Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Niniejsza procedura służy do lokalizacji przestrzennej wielu endogennych lipidów w soczewce bydlęcej. Wykorzystuje ona technikę obrazowania spektrometrycznego opartego na desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej macierzą (MALDI). W pierwszej kolejności należy przygotować cienki przekrój tkanki soczewki bydlęcej i nałożyć wielomacierz, a następnie pozyskać zestaw danych widm masowych MALDI.

Przetwórz zbiór danych w wizualną reprezentację lipidów wykrytych w przekroju tkanki soczewki. Wspólnie wyniki te pozwalają określić lokalizację i względną zawartość lipidów w soczewce bydlęcej oraz stworzyć wizualną reprezentację tego rozkładu. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekstrakcja lipidów z późniejszą analizą LCMS, obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI umożliwia jednoczesną wizualizację wielu lipidów bez utraty ich lokalizacji przestrzennej. Wyjmij mrożone w ciekłym azocie próbki tkanek z przechowywania w temperaturze -80 °C.

Usuń torebkę z powierzchni soczewki, aby przygotować cały przekrój soczewki cielęcej. Nanieś jedną lub dwie krople wody na stół tnący kriotomatu. Szybko umieść soczewkę w wodzie, zanim ta zamarznie, po tym jak kriotomat osiągnie optymalną temperaturę roboczą.

Przetnij tkankę równikowo na sekcje o grubości 20 mikronów. Odrzuć pierwsze sekcje tkanki i do obrazowania tkanki soczewki oka używaj wyłącznie tych przekrojów, które znajdują się blisko płaszczyzny równikowej lub ją obejmują. Dodaj 1,5 µL kwasu mrówkowego, aby nawilżyć powierzchnię szkiełka przedmiotowego pokrytego warstwą ITO.

Następnie ostrożnie przenieś skrawki tkanek na szkiełko wewnątrz kriostatu. Następnie liofilizuj szkiełka przez 15 minut przed nałożeniem macierzy MALDI. Za pomocą korektora w pisaku nanieś trzy znaki orientacyjne na nieprzewodzącej powierzchni szkiełka szklanego powlekanego ITO.

Następnie należy wykonać obraz optyczny preparatu tkankowego za pomocą skanera płaskiego i zapisać go w odpowiednim formacie, takim jak TIFF lub jpeg. Najpierw zaklej taśmą krawędzie przedniej powierzchni szkiełek szklanych powlekanych ITO, aby matryca nie pokryła krawędzi szkiełka. Przygotuj matrycę do użycia w odpowiednim rozpuszczalniku.

Następnie należy nanieść roztwory matrycy na powierzchnie skrawków tkanek. Pokryj szkiełko przedmiotowe, stosując 20 cykli nanoszenia matrycy. Alternatywnie, jeśli rozpuszczalnik jest niekompatybilny z elektronicznym rozpylaczem matrycy, do aplikacji matryc można użyć pneumatycznego aerografu.

W celu przygotowania roztworu do kalibracji masy, rozcieńcz standardowy roztwór mieszaniny strojącej ES w stosunku 1:200 w 60% izopropanolu. Do źródła jonizacji rozpylnej z elektrosprayem w trybie podwójnym w urządzeniu Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance MS wprowadzaj rozcieńczony roztwór mieszaniny strojącej ES z prędkością 2 µL/min. Instrument FT-ICR należy uruchomić w trybie ESI dla jonów dodatnich z detekcją szerokopasmową i rozmiarem akwizycji danych wynoszącym 1024 kB/s. Typowo parametry ESI ustawia się na napięcie kapilary elektrospray wynoszące 3900 V.

Napięcie osłony rozpylacza ustawiono na 3 600 V, a przepływ azotu w nebulizatorze na 2 l/min. Przepływ suchego azotu ustawiono na 4 l/min, a temperaturę na 200 °C. Napięcie skimmera 1 ustawiono na 15 V.

Ustaw czas przelotu na 0,01 s, przepływ argonu w komórce kolizyjnej na 0,4 l/s, czas akumulacji jonów w źródle na 0,1 s oraz czas akumulacji jonów w komórce kolizyjnej na 0,2 s. Następnie dostrój parametry pracy F-T-I-C-R, aby zmaksymalizować czułość analityczną w zakresie stosunku masy do ładunku od 200 do 1400, zachowując jednocześnie dobre sygnały swobodnego indukcyjnego zaniku w dziedzinie czasu. Następnie zarejestruj widma mas ESI i skalibruj instrument, korzystając z mas odniesienia standardowych związków zawartych w roztworze mieszaniny strojącej E es.

Aby dostroić instrument do pracy w trybie MALDI, rozpuść kilka jednomikrolitrowych alikwotów mieszanego roztworu standardów tauryny i INE w roztworze matrycy, osiągając stężenie 1 µM dla każdego z nich, a następnie nanieś te roztwory bezpośrednio na jeden z przekrojów tkanki próbki. Umieść preparat w adapterze do slajdów tkankowych i wprowadź adapter stroną MALDI do podwójnego źródła jonizacji ESI MALDI. Następnie zoptymalizuj odpowiednie parametry pracy MALDI w zakresie mocy lasera oraz liczby impulsów lasera dla akumulacji sygnału MALDI dla każdego skanu masy.

Po dostrojeniu, kalibracji i optymalizacji urządzenia pod kątem eksperymentów MALDI MSI, należy dopasować fizyczne położenie skrawka tkanki przeznaczonego do obrazowania z jego zarejestrowanym obrazem optycznym w oprogramowaniu do obrazowania. Dopasuj trzy oznaczenia wykonane płynem korygującym, stosując metodę triangulacji trójpunktowej. Następnie rozpocznij jednoczesną operację ESI MALDI, aby każde widmo masowe zawierało referencyjne piki masowe roztworu mieszaniny strojeniowej E ES w celu przeprowadzenia wewnętrznej kalibracji masy po akwizycji.

Najpierw osłab konie sygnału ESI poprzez zmniejszenie napięcia kapilarnego, aż sygnały MALDI będą dominować w widmach, przy jednoczesnym zachowaniu sygnałów kalibracyjnych ESI na poziomie wystarczającym do wewnętrznej kalibracji masy. Następnie skonfiguruj zautomatyzowaną metodę skanowania wiązką laserową, stosując analizę losowych punktów.

Zdefiniuj obszary tkanki do obrazowania i ustaw odpowiednią wielkość kroku RA lasera. Przeskaluj widma mas MALDI, stosując kalibrację wewnętrzną do wstępnego porównania oraz w celu wyboru piku do deizotopacji MSMS i wyboru pików monizotopowych przy użyciu dostosowanego skryptu VBA, a następnie wyeksportuj wynikowe listy pików monizotopowych. Wprowadź zmierzone wartości stosunku masy do ładunku do baz danych Melin nine oraz/lub HMDB metabolome w celu dopasowania masy do wpisów w bibliotece.

Następnie, przy użyciu oprogramowania do obrazowania, wygeneruj obrazy MALDI dla wszystkich wykrytych encji lipidowych w całym przekroju tkanki, stosując szerokość filtra masy wynoszącą jedną milionową (1 ppm) w wierzchołku piku. Po wygenerowaniu obrazów dla wszystkich wartości stosunku masy do ładunku zgodnych z wpisami w bazie danych, wygeneruj obrazy dla wszystkich pozostałych pików, aby poszukać unikalnych wzorców rozmieszczenia, które mogą zostać później zbadane dla konkretnych tkanek, takich jak soczewka bydlęca. W przypadku stosowania montowania bezpośrednio po rozmrożeniu często obserwuje się rozległe rozdarcia tkanki.

Pretreatment preparatu IT OAS etanolem lub kwasem mrówkowym pomaga zachować integralność przekrojów tkankowych podczas montowania tkanki. Zarówno wybór matrycy, jak i dobór rozpuszczalnika są istotnymi czynnikami wpływającymi na jakość widm MALDI. Przedstawione przykłady porównują widmo uzyskane przy użyciu wydajnego rozpuszczalnika matrycy z widmem uzyskanym przy niewłaściwym wyborze rozpuszczalnika matrycy dla diolu.

Po uzyskaniu zestawu widm mas z eksperymentu Maldi MSI można wygenerować obraz dla każdego z wykrytych jonów. Każdy piksel reprezentuje miejsce naświetlania laserem na powierzchni skrawka tkanki. Względne stężenia analitów mogą być szczegółowo przedstawione w różnych częściach skrawka tkanki.

W większości eksperymentów dane są normalizowane względem całkowitego prądu jonowego w każdym widmie. Bez tej normalizacji obszary z lepszą macierzą analityczną lub krystalizacją COC mogłyby generować silniejsze sygnały dla analitów, co zniekształciłoby dane. Przygotowanie tkanek może również drastycznie zmienić generowany obraz.

Jeśli próbka jest zbyt wilgotna, anality będą ulegać delokalizacji w tkance, co doprowadzi do utraty większości informacji przestrzennych. Przedstawione doświadczenie obrazowania tkanek soczewki oka wykorzystywa diol jako macierz wielofunkcyjną (multi Matrixx) w celu określenia rozmieszczenia przestrzennego lipidów za pomocą F-T-I-C-R-M-S. Obrazowanie lipidów w różnych typach tkanek można przeprowadzić w podobny sposób, stosując diol lub inną macierz.