Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowy pomiar organizacji podjądrowej w komórkach drożdży oraz określenie, w jaki sposób wpływają na nią zmiany warunków wzrostu lub mutacje. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek drożdży do fazy logarytmicznej w warunkach minimalizujących autofluorescencję. Następnie komórki umieszcza się w komorze wzrostowej w celu obserwacji pod mikroskopem.

Następnie wykonuje się zdjęcia, aby zmierzyć odległość między różnymi strukturami komórkowymi znakowanymi fluorescencyjnie. Uzyskane wyniki wykazują różnice w organizacji pozjądrowej, która zależy od zmiany warunków odżywczych podczas wzrostu kultury drożdży. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki dotyczące współzależności między organizacją subjądrową chromatyny a regulacją genów.

Przed rozpoczęciem pracy z rybami i drożdżami należy przygotować minimalne podłoże z Edynburga (Edinburgh minimal medium, EMM) lub podłoże EMM z dodatkiem chlorku amonu w celu zmniejszenia autofluorescencji, zamiast stosować autoklawowanie. Do sterylizacji roztworu glukozy należy użyć filtra o wielkości oczek 0,2 µm, a następnie dodać go do przetworzonego w autoklawie podłoża. Do 30 ml probówek zawierających 3 ml podłoża EMM należy wprowadzić komórki ryb i drożdży.

Komórki świeżo wyhodowane na płytce agarowej w bogatej pożywce YEA należy przenieść do probówek, lekko je zakapslować i inkubować w inkubatorze wytrząsowym przy 225 RPM i 30 °C. Przez dwa dni należy utrzymywać komórki w fazie logarytmicznej, dokonując odczytów w komorze Bürkera każdego ranka i wieczora oraz rozcieńczając hodowlę do odpowiedniej gęstości. W dniu eksperymentu.

Komórki powinny znajdować się w wczesnej fazie wzrostu logarytmicznego w pożywce azotowej. Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym, aby zebrać komórki w jeden pellet na dnie probówki do wirowania; 1,5 ml zawiesiny komórkowej w probówce typu Eppendorf wirować z maksymalną siłą 1,5 RCF, najpierw przez dwie minuty, a następnie obrócić probówkę o 180 stopni i wirować przez kolejne dwie minuty. Usunąć cały naddestylat poza 10 do 15 µl i resuspenderć komórki w pozostałej pożywce, dodając aliquot lektyny w stężeniu 1 mg/ml, sterylizowanej przez filtr.

Dodaj 5 µL roztworu lektyny do narożnika szkiełka nakrywki, a następnie dodaj 5 µL hodowli do kropli lektyny. Aby stworzyć komorę wzrostu dla komórek bazowych S. pom, nanieś pipetą 5 µL EMM na czyste szkiełko przedmiotowe, a następnie odwróć szkiełko nakrywki z hodowlą pod kątem 70 stopni nad medium i opuść je pionowo na EMM, aby uszczelnić krawędzie smarem silikonowym. Odetnij szeroki koniec końcówki 200 µL i przymocuj wąski koniec do strzykawki 2 mL.

Napełnij strzykawkę około jednym mililitrem smaru silikonowego. Nanieś cienką linię silikonu na krawędzie szkiełka nakrywkowego, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby uszczelnić komorę wzrostu. Rozpocznij od użycia obrazowania w polu jasnym (Brightfield Imaging), aby zlokalizować komórki i obszar badania.

Uzyskaj wyraźny obraz do mikroskopii konfokalnej. Używamy skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM 700 z obiektywem plan apochromat 63x z imersją olejową oraz ustawieniem uśredniania skanu płaszczyzny dla 16 linii. Ustaw jednostki obszaru w zakresie od 1 do 1,1, aby uzyskać plaster optyczny o grubości 0,8 µm.

Przeskanuj komórki laserami wykrywającymi Alexa 4 88 i mCherry lub GFP. zarejestruj wystarczającą liczbę obrazów, aby przeprowadzić pomiary w 60 komórkach dla każdego odpływu. Przejdź do nowej komory hodowlanej ze świeżymi komórkami.

Po 60 minutach obrazowania otwórz obraz w programie Zeen Light Edition, aby zmierzyć odległość między sygnałami różnych fluoroforów w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Otwórz narzędzie pomiarowe i dostosuj intensywność światła oraz kontrast, aby zidentyfikować środek każdego sygnału fluorescencyjnego, na przykład ciała bieguna wrzeciona i błony jądrowej, a następnie zmierz odległość między nimi. Przenieś dane do arkusza notatnika.

Porównaj średnie lub mediany odległości wewnątrzkomórkowych pomiędzy różnymi szczepami i wariantami traktowania, wykorzystując oprogramowanie statystyczne lub testy takie jak test t-Studenta lub test sumy rang Manna-Whitneya. W tym przykładzie szczep PJ 1 18 5 był hodowany w EMM, a próbkę umieszczono w komorze wzrostowej w celu obrazowania. Następnie pobrano alikwot PJ 1 18 5.

Kulturę przeniesiono do pożywki EMMN i inkubowano przez 15 minut, po czym próbkę umieszczono w komorze wzrostowej w celu obrazowania. Za pomocą narzędzia pomiarowego zmierzono odległość między lokusem a ciałem bieguna wrzeciona oraz między lokusem a błoną jądrową. Jak pokazano tutaj, odnotowano statystycznie istotną różnicę w odległości klastra genów przemieszczającego się od błony jądrowej w stronę ciała bieguna wrzeciona w komórkach głodzonych azotowo w porównaniu do komórek hodowanych na podłożu z azotem.

Dane dotyczące pomiaru odległości między GFP a SBP miały rozkład normalny, w związku z czym średnie odległości można było porównać za pomocą testu t-Studenta. Odnotowano istotną różnicę między dwiema średnimi wartościami. Dane dotyczące pomiaru odległości między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, dlatego odległości medianowe porównano za pomocą testu sumy rang Manna-Whitneya.

Po zastosowaniu tej procedury odnotowano istotną różnicę między dwiema wartościami mediany. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące korelacji poziomu ekspresji genów ze zmianami w organizacji podjądrowej można zastosować inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym.