Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą
29 lipca 2018
Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.
Opracowano prostą procedurę przygotowania próbki w celu ulepszenia konwencjonalnej metody spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą poprzez reformę prostej morfologii podczas procesu suszenia. Zaletą tej techniki jest to, że intensywność sygnału próbek węglowodanów przygotowanych tą zoptymalizowaną metodą może być skutecznie zwiększona. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ etap obniżania ciśnienia metanolu jest bardzo ważny i należy go wykonać za jednym razem.
Każde wahanie obniży jakość danych. Na początek, nosząc rękawice nitrylowe, użyj 100 mililitrów roztworu detergentu do ręcznego umycia płytki próbki. Użyj wody destylowanej dejonizowanej lub DD do ręcznego mycia talerza.
Następnie 30 mililitrami metanolu spłucz jego powierzchnię. Włóż płytkę do próbki do zlewki o pojemności 600 mililitrów i napełnij ją wodą DD, aż płytka zostanie całkowicie zanurzona. Następnie umieść zlewkę w łaźni ultradźwiękowej i sonikuj płytkę przez 15 minut.
Wyjąć płytkę z próbką ze zlewki i użyć azotu pod ciśnieniem, aby zdmuchnąć krople wody. Następnie umieść 0,2 mikrolitra metanolu na płytce próbki, aby sprawdzić, czy rozprzestrzenia się on na inne miejsca. Jeśli tak, powtórz mycie, sonikację i obróbkę azotem, jak pokazano poniżej.
Po przygotowaniu komory suszenia zgodnie z protokołem tekstowym, w probówce mikrowirówki należy wymieszać 0,25 mikrolitra roztworu kwasu 2-5-dihydroksybenzoesowego i 0,25 mikrolitra roztworu Sialylo-Lewisa A lub maltoheptaozy. Następnie wiruj rurkę przez trzy sekundy. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce w temperaturze 2000 razy G przez dwie sekundy.
Następnie natychmiast odpipetować 0,1 mikrolitra wstępnie zmieszanego roztworu na płytkę z próbką. Gdy próbka wyschnie, pracując szybko, aby uniknąć parowania, odpipetować 0,2 mikrolitra metanolu bezpośrednio na miejsce próbki. Próbka ponownie się rozpuści, a następnie natychmiast wyschnie.
Etap osadzania metanolu jest najtrudniejszym krokiem, który decyduje o jakości i odtwarzalności danych. Aby zapewnić najlepszą wydajność, zalecamy, aby użytkownik zakończył osadzanie w ciągu trzech do pięciu sekund, aby uniknąć znacznych strat metanolu w wyniku parowania. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.
Następnie pod mikroskopem zbadaj próbkę. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, powtórz mieszanie próbki i nakrapianie na płytce próbki. Aby upewnić się, że kryształy próbki mają optymalną morfologię po rekrystalizacji, zawsze należy je badać pod mikroskopem.
Trudno jest prawidłowo określić jakość morfologii kryształów gołym okiem. Aby przeanalizować próbkę o objętości jednego mikrolitra, należy wymieszać 2,5 mikrolitra roztworu kwasu 2-dihydroksybenzoesowego i 2,5 mikrolitra roztworu Sialylo-Lewisa A lub maltoheptaozy w probówce do mikrowirówki. Wiruj wstępnie zmieszany roztwór przez pięć sekund.
Wirować zmieszany roztwór w temperaturze 2000 razy G przez dwie sekundy, a następnie natychmiast odpipetować jeden mikrolitr wstępnie wymieszanego roztworu na płytkę z próbką. Po wyschnięciu próbki należy odpipetować 1,5 mikrolitra metanolu bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka ponownie się rozpuści i natychmiast wyschnie.
Ostrożnie wyjąć próbkę z komory suszenia. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, należy powtórzyć przygotowanie roztworu, jak pokazano.
Aby przeprowadzić spektrometrię mas, otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem mas i włóż płytkę próbki do urządzenia. Wybierz wstępnie zoptymalizowaną metodę pozyskiwania danych w oprogramowaniu, a następnie za pomocą oprogramowania do obrazowania zarejestruj cały obszar próbki do obrazowania spektrometrii mas. Uruchom akwizycję danych w trybie wsadowym oprogramowania sterującego.
Po zakończeniu akwizycji danych użyj oprogramowania do obrazowania, aby wykreślić obrazy jonów i przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Reprezentatywne obrazy SEM Sialyl-Lewisa A zmieszanego z kwasem 2,5-dihydroksybenzoesowym przygotowanym przy użyciu metod suszonych kropelek i rekrystalizacji przedstawiono tutaj. Typowa morfologia kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego to duże, igiełkowate kryształy na krawędzi i drobne struktury krystaliczne w środku plamek próbki.
Po rekrystalizacji przez metanol próbka ma większą powierzchnię równomiernie pokrytą drobnymi, płatkowymi kryształami. Rysunek ten przedstawia wyniki obrazowania spektrometrii mas Sialyla-Lewisa A i maltoheptaozy z rekrystalizacją metanolu i bez niej. Po rekrystalizacji rozkład sygnałów Sialylo-Lewisa A i maltohepaozy dobrze pasuje do obrazów w jasnym polu plam próbki.
Intensywność sygnału w próbkach rekrystalizowanych węglowodanów jest również zwiększona w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami z suchymi kropelkami. Wykres ten porównuje intensywność sygnału węglowodanów w trybie jonów sodowanych lub dodatnich oraz w trybie jonów deprotonowanych lub ujemnych w próbkach rekrystalizowanych w odniesieniu do intensywności sygnału w próbkach z suszonych kropel. Średnio rekrystalizacja próbek sialylo-Lewisa A i maltoheptaozy zwiększyła sygnały sodowane o czynniki 3,9 i 3,3.
Deprotonowane sygnały jonów A sialylo-Lewisa zostały wzmocnione 4,7-krotnie po rekrystalizacji. Po opanowaniu próbki można przygotować w ciągu 10 minut przy użyciu tej techniki, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kropla metanolu została natychmiast i precyzyjnie osadzona w miejscu próbki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie kontrolować morfologię kryształów wielu próbek, aby uzyskać najlepsze sygnały jonowe do rutynowej analizy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół poprawy sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii masowej MALDI poprzez optymalizację przygotowania próbki. Metoda koncentruje się na odtworzeniu struktur krystalicznych podczas procesu suszenia, aby poprawić intensywność sygnału.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria mas
- Techniki przygotowania próbek
- Analiza węglowodanów
Tło
- Spektrometria masowa MALDI jest kluczową techniką do analizy węglowodanów.
- Konwencjonalne metody mogą przynosić suboptymalne intensywności sygnału.
- Poprawa przygotowania próbki może poprawić jakość danych.
- Rozumienie procesu suszenia jest kluczowe dla efektywnej analizy próbek.
Cel badania
- Opracowanie prostego protokołu przygotowania próbki dla spektrometrii masowej MALDI.
- Poprawa intensywności sygnału próbek węglowodanowych.
- Dostarczenie wskazówek dla nowych użytkowników na temat krytycznych etapów w procesie.
Stosowane metody
- Ręczne mycie płytki próbki roztworem detergentu.
- Używanie wody destylowanej-dejonizowanej do płukania.
- Zastosowanie etapu depresjonizacji metanolu.
- Optymalizacja procesu suszenia w celu odtworzenia struktur krystalicznych.
Główne wyniki
- Optymalizacja metody znacząco poprawia intensywność sygnału.
- Właściwe wykonanie etapu metanolu jest krytyczne dla jakości danych.
- Nowi użytkownicy mogą napotykać na wyzwania, ale mogą osiągać lepsze wyniki poprzez ćwiczenie.
- Protokół zapewnia niezawodne podejście do analizy węglowodanów.
Wnioski
- Odtwarzanie struktur krystalicznych podczas przygotowania próbek poprawia wyniki spektrometrii masowej MALDI.
- Uważność w procesie przygotowawczym jest istotna.
- Ta metoda może być korzystna dla badaczy pracujących z próbkami węglowodanów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust carbohydrate quantification in MALDI-MS is often limited by poor ion signal and data variability, impacting early discovery and analytical workflows. This optimized sample preparation protocol directly addresses signal enhancement and reproducibility, enabling higher confidence in glycan profiling and biomarker studies. Improved data quality at this stage supports more reliable downstream decision-making in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables more accurate detection and quantification of carbohydrate analytes for pathway elucidation.
- Reduces analytical variability, supporting functional validation of glycan-related targets.
- Improves predictive confidence in early-stage biomarker discovery and mechanistic studies.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of reproducible, high-quality samples for MALDI-MS-based screening assays.
- Supports assay standardization by minimizing crystal morphology-induced signal variation.
- Enables reliable quantitative outputs for compound or biomarker evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Improved signal intensity and distribution enhance translational biomarker alignment in glycomics studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing robust analytical data.
- Reduces risk of false negatives in preclinical carbohydrate profiling.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation method integrates at the analytical validation stage, bridging early discovery and preclinical workflows for glycan analysis.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing and pathway clarification by improving carbohydrate signal detection.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative MALDI-MS outputs suitable for high-throughput workflows.
- Analytics: Provides robust ion intensity and spatial distribution data for comparative analyses.
- Translational Research: Strengthens biomarker discovery and validation by ensuring data stability across samples.
- Enterprise Reuse: Protocol is broadly applicable to various carbohydrates and matrices, supporting platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in glycan analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, improving reproducibility and scalability for routine analysis.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing higher quality analytical data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing analytical uncertainty in carbohydrate-focused programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in precise methanol deposition and crystal morphology assessment.
- Needs access to MALDI-MS instrumentation and imaging software for data acquisition and analysis.
- Demands cross-team standardization of sample handling and preparation protocols.
- Adaptable to various carbohydrate analytes and matrix systems without altering sample composition.
- Critical steps, such as rapid methanol application, may present a learning curve for new users.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Cleaning Sample Plate
1:41
Sample Deposition and Recrystallization (Small Amount of Sample)
3:20
Analysis of a 1 μL Sample
4:22
Mass Spectrometry Data Acquisition and Analysis
5:04
Results: Carbohydrate Ion Signals in Recrystallized Structures by MALDI Mass Spectrometry
6:34
Conclusion
