Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie ekspresji białek kinazy aktywowanej mitogenem na poziomie pojedynczych komórek. W tym celu wygenerowano szczep drożdży zawierający fluorescencyjny reporter ekspresji quadruple Venus, kontrolowany przez promotor STL1 i specyficzny dla aktywacji kinazy MAP Hog1. Ekspresję białka fluorescencyjnego można określić ilościowo albo za pomocą badania mikroskopowego żywych komórek, w którym komórki są poddawane stresowi bezpośrednio pod mikroskopem w celu umożliwienia obserwacji fluorescencji w czasie rzeczywistym, albo za pomocą cytometrii przepływowej, w której przypadku komórki są poddawane stresowi w mikroprobówce, a synteza białek jest blokowana w określonym czasie.

Dzięki zastosowaniu cykloheksymidu za pomocą mikroskopii żywych komórek można analizować tylko kilka komórek jednocześnie, ale pozwala to na bezpośrednią obserwację losów poszczególnych komórek i powiązanie ich z innymi właściwościami komórkowymi; z kolei cytometria przepływowa umożliwia ocenę ekspresji białek aktywowanych mitogenami w dużej liczbie komórek jednocześnie. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji, takie jak to, które białka biorą udział w regulacji ekspresji genów. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat ścieżek sygnałowych drożdży, może zostać zastosowana również do innych kaskad sygnalizacyjnych, w zależności od dostępności odpowiedniego białka reporterowego.

Aby przygotować komórki do mikroskopii żywych komórek, należy rozpocząć od zaszczepienia pięciu mililitrów pożywki syntetycznej drożdżami, a następnie hodować komórki w temperaturze 30 °C przez noc. Następnego dnia rano należy zmierzyć OD 600 hodowli nocnej, a następnie rozcieńczyć tę hodowlę w pięciu mililitrach pożywki syntetycznej do wartości OD 600 wynoszącej 0,05. Rozcieńczoną hodowlę należy inkubować w temperaturze 30 °C przez co najmniej kolejne cztery godziny.

Następnie przefiltruj około 200 µL świeżo przygotowanego roztworu kowalencyjnego do dołka płytki. Po 30 minutach usuń roztwór i dodaj do dołka 150 µL wody. Następnie usuń wodę i pozostaw dołek do wyschnięcia, podczas gdy przygotowywane będą komórki.

Ponownie zmierz OD 600 hodowli komórkowej, a następnie rozcieńcz komórki w probówce mikrotubkowej o pojemności 1,5 mililitra, aby uzyskać 300 mikrolitrów hodowli przy OD 600 równym 0,02. Poddaj komórki sonikacji w kąpieli wodnej przez 45 sekund. Krótko wymieszaj zawartość mikrotubówek na vortexie, a następnie ponownie przeprowadź sonikację i mieszanie na vortexie.

Teraz należy dodać 200 µL komórek do studzienki na szkiełku, a po odczekaniu około 30 minut, aż komórki osiądą na dnie studzienki, umieścić szkiełko pod mikroskopem. Następnie należy dobrać ustawienia oświetlenia dla kanału fluorescencyjnego, który ma zostać zarejestrowany, oraz dla dwóch obrazów w polu jasnym, dostosowując jedno z ustawień pola jasnego na około 3 µm poniżej płaszczyzny ogniskowania, aby umożliwić prawidłową segmentację komórek. Następnie należy ustawić odstępy czasowe dla pomiarów time-lapse i wybrać pola widzenia do obrazowania.

Rozpocznij akwizycję kilku klatek, a następnie wstrzymaj ją, aby dodać 100 µL świeżo przygotowanego medium z 0,6 M NaCl, i wznowij obrazowanie, aby przygotować komórki do pomiaru metodą cytometrii przepływowej. Zacznij od inokulacji drożdży w pięciu mililitrach medium syntetycznego i hoduj komórki przez noc w temperaturze 30 °C. Następnego dnia rano zmierz OD 600 hodowli nocnej, a następnie rozcieńcz zawiesinę komórkową w pięciu mililitrach medium syntetycznego do wartości OD 600 wynoszącej 0,1.

Hodowlę inkubowano przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 30 °C, aż do osiągnięcia wartości OD 600 od 0,2 do 0,4. Następnie do probówek typu microtube o pojemności 1,5 ml przeznaczonych dla każdego punktu pomiarowego w czasie zero dodano 100 µL świeżo przygotowanego 0,6 M chlorku sodu. Do każdej probówki dodano 200 µL zawiesiny komórek i inkubowano hodowle z wstrząsaniem w temperaturze 30 °C.

Następnie w każdym z eksperymentalnych punktów czasowych należy dodać 30 µL świeżo przygotowanego cykloheksymidu do jednej z mikroprobek. Podczas inkubacji mikroprobek należy dodać 400 µL PBS do odpowiadającej każdej z nich probówki FACS. Po inkubacji mikroprobki należy krótko wymieszać w wortexie, a następnie poddać komórki sonikacji w kąpieli wodnej przez jedną minutę, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Następnie należy dodać 100 µL hodowli komórkowej z każdej mikroprobówki do odpowiadającej jej probówki w cytometrze przepływowym. Po wczytaniu odpowiednich ustawień wzbudzenia i detekcji należy przetestować próbki niewyrażające i w pełni wyrażające białko, aby zweryfikować, czy mieszczą się one w zakresie czułości detektora. Na koniec należy zmierzyć 10 000 komórek dla każdej próbki; w tych obrazach komórki drożdży wykazujące ekspresję raportowej białka quadruple venous protein pod kontrolą promotora TL1 i przytwierdzone do dna szkiełka z wgłębnikami zostały stymulowane poprzez bezpośrednie dodanie medium stresowego.

Jak właśnie pokazano, komórki monitorowano przez około dwie godziny w 10-minutowych odstępach czasu, a obrazy pozyskano zarówno przed, jak i po podaniu bodźca. Zwróć uwagę na fluorescencyjną ekspresję reportera w komórkach aktywowanych. Aby wyodrębnić ilościowe informacje zawarte w tych obrazach, należy przeprowadzić tutaj złożony proces analizy obrazu.

Przedstawiono wyniki uzyskane za pomocą platformy do analizy ilościowej drożdży. Każdy czerwony ślad reprezentuje ewolucję czasową średniej intensywności fluorescencji pojedynczej komórki. Niebieska linia ilustruje medianę z ponad 500 komórek, które zostały wysegmentowane i śledzone przez 20 klatek z pięciu filmów poklatkowych zarejestrowanych w pięciu różnych polach widzenia z tej samej studzienki; jasnoniebieski obszar reprezentuje 25. i 75. percentyl wszystkich intensywności zmierzonych w danym punkcie czasowym. Aby zbadać dynamikę ekspresji tego samego reportera za pomocą cytometrii przepływowej, do kultur komórek drożdży dodawano cykloheksymid w różnych punktach czasowych w odstępach od 5 do 10 minut.

Lek ten blokuje syntezę nowych białek, jednak dojrzewanie już wyekspresowanego białka fluorescencyjnego nie zostaje zaburzone. Zatem ekspresja białka, wizualizowana poprzez przesunięcie histogramu w prawo, może być ilościowo określona w momencie podania Cycl H, co pozwala uniknąć problemów związanych z dojrzewaniem białka fluorescencyjnego. Na tym wykresie porównano dynamikę reportera ekspresji mierzoną za pomocą mikroskopii oraz cytometrii przepływowej; podczas gdy sygnał fluorescencyjny mierzony mikroskopią narasta 30 do 40 minut po dodaniu pożywki stresowej, pomiary cytometrii przepływowej wyraźnie wskazują, że białka są już produkowane od 10 do 15 minut po bodźcu, co demonstruje powolne dojrzewanie białek fluorescencyjnych.

Obie techniki umożliwiają uzyskanie informacji na poziomie pojedynczej komórki w tych prostych eksperymentach, a zmienność między trzema powtórzeniami biologicznymi jest niewielka w porównaniu do dużej zmienności obserwowanej w odpowiedziach pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej. Po zastosowaniu tych procedur można przeprowadzić inne metody, takie jak wspomniane pomiary odpowiedzi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące progu ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mierzyć ekspresję białek na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopu lub cytometrii przepływowej.