Name: Ilościowa analiza pod mikroskopią fluorescencyjną żywych komórek drożdży rozszczepieniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy organizacji podjądrowej w komórkach drożdży rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala badać wpływ warunków odżywczych i mutacji na dynamikę chromatyny oraz regulację ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy profesorowi Hiraoka za przesłanie szczepów. Podziękowania za wsparcie kierujemy do Goran Gustafssons Foundation oraz Szwedzkiego Towarzystwa Walki z Rakiem (Swedish Cancer Society, 2008/939).

1. Hodowla drożdży szczelinowych
<ol>
	<li>Przygotować minimalne podłoże edynburskie (EMM) oraz EMM bez chlorku amonu (EMM-N) 8. Aby zmniejszyć autofluorescencję, roztwór glukozy nie powinien być autoklawowany, lecz wysterylizowany przez filtr o rozmiarze 0,2 μm i następnie dodany do autoklawowanego podłoża.</li>
	<li>Zaszczepić komórki drożdży szczelinowych, świeżo wyhodowane na płytce agarowej z bogatym podłożem YEA 8, w 3 mL płynnego podłoża EMM z wysterylizowaną przez filtr glukozą. Należy użyć probówek o pojemności 13 mL z lekko nasuniętą zakrętką, aby zapewnić komórkom odpowiednią wentylację. Hodować komórki w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 rpm. Przez 2 dni utrzymywać komórki w fazie logarytmicznej (1 X 106 - 2 X 107 komórek / mL), wykonując każdego ranka i wieczora odczyt za pomocą komory Bürkera, a następnie stosując odpowiednie rozcieńczenie.</li>
	<li>W dniu eksperymentu należy upewnić się, że komórki znajdują się we wczesnej fazie logarytmicznej, w stężeniu 5 X 106 - 1 X 107 komórek / mL.</li>
	<li>Aby poddać komórki 20-minutowemu głodzeniu azotowemu, należy przenieść je z podłoża EMM do podłoża EMM-N. W tym celu zebrać 3 ml hodowli do probówki Eppendorfa 1,5 mL w wirówce laboratoryjnej przy maksymalnej sile 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać odpowiedź stresową u drożdży szczelinowych 9. Zastosować technikę podwójnego wirowania, polegającą na wirowaniu przez 2 min, następnie obróceniu probówki Eppendorfa o 180° i ponownym wirowaniu przy 1,5 rcf przez 2 min 10. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym osadzie na dnie probówki. Przepłukać raz podłożem EMM-N, a następnie zawiesić osad w EMM-N i inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 rpm, po czym przejść do punktu 2. Przygotowanie próbek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Odwiruj 1,5 mL komórek w probówce Eppendorfa 1,5 mL w wirówce nakładkowej przy maksymalnej sile 1,5 rcf, ponieważ wirowanie z większą prędkością może wywołać reakcję stresową u drożdży rozdzielających 9. Zastosuj technikę podwójnego wirowania: najpierw wiruj przez 2 min, następnie obróć probkę Eppendorfa o 180° i ponownie wiruj przy 1,5 rcf przez 2 min 10. Pomaga to zebrać wszystkie komórki w jednym osadzie na dnie probówki.</li>
	<li>Usuń supernatant, pozostawiając 10-15 μL, i resuspenduj komórki w pozostałym medium. Alternatywnie dodaj 10 μL świeżego medium, aby resuspendować osad komórkowy.</li>
	<li>Upewnij się, że posiadasz czyste szkiełka przedmiotowe i szkiełka nakrywki (No 1.5). Zazwyczaj nie trzeba ich czyścić, ale upewnij się, że nie są zakurzone.</li>
	<li>Wyjmij z zamrażarki alikwot roztworu stokowego lektyny o stężeniu 1mg/mL, który został wysterylizowany przez filtrowanie. Roztwór lektyny można zamrażać i rozmrażać kilka razy. Lektyna służy do unieruchomienia komórek drożdży na szkiełku nakrywce.</li>
	<li>Nanieś 5 μL medium EMM z wysterylizowaną przez filtrowanie glukozą na szkiełko przedmiotowe.</li>
	<li>Nanieś 5 μL roztworu lektyny w narożnik szkiełka nakrywki. Następnie nanieś 5 μL kultury komórkowej w ten sam narożnik, czyli do kropli lektyny. Wymieszaj, pipetując kilka razy, a następnie rozprowadź mieszaninę kultury komórkowej i lektyny po całym szkiełku nakrywce, używając długiej strony końcówki pipety. W zależności od gęstości mieszaniny komórkowej pozostaw całość lub odsącz nadmiar cieczy z przeciwległego narożnika szkiełka nakrywki.</li>
	<li>Połóż szkiełko nakrywkę stroną górną do góry, tak aby jedna krawędź opierała się o szkiełko przedmiotowe, a druga o blat. Pozostaw szkiełko nakrywkę do lekkiego podeschnięcia przez kilka minut. Nie może ono być całkowicie suche, ale na szkle nie powinno znajdować się zbyt dużo cieczy.</li>
	<li>Ustaw szkiełko nakrywkę pod kątem około 70° względem szkiełka przedmiotowego w miejscu kropli EMM. Puść szkiełko nakrywkę tak, aby opadło stroną górną do dołu w kroplę EMM.</li>
	<li>Aby uszczelnić krawędzie smarem silikonowym, przygotuj strzykawkę 2 mL. Odetnij szeroki koniec końcówki 200 μl i przymocuj ją do strzykawki. Napełnij strzykawkę około 1 mL smaru silikonowego. Delikatnie naciskając tłok strzykawki, nanieś cienką linię silikonu na krawędzie szkiełka nakrywki. W ten sposób powstanie mała komora wzrostu komórek S. pombe.</li>
</ol>
3. Mikroskopia
<ol>
	<li>Uruchom mikroskop fluorescencyjny, włączając lampę rtęciową/ksenonową, mikroskop oraz komputer. Umieść komorę wzrostową drożdży w mikroskopie fluorescencyjnym. Użyj obiektywu 63 X lub 100 X z NA=1.3 lub wyższym. W przypadku użycia obiektywu imersyjnego nanieś olej.</li>
	<li>Użyj pola jasnego, aby zlokalizować komórki i uzyskać ostry obraz.</li>
	<li>Ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej różnią się w zależności od użytych fluorochromów do znakowania komórek drożdży oraz rodzaju mikroskopu. W tej procedurze wykorzystano konfokalny mikroskop skaningowy Zeiss LSM 700 z obiektywem olejowym Plan-Apochromat 63x (NA=1.4) przy ustawieniu średniego skanu płaszczyzny 16 linii. Apertura pinhole powinna być ustawiona na 1-1.1 jednostek Airy, co zapewnia optyczny przekrój o grubości 0.8 mm. Detekcję GFP w kanale Track 1 przeprowadzono przy użyciu zestawu filtrów dla Alexa 488 z dzielnikiem wiązki przy 582 nm, co pozwala na detekcję długości fal między 488 a 582 nm. W kanale Track 2 wykorzystano zestaw filtrów optymalnych dla mCherry z dzielnikiem wiązki przy 578 nm, detekując długości fal między 578 a 600 nm. Oznacza to, że w kanale Track 2 wykrywane będą zarówno mRFP (SPB), jak i NM (mCherry).</li>
	<li>Wykonaj tyle zdjęć, ile jest konieczne do przeprowadzenia pomiarów w 60 różnych komórkach dla każdego szczepu. Zazwyczaj wystarczające jest 15 zdjęć niezależnych pól widzenia. Zaleca się przygotowanie nowej komory wzrostowej ze świeżymi komórkami, jeśli czas mikroskopii przekroczy 60 minut.</li>
</ol>
4. Ilościowy pomiar odległości subkomórkowych
<ol>
	<li>Otwórz obrazy w programie Zeiss Zen Light Edition. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierz odległość w μm pomiędzy różnymi fluorochromami we wszystkich komórkach, w których wszystkie sygnały znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Dostosuj natężenie światła i kontrast, aby zidentyfikować środek sygnału fluorescencyjnego. Ten uproszczony protokół wykorzystuje tylko dwa różne kolory, w związku z czym SPB i NM znajdują się w tym samym kanale. SPB można rozpoznać po dużej, okrągłej strukturze w obrębie NM. Przenieś zmierzone odległości do arkusza notatnika. Wykonaj pomiary w co najmniej 60 komórkach. Do pomiaru odległości można wykorzystać również inne programy, takie jak ImageJ, jednak preferowany jest Zeiss Zen Light ze względu na wyższą rozdzielczość obrazu oraz łatwość przybliżania i oddalania widoku. Obrazy w formacie lsm otwarte w ImageJ będą miały dwa kanały nałożone na siebie. Aby utworzyć obraz z obydwoma kanałami, najpierw rozdziel oba kanały, a następnie je połącz. Po tym zabiegu można użyć narzędzia linii do pomiaru odległości zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Porównaj średnie lub mediany podkomórkowych odległości pomiędzy różnymi szczepami i wariantami traktowania za pomocą programu statystycznego, na przykład stosując test t lub test suma rang Manna-Whitneya, np. przy użyciu oprogramowania SigmaStat-3.5. Dane często nie mają rozkładu normalnego, ponieważ występuje selekcja komórek z krótszymi odległościami między sygnałami fluorescencyjnymi, gdyż wszystkie sygnały muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, aby można było je zmierzyć. Test t można zastosować tylko wtedy, gdy dane mają rozkład normalny, natomiast test suma rang Manna-Whitneya pozwala na porównanie zbiorów danych, które nie wykazują rozkładu normalnego. W teście t porównuje się średnie z dwóch różnych zbiorów danych, podczas gdy w teście suma rang Manna-Whitneya porównuje się mediany.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Szczep PJ1185:(h+ his7+::dis1placR-GFP Chr1[::ura4+ hphMX6 lacO] sid4-mRFP::kanMX6 cut11-mCherry::natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN/N ) hodowano w pożywce EMM. Pobrano próbkę i umieszczono ją w małej komorze wzrostowej, a następnie wykonano zdjęcia (Rys. 1A +N). Następnie podłoże wzrostowe zastąpiono pożywką EMM bez chlorku amonu (EMM-N) i hodowano komórki przez 15 minut przy wstrząsaniu. Komórki poddane deprywacji azotu umieszczono następnie w komorze wzrostowej z EMM-N i wykonano zdjęcia (Rys. 1A -N). Do pomiaru odległości między locus (GFP) a SPB wykorzystano narzędzie pomiarowe (Rys. 1B i Tabela 1). Dodatkowo zmierzono odległość między locus (GFP) a NM (Rys. 1B i Tabela 2). Mediany odległości wewnątrzkomórkowych przed i po usunięciu azotu porównano za pomocą oprogramowania SigmaStat-3.5 (Tabela 3). Odnotowano statystycznie istotną zmianę lokalizacji klastra genów, który przemieścił się z NM w stronę SBP. Dane dotyczące odległości między GFP a SBP miały rozkład normalny, zatem średnie odległości (1,777 μm +N oraz 1,587 μm -N) można było porównać za pomocą testu t (Tabela 1 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema wartościami średnimi (P = 0,008, test t). Dane dotyczące odległości między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, dlatego odległości medianowe (0 μm +N oraz 0,390 μm -N) porównano za pomocą testu sum rang Manna-Whitneya (Tabela 2 i 3). Stwierdzono istotną różnicę między dwiema wartościami medianowymi (P &lt; 0,001, test sum rang Manna-Whitneya).
<img alt="Obraz mikroskopowy porównujący próbki N+ i N- z pomiarami odległości; analiza fluorescencyjna." src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Lokalizacja klastra genów nazwanego Chr1, znakowanego białkiem GFP, uległa zmianie po wprowadzeniu głodówki azotowej. (A) Lewa kolumna, +N, reprezentatywne jądro komórkowe komórki hodowanej w pożywce EMM; prawa kolumna, -N, reprezentatywne jądro komórkowe komórki hodowanej w pożywce EMM-N. Kolor zielony to sygnał GFP znakujący klaster Chr1, kolor czerwony to mRFP i mCherry znakujące odpowiednio SPB oraz błonę jądrową (NM). (B) To samo jądro komórkowe co w (A), ale z naniesionymi pomiarami odległości subnuklearnych; żółty: średnica jądra komórkowego, niebieski: odległość między SPB a sygnałem GFP oraz różowy: odległość między sygnałem GFP a błoną jądrową.
<img alt="Tabela danych równowagi statycznej; pomiary dla GFP-SPB, GFP-NM; analiza wyników eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 1"> 
<img alt="Tabela wyników analizy danych z wartościami numerycznymi dla badań naukowych." src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 1"> 
<img alt="Wykres analizy danych z wartościami numerycznymi, przydatny w badaniach statystycznych lub naukowych." src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Zmierzone odległości wewnątrzjądrowe w μm dla szczepu PJ1185 hodowanego w EMM. Pierwszy wiersz: średnica komórki (d), drugi wiersz: odległość między GFP a SPB, trzeci wiersz: odległość między GFP a NM.
<img alt="Tabela danych przedstawiająca pomiary białek dla GFP-SPB i GFP-NM." src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 2"> 
<img alt="Analiza danych; zbiór danych liczbowych wyświetlony w formacie kolumnowym; do oceny statystycznej i badań." src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 2"> 
<img alt="Tabela danych z wartościami liczbowymi, istotna dla analizy statystycznej lub interpretacji danych badawczych." src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Zmierzone odległości podjądrowe w μm dla szczepu PJ1185 hodowanego w EMM-N. Pierwszy wiersz: średnica komórki (d), drugi wiersz: odległość między GFP a SPB, trzeci wiersz: odległość między GFP a NM.
<img alt="Tabela z danymi pomiarowymi komórek; przedstawiająca liczbę komórek, średnią, medianę oraz wyniki analizy GFP-SPB/NM." src="/files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 3. Statystyki opisowe obserwowanych odległości wewnątrzjądrowych w szczepie PJ1185 przed (+N) i po (-N) zagłodzeniu azotowym. Pierwszy wiersz: liczba zmierzonych komórek, drugi wiersz: średnica średnia (d), trzeci wiersz: średnica mediana (d), czwarty wiersz: średnia odległość między GFP a SPB, piąty wiersz: mediana odległości między GFP a NM.

<ol><li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li>
<li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li>
<li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li>
<li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li>
<li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li>
<li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li>
<li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cut11%28%2B%29%3A+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li>
<li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li>
<li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li>
<li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li>
<li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+IM+%22Fluorescence+microscopy+in+yeast%22">Fluorescence microscopy in yeast</a>. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li>
<li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W ciągu ostatniej dekady obrazowanie żywych komórek w celu monitorowania zdarzeń komórkowych stało się coraz bardziej popularne. Zaczęło się od zastosowania zielonego białka fluorescencyjnego z meduzy Aequorea victoria, a obecnie dostępnych jest wiele różnych fluorochromów emitujących fluorescencję w szerokim spektrum, od cyjanowego (475 nm) do dalekiej czerwieni (648 nm) 11. Jedną z głównych zalet obrazowania żywych komórek w stosunku do immunofluorescence jest fakt, że komórki nie są utrwalane formaldehydem ani traktowane etanolem/acetonem przed mikroskopią, co pozwala uniknąć możliwych artefaktów wynikających z procesu utrwalania. Ponadto obrazowanie żywych komórek daje możliwość śledzenia pojedynczych komórek i wykonywania zdjęć w częstych odstępach czasu podczas wielogodzinnej lub wielodniowej inkubacji, co umożliwia rejestrowanie filmów z przebiegu zdarzeń komórkowych 12. Komórki ssacze mają tę zaletę, że są większe, o średnicach około 100 μm, w porównaniu do mniejszych komórek drożdży o średnicy około 3-4 μm. Z drugiej strony zaletą drożdży jest łatwo manipulowalny genom. Rekombinacja homologiczna zachodzi w drożdżach bardzo wydajnie i jest wykorzystywana do fuzji białek zainteresowania z różnymi fluorochromami 3. Co więcej, zastosowanie ukierunkowanej integracji sekwencji lacO i późniejsza ekspresja białka LacR-GFP pozwala na detekcję konkretnej części genomu w obrębie jądra komórkowego 2. Wykorzystanie komórek S. pombe w mikroskopii ma dodatkowe zalety, ponieważ są to naturalne organizmy jednokomórkowe o krótkim czasie generacji, rosnące w niskokosztowych warunkach hodowli komórkowej. Ponadto S. pombe jest doskonałym eukariotycznym organizmem modelowym, ponieważ posiada geny homologiczne do genów metazoa.
Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest autofluorescencja komórek drożdży, która zakłóca detekcję właściwego sygnału. Problem ten można rozwiązać, stosując minimalne pożywki z glukozą sterylizowaną przez filtr zamiast autoklawowania. Dodatkowo komórki drożdży powinny być hodowane przez 2 dni w fazie logarytmicznej przed ich osadzeniem na preparacie. Przedstawiony tutaj protokół oferuje stosunkowo prostą, a jednocześnie ilościową metodę określania subkomórkowej lokalizacji białek w komórce drożdży. Ponadto, wykonując zdjęcia w różnych punktach czasowych, możemy śledzić zdarzenia komórkowe.

<table><tbody><tr><td>Lektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1395</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Mikroskop skaningowy laserowy&lt;/p&gt;LSM 700</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 700</td><td>Można zastosować inny mikroskop konfokalny.</td></tr><tr><td>SigmaStat&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt;3.5</td><td>Statcon</td><td>SigmaStat&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt;3.5</td><td>Można wykorzystać dowolne oprogramowanie do analizy statystycznej.</td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Obecnie dostępnych jest wiele technik mikroskopowych, które umożliwiają detekcję specyficznego białka wewnątrz komórki. W ciągu ostatniej dekady coraz popularniejsze stało się obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem fluorochromów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), bezpośrednio przyłączonych do białka będącego przedmiotem zainteresowania 1. Dzięki zastosowaniu GFP i podobnych fluorochromów w mikroskopie fluorescencyjnym można wykryć subkomórkową lokalizację i ruchy białek. Ponadto technika ta pozwala na badanie lokalizacji subjądrowej określonego regionu chromosomu. GFP zostaje połączone z białkiem represora Lac (LacR) i ektopowo wyeksponowane w komórce, do której w badanym regionie chromosomu wprowadzono tandemowe powtórzenia sekwencji lacO2. Kompleks LacR-GFP zwiąże się z powtórzeniami lacO, a ten obszar genomu będzie widoczny jako zielona kropka w mikroskopie fluorescencyjnym. Drożdże są szczególnie odpowiednie do tego typu manipulacji, ponieważ rekombinacja homologiczna jest w nich bardzo wydajna, co umożliwia ukierunkowaną integrację powtórzeń lacO oraz zaprojektowanych białek fuzyjnych z GFP 3. W niniejszej pracy opisujemy ilościową metodę analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych. Dodatkowe protokoły analizy żywych komórek drożdży rozszczepialnych można znaleźć na przykład w instrukcji dotyczącej przygotowania filmu przedstawiającego zachowanie chromosomów podczas mejozy 4. W tym konkretnym eksperymencie skupiamy się na organizacji subjądrowej i tym, jak ulega ona zmianie podczas indukcji genów. Oznaczyliśmy klaster genów, nazwany Chr1, poprzez wprowadzenie miejsc wiązania lacO w sąsiedztwie genów. Klaster ten jest wzbogacony w geny, które są indukowane wczesną fazą głodzenia azotowego drożdży rozszczepialnych 5. W badanym szczepie błona jądrowa (NM) jest znakowana poprzez przyłączenie mCherry do białka NM Cut11, co daje czerwony sygnał fluorescencyjny. Białko Sid4 z ciała bieguna wrzeciona (SPB) jest połączone z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (Sid4-mRFP) 6. W wegetatywnie rosnących komórkach drożdży centromery są zawsze przytwierdzone do SPB, które jest osadzone w NM 7. SPB jest identyfikowane jako duża, okrągła struktura w NM. Poprzez obrazowanie przed i 20 minut po usunięciu źródła azotu możemy wyznaczyć odległość między klastrem genów (GFP) a NM/SPB. Porównując średnie lub mediany odległości przed i po usunięciu azotu, możemy ilościowo określić, czy po usunięciu azotu następuje zmiana lokalizacji subkomórkowej klastra genów.

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Obecnie dostępnych jest kilka technik mikroskopowych, które pozwalają na wykrycie konkretnego białka wewnątrz komórki. W ciągu ostatniej dekady obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowy pomiar organizacji podjądrowej w komórkach drożdży oraz analiza wpływu mutacji lub zmian w warunkach hodowli na tę organizację. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek drożdży do fazy logarytmicznej w warunkach minimalizujących autofluorescencję. Następnie komórki są przenoszone do komory hodowlanej w celu obserwacji pod mikroskopem.Następnie wykonuje się obrazy w celu pomiaru odległości między różnymi strukturami znakowanymi fluorescencyjnie w komórce. Otrzymane wyniki wykazują różnice w organizacji pozjądrowej, która zależy od zmiany warunków odżywczych podczas wzrostu kultury drożdży. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki dotyczące współzależności między organizacją subjądrową chromatyny a regulacją genów.Przygotowanie ryb i drożdży rozpoczyna się od sporządzenia minimalnego medium edynburskiego (EMM) lub EMM z dodatkiem chlorku amonu w celu zredukowania autofluorescencji, zamiast stosowania autoklawowania. Do sterylizacji roztworu glukozy należy użyć filtra 0,2 µm, a następnie dodać go do mediów autoklawowanych. W probówkach o pojemności 30 ml należy zaszczepić 3 ml EMM komórkami ryb i drożdży.Komórki świeżo wyhodowane na płytce agarowej w bogatym medium YEA należy przenieść do probówek, lekko je zakapslować i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 RPM i 30 °C. Przez dwa dni należy utrzymywać komórki w fazie logarytmicznej, wykonując odliczanie w komorze Bürkera każdego ranka i wieczora oraz rozcieńczając zawiesinę do odpowiedniego zagęszczenia. W dniu eksperymentu.Komórki powinny znajdować się we wczesnej fazie logarytmicznej wzrostu w pożywce z ograniczoną ilością azotu. Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym, aby zebrać komórki w jeden osad na dnie probówki wirówkowej 1,5 ml w wirówce typu Eppendorf, przy maksymalnej sile odśrodkowej 1,5 RCF, najpierw wirując probówkę przez dwie minuty, a następnie obracając ją o 180 stopni i wirując przez kolejne dwie minuty. Należy usunąć cały nadsącz z wyjątkiem 10 do 15 µL i resuspenderć komórki w pozostałej pożywce, a następnie dodać porcję lektyny stężeniem 1 mg/mL, wysterylizowanej przez filtr.Nanieś 5 µL roztworu lektyny na róg szkiełka nakrywkowego, a następnie dodaj 5 µL hodowli do kropli lektyny. Aby stworzyć komorę wzrostową dla komórek bazalnych S pom, nanieś pipetą 5 µL podłoża EMM na czystą laminkę, a następnie odwróć szkiełko nakrywkowe z hodowlą pod kątem 70 stopni nad podłożem i opuść je pionowo na EMM, uszczelniając krawędzie smarem silikonowym. Odetnij szeroki koniec końcówki o pojemności 200 µL i przymocuj wąski koniec do strzykawki o pojemności 2 mL.Napełnij strzykawkę około 1 ml smaru silikonowego. Nałóż cienką linię silikonu na krawędzie szkiełka nakrywkowego, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby uszczelnić komorę wzrostową. Rozpocznij od użycia obrazowania w polu jasnym, aby zlokalizować komórki i wykonać wykop.Uzyskaj ostry obraz do mikroskopii konfokalnej. Używamy skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM 700 z obiektywem olejowym Plan Apochromat 63× oraz ustawieniem średniej z 16 linii skanowania w płaszczyźnie. Ustaw jednostki obszaru na 1 do 1,1, aby uzyskać przekrój optyczny o grubości 0,8 µm.Przeskanuj komórki za pomocą laserów wykrywających Alexa 4 88 oraz mCherry lub GFP. Wykonaj wystarczającą liczbę obrazów, aby przeprowadzić pomiary w 60 komórkach dla każdego odpływu. Przejdź do nowej komory wzrostowej z nowymi komórkami.Po 60 minutach obrazowania otwórz obraz w programie Zeen Light Edition, aby zmierzyć odległość między sygnałami różnych fluoroforów w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Otwórz narzędzie pomiarowe i dostosuj intensywność światła oraz kontrast, aby zidentyfikować środek każdego sygnału fluorescencyjnego, na przykład ciała bieguna wrzeciona i błony jądrowej, a następnie zmierz odległość między nimi. Przenieś dane do arkusza notatnika.Porównaj średnie lub mediany odległości subkomórkowych pomiędzy różnymi szczepami i wariantami traktowania, korzystając z oprogramowania statystycznego lub testów, takich jak test t-Studenta lub test sum rang preparationsa Mann-Whitneya. W tym przykładzie szczep PJ 1 18 5 był hodowany w EMM, a próbkę umieszczono w komorze wzrostowej w celu obrazowania. Następnie pobrano alikwot PJ 1 18 5.Kulturę przeniesiono do pożywki EMMN i inkubowano przez 15 minut, po czym próbkę umieszczono w komorze wzrostu w celu obrazowania. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierzono odległość między locus a ciałem bieguna wrzeciona oraz między locus a błoną jądrową. Jak pokazano tutaj, stwierdzono statystycznie istotną różnicę w odległości klastra genów oddalającego się od błony jądrowej w kierunku ciała bieguna wrzeciona w komórkach głodzonych azotem w porównaniu do komórek hodowanych w obecności azotu.Dane dotyczące pomiaru odległości między GFP a SBP miały rozkład normalny, w związku z czym średnie odległości można było porównać za pomocą testu T. Stwierdzono istotną różnicę między tymi dwiema wartościami średnimi. Dane dotyczące pomiaru odległości między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, dlatego mediany odległości porównano za pomocą testu suma rang Manna-Whitneya.Po zastosowaniu tej procedury odnotowano istotną różnicę między dwiema wartościami mediany. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące korelacji poziomu ekspresji genów ze zmianami w organizacji podjądrowej można przeprowadzić inne metody, takie jak real-time PCR.

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek drożdży fisyjnych

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę ilościowej analizy organizacji podjądrowej w komórkach drożdży rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala badać wpływ warunków odżywczych i mutacji na dynamikę chromatyny oraz regulację ekspresji genów.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Przeglądaj więcej filmów