Ilościowa analiza pod mikroskopią fluorescencyjną żywych komórek drożdży rozszczepieniowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowy pomiar organizacji subjądrowej w komórkach drożdży i tego, jak wpływają na nią zmiany warunków wzrostu lub mutacje. Osiąga się to poprzez hodowanie komórek drożdży do fazy logarytmicznej w warunkach, które zminimalizują autofluorescencję. Następnie komórki umieszcza się w komorze wzrostowej w celu obejrzenia pod mikroskopem.

Następnie wykonywane są obrazy w celu zmierzenia odległości między różnymi fluorescencyjnie znakowanymi strukturami w komórce. Uzyskano wyniki, które wskazują na różnice w organizacji niejądrowej, która jest zależna od zmiany warunków żywieniowych podczas wzrostu kultury drożdży. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epie dotyczące wzajemnych oddziaływań między organizacją subar lub chromatyną a regulacją genów.

Ryby i drożdże Toul zaczynają się od przygotowania minimalnej pożywki z Edynburga lub EMM i EMM z chlorkiem amonu w celu zmniejszenia autofluorescencji, a nie w autoklawie. Użyj filtra 0,2 mikrona, aby wysterylizować roztwór glukozy i dodać go do podłoża autoklawu. Zaszczep trzy mililitry EMM w 30-mililitrowych probówkach komórkami ryb i drożdży.

Świeżo wyhodowane na płytce agarowej w bogatym podłożu, YEA lekko zakryć probówki i inkubować komórki w wytrząsarce z prędkością 225 obr./min i 30 stopni Celsjusza. Utrzymuj komórki w fazie logarytmicznej przez dwa dni, licząc je w komorze birki codziennie rano i wieczorem i rozcieńczając je do odpowiedniej gęstości. W dniu eksperymentu.

Komórki powinny być wczesną fazą logarytmiczną dla personelu azotowego. Komórki odnoszą się do procedury opisanej w pisemnym protokole, polegającej na zebraniu komórek w jednym granulie na dnie wirówki probówkowej, 1,5 mililitra komórek w probówce eend orph przy maksymalnej wartości 1,5 RCF, najpierw obracając probówkę przez dwie minuty, a następnie obracając ją o 180 stopni przez dodatkowe dwie minuty. Usunąć wszystkie oprócz 10 do 15 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu, przy podwielokrotności jednego miligrama na mililitr wysterylizowanej lektyny filtracyjnej.

Dodaj pięć mikrolitrów roztworu lektyny do rogu szkła nakrywkowego i dodaj pięć mikrolitrów kultury do kropli lektyny. Aby utworzyć komorę wzrostową komórek na bazie S pom, odpipetuj pięć mikrolitrów EMM na czystym szkiełku i odwróć szkło nakrywkowe z kulturą pod kątem 70 stopni nad pożywką i upuść ją od góry do dołu na EMM, aby uszczelnić krawędzie smarem silikonowym. Odetnij szeroki koniec końcówki o pojemności 200 mikrolitrów i przymocuj wąski koniec do dwumililitrowej strzykawki.

Napełnić strzykawkę około jednym mililitrem smaru silikonowego. Nałóż cienką linię silikonu na krawędzie szkła nakrywkowego, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby zobrazować komorę wzrostu. Zacznij od użycia obrazowania w jasnym polu, aby zlokalizować komórki i kopać.

Uzyskaj ostry obraz do mikroskopii konfokalnej. Używamy laserowego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM 700 z soczewką obiektywową z chromatem planowym 63 razy i 16-liniowym ustawieniem średniego skanowania płaszczyzny. Ustaw jednostki powierzchni na jeden do 1,1, aby uzyskać wycinek optyczny o wielkości 0,8 mikrona.

Zeskanuj komórki za pomocą laserów, które wykrywają Alexa 4 88 i mCherry lub GFP. Zapisz wystarczającą liczbę obrazów, aby wykonać pomiary w 60 komórkach dla każdego drenu. Przełącz się na nową komorę wzrostową ze świeżymi komórkami.

Po 60 minutach obrazowania otwórz obraz w programie Zeen Light Edition, aby zmierzyć odległość między sygnałami różnych fluoroforów w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Otwórz narzędzie pomiarowe i dostosuj natężenie światła i kontrast, aby zidentyfikować środek każdego sygnału fluorescencyjnego, na przykład korpus bieguna wrzeciona i membranę jądrową, a następnie zmierzyć odległość między nimi. Przenieś dane do arkusza notatnika.

Porównaj średnie lub mediany odległości subkomórkowych między różnymi szczepami i terapiami za pomocą oprogramowania statystycznego lub testów, takich jak test T lub test sumy rang Mana-Whitneya. W tym przykładowym szczepie PJ 1 18 5 wyhodowano w EMM, a próbkę umieszczono w komorze wzrostowej w celu obrazowania. Następnie podwielokrotność PJ 1 18 5.

Hodowlę przeniesiono do EMMN i inkubowano przez 15 minut, zanim próbkę umieszczono w komorze wzrostowej w celu obrazowania. Przyrząd pomiarowy posłużył do zmierzenia odległości między locus a korpusem bieguna wrzeciona, a także między locus a błoną jądrową. Jak pokazano tutaj, istniała statystycznie istotna różnica w odległości klastra genów oddalającego się od błony jądrowej w kierunku korpusu bieguna wrzeciona w komórkach pozbawionych azotu w porównaniu z komórkami hodowanymi w azocie.

Dane mierzące odległość między GFP a SBP miały rozkład normalny, a zatem średnie odległości można było porównać za pomocą testu T. Wystąpiła znacząca różnica między tymi dwiema średnimi wartościami. Dane mierzące odległość między GFP a NM nie miały rozkładu normalnego, w związku z czym mediany odległości porównano za pomocą testu sumy rangowej Whitneya.

Po wykonaniu tej procedury wystąpiła znacząca różnica między dwiema medianami. Inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób poziom ekspresji genów koreluje ze zmianami w organizacji subjądrowej.