Name: Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę przygotowania próbek do spektrometrii mas MALDI w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych. Technika obejmuje rekrystalizację metanolową poprawiającą morfologię kryształów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Wstępne kondycjonowanie płytki próbki
<ol>
	<li>Czyszczenie płytki z próbką
	<ol>
		<li>Nosić rękawice nitrylowe, aby uniknąć zanieczyszczenia płytki sample podczas czyszczenia.</li>
		<li>Płytkę z próbką umyć ręcznie 100,0 ml roztworu detergentu (1,0 mg/ml).</li>
		<li>Płytkę z próbką należy umyć ręcznie wodą destylowaną dejonizowaną (DDW).</li>
		<li>Przepłukać powierzchnię płytki próbki 30,0 ml MeOH.</li>
		<li>Umieścić płytkę z próbką w zlewce o pojemności 600 ml i napełnić ją DDW, aż płytka z próbką zostanie całkowicie zanurzona w wodzie.</li>
		<li>Umieścić zlewkę w łaźni ultradźwiękowej (patrz Tabela Materiałów) i sonikować płytkę próbki przez 15 minut (200 W, 40 kHz).</li>
		<li>Wyjmij płytkę z próbką i zdmuchnij krople wody za pomocą azotu pod ciśnieniem.</li>
		<li>Umieść 0,2 μl MeOH na płytce próbki, aby sprawdzić, czy MeOH rozprzestrzenia się na inne miejsca. 
		nuta: Jeśli MeOH łączy się z innymi plamami, powtórz kroki 1.1.3-1.1.5; Jeśli nie, przejdź do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja temperatury w komorze suszenia
	<ol>
		<li>Użyj komory suszącej w stałych warunkach, aby wysuszyć kropelki, jak opisano wcześniej11,12,13. W szczególności należy zastosować szczegółową procedurę opisaną w krokach 2.1-2.5 Ou, Y.-M. Wsp. 201612. Krótko:
		<ol>
			<li>Przedmuchnąć komorę suszenia azotem o temperaturze pokojowej przy stałym natężeniu przepływu, aby utrzymać środowisko o niskiej wilgotności względnej.</li>
			<li>Utrzymywać stałą temperaturę płytki próbki w warunkach regularnych (25 °C) lub szybkoschnących (50 °C), regulowanych przez blok miedziany o regulowanej temperaturze w komorze suszącej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów matryc i analitów
	<ol>
		<li>Przygotowanie roztworów matrycowych
		<ol>
			<li>Rozpuścić DHB w 50% acetonitrylu (ACN):50% DDW, aby przygotować 0,1 M roztwór.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie analitów węglowodanowych
		<ol>
			<li>Rozpuścić SLeA w DDW, aby przygotować 10-4 M roztwór.</li>
			<li>Rozpuścić MH w DDW, aby przygotować 10-4 M roztwór.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie próbki i rekrystalizacja
Uwaga: Zoptymalizowane procedury analizy małych i regularnych ilości próbek są opisane tutaj. Upewnij się, że temperatura płytki próbki jest ustabilizowana na żądanym poziomie przed złożeniem roztworów. Jeśli próbka rozprzestrzenia się na dużym obszarze, aby pokryć inne miejsca próbki podczas rekrystalizacji, należy przygotować nową próbkę lub powtórzyć krok 1.1.
<ol>
	<li>Do analizy niewielkiej ilości (0,1 μl) próbki 
	Uwaga: Poniższe kroki zostały opracowane w celu zminimalizowania zużycia próbki i czasu. Nadaje się do analizy ilościowej rzeczywistych próbek z ograniczoną ilością lub szybkiego IMS do analizy ilościowej.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 0,25 μl roztworu DHB i 0,25 μl roztworu SLeA lub MH w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>Mieszaj zmieszany roztwór za pomocą mieszalnika wirowego przez 3 sekundy.</li>
		<li>Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce przez 2 sekundy (2000 x g).</li>
		<li>Za pomocą pipety pobrać 0,1 μl wstępnie zmieszanego roztworu i natychmiast umieścić go na płytce z próbką. 
		nuta: Podczas wrzucania niewielkiej ilości próbki NIE WOLNO przechowywać wstępnie zmieszanego roztworu na końcówce pipety przez ponad 10 sekund.</li>
		<li>Poczekaj, aż próbka wyschnie. Typowe czasy schnięcia podano w tabeli 1.</li>
		<li>Za pomocą pipety nanieść 0,2 μl MeOH bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka natychmiast ulegnie zamoczeniu i wyschnięciu. 
		nuta: Upewnij się, że procedura osadzania została zakończona w ciągu 3 sekund, aby uniknąć znacznych strat MeOH w wyniku parowania.</li>
		<li>Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami (patrz Rysunek 1 jako przykład pożądanych wyników), powtórz kroki 2.1.1-2.1.6, aby przygotować nową próbkę.</li>
		<li>Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do analizy regularnej ilości (1 μl) próbki 
	nuta: Poniższe kroki zostały opracowane w celu maksymalizacji jednorodności próbek węglowodanów przy typowo stosowanej ilości próbki MALDI. Proces nadaje się do analiz rutynowych i ilościowych. Proces rekrystalizacji polega na równomiernym rozprowadzaniu próbek i matryc na większych obszarach.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 2,5 μl roztworu DHB i 2,5 μl roztworu SLeA lub MH w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>Wirować wstępnie zmieszany roztwór za pomocą mieszalnika wirowego przez 5 sekund.</li>
		<li>Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce przez 2 sekundy (2000 x g).</li>
		<li>Za pomocą pipety pobrać 1,0 μl wstępnie zmieszanego roztworu i natychmiast umieścić go na płytce z próbką. 
		Uwaga: NIE WOLNO ponownie używać pozostałego wstępnie zmieszanego roztworu po zdeponowaniu próbek.</li>
		<li>Poczekaj, aż próbka wyschnie. Typowe czasy schnięcia podano w tabeli 1.</li>
		<li>Za pomocą pipety nanieść 1,5 μl MeOH bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka natychmiast ulegnie zamoczeniu i wyschnięciu. 
		nuta: W przypadku wysokiej temperatury płytki próbki (50 °C) etap rekrystalizacji należy przeprowadzić w ciągu 5 sekund, aby zminimalizować parowanie MeOH w końcówce pipety.</li>
		<li>Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1 jako przykład pożądanych wyników), powtórz kroki 2.2.1-2.2.6, aby przygotować nową próbkę.</li>
		<li>Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja i analiza danych spektrometrii mas
Uwaga: Analiza jest wykonywana przy użyciu komercyjnego spektrometru mas czasu przelotu (Tabela materiałów) wyposażonego w źródło jonów MALDI. Przyrząd jest obsługiwany przez specjalne oprogramowanie sterujące (Tabela materiałów) ze wstępnie zoptymalizowanym opóźnieniem ekstrakcji i energią lasera. Widma rejestrowane są w trybie liniowym o zakresie mas m/z = 0 – 1500. Potencjał płytki próbki wynosi ±25 keV, a każde widmo ma średnio 10 strzałów laserowych. Użytkownicy powinni przeprowadzić optymalizację urządzenia i analizę próbki przy użyciu kompatybilnego oprogramowania i postępować zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Włożyć płytkę z próbką do spektrometru masowego.</li>
	<li>Wybierz wstępnie zoptymalizowaną metodę pozyskiwania danych w oprogramowaniu.</li>
	<li>Zarejestruj cały obszar próbki dla IMS za pomocą oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela materiałów). 
	nuta: Pomiń ten krok, jeśli nie korzystasz z IMS.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję danych w trybie wsadowym oprogramowania sterującego.</li>
	<li>Wykreśl obrazy jonów za pomocą oprogramowania do obrazowania po zakończeniu zbierania danych.</li>
	<li>Analizuj widma masowe za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów), jeśli dane są rejestrowane bez obrazu jonów.</li>
</ol>

<ol><li>Holme, D. J., Peck, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolme%2C+DJ+%22Analytical+Biochemistry%22">Analytical Biochemistry</a>. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).</li>
<li>Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time%2C+life+...+and+mass+spectrometry+-+New+techniques+to+address+biological+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions.</a> Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).</li>
<li>Caroff, M., Karibian, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14670707">Structure of bacterial lipopolysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).</li>
<li>Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+in+clinical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry.</a> Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10639030">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates.</a> Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).</li>
<li>Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+chromatographic%2C+electrophoretic+and+mass+spectrometric+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis.</a> Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).</li>
<li>Nishikaze, T., Amano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+thin+layer+method+for+enhanced+ion+yield+of+oligosaccharides+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).</li>
<li>Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrix+crystal+structure+on+ion+abundance+of+carbohydrates+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).</li>
<li>Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fast-evaporation+sample+preparation+method+for+improving+quantification+of+angiotensin+II+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).</li>
<li>Lai, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).</li>
<li>Ou, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Homogeneous+MALDI+Samples+for+Quantitative+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+carbohydrate+ion+yield+by+controlling+crystalline+structures+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).</li>
<li>Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0169433296005302">Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes.</a> Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).</li>
<li>Sadeghi, M., Vertes, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169433297006363">Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization.</a> Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niejednorodność próbek jest kluczowym problemem w MALDI-MS. DD jest najczęściej stosowaną metodą przygotowania próbek, ale powstałe kryształy są bardzo niejednorodne. Takie próbki wykazują słabą odtwarzalność sygnału między ujęciami i próbkami. W związku z tym wyszukiwanie "słodkich punktów" w obszarach próbki podczas pozyskiwania danych jest powszechną procedurą w eksperymentach MALDI. Takie niejednorodne próbki nie nadają się do oznaczania ilościowego w rutynowych analizach.
W obecnym badani...

Analiza węglowodanów to ważny i wymagający temat. Węglowodany i ich pochodne odgrywają ważną rolę w organizmach żywych1,2,3. Cząsteczki te mają skomplikowaną strukturę i są podatne na rozkład. Wielu z nich nie można jednoznacznie scharakteryzować ze względu na trudności w separacji i wykrywaniu. Chociaż spektrometria mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) została zastosowana do analizy szerokiego zakresu biomolekuł, ze względu na jej czułość i zrozumiałe wyniki4, analiza węglowodanów za pomocą MALDI-MS nadal stanowi poważne wyzwanie ze względu na niską wydajność jonizacji takich cząsteczek5. Derywatyzacja chemiczna jest powszechnym sposobem na poprawę efektywności jonizacji węglowodanów6,7, ale takie procedury są czasochłonne i pochłaniają próbki. Poza tym skuteczność jonizacji derywatyzowanych węglowodanów jest nadal niższa niż białek. W związku z tym konieczne jest opracowanie metod poprawy sygnału węglowodanowego w MALDI-MS bez skomplikowanych procedur.
Zastosowanie MALDI-MS do analizy ilościowej to kolejny trudny temat. Głównym problemem MALDI-MS jest to, że jego czułość i odtwarzalność danych zależy w decydującym stopniu od protokołów przygotowania próbek i parametrów eksperymentalnych. W wielu przypadkach analiza ilościowa za pomocą MALDI-MS jest niewiarygodna ze względu na niejednorodną morfologię próbki i rozmieszczenie analitu. Dobrze znanym przykładem są próbki przygotowane z matrycą MALDI kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB). Gdy DHB krystalizuje powoli w środowisku otoczenia, zakres włączenia analitu do kryształów matrycy jest nieprzewidywalny, ponieważ powstałe próbki wykazują nieregularną morfologię. Takie próbki zwykle składają się z dużych igieł i drobnych kryształów. Gdy DHB jest przygotowywany przy użyciu lotnego rozpuszczalnika i/lub podgrzanej płytki próbki, szybki proces schnięcia skutkuje bardziej jednorodnymi drobnymi kryształami i lepszymi wynikami ilościowymi8,9,10. Technika ta jest znana jako "rekrystalizacja" próbek MALDI. Poprawę przypisuje się lepszemu wprowadzaniu analitów do drobnych kryształów osnowy podczas procesu szybkiej krystalizacji. Wykazaliśmy również, że dostosowanie środowiska przygotowania próbki zmniejszyło niejednorodność sygnału węglowodanowego i poprawiło wyniki ilościowe11,12. Wyniki tych prac sugerują, że morfologia próbki jest krytycznym czynnikiem określającym jakość sygnału węglowodanów. Aby opracować ogólną strategię codziennej analizy, potrzebna jest skuteczna metoda reformowania próbki, zapewniająca poprawę wrażliwości na węglowodany.
Systematycznie badaliśmy korelację między morfologią próbki a wrażliwością na węglowodany w MALDI-MS w niedawnym raporcie13. Wyniki uzyskane przy użyciu kilku ważnych węglowodanów i matryc pokazują, że najlepsze wzmocnienie sygnału jest realizowane przez rekrystalizację wysuszonych próbek MALDI. Morfologia próbek przygotowanych konwencjonalną metodą suchych kropel (DD) jest reformowana przez szybką rekrystalizację metanolem (MeOH). Szczegółowe protokoły przygotowania próbek przedstawiono tutaj. Protokół składa się z trzech głównych etapów, w tym wstępnego kondycjonowania płytki próbki, osadzania i rekrystalizacji próbki oraz analizy spektrometrii mas. Wykorzystywane węglowodany obejmują sialyl-lewis A (SLeA) i maltoheptaozę (MH). DHB jest używany jako macierz modelu. Wyniki pokazują, że intensywność sygnału węglowodanów i rozkład przestrzenny znacznie się poprawiły po rekrystalizacji. Taką metodę można zastosować do próbek z innymi popularnymi matrycami, w tym 2,4,6-trihydroksyacetofenonem (THAP) i kwasem α-cyjano-4-hydroksycynamonowym. Metoda ta służy jako ogólne podejście, które można łatwo zintegrować z rutyną laboratoryjną do analizy węglowodanów.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergent w proszku</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB)</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11459</td><td></td></tr><tr><td>sialyl-Lewis A (SLeA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1782</td><td></td></tr><tr><td>Maltoheptaose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7753</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe bezpudrowe</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 600 ml</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td></td> Delta <td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Higrometr</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz azotu</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>Termopary typu</td><td>K Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Scientific Industries</td><td>&nbsp; SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Komora susząca z regulacją temperatury</td><td>Ten laboratoryjny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spektrometr masowy Ultraflex II TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTP 384 tarcza celownicza stal polerowana BC</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Flexcontrol Wersja 3.4</td><td>Oprogramowanie do sterowania</td><td>daltonikami firmy Bruker Oprogramowanie do obrazowania daltoniki</td><td></td></tr><tr><td>Fleximaging w wersji 2.1</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>daltoniki firmy Bruker Oprogramowanie do analizy daltoniki</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>w<td>wersji 3.4</td></tr></tbody></table>

wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Przygotowanie próbki jest krytycznym procesem w analizie węglowodanów metodą spektrometrii mas (MS). Chociaż desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) MS jest metodą z wyboru w analizie węglowodanów, słaby sygnał jonowy i odtwarzalność danych próbek węglowodanów nadal stanowią poważny problem. Do ilościowej analizy węglowodanów niezbędny jest skuteczny protokół analityczny zapewniający najwyższą jakość danych. Ten film przedstawia protokoły przygotowania próbek w celu poprawy intensywności sygnału i zminimalizowania zmienności danych dotyczących węglowodanów w MALDI-MS. Po wysuszeniu i krystalizacji kropelek próbki, morfologia kryształów jest reformowana przez metanol przed analizą spektrometryczną mas. Wzmocnienie sygnału węglowodanowego bada się za pomocą obrazowania metodą spektrometrii mas (IMS) MALDI. Wyniki eksperymentalne pokazują, że reformacja kryształów dostosowuje struktury krystaliczne i redystrybuuje anality węglowodanowe. W porównaniu z metodą przygotowania suszonych kropel w konwencjonalnym MALDI-MS, reformowanie morfologii kryształów węglowodanów za pomocą metanolu wykazuje znacznie lepszą intensywność sygnału, rozkład obrazu jonów i stabilność danych. Ponieważ przedstawione w niniejszym dokumencie protokoły nie obejmują zmian w składzie próbki, mają one ogólne zastosowanie do różnych węglowodanów i matryc.

Reprezentatywne obrazy SEM SLeA zmieszanego z DHB, przygotowane metodami DD oraz rekrystalizacji, przedstawiono na Rysunku 1. Typowa morfologia DHB przygotowanego metodą DD charakteryzuje się obecnością dużych kryształów w kształcie igieł na obrzeżach oraz drobnych struktur krystalicznych w centrum plam z próbką. Typowa długość takich igłowatych kryształów wynosi ~100 µm. Po rekrystalizacji za pomocą MeOH próbka posiada większy obszar równomiernie ...

Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Opracowano prostą procedurę przygotowania próbki w celu ulepszenia konwencjonalnej metody spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą poprzez reformę prostej morfologii podczas procesu suszenia. Zaletą tej techniki jest to, że intensywność sygnału próbek węglowodanów przygotowanych tą zoptymalizowaną metodą może być skutecznie zwiększona. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ etap obniżania ciśnienia metanolu jest bardzo ważny i należy go wykonać za jednym razem.Każde wahanie obniży jakość danych. Na początek, nosząc rękawice nitrylowe, użyj 100 mililitrów roztworu detergentu do ręcznego umycia płytki próbki. Użyj wody destylowanej dejonizowanej lub DD do ręcznego mycia talerza.Następnie 30 mililitrami metanolu spłucz jego powierzchnię. Włóż płytkę do próbki do zlewki o pojemności 600 mililitrów i napełnij ją wodą DD, aż płytka zostanie całkowicie zanurzona. Następnie umieść zlewkę w łaźni ultradźwiękowej i sonikuj płytkę przez 15 minut.Wyjąć płytkę z próbką ze zlewki i użyć azotu pod ciśnieniem, aby zdmuchnąć krople wody. Następnie umieść 0,2 mikrolitra metanolu na płytce próbki, aby sprawdzić, czy rozprzestrzenia się on na inne miejsca. Jeśli tak, powtórz mycie, sonikację i obróbkę azotem, jak pokazano poniżej.Po przygotowaniu komory suszenia zgodnie z protokołem tekstowym, w probówce mikrowirówki należy wymieszać 0,25 mikrolitra roztworu kwasu 2-5-dihydroksybenzoesowego i 0,25 mikrolitra roztworu Sialylo-Lewisa A lub maltoheptaozy. Następnie wiruj rurkę przez trzy sekundy. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce w temperaturze 2000 razy G przez dwie sekundy.Następnie natychmiast odpipetować 0,1 mikrolitra wstępnie zmieszanego roztworu na płytkę z próbką. Gdy próbka wyschnie, pracując szybko, aby uniknąć parowania, odpipetować 0,2 mikrolitra metanolu bezpośrednio na miejsce próbki. Próbka ponownie się rozpuści, a następnie natychmiast wyschnie.Etap osadzania metanolu jest najtrudniejszym krokiem, który decyduje o jakości i odtwarzalności danych. Aby zapewnić najlepszą wydajność, zalecamy, aby użytkownik zakończył osadzanie w ciągu trzech do pięciu sekund, aby uniknąć znacznych strat metanolu w wyniku parowania. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.Następnie pod mikroskopem zbadaj próbkę. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, powtórz mieszanie próbki i nakrapianie na płytce próbki. Aby upewnić się, że kryształy próbki mają optymalną morfologię po rekrystalizacji, zawsze należy je badać pod mikroskopem.Trudno jest prawidłowo określić jakość morfologii kryształów gołym okiem. Aby przeanalizować próbkę o objętości jednego mikrolitra, należy wymieszać 2,5 mikrolitra roztworu kwasu 2-dihydroksybenzoesowego i 2,5 mikrolitra roztworu Sialylo-Lewisa A lub maltoheptaozy w probówce do mikrowirówki. Wiruj wstępnie zmieszany roztwór przez pięć sekund.Wirować zmieszany roztwór w temperaturze 2000 razy G przez dwie sekundy, a następnie natychmiast odpipetować jeden mikrolitr wstępnie wymieszanego roztworu na płytkę z próbką. Po wyschnięciu próbki należy odpipetować 1,5 mikrolitra metanolu bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka ponownie się rozpuści i natychmiast wyschnie.Ostrożnie wyjąć próbkę z komory suszenia. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, należy powtórzyć przygotowanie roztworu, jak pokazano.Aby przeprowadzić spektrometrię mas, otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem mas i włóż płytkę próbki do urządzenia. Wybierz wstępnie zoptymalizowaną metodę pozyskiwania danych w oprogramowaniu, a następnie za pomocą oprogramowania do obrazowania zarejestruj cały obszar próbki do obrazowania spektrometrii mas. Uruchom akwizycję danych w trybie wsadowym oprogramowania sterującego.Po zakończeniu akwizycji danych użyj oprogramowania do obrazowania, aby wykreślić obrazy jonów i przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Reprezentatywne obrazy SEM Sialyl-Lewisa A zmieszanego z kwasem 2,5-dihydroksybenzoesowym przygotowanym przy użyciu metod suszonych kropelek i rekrystalizacji przedstawiono tutaj. Typowa morfologia kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego to duże, igiełkowate kryształy na krawędzi i drobne struktury krystaliczne w środku plamek próbki.Po rekrystalizacji przez metanol próbka ma większą powierzchnię równomiernie pokrytą drobnymi, płatkowymi kryształami. Rysunek ten przedstawia wyniki obrazowania spektrometrii mas Sialyla-Lewisa A i maltoheptaozy z rekrystalizacją metanolu i bez niej. Po rekrystalizacji rozkład sygnałów Sialylo-Lewisa A i maltohepaozy dobrze pasuje do obrazów w jasnym polu plam próbki.Intensywność sygnału w próbkach rekrystalizowanych węglowodanów jest również zwiększona w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami z suchymi kropelkami. Wykres ten porównuje intensywność sygnału węglowodanów w trybie jonów sodowanych lub dodatnich oraz w trybie jonów deprotonowanych lub ujemnych w próbkach rekrystalizowanych w odniesieniu do intensywności sygnału w próbkach z suszonych kropel. Średnio rekrystalizacja próbek sialylo-Lewisa A i maltoheptaozy zwiększyła sygnały sodowane o czynniki 3,9 i 3,3.Deprotonowane sygnały jonów A sialylo-Lewisa zostały wzmocnione 4,7-krotnie po rekrystalizacji. Po opanowaniu próbki można przygotować w ciągu 10 minut przy użyciu tej techniki, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kropla metanolu została natychmiast i precyzyjnie osadzona w miejscu próbki.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie kontrolować morfologię kryształów wielu próbek, aby uzyskać najlepsze sygnały jonowe do rutynowej analizy.

an-efficient-sample-preparation-method-to-enhance-carbohydrate-ion

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Pokazano protokół redukcji przestrzennych niejednorodności sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI poprzez regulację temperatury substratu podczas procesów suszenia próbki.

Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Opisano protokół charakterystyki polimerów syntetycznych wspomaganej matrycowo desorpcji laserowej, czasu jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS), w tym optymalizacji przygotowania próbek, akwizycji widma i analizy danych.

Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)

Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem spektrometrii mas do charakterystyki biomolekuł, szczególnie dlatego, że jest wrażliwa na izomerię. Protokół ten opisuje tandemowy eksperyment IMS (IMS/IMS), który pozwala na izolację cząsteczki i wygenerowanie profili ruchliwości jej fragmentów.

Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Ten protokół miał na celu opisanie szczegółowych wytycznych dotyczących przygotowania sekcji próbek twardych nasion o niskiej zawartości wody do analizy MALDI-IMS, utrzymania pierwotnego rozkładu i obfitości analitów oraz zapewnienia wysokiej jakości sygnału i rozdzielczości przestrzennej.

Przygotowanie twardych nasion palmy do analizy spektrometrii mas metodą desorpcji laserowej/jonizacji wspomaganej matrycowo

Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje i przykłady dotyczące przygotowania próbki, akwizycji danych i analizy danych w celu scharakteryzowania polimerów syntetycznych o różnej dyspersji i grupach końcowych przy użyciu spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą.

MALDI-ToF MS Metoda charakterystyki polimerów syntetycznych o różnej dyspersyjności i grupach końcowych

Poznaj zoptymalizowaną metodę przygotowania próbek do spektrometrii mas MALDI w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych. Technika obejmuje rekrystalizację metanolową poprawiającą morfologię kryształów.

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (Wideo) | JoVE Journal

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Przeglądaj więcej filmów