przepływowa to dwie techniki, które idealnie nadają się do wykonywania takich ilościowych pomiarów pojedynczych komórek. Endogenne znakowanie białek białkiem fluorescencyjnym można wykorzystać do ilościowego określenia ich poziomu ekspresji 4. Ponieważ jednak dodanie dużej cząstki fluorescencyjnej na końcu białka może sprawić, że stanie się ono niefunkcjonalne, często bardziej pożądane jest generowanie specyficznych reporterów ekspresji w oparciu o promotor napędzający ekspresję konstruktu fluorescencyjnego. To białko reporterowe jest egzogenne dla układu komórkowego i dlatego nie wpływa na zdarzenia sygnalizacyjne zachodzące w komórce.
Zarówno mikroskopia, jak i cytometria przepływowa były szeroko stosowane w dziedzinie sygnalizacji drożdży. Jako przykłady; Colman-Lerner i współpracownicy skorelowali w pojedynczych komórkach ekspresję specyficznych dla kojarzenia i konstytutywnie wyrażonych reporterów za pomocą mikroskopii, aby określić ilościowo szum w kaskadzie transdukcji sygnału kojarzenia drożdży5, Acar i współpracownicy wykorzystali cytometrię przepływową do zbadania sieci regulacyjnej kontrolującej ekspresję genów GAL6. W poprzednim badaniu7 zastosowaliśmy kombinację tych dwóch technik do zbadania ekspresji ze szlaku glicerolu o wysokiej osmolarności (HOG) w pączkujących drożdżach. Ten szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) jest wyzwalany przez stres hiperosmotyczny. Powoduje to aktywację MAPK Hog1, który przemieszcza się do jądra komórki w celu wywołania programu transkrypcyjnego, w wyniku którego dochodzi do ekspresji około 300 genów. Aby zbadać ten proces, zaprojektowaliśmy reporter ekspresji oparty na promotorze STL1 (gen indukowany specjalnie w odpowiedzi na aktywność Hog18) napędzający ekspresję poczwórnego białka fluorescencyjnego Wenus (pSTL1-qV). Pomiary cytometrii przepływowej ujawniły obecność dwóch populacji komórek na pośrednim poziomie stresu (0,1 M NaCl), przy czym tylko ułamek populacji wykazywał ekspresję fluorescencyjnego reportera. Użyliśmy mikroskopii, aby dokładniej zbadać to zachowanie i odkryliśmy, że ten szum w ekspresji białek był regulowany przez czynniki wewnętrzne9. Mogliśmy dalej zaobserwować, że komórki o podobnym poziomie aktywności Hog1 mogą wykazywać uderzająco różne wyniki ekspresji. Połączenie tych dwóch technik pozwoliło nam zademonstrować, w jaki sposób powolna przebudowa genów reakcji na stres wpłynęła na wynik ekspresji na poziomie pojedynczej komórki7.
W tym artykule używamy wyrażenia reporterap STL1-qV wywołanego przez szok hiperosmotyczny jako przykładu kwantyfikacji ekspresji białka za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Ten sam szczep poddany naprężeniu 0,2 M NaCl badano za pomocą obu technik. Pozwoli nam to podkreślić kilka kluczowych różnic w tych dwóch wysoce uzupełniających się technikach.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodagent</td></tr><tr><td>Drożdże Azot Baza</td><td>ForMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM mieszanka aminokwasów</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Materiał</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące mikroskopem</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Komora inkubacyjna</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Światło fluorescencyjne źródło:</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel Sonicator</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowy szkiełko </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Matrical biological</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS dętka</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej mapk w pojedynczych komórkach drożdży

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Kwantyfikacja ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki odkrywa nowe mechanizmy regulacyjne, które są ukryte w pomiarach przeprowadzonych na poziomie populacji. Przedstawiono dwie metody oparte na mikroskopii i cytometrii przepływowej, aby pokazać, w jaki sposób można pozyskać takie dane. Jako przykład posłużono się ekspresją fluorescencyjnego reportera indukowaną po aktywacji szlaku MAPK glicerolu o wysokiej osmolarności w drożdżach. Podkreślono konkretne zalety każdej z metod. Cytometria przepływowa mierzy dużą liczbę komórek (10 000) i zapewnia bezpośredni pomiar dynamiki ekspresji białek niezależnie od powolnej kinetyki dojrzewania białka fluorescencyjnego. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii jest natomiast ograniczone do pomiaru dojrzałej formy reportera w mniejszej liczbie komórek. Jednak zbiory danych generowane tą techniką mogą być niezwykle bogate dzięki kombinacjom wielu reporterów oraz informacjom przestrzennym i czasowym uzyskanym z poszczególnych komórek. Połączenie tych dwóch metod pomiarowych może dostarczyć nowych informacji na temat regulacji ekspresji białek za pomocą szlaków sygnałowych.

Mikroskopia
Komórki drożdży niosące reporter ekspresji pSTL1-qV (ySP97) przymocowano do dna szkiełka z wgłębieniami i umieszczono pod mikroskopem. Komórki stymulowano poprzez dodanie pożywki stresowej bezpośrednio do wgłębienia w trakcie sesji obrazowania. Pozwala to na wykonanie kilku obrazów komórek przed indukcją szlaku i śledzenie ich losów po stymulacji. W niniejszym przypadku komórki obserwowano przez ~2 hr w odstępach czasu wynoszących 10 min. Rysunek 1A</strong...

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie ekspresji białek kinazy aktywowanej mitogenem na poziomie pojedynczych komórek. W tym celu wygenerowano szczep drożdży zawierający fluorescencyjny reporter ekspresji quadruple Venus, kontrolowany przez promotor STL1 i specyficzny dla aktywacji kinazy MAP Hog1. Ekspresję białka fluorescencyjnego można określić ilościowo albo za pomocą badania mikroskopowego żywych komórek, w którym komórki są poddawane stresowi bezpośrednio pod mikroskopem w celu umożliwienia obserwacji fluorescencji w czasie rzeczywistym, albo za pomocą cytometrii przepływowej, w której przypadku komórki są poddawane stresowi w mikroprobówce, a synteza białek jest blokowana w określonym czasie.Dzięki zastosowaniu cykloheksymidu za pomocą mikroskopii żywych komórek można analizować tylko kilka komórek jednocześnie, ale pozwala to na bezpośrednią obserwację losów poszczególnych komórek i powiązanie ich z innymi właściwościami komórkowymi; z kolei cytometria przepływowa umożliwia ocenę ekspresji białek aktywowanych mitogenami w dużej liczbie komórek jednocześnie. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji, takie jak to, które białka biorą udział w regulacji ekspresji genów. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat ścieżek sygnałowych drożdży, może zostać zastosowana również do innych kaskad sygnalizacyjnych, w zależności od dostępności odpowiedniego białka reporterowego.Aby przygotować komórki do mikroskopii żywych komórek, należy rozpocząć od zaszczepienia pięciu mililitrów pożywki syntetycznej drożdżami, a następnie hodować komórki w temperaturze 30 °C przez noc. Następnego dnia rano należy zmierzyć OD 600 hodowli nocnej, a następnie rozcieńczyć tę hodowlę w pięciu mililitrach pożywki syntetycznej do wartości OD 600 wynoszącej 0,05. Rozcieńczoną hodowlę należy inkubować w temperaturze 30 °C przez co najmniej kolejne cztery godziny.Następnie przefiltruj około 200 µL świeżo przygotowanego roztworu kowalencyjnego do dołka płytki. Po 30 minutach usuń roztwór i dodaj do dołka 150 µL wody. Następnie usuń wodę i pozostaw dołek do wyschnięcia, podczas gdy przygotowywane będą komórki.Ponownie zmierz OD 600 hodowli komórkowej, a następnie rozcieńcz komórki w probówce mikrotubkowej o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać 300 mikrolitrów hodowli przy OD 600 równym 0,02. Poddaj komórki sonikacji w kąpieli wodnej przez 45 sekund. Krótko wymieszaj zawartość mikrotubówek na vortexie, a następnie ponownie przeprowadź sonikację i mieszanie na vortexie.Teraz należy dodać 200 µL komórek do studzienki na szkiełku, a po odczekaniu około 30 minut, aż komórki osiądą na dnie studzienki, umieścić szkiełko pod mikroskopem. Następnie należy dobrać ustawienia oświetlenia dla kanału fluorescencyjnego, który ma zostać zarejestrowany, oraz dla dwóch obrazów w polu jasnym, dostosowując jedno z ustawień pola jasnego na około 3 µm poniżej płaszczyzny ogniskowania, aby umożliwić prawidłową segmentację komórek. Następnie należy ustawić odstępy czasowe dla pomiarów time-lapse i wybrać pola widzenia do obrazowania.Rozpocznij akwizycję kilku klatek, a następnie wstrzymaj ją, aby dodać 100 µL świeżo przygotowanego medium z 0,6 M NaCl, i wznowij obrazowanie, aby przygotować komórki do pomiaru metodą cytometrii przepływowej. Zacznij od inokulacji drożdży w pięciu mililitrach medium syntetycznego i hoduj komórki przez noc w temperaturze 30 °C. Następnego dnia rano zmierz OD 600 hodowli nocnej, a następnie rozcieńcz zawiesinę komórkową w pięciu mililitrach medium syntetycznego do wartości OD 600 wynoszącej 0,1.Hodowlę inkubowano przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 30 °C, aż do osiągnięcia wartości OD 600 od 0,2 do 0,4. Następnie do probówek typu microtube o pojemności 1,5 ml przeznaczonych dla każdego punktu pomiarowego w czasie zero dodano 100 µL świeżo przygotowanego 0,6 M chlorku sodu. Do każdej probówki dodano 200 µL zawiesiny komórek i inkubowano hodowle z wstrząsaniem w temperaturze 30 °C.Następnie w każdym z eksperymentalnych punktów czasowych należy dodać 30 µL świeżo przygotowanego cykloheksymidu do jednej z mikroprobek. Podczas inkubacji mikroprobek należy dodać 400 µL PBS do odpowiadającej każdej z nich probówki FACS. Po inkubacji mikroprobki należy krótko wymieszać w wortexie, a następnie poddać komórki sonikacji w kąpieli wodnej przez jedną minutę, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Następnie należy dodać 100 µL hodowli komórkowej z każdej mikroprobówki do odpowiadającej jej probówki w cytometrze przepływowym. Po wczytaniu odpowiednich ustawień wzbudzenia i detekcji należy przetestować próbki niewyrażające i w pełni wyrażające białko, aby zweryfikować, czy mieszczą się one w zakresie czułości detektora. Na koniec należy zmierzyć 10 000 komórek dla każdej próbki; w tych obrazach komórki drożdży wykazujące ekspresję raportowej białka quadruple venous protein pod kontrolą promotora TL1 i przytwierdzone do dna szkiełka z wgłębnikami zostały stymulowane poprzez bezpośrednie dodanie medium stresowego.Jak właśnie pokazano, komórki monitorowano przez około dwie godziny w 10-minutowych odstępach czasu, a obrazy pozyskano zarówno przed, jak i po podaniu bodźca. Zwróć uwagę na fluorescencyjną ekspresję reportera w komórkach aktywowanych. Aby wyodrębnić ilościowe informacje zawarte w tych obrazach, należy przeprowadzić tutaj złożony proces analizy obrazu.Przedstawiono wyniki uzyskane za pomocą platformy do analizy ilościowej drożdży. Każdy czerwony ślad reprezentuje ewolucję czasową średniej intensywności fluorescencji pojedynczej komórki. Niebieska linia ilustruje medianę z ponad 500 komórek, które zostały wysegmentowane i śledzone przez 20 klatek z pięciu filmów poklatkowych zarejestrowanych w pięciu różnych polach widzenia z tej samej studzienki; jasnoniebieski obszar reprezentuje 25. i 75. percentyl wszystkich intensywności zmierzonych w danym punkcie czasowym. Aby zbadać dynamikę ekspresji tego samego reportera za pomocą cytometrii przepływowej, do kultur komórek drożdży dodawano cykloheksymid w różnych punktach czasowych w odstępach od 5 do 10 minut.Lek ten blokuje syntezę nowych białek, jednak dojrzewanie już wyekspresowanego białka fluorescencyjnego nie zostaje zaburzone. Zatem ekspresja białka, wizualizowana poprzez przesunięcie histogramu w prawo, może być ilościowo określona w momencie podania Cycl H, co pozwala uniknąć problemów związanych z dojrzewaniem białka fluorescencyjnego. Na tym wykresie porównano dynamikę reportera ekspresji mierzoną za pomocą mikroskopii oraz cytometrii przepływowej; podczas gdy sygnał fluorescencyjny mierzony mikroskopią narasta 30 do 40 minut po dodaniu pożywki stresowej, pomiary cytometrii przepływowej wyraźnie wskazują, że białka są już produkowane od 10 do 15 minut po bodźcu, co demonstruje powolne dojrzewanie białek fluorescencyjnych.Obie techniki umożliwiają uzyskanie informacji na poziomie pojedynczej komórki w tych prostych eksperymentach, a zmienność między trzema powtórzeniami biologicznymi jest niewielka w porównaniu do dużej zmienności obserwowanej w odpowiedziach pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej. Po zastosowaniu tych procedur można przeprowadzić inne metody, takie jak wspomniane pomiary odpowiedzi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące progu ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mierzyć ekspresję białek na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopu lub cytometrii przepływowej.

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej przez MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Szybkie techniki wizualizacji coraz unieruchomionych komórek drożdży, tutaj stosowane do świetlówek dziennikarzom w cichej krycia loci HML i...

Szybkie Technika Wizualizacja żywo unieruchomionych komórek drożdży

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metody kwantyfikacji ekspresji MAPK w pojedynczych komórkach drożdży za pomocą mikroskopii komórek żywych i cytometrii przepływowej. Techniki te umożliwiają badanie dynamiki ekspresji genów w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Przeglądaj więcej filmów