Name: Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T19:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę obrazowania MALDI z dithranolem do analizy lipidów endogennych w soczewce wołowej. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzenną lipidów bez utraty ich lokalizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Genome Canada i Genome British Columbia za finansowanie platformy i wsparcie. Dziękujemy również dr Carol E. Parker za krytyczną recenzję manuskryptu i pomoc w jego redakcji. CHL dziękuje również British Columbia Proteomics Network za wsparcie.

1. Sekcja tkanek
<ol>
	<li>Po zebraniu próbek należy błyskawicznie zamrozić przy użyciu ciekłego azotu, wysłać je na suchym lodzie (jeśli wymagana jest wysyłka) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu podziału tkanki. (Jeśli używane są próbki handlowe, należy upewnić się, że próbki są przygotowane w ten sposób.)</li>
	<li>Przytnij narządy do możliwego do opanowania rozmiaru, aby pasowały do celu MALDI. Odetnij wszelkie niechciane części narządu. W tym opisanym tutaj badaniu soczewki cieląt bydlęcych zostały pozbawione kapsułki przy użyciu wcześniej opisanej procedury35 przed sekcją tkanek.</li>
	<li>Wyjmij całe narządy z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść je na etapie kriogenicznego cięcia tkanki. Aby zamocować soczewkę cielęcia bydlęcego, umieść jedną lub dwie krople wody na etapie cięcia tkanek kriostatu. Szybko umieść soczewkę w wodzie, zanim stwardnieje. Alternatywnie, związki o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) mogą być również używane do mocowania tkanki na etapie cięcia. Jeżeli stosuje się związki OCT, należy zastosować minimalną ilość OCT i należy zadbać o to, aby przecięte skrawki tkanek nie były zanieczyszczone związkami OCT, które mogą zakłócać jonizację i wykrywanie analitów5,36,37.</li>
	<li>Pozwolić, aby temperatura wewnątrz kriostatu zrównoważyła się do -18 °C. Niższe lub cieplejsze temperatury mogą być stosowane odpowiednio dla tkanek miękkich lub twardszych. Następnie pokrój tkankę równikowo na plastry o grubości 20 μm. Do większości tkanek używaj plastrów o grubości 10-15 μm; Jednak ze względu na delikatną naturę tkanki soczewki bydlęcej użyto plastrów o grubości 20 μm. W przypadku bydlęcej tkanki soczewkowej należy odrzucić pierwsze skrawki tkanki i używać tylko plastrów, które znajdują się blisko lub na płaszczyźnie równikowej.</li>
	<li>Jeśli obrazowana jest tkanka soczewki oka, użyj 1,5 μl kwasu mrówkowego (czystość 98%, klasa LC-MS) do wstępnego zwilżenia powierzchni szkiełka podstawowego pokrytego tlenkiem indu cyny (ITO).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś skrawki tkanki na powierzchnię mikroskopijnego szkiełka mikroskopijnego pokrytego ITO wewnątrz kriostatu. Przekrój tkanki szybko się rozmrozi i zostanie mocno przymocowany do powierzchni szkiełka. Zazwyczaj w ten sposób można zamontować wiele odcinków tkanek na tym samym szkiełku pokrytym ITO.</li>
	<li>Liofilizować szkiełko przez 15 minut przed aplikacją matrycy MALDI.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia badania matrycowego należy rozpuścić poszczególne matryce w odpowiednich rozpuszczalnikach. Ręcznie nanieść 1 μl każdego roztworu matrycy na wycinek tkanki. Dodatkowo nanieś na tkankę wzorzec kalibracyjny małych cząsteczek w celu weryfikacji czułości MALDI.</li>
	<li>Dodaj trzy znaki dydaktyczne do szkiełka ze szkła powlekanego ITO, pisząc na nieprzewodzącej powierzchni szkiełka ze szkła powlekanego ITO za pomocą pisaka w płynie korekcyjnym. Wykonaj optyczne zdjęcie szkiełka tkankowego za pomocą skanera płaskiego i zapisz je w odpowiednim formacie, takim jak TIFF lub jpg.</li>
</ol>
2. Powłoka matrycy
2.1. Automatyczne powlekanie matrycy
<ol>
	<li>Roztwory matrycy, które zawierają acetonitryl lub mieszaninę acetonitrylu i wody jako rozpuszczalniki, należy automatycznie nanosić na powierzchnie skrawków tkanek za pomocą Bruker ImagePrep lub podobnego elektronicznego urządzenia do natryskiwania matrycy.</li>
	<li>Krawędzie przedniej powierzchni szkiełka z powłoką ITO należy pokryć taśmą, tak aby matryca nie pokrywała krawędzi szkiełka. Gwarantuje to, że znaczniki uczenia na przeciwległej powierzchni mogą być używane do wyrównania szkiełek tkankowych. Nie zakrywaj krawędzi szkiełka matrycą, ponieważ są one używane jako punkty kontaktowe w celu utrzymania przewodności elektrycznej szkiełka pokrytego ITO.</li>
	<li>Pokryj szkiełko szkiełkowe, używając dwudziestu cykli powlekania matrycy (2-sekundowe natryskiwanie, 30-sekundowa inkubacja i 60-sekundowy czas schnięcia dla każdego cyklu).</li>
</ol>
2.2. Ręczne powlekanie matrycy
<ol>
	<li>Jeśli wymagane są rozpuszczalniki organiczne (np. chloroform i octan etylu), które są niekompatybilne z materiałami produkcyjnymi elektronicznego rozpylacza matrycowego, należy użyć pneumatycznie wspomaganego rozpylacza aerografu do nałożenia matrycy. Dodaj przygotowany roztwór matrycy do zbiornika rozpuszczalnika pistoletu do aerografu i nałóż delikatny strumień azotu pod ciśnieniem, aby zalać spray.</li>
	<li>Krawędzie przedniej powierzchni szkiełek podstawowych z powłoką ITO należy pokryć taśmą, tak aby matryca nie pokrywała krawędzi szkiełka. Gwarantuje to, że znaczniki uczenia na przeciwległej powierzchni mogą być używane do wyrównania szkiełek tkankowych. Nie zakrywaj krawędzi szkiełka matrycą, ponieważ są one używane jako punkty kontaktowe w celu utrzymania przewodności elektrycznej szkiełka pokrytego ITO.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu stabilnych i drobnych rozpyleń należy ręcznie spryskać matrycę, tak aby całkowicie pokryła wycinek tkanki. Zastosuj minimalną ilość roztworu matrycy wymaganą do ledwo zwilżonej powierzchni podczas każdego cyklu, aby zapobiec możliwemu delokacji analitu. Ogólnie rzecz biorąc, użyj około 10 cykli sprayu matrycowego, aby pokryć wycinek tkanki; Liczba cykli zależy od rodzaju tkanki i składu matrycy.</li>
</ol>
3. MALDI MS
<ol>
	<li>Przygotować roztwór wzorcowy masy, rozcieńczając roztwór wzorcowy "ES Tuning Mix" w stosunku 1:200 w stosunku 60:40 izopropanolu:wody (zawierającym 0,1% kwasu mrówkowego w końcowej mieszaninie).</li>
	<li>Wprowadzić 2 μl/min rozcieńczonego roztworu "ES Tuning Mix" do dwutrybowego źródła jonów jonizacji elektronatryskowej (ESI)/MALDI na spektrometrze mas FTICR, od strony ESI.</li>
	<li>Urządzenie FTICR pracuje w trybie ESI jonów dodatnich, z detekcją szerokopasmową i akwizycją danych o wielkości 1 024 kb/s. Typowe parametry ESI to napięcie elektrorozpylania kapilarnego, 3 900 V; napięcie osłony przeciwbryzgowej, 3 600 V; przepływ gazu nebulizatora (N2), 2 l/min; przepływ i temperatura suchego gazu (N2), 4 l/min i 200 °C; skimmer 1 napięcie, 15 V; czas lotu (TOF), 0,009 sek.; przepływ gazu zderzeniowego (Ar), 0,4 l/s; czas akumulacji jonów źródłowych, 0,1 sek.; i czas akumulacji jonów w ogniwie zderzeniowym, 0,2 sek. Dostosuj parametry operacyjne FTICR w celu maksymalizacji czułości analitycznej w zakresie mas od m/z 200 do 1 400, przy jednoczesnym zachowaniu dobrych sygnałów rozpadu swobodnej indukcji w dziedzinie czasu (FID). Zazwyczaj parametry pracy ICR to napięcie pomocnicze, 8 V; napięcie niezrównoważenia pomocnika, 8 V; wzmocnienie wzbudzenia 10; czas impulsu wzbudzenia, 0,01-0,015 sek.; napięcie przedniej płyty syfonu, 1,5 V; napięcie płyty pułapki wstecznej, 1,6 V i napięcie wejściowe analizatora, -4 V. Po określeniu zestawu parametrów pracy FTICR, należy pobrać widma masowe ESI i skalibrować przyrząd przy użyciu mas odniesienia związków wzorcowych w roztworze "ES Tuning Mix".</li>
	<li>Aby dostroić przyrząd do operacji MALDI, należy rozpuścić kilka 1 μl podwielokrotności zmieszanego roztworu wzorcowego terfenadyny i rezerpiny w roztworze matrycy o stężeniu 1 μM każdy i umieścić te roztwory bezpośrednio na jednym z odcinków tkanki (tj. wycinku tkanki testowej), który został zamontowany na szkiełku pokrytym ITO. Umieść szkiełko z powłoką ITO w adapterze do szkiełek tkankowych (tj. specjalnym celu MALDI) i załaduj adapter od strony MALDI do podwójnego źródła jonów ESI/MALDI. Zoptymalizuj odpowiednie parametry pracy MALDI dla mocy lasera i liczby strzałów laserowych dla akumulacji sygnału MALDI dla każdego skanu masowego itp. Typowe parametry pracy MALDI to: strzały laserowe, 50; i napięcie anodowe MALDI 300 V.</li>
	<li>Po dostrojeniu, kalibracji i optymalizacji instrumentu do eksperymentów MALDI-MSI, dopasuj fizyczną lokalizację zobrazowanego odcinka tkanki do zarejestrowanego obrazu optycznego w oprogramowaniu do obrazowania. Do tego wyrównania za pomocą metody triangulacji trzypunktowej należy użyć trzech znaczników "płynu korekcyjnego", które zostały wcześniej umieszczone po przeciwnej stronie powierzchni szkiełka pokrytego ITO (krok 1.9).</li>
	<li>Wykonaj jednoczesną operację ESI i MALDI tak, aby każde widmo masowe zawierało piki masy odniesienia roztworu "ES Tuning Mix" do wewnętrznej kalibracji masy po akwizycji. Spowoduje to najdokładniejszy pomiar masy podczas MALDI MS. Aby to zrobić, najpierw należy stłumić sygnał ESI, zmniejszając napięcie kapilarne, aż sygnały MALDI zdominują widma, podczas gdy sygnały kalibru ESI będą nadal wystarczająco wysokie, aby można było przeprowadzić wewnętrzną kalibrację masy.</li>
	<li>Następnie skonfiguruj zautomatyzowaną metodę rastrowania dla promieniowania laserowego. Zdefiniuj obszary tkanki, które mają być obrazowane, i ustaw odpowiedni rozmiar kroku rastra lasera. Należy zauważyć, że mniejsze rozmiary kroku rastrowego zapewniają obrazy tkanek o wyższej rozdzielczości, ale wymagają znacznie dłuższego czasu akwizycji widma masowego i większej przestrzeni do przechowywania danych. Liczba pikseli obrazu zależy od rozmiaru kroku rastra lasera do skonfigurowania i rozmiaru tkanki. W przypadku typowej soczewki bydlęcej, która ma rozmiar tkanki 1cm2, obraz tkanki składa się zwykle z ok. 5 000 pikseli, jeśli w instrumencie FTICR stosuje się raster laserowy o rozmiarze kroku 200 μm. Użyj analizy "losowego punktu", ponieważ zapobiega to stronniczości opartej na lokalizacji spowodowanej stopniowym tłumieniem sygnału podczas eksperymentu.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Skalibruj widma masowe MALDI za pomocą kalibracji wewnętrznej w celu wstępnego porównania i wyboru pików dla MS/MS. Deizotop i wybierz piki monoizotopowe zgodnie z wcześniejszym opisem, używając dostosowanego skryptu VBA38.</li>
	<li>Eksportuj wynikowe listy pików monoizotopowych i wprowadź zmierzone wartości m/z do bazy danych metabolomu METLIN39 i/lub HMDB40 w celu dopasowania masy do wpisów w bibliotece. Weź pod uwagę jony (M+H)+, (M+Na)+ i (M+K)+ podczas przeszukiwania bazy danych, z dopuszczalnym błędem masy ±1 ppm.</li>
	<li>Generuj obrazy MALDI dla wszystkich jednostek lipidowych wykrytych w całym przekroju tkanki za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, z szerokością filtra masowego 1 ppm na wierzchołku szczytu.</li>
	<li>Po wygenerowaniu obrazów dla wszystkich wartości m/z, które pasują do wpisów w bazie danych, wygeneruj obrazy dla wszystkich innych pików, aby poszukać unikalnych wzorców rozkładu, które można później zbadać.</li>
</ol>
5. Potwierdzenie tożsamości zobrazowanych lipidów
<ol>
	<li>Potwierdź tożsamość lipidów o wysokiej obfitości, które mają charakterystyczne jony fragmentacyjne, które można wykryć za pomocą instrumentu FTICR (np. 184.073 dla fosfolipidów), za pomocą MALDI-MS/MS. Wykonaj MALDI-MS/MS za pomocą dysocjacji wywołanej kolizją (CID) bezpośrednio na tkance.</li>
	<li>W przypadku tych gatunków lipidów, których nie można bezpośrednio potwierdzić za pomocą MALDI-MS/MS, należy użyć systemu UPLC sprzężonego ze spektrometrem masowym q-TOF34.
	<ol>
		<li>Ręcznie wypreparuj podwielokrotności zawierające ~10 mg tkanki z obszaru, w którym zlokalizowano interesujący nas gatunek. Umieścić te porcje tkanek w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Homogenizować każdą porcję tkanki w 250 μl wody, używając młynka mieszającego z dwiema metalowymi kulkami ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu chloroformu i metanolu (1:3, v/v) i przemieszać probówki. Następnie odwirować probówki za pomocą mikrowirówki o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Zebrać supernatanty i wysuszyć je w obrotowym koncentratorze próżniowym.</li>
		<li>Rozpuścić pozostałości w 100 μl izopropanolu w proporcji 30:70 woda. Wstrzyknąć 10-μl podwielokrotności do kolumny UPLC w celu rozdzielenia za pomocą elucji gradientowej.</li>
		<li>Skorzystaj z warunków chromatograficznych dla on-line lipidów LC-MS/MS, które zostały opublikowane wcześniej34.</li>
		<li>Generować chromatogramy wyekstrahowanego prądu jonowego (XIC) przy użyciu teoretycznych wartości m/z, z oknem ±50 ppm wokół mas teoretycznych.</li>
		<li>Jeżeli dostępne są autentyczne związki dla tych lipidów, należy dopasować czasy retencji autentycznych związków do czasów odpowiadających im pików XIC z próbek tkanek. Jeśli związki są takie same, czasy retencji i widma MS/MS powinny się zgadzać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli autentyczny związek jest niedostępny, należy użyć wzorca fragmentacji wykrytego lipidu, aby dopasować standardowe widmo MS/MS z bazy danych metabolomów, takiej jak METLIN lub HMDB. Użyj interpretacji widma mas de novo, aby określić możliwą strukturę lipidu.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Najważniejszymi czynnikami wpływającymi na powodzenie MALDI MSI są: 1) przygotowanie tkanki; 2) wybór matrycy; 3) aplikacja matrycowa; oraz 4) interpretacja i analiza danych. Gdy próbka i matryca są odpowiednio przygotowane, akwizycja danych MS jest zautomatyzowana. Analiza danych z tego typu eksperymentu jest dość pracochłonna.
Odpowiednie przygotowanie tkanek ma kluczowe znaczenie dla udanych eksperymentów MALDI MSI. Źródło pochodzenia tkanki i sposób obchodzenia się z nią mogą mieć duży wpł...

Obrazowanie spektrometrią mas (MSI) jest techniką analityczną służącą do określania przestrzennej lokalizacji i wzorców dystrybucji związków na powierzchni tkanki o przekroju1,2. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) MSI do analizy peptydów i białek jest stosowana od ponad dekady i nastąpiła znaczna poprawa w metodach przygotowania próbek, czułości wykrywania, rozdzielczości przestrzennej, odtwarzalności i przetwarzania danych3,4. Łącząc informacje z histologicznie barwionych skrawków i eksperymentów MSI, patolodzy są w stanie skorelować rozkłady określonych związków o patofizjologicznie interesujących cechach5.
Wzorce dystrybucji małych molekuł, w tym leków egzogennych6,7 i ich metabolitów8-10, zostały również zbadane przez obrazowanie tkanek MALDI-MS11. Lipidy są prawdopodobnie najszerzej badaną klasą związków z obrazowaniem MALDI, zarówno w trybie MS12-17, jak i MS/MS18. Zastosowanie MALDI MSI do obrazowania małych cząsteczek zostało ograniczone przez kilka czynników: 1) Matryce MALDI same w sobie są małymi cząsteczkami (zwykle m/z <500), które generują obfite sygnały jonowe. Te obfite sygnały mogą hamować jonizację małocząsteczkowych analitów i zakłócać ich wykrywanie19,20. Bezrozpuszczalnikowa powłoka matrycowa21, sublimacja matrycy22 i wstępnie powlekana matryca MALDI MS23 zostały opracowane w celu poprawy MSI małych cząsteczek.
Nowe matryce, które mogą usprawnić analizę związków o niskiej mocy, cieszą się dużym zainteresowaniem w małocząsteczkowych MSI. Matryce te powinny dostarczać zwiększone sygnały analitowe przy zmniejszonych sygnałach matrycowych. W trybie jonów dodatnich kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB) i kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA) to dwie powszechnie stosowane matryce MALDI MS dla MSI24. Idealna matryca tworzyłaby małe kryształy, aby zachować lokalizację przestrzenną analitów. DHB ma tendencję do tworzenia większych kryształów, dlatego zastosowanie matrycy za pomocą sublimacji zostało opracowane w celu częściowego przezwyciężenia tego problemu i umożliwiło użycie tej matrycy do czułego obrazowania fosfolipidów22,25. 9-aminoakrydyna była stosowana do MSI analitów protonowych w trybie jonów dodatnich26 oraz do nukleotydów i fosfolipidów w trybie jonów ujemnych26-29. Stwierdzono, że 2-merkaptobenzotiazol zapewnia skuteczne wykrywanie lipidów MALDI30 i jest używany do obrazowania gangliozydów mózgu myszy31. Ultrawysoka rozdzielczość spektrometrów mas spektrometru rezonansu cyklotronowego z transformacją jonową Fouriera (FTICR) może nieco złagodzić ten problem poprzez rozdzielenie sygnałów analitowych z sygnałów matrycowych32. Kolejną zaletą zastosowania FTICR-MS jest to, że intensywności metastabilnych klastrów matrycowych są zmniejszone33, co również zmniejsza te zakłócenia27.
Użycie ditranolu (DT; 1,8-dihydroksy-9,10-dihydroantracen-9-onu) jako matrycy MALDI do obrazowania tkanek zostało wcześniej zgłoszone34. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół stosowania DT do MSI endogennych lipidów na powierzchniach skrawków tkanki soczewki bydlęcej, w trybie jonów dodatnich.

<table><tbody><tr><td>Wątroba szczura</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56023-2</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka cielęca bydlęca</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>57114-2</td><td>Próbkę należy zdekapsulować29 przed użyciem</td></tr><tr><td>Dithranol (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10608</td><td>MALDI Matrix</td></tr><tr><td>&alpha;--Cyjano-4-hydroksy-cynamonowy kwas (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70990</td><td>MALDI Matrix</td></tr><tr><td>Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td>MALDI Matrix</td></tr><tr><td>Rezerpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td></td></tr><tr><td>Terfenadyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9652</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14266</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>320145</tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34972</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Alkohole</td><td></td> komercyjne <td>95%</td></tr> <tr><td>ES Tuning Mix</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2431A Szkiełka powlekane</td><td></td></tr><tr><td>ITO</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI1207000</td><td>Upewnij się, że próbki są umieszczone po stronie przewodzącej prąd elektryczny</td></tr><tr><td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Korektor</td><td>Pen Bic</td><td>WOSQP11</td><td></td></tr><tr><td>Aerograf Opryskiwacz</td><td>Iwata</td><td>Eclipse HP-CS</td><td></td></tr><tr><td>ImagePrep</td><td>Bruker</td><td>249500-LS</td><td></td></tr><tr><td>Adapter MALDI</td><td>Bruker</td><td>235380</td><td></td></tr></tbody></table>

dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją fouriera

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Obrazowanie spektrometrii mas (MSI) określa przestrzenną lokalizację i wzorce dystrybucji związków na powierzchni wycinka tkanki, głównie za pomocą technik analitycznych opartych na MALDI (matryca wspomagana desorpcją/jonizacją laserową). Potrzebne są nowe matryce dla małocząsteczkowych MSI, które mogą usprawnić analizę związków o niskiej masie cząsteczkowej (MW). Matryce te powinny zapewniać zwiększone sygnały analitowe przy jednoczesnym zmniejszaniu sygnałów tła MALDI. Ponadto zastosowanie instrumentów o ultrawysokiej rozdzielczości, takich jak spektrometry mas rezonansu cyklotronowego z transformacją jonową Fouriera (FTICR), ma zdolność oddzielania sygnałów analitowych od sygnałów matrycowych, a to może częściowo przezwyciężyć wiele problemów związanych z tłem pochodzącym z matrycy MALDI. Zmniejszenie intensywności klastrów matryc metastabilnych przez FTICR MS może również pomóc w przezwyciężeniu niektórych zakłóceń związanych z pikami matrycy w innych instrumentach. Przyrządy o wysokiej rozdzielczości, takie jak spektrometry mas FTICR, są korzystne, ponieważ mogą wytwarzać wzorce rozkładu wielu związków jednocześnie, zapewniając jednocześnie pewność identyfikacji chemicznej. Dithranol (DT; 1,8-dihydroksy-9,10-dihydroantracen-9-on) był wcześniej opisywany jako matryca MALDI do obrazowania tkanek. W niniejszej pracy przedstawiono protokół użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów z powierzchni skrawków tkanek ssaków, za pomocą dodatnio jonowego MALDI-MS, na hybrydowym kwadrupolowym instrumencie FTICR o ultrawysokiej rozdzielczości.

Próbki tkanki, które zostały pocięte i zamontowane metodą rozmrażania na szkiełkach z powłoką ITO, powinny być nieuszkodzone, bez widocznych pęknięć. W przypadku wielu tkanek bezpośrednie montowanie metodą rozmrażania na szkiełku z powłoką ITO jest dopuszczalne. W przypadku niektórych specyficznych tkanek, takich jak soczewka bydlęca, podczas bezpośredniego montowania metodą rozmrażania często obserwuje się rozległe pęknięcia tkanki (Rycina 1a). Wstępne pokrycie szkiełka ITO etanolem lub kwasem mrówkowym...

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Niniejsza procedura służy do lokalizacji przestrzennej wielu endogennych lipidów w soczewce bydlęcej. Wykorzystuje ona technikę obrazowania spektrometrycznego opartego na desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej macierzą (MALDI). W pierwszej kolejności należy przygotować cienki przekrój tkanki soczewki bydlęcej i nałożyć wielomacierz, a następnie pozyskać zestaw danych widm masowych MALDI.Przetwórz zbiór danych w wizualną reprezentację lipidów wykrytych w przekroju tkanki soczewki. Wspólnie wyniki te pozwalają określić lokalizację i względną zawartość lipidów w soczewce bydlęcej oraz stworzyć wizualną reprezentację tego rozkładu. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekstrakcja lipidów z późniejszą analizą LCMS, obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI umożliwia jednoczesną wizualizację wielu lipidów bez utraty ich lokalizacji przestrzennej. Wyjmij mrożone w ciekłym azocie próbki tkanek z przechowywania w temperaturze -80 °C.Usuń torebkę z powierzchni soczewki, aby przygotować cały przekrój soczewki cielęcej. Nanieś jedną lub dwie krople wody na stół tnący kriotomatu. Szybko umieść soczewkę w wodzie, zanim ta zamarznie, po tym jak kriotomat osiągnie optymalną temperaturę roboczą.Przetnij tkankę równikowo na sekcje o grubości 20 mikronów. Odrzuć pierwsze sekcje tkanki i do obrazowania tkanki soczewki oka używaj wyłącznie tych przekrojów, które znajdują się blisko płaszczyzny równikowej lub ją obejmują. Dodaj 1,5 µL kwasu mrówkowego, aby nawilżyć powierzchnię szkiełka przedmiotowego pokrytego warstwą ITO.Następnie ostrożnie przenieś skrawki tkanek na szkiełko wewnątrz kriostatu. Następnie liofilizuj szkiełka przez 15 minut przed nałożeniem macierzy MALDI. Za pomocą korektora w pisaku nanieś trzy znaki orientacyjne na nieprzewodzącej powierzchni szkiełka szklanego powlekanego ITO.Następnie należy wykonać obraz optyczny preparatu tkankowego za pomocą skanera płaskiego i zapisać go w odpowiednim formacie, takim jak TIFF lub jpeg. Najpierw zaklej taśmą krawędzie przedniej powierzchni szkiełek szklanych powlekanych ITO, aby matryca nie pokryła krawędzi szkiełka. Przygotuj matrycę do użycia w odpowiednim rozpuszczalniku.Następnie należy nanieść roztwory matrycy na powierzchnie skrawków tkanek. Pokryj szkiełko przedmiotowe, stosując 20 cykli nanoszenia matrycy. Alternatywnie, jeśli rozpuszczalnik jest niekompatybilny z elektronicznym rozpylaczem matrycy, do aplikacji matryc można użyć pneumatycznego aerografu.W celu przygotowania roztworu do kalibracji masy, rozcieńcz standardowy roztwór mieszaniny strojącej ES w stosunku 1:200 w 60% izopropanolu. Do źródła jonizacji rozpylnej z elektrosprayem w trybie podwójnym w urządzeniu Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance MS wprowadzaj rozcieńczony roztwór mieszaniny strojącej ES z prędkością 2 µL/min. Instrument FT-ICR należy uruchomić w trybie ESI dla jonów dodatnich z detekcją szerokopasmową i rozmiarem akwizycji danych wynoszącym 1024 kB/s. Typowo parametry ESI ustawia się na napięcie kapilary elektrospray wynoszące 3900 V.Napięcie osłony rozpylacza ustawiono na 3 600 V, a przepływ azotu w nebulizatorze na 2 l/min. Przepływ suchego azotu ustawiono na 4 l/min, a temperaturę na 200 °C. Napięcie skimmera 1 ustawiono na 15 V.Ustaw czas przelotu na 0,01 s, przepływ argonu w komórce kolizyjnej na 0,4 l/s, czas akumulacji jonów w źródle na 0,1 s oraz czas akumulacji jonów w komórce kolizyjnej na 0,2 s. Następnie dostrój parametry pracy F-T-I-C-R, aby zmaksymalizować czułość analityczną w zakresie stosunku masy do ładunku od 200 do 1400, zachowując jednocześnie dobre sygnały swobodnego indukcyjnego zaniku w dziedzinie czasu. Następnie zarejestruj widma mas ESI i skalibruj instrument, korzystając z mas odniesienia standardowych związków zawartych w roztworze mieszaniny strojącej E es.Aby dostroić instrument do pracy w trybie MALDI, rozpuść kilka jednomikrolitrowych alikwotów mieszanego roztworu standardów tauryny i INE w roztworze matrycy, osiągając stężenie 1 µM dla każdego z nich, a następnie nanieś te roztwory bezpośrednio na jeden z przekrojów tkanki próbki. Umieść preparat w adapterze do slajdów tkankowych i wprowadź adapter stroną MALDI do podwójnego źródła jonizacji ESI MALDI. Następnie zoptymalizuj odpowiednie parametry pracy MALDI w zakresie mocy lasera oraz liczby impulsów lasera dla akumulacji sygnału MALDI dla każdego skanu masy.Po dostrojeniu, kalibracji i optymalizacji urządzenia pod kątem eksperymentów MALDI MSI, należy dopasować fizyczne położenie skrawka tkanki przeznaczonego do obrazowania z jego zarejestrowanym obrazem optycznym w oprogramowaniu do obrazowania. Dopasuj trzy oznaczenia wykonane płynem korygującym, stosując metodę triangulacji trójpunktowej. Następnie rozpocznij jednoczesną operację ESI MALDI, aby każde widmo masowe zawierało referencyjne piki masowe roztworu mieszaniny strojeniowej E ES w celu przeprowadzenia wewnętrznej kalibracji masy po akwizycji.Najpierw osłab konie sygnału ESI poprzez zmniejszenie napięcia kapilarnego, aż sygnały MALDI będą dominować w widmach, przy jednoczesnym zachowaniu sygnałów kalibracyjnych ESI na poziomie wystarczającym do wewnętrznej kalibracji masy. Następnie skonfiguruj zautomatyzowaną metodę skanowania wiązką laserową, stosując analizę losowych punktów.Zdefiniuj obszary tkanki do obrazowania i ustaw odpowiednią wielkość kroku RA lasera. Przeskaluj widma mas MALDI, stosując kalibrację wewnętrzną do wstępnego porównania oraz w celu wyboru piku do deizotopacji MSMS i wyboru pików monizotopowych przy użyciu dostosowanego skryptu VBA, a następnie wyeksportuj wynikowe listy pików monizotopowych. Wprowadź zmierzone wartości stosunku masy do ładunku do baz danych Melin nine oraz/lub HMDB metabolome w celu dopasowania masy do wpisów w bibliotece.Następnie, przy użyciu oprogramowania do obrazowania, wygeneruj obrazy MALDI dla wszystkich wykrytych encji lipidowych w całym przekroju tkanki, stosując szerokość filtra masy wynoszącą jedną milionową (1 ppm) w wierzchołku piku. Po wygenerowaniu obrazów dla wszystkich wartości stosunku masy do ładunku zgodnych z wpisami w bazie danych, wygeneruj obrazy dla wszystkich pozostałych pików, aby poszukać unikalnych wzorców rozmieszczenia, które mogą zostać później zbadane dla konkretnych tkanek, takich jak soczewka bydlęca. W przypadku stosowania montowania bezpośrednio po rozmrożeniu często obserwuje się rozległe rozdarcia tkanki.Pretreatment preparatu IT OAS etanolem lub kwasem mrówkowym pomaga zachować integralność przekrojów tkankowych podczas montowania tkanki. Zarówno wybór matrycy, jak i dobór rozpuszczalnika są istotnymi czynnikami wpływającymi na jakość widm MALDI. Przedstawione przykłady porównują widmo uzyskane przy użyciu wydajnego rozpuszczalnika matrycy z widmem uzyskanym przy niewłaściwym wyborze rozpuszczalnika matrycy dla diolu.Po uzyskaniu zestawu widm mas z eksperymentu Maldi MSI można wygenerować obraz dla każdego z wykrytych jonów. Każdy piksel reprezentuje miejsce naświetlania laserem na powierzchni skrawka tkanki. Względne stężenia analitów mogą być szczegółowo przedstawione w różnych częściach skrawka tkanki.W większości eksperymentów dane są normalizowane względem całkowitego prądu jonowego w każdym widmie. Bez tej normalizacji obszary z lepszą macierzą analityczną lub krystalizacją COC mogłyby generować silniejsze sygnały dla analitów, co zniekształciłoby dane. Przygotowanie tkanek może również drastycznie zmienić generowany obraz.Jeśli próbka jest zbyt wilgotna, anality będą ulegać delokalizacji w tkance, co doprowadzi do utraty większości informacji przestrzennych. Przedstawione doświadczenie obrazowania tkanek soczewki oka wykorzystywa diol jako macierz wielofunkcyjną (multi Matrixx) w celu określenia rozmieszczenia przestrzennego lipidów za pomocą F-T-I-C-R-M-S. Obrazowanie lipidów w różnych typach tkanek można przeprowadzić w podobny sposób, stosując diol lub inną macierz.

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dytranol jako macierz dla obrazowania z pomocą laserowej desorpcji/jonizacji na masowieczu rezonansie cyklotronowym transformacji Fouriera

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Przedstawiono protokół sublimacji matrycy DAN na tkankę mózgową szczura w celu wykrycia gangliozydów za pomocą spektrometrii mas obrazowania MALDI.

Sublimacja matrycy DAN do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w tkance mózgowej szczura do obrazowania MALDI Spektrometria mas

Opisano protokół charakterystyki polimerów syntetycznych wspomaganej matrycowo desorpcji laserowej, czasu jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS), w tym optymalizacji przygotowania próbek, akwizycji widma i analizy danych.

Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących prawidłowego przygotowania próbki do analizy lipidów i metabolitów w małych tkankach, takich jak mózg Drosophila, przy użyciu wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) obrazowania spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje i przykłady dotyczące przygotowania próbki, akwizycji danych i analizy danych w celu scharakteryzowania polimerów syntetycznych o różnej dyspersji i grupach końcowych przy użyciu spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą.

MALDI-ToF MS Metoda charakterystyki polimerów syntetycznych o różnej dyspersyjności i grupach końcowych

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Badania genetyczne na drożdżach mogą być wykorzystywane do badania funkcji molekularnych i komórkowych ludzkich genów w komórkowym metabolizmie DNA. Opisano metody genetycznej charakterystyki produktu ludzkiego genu WRN, którego defekt występuje w zespole Wernera – chorobie objawiającej się przedwczesnym starzeniem się, w funkcjonalnie konserwowanych szlakach, wykorzystując drożdże jako przystępny system modelowy.

Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Poznaj metodę obrazowania MALDI z dithranolem do analizy lipidów endogennych w soczewce wołowej. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzenną lipidów bez utraty ich lokalizacji.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera (Wideo) | JoVE Journal

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Przeglądaj więcej filmów