Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Procedura ta lokalizuje przestrzennie wiele endogennych lipidów w soczewce bydlęcej. Wykorzystując technikę jonizacji DESORPCJI laserowej wspomaganej matrycą, obrazowania spektrometrycznego mas. Najpierw przygotuj cienki wycinek tkanki soczewki bydlęcej i nałóż matrycę wielomatrycową, a następnie uzyskaj zestaw danych spektralnych mas maldi.

Przetwarzaj zestaw danych na wizualną reprezentację wykrytych lipidów w przekroju tkanki soczewki. Razem wyniki te mogą określić lokalizację i względną obfitość lipidów w soczewce bydlęcej i stworzyć wizualną reprezentację tego rozkładu W porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekstrakcja lipidów, a następnie analiza LCMS, obrazowanie spektrometrii mas maldi pozwala na wizualizację wielu lipidów jednocześnie bez utraty ich lokalizacji przestrzennej. Usunąć zamrożone próbki tkanek z miejsca przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Wyjmij kapsułkę z powierzchni soczewki, aby zamocować cały wycinek soczewki cielęcia bydlęcego. Umieść jedną lub dwie krople wody na etapie cięcia tkanek kriostatu. Szybko umieść soczewkę w wodzie, zanim stwardnieje, gdy kriostat osiągnie optymalną temperaturę.

Pokrój tkankę równikowo na odcinki o grubości 20 mikronów. Odrzuć pierwsze skrawki tkanki i używaj tylko plastrów, które są blisko lub dodają płaszczyznę równikową do obrazowania tkanki soczewki oka. Dodaj 1,5 mikrolitra kwasu mrówkowego, aby wstępnie zwilżyć powierzchnię szkiełka ze szkła powlekanego ITO.

Następnie ostrożnie przenieś skrawki tkanki na szkiełko wewnątrz kriostatu. Następnie liofilizuj szkiełka przez 15 minut przed aplikacją maldi matrix. Za pomocą korektora w płynie narysuj trzy znaki dydaktyczne na nieprzewodzącej powierzchni szkiełka z powłoką ITO.

Teraz wykonaj optyczny obraz szkiełka tkankowego za pomocą skanera płaskiego i zapisz go w odpowiednim formacie, takim jak TIFF lub jpeg. Najpierw zakryj krawędzie przedniej powierzchni szkiełek szklanych powlekanych ITO taśmą, aby matryca nie pokrywała krawędzi szkiełka. Przygotować matrycę do użycia w odpowiednim rozpuszczalniku.

Następnie nałóż roztwory matrycy na powierzchnie skrawków tkanki. Pokryj szkiełko szkiełkiem, używając 20 cykli powlekania matrycy. Alternatywnie, do nakładania matryc można użyć pneumatycznie wspomaganego rozpylacza aerografu, jeśli rozpuszczalnik jest niekompatybilny z elektronicznym opryskiwaczem matrycowym.

W przypadku roztworu do kalibracji masy rozcieńczyć roztwór wzorcowy mieszanki strojeniowej ES w stosunku od jednego do 200 w 60% Izopropanol wprowadził dwa mikrolitry na minutę rozcieńczonego roztworu mieszanki strojeniowej ES do dwutrybowego źródła jonów jonizacyjnych w trybie elektronatryskowym na przyrządzie dla czterech rezonansu cyklotronowego jonów transformacyjnych ms. Uruchom instrument F-T-I-C-R w trybie ESI jonów dodatnich z detekcją szerokopasmową i rozmiarem akwizycji danych 1024 kilobajtów Sekundę. Zazwyczaj ustawia się parametry ESI na 3 900 woltów napięcia elektronatrysku kapilarnego.

Napięcie osłony przeciwbryzgowej 3 600 V przepływu azotu w nebulizatorze z prędkością dwóch litrów na minutę. Przepływ suchego azotu z prędkością czterech litrów na minutę i temperatura 200 stopni Celsjusza. Ustaw również odpieniacz o jedno napięcie na 15 woltów.

Czas lotu do 0,01 sekundy Zderzenie przepływu argonu do 0,4 litra na sekundę, czas akumulacji jonów źródłowych do 0,1 sekundy i czas akumulacji jonów ogniwa zderzeniowego do 0,2 sekundy. Teraz dostosuj parametry pracy F-T-I-C-R, aby zmaksymalizować czułość analityczną w zakresie masy od stosunku masy do ładunku od 200 do 1400, zachowując przy tym dobre sygnały zaniku indukcji w dziedzinie czasu. Następnie uzyskaj widma masowe ESI i skalibruj przyrząd przy użyciu mas referencyjnych związków wzorcowych w roztworze mieszanki strojeniowej E es.

Aby dostroić przyrząd do działania MALDI, należy rozpuścić kilka jednolitrowych podwielokrotności zmieszanego roztworu wzorcowego turyny i INE w roztworze matrycy o stężeniu jednego mikromola każdy i umieścić te roztwory bezpośrednio na jednym z odcinków tkanki próbki. Umieść szkiełko w adapterze szkiełka tkankowego i załaduj adapter od strony MALDI do podwójnego źródła jonów ESI maldi. Następnie należy zoptymalizować odpowiednie parametry pracy MALDI dla mocy lasera oraz liczby strzałów laserowych dla akumulacji sygnału MALDI dla każdego skanu masowego.

Po dostrojeniu, kalibracji i optymalizacji instrumentu do eksperymentów maldi MSI, dopasuj fizyczną lokalizację zobrazowanego odcinka tkanki do zarejestrowanego obrazu optycznego w oprogramowaniu do obrazowania. Wyrównaj trzy oznaczenia płynu korekcyjnego za pomocą metody triangulacji trzypunktowej. Następnie rozpocznij jednoczesną operację ESI MALDI, tak aby każde widmo masy zawierało piki masy odniesienia roztworu mieszanki strojeniowej E ES do wewnętrznej kalibracji masy po akwizycji.

Najpierw należy osłabić sygnał ESI poprzez zmniejszenie napięcia kapilarnego, aż sygnały MALDI zdominują widma, podczas gdy sygnały kalibru ESI są nadal wystarczająco wysokie, aby można było przeprowadzić wewnętrzną kalibrację masy. Następnie skonfiguruj zautomatyzowaną metodę rasingu dla lasera promieniowania. Korzystanie z losowej analizy punktowej.

Zdefiniuj obszary tkanki, które mają być obrazowane i ustaw odpowiedni rozmiar kroku lasera RA. Skalibruj widma masowe MALDI za pomocą kalibracji wewnętrznej w celu wstępnego porównania oraz wybierz piki dla izotopu MSMS de i wybierz piki monoizotopowe za pomocą dostosowanego skryptu VBA i wyeksportuj wynikowe listy pików monoizotopowych. Wprowadź zmierzone wartości stosunku masy do ładunku do bazy danych metabolomu Melin nine i/lub HMDB w celu dopasowania masy do wpisów w bibliotece.

Następnie wygeneruj obrazy maldi dla wszystkich jednostek lipidowych wykrytych w całym przekroju tkanki za pomocą oprogramowania do obrazowania o szerokości filtra masowego jednej części na milion w wierzchołku szczytu. Po wygenerowaniu obrazów dla wszystkich wartości stosunku masy do ładunku, które są zgodne z wpisami w bazie danych, wygeneruj obrazy dla wszystkich innych pików, aby poszukać unikalnych wzorców rozkładu, które można później zbadać dla niektórych określonych tkanek, takich jak soczewka bydlęca. Często obserwuje się rozległe rozdarcie tkanki, gdy stosuje się montaż z bezpośrednim rozmrażaniem.

Preco szkiełka IT OAS z etanolem lub kwasem mrówkowym pomaga utrzymać integralność skrawków tkanek podczas montażu tkanki. Zarówno wybór matrycy, jak i dobór rozpuszczalnika są ważnymi czynnikami wpływającymi na jakość widm MALDI. W tych przykładach porównano widmo wytworzone przy użyciu wydajnego rozpuszczalnika matrycowego ze złym wyborem rozpuszczalnika matrycowego dla diolu.

Po uzyskaniu zestawu widm masowych z eksperymentu Maldi MSI, można wygenerować obraz dla każdego z wykrytych jonów. Przy czym każdy piksel reprezentuje punkt napromieniowania laserowego z powierzchni wycinka tkanki. Względne stężenia analitów można wyszczególnić w różnych częściach sekcji tkanki.

W większości eksperymentów dane są normalizowane jako całkowity prąd jonowy w każdym spektrum. Bez tej normalizacji obszarów z lepszą matrycą analitową, krystalizacja COC może powodować silniejsze sygnały dla analitów, a to zniekształciłoby dane. Przygotowanie tkanek może również radykalnie zmienić generowany obraz.

Jeśli próbka jest zbyt mokra, anality ulegną delokalizacji na tkance i wiele informacji przestrzennych zostanie utraconych. Ta demonstracja eksperymentu obrazowania tkanek na soczewce oka wykorzystała diol jako multi Matrixx do określenia przestrzennego rozkładu lipidów przez F-T-I-C-R-M-S. Obrazowanie lipidów w różnych typach tkanek można przeprowadzić za pomocą diolu lub innej matrycy w podobny sposób.