Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Opracowano prostą procedurę przygotowania próbki w celu ulepszenia konwencjonalnej metody spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą poprzez reformę prostej morfologii podczas procesu suszenia. Zaletą tej techniki jest to, że intensywność sygnału próbek węglowodanów przygotowanych tą zoptymalizowaną metodą może być skutecznie zwiększona. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ etap obniżania ciśnienia metanolu jest bardzo ważny i należy go wykonać za jednym razem.

Każde wahanie obniży jakość danych. Na początek, nosząc rękawice nitrylowe, użyj 100 mililitrów roztworu detergentu do ręcznego umycia płytki próbki. Użyj wody destylowanej dejonizowanej lub DD do ręcznego mycia talerza.

Następnie 30 mililitrami metanolu spłucz jego powierzchnię. Włóż płytkę do próbki do zlewki o pojemności 600 mililitrów i napełnij ją wodą DD, aż płytka zostanie całkowicie zanurzona. Następnie umieść zlewkę w łaźni ultradźwiękowej i sonikuj płytkę przez 15 minut.

Wyjąć płytkę z próbką ze zlewki i użyć azotu pod ciśnieniem, aby zdmuchnąć krople wody. Następnie umieść 0,2 mikrolitra metanolu na płytce próbki, aby sprawdzić, czy rozprzestrzenia się on na inne miejsca. Jeśli tak, powtórz mycie, sonikację i obróbkę azotem, jak pokazano poniżej.

Po przygotowaniu komory suszenia zgodnie z protokołem tekstowym, w probówce mikrowirówki należy wymieszać 0,25 mikrolitra roztworu kwasu 2-5-dihydroksybenzoesowego i 0,25 mikrolitra roztworu Sialylo-Lewisa A lub maltoheptaozy. Następnie wiruj rurkę przez trzy sekundy. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce w temperaturze 2000 razy G przez dwie sekundy.

Następnie natychmiast odpipetować 0,1 mikrolitra wstępnie zmieszanego roztworu na płytkę z próbką. Gdy próbka wyschnie, pracując szybko, aby uniknąć parowania, odpipetować 0,2 mikrolitra metanolu bezpośrednio na miejsce próbki. Próbka ponownie się rozpuści, a następnie natychmiast wyschnie.

Etap osadzania metanolu jest najtrudniejszym krokiem, który decyduje o jakości i odtwarzalności danych. Aby zapewnić najlepszą wydajność, zalecamy, aby użytkownik zakończył osadzanie w ciągu trzech do pięciu sekund, aby uniknąć znacznych strat metanolu w wyniku parowania. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.

Następnie pod mikroskopem zbadaj próbkę. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, powtórz mieszanie próbki i nakrapianie na płytce próbki. Aby upewnić się, że kryształy próbki mają optymalną morfologię po rekrystalizacji, zawsze należy je badać pod mikroskopem.

Trudno jest prawidłowo określić jakość morfologii kryształów gołym okiem. Aby przeanalizować próbkę o objętości jednego mikrolitra, należy wymieszać 2,5 mikrolitra roztworu kwasu 2-dihydroksybenzoesowego i 2,5 mikrolitra roztworu Sialylo-Lewisa A lub maltoheptaozy w probówce do mikrowirówki. Wiruj wstępnie zmieszany roztwór przez pięć sekund.

Wirować zmieszany roztwór w temperaturze 2000 razy G przez dwie sekundy, a następnie natychmiast odpipetować jeden mikrolitr wstępnie wymieszanego roztworu na płytkę z próbką. Po wyschnięciu próbki należy odpipetować 1,5 mikrolitra metanolu bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka ponownie się rozpuści i natychmiast wyschnie.

Ostrożnie wyjąć próbkę z komory suszenia. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, należy powtórzyć przygotowanie roztworu, jak pokazano.

Aby przeprowadzić spektrometrię mas, otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem mas i włóż płytkę próbki do urządzenia. Wybierz wstępnie zoptymalizowaną metodę pozyskiwania danych w oprogramowaniu, a następnie za pomocą oprogramowania do obrazowania zarejestruj cały obszar próbki do obrazowania spektrometrii mas. Uruchom akwizycję danych w trybie wsadowym oprogramowania sterującego.

Po zakończeniu akwizycji danych użyj oprogramowania do obrazowania, aby wykreślić obrazy jonów i przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Reprezentatywne obrazy SEM Sialyl-Lewisa A zmieszanego z kwasem 2,5-dihydroksybenzoesowym przygotowanym przy użyciu metod suszonych kropelek i rekrystalizacji przedstawiono tutaj. Typowa morfologia kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego to duże, igiełkowate kryształy na krawędzi i drobne struktury krystaliczne w środku plamek próbki.

Po rekrystalizacji przez metanol próbka ma większą powierzchnię równomiernie pokrytą drobnymi, płatkowymi kryształami. Rysunek ten przedstawia wyniki obrazowania spektrometrii mas Sialyla-Lewisa A i maltoheptaozy z rekrystalizacją metanolu i bez niej. Po rekrystalizacji rozkład sygnałów Sialylo-Lewisa A i maltohepaozy dobrze pasuje do obrazów w jasnym polu plam próbki.

Intensywność sygnału w próbkach rekrystalizowanych węglowodanów jest również zwiększona w porównaniu z konwencjonalnymi próbkami z suchymi kropelkami. Wykres ten porównuje intensywność sygnału węglowodanów w trybie jonów sodowanych lub dodatnich oraz w trybie jonów deprotonowanych lub ujemnych w próbkach rekrystalizowanych w odniesieniu do intensywności sygnału w próbkach z suszonych kropel. Średnio rekrystalizacja próbek sialylo-Lewisa A i maltoheptaozy zwiększyła sygnały sodowane o czynniki 3,9 i 3,3.

Deprotonowane sygnały jonów A sialylo-Lewisa zostały wzmocnione 4,7-krotnie po rekrystalizacji. Po opanowaniu próbki można przygotować w ciągu 10 minut przy użyciu tej techniki, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kropla metanolu została natychmiast i precyzyjnie osadzona w miejscu próbki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie kontrolować morfologię kryształów wielu próbek, aby uzyskać najlepsze sygnały jonowe do rutynowej analizy.