Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie chipa z mikrokanałami dla komórek endotelialnych o okrągłym przekroju i wielu głębokościach, który naśladuje geometrię 3D naczyń mikrokrwionośnych in vivo i pracuje w warunkach kontrolowanego, ciągłego przepływu perfuzyjnego. Zostaje to osiągnięte poprzez najpierw fotolitograficzne wykonanie formy matki z siecią mikrokanałów o półkolistym przekroju przy użyciu pozytywnego, przepływnego fotorezystu. Drugim krokiem jest wykorzystanie formy matki do powielenia dwóch mikrokanałów z polidimetylosiloksanu, ich wyrównanie i połączenie w celu utworzenia cylindrycznej sieci mikrokanałów.

Następnie pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej są osadzane w sieci mikrokanałów przed hodowlą komórek w kontrolowanych warunkach ciągłej perfuzji medium przez okres od czterech dni do dwóch tygodni. Ostatecznie, wzdłuż wewnętrznej powierzchni sieci mikrokanałów rozwija się konfluencja monowarstwy komórkowej, wskazywana przez obecność błony i jąder komórkowych pod mikroskopem, co umożliwia obliczenie funkcjonalnych mikonaczyniń, które mogą stanowić platformę do badania złożonych zjawisk naczyniowych. Jednak konwencjonalne testy pojedynczych mikonaczyniń, takie jak testy migracji komórek, testy tworzenia rurek oraz testy pierścieni endotelialnych, mają ograniczone możliwości w odtwarzaniu pojedynczych mikonaczyniń pod kątem geometrii trójwymiarowej i kontroli ciągłego przepływu.

Główną zaletą naszych technik, a konkretnie stosowanej przez nas metody mikrofabrykacji, jest możliwość konwencjonalnego wytwarzania wielopoziomowej sieci kanałów mikrofluidycznych, która naśladuje złożoną geometrię 3D naczyń mikrokrążenia in vivo o zaokrąglonych przekrojach poprzecznych. Pozwala ona również na projektowanie biomagnetycznych systemów mikronaczyniowych, które w przybliżeniu spowalniają i utrzymują przepływ cieczy na wymaganym poziomie, tak aby całkowity opór kanałów był niski, a uzyskany przepływ był bardziej jednolity w całej sieci; procedurę tę zaprezentuje doktorant z mojego laboratorium. Procedura ta rozpoczyna się od wykonania wzorca z fotorezystu, składającego się z mikrokanałów o średnicach od 30 µm do 60 µm, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym; w skrócie: przenieś fotorezyst reflow z lodówki o temperaturze 4 °C do pomieszczenia czystego na 24 godziny przed użyciem i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej.

Zacznij od naniesienia metodą spin coatingu warstwy pozytywnego fotorezystu reflow na uprzednio oczyszczoną podłożze krzemowe, zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie naświetl fotorezyst światłem UV przez maskę z wzorem, a następnie wywołaj wzór mikrokanałów. Na koniec, po procesie reflow, utwórz sieć mikrokanałów o półkolistym przekroju poprzecznym.

Po przygotowaniu formy matki, należy przygotować roztwór polidimetylosiloksanu (PDMS), zachowując stosunek wagowy bazy do utwardzacza wynoszący 10:1, a następnie dokładnie go wymieszać za pomocą planetarnej mieszadarki odśrodkowej. Roztwór PDMS należy wylać na formę matkę z przetopionym fotorezystem. Wylany PDMS należy umieścić w eksykatore na 15 minut w celu odgazowania.

W razie potrzeby użyć gazu azotowego, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza. Wypiec PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez trzy godziny, aby umożliwić jego utwardzenie. Następnie oddzielić utwardzoną warstwę PDMS od formy matki.

Za pomocą naostrzonego przebijaka wykonaj otwory wlotowe i wylotowe, przebijając sieć kanałów. Oczyść powierzchnię PDMS za pomocą gazu azotowego. Poddaj dwie warstwy PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 sekund w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przy ciśnieniu roboczym 45 milato i przepływie tlenu wynoszącym 3,5 cubic feet per minute.

Następnie ręcznie wyrównaj powierzchnie PDMS pod mikroskopem optycznym. W razie potrzeby użyj kropli wody, aby uzyskać lepszą kontrolę nad procesem wyrównywania. Na koniec wypiecz urządzenie w piekarniku w temperaturze 60°C przez 30 minut, aby uzyskać trwałe połączenie warstw.

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej lub VE w pożywce hodowlanej z L-glutaminą, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej. Poddać urządzenie działaniu plazmy tlenowej przez pięć minut przy ciśnieniu roboczym 45 milit i przepływie tlenu wynoszącym 3,5 stóp sześciennych na minutę. Następnie wypełnić urządzenie wodą dejonizowaną i poddać działaniu światła UV przez osiem godzin w laminarnym dygestorium biologicznym w celu sterylizacji.

Na jeden dzień przed przygotowaniem komórek należy przemyć urządzenie jednokrotnym roztworem fosforanowo-buforowanym (PBS), a następnie pokryć je fibronektyną. Inkubować w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji należy je zebrać, najpierw płucząc je roztworem buforu Hanksa, a następnie traktując trypsyną z EDTA po dodaniu trypsyny.

Inkubować komórki od dwóch do sześciu minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trypsynizacji zneutralizować trypsynę z EDTA za pomocą roztworu neutralizującego trypsynę. Policzyć komórki, a następnie poddać je wirowaniu przed resuspensją.

Zawieszenie w pożywce hodowlanej z 8% dekstryną służy do zwiększenia lepkości medium, co wspomaga lepsze osadzanie się i przywieranie komórek po powłoce FI enc ENC. Przemyć urządzenie raz roztworem XPBS, a następnie napełnić je pożywką hodowlaną przed inkubacją w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie do urządzenia nanosi się komórki w pożywce hodowlanej z 8% dekstryną w stężeniu od 3 do 4 milionów komórek na ml.

Nanieś kroplę zawiesiny komórek o objętości 20 µL do jednego z wlotów urządzenia i przechyl je, aby wprowadzić komórki do kanału mikrofluidycznego. Po 15 do 20 minutach komórki zaczną przytwierdzić się do ścianek bocznych kanałów. Obracaj urządzenie co 15 minut, aby uzyskać bardziej jednorodny rozkład komórek.

W razie potrzeby można przeprowadzić dodatkowe zasiewanie. Po pięciu do sześciu godzinach statycznej hodowli przytwierdzone komórki zaczną całkowicie się rozprzestrzeniać. Należy uruchomić długotrwałą perfuzję przy użyciu zdalnie sterowanego systemu pompy strzykawkowej ze stałym przepływem 10 µL/h; przepływ ten można dostosować do wyższej wartości, a perfuzja może trwać od czterech dni do dwóch tygodni.

Gdy komórki osiągną konfluencję wewnątrz urządzenia, należy najpierw przemyć urządzenie raz XPBS w celu całkowitego usunięcia pożywki. Następnie należy wprowadzić do urządzenia rozcieńczony czerwony barwnik po inkubacji urządzenia w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przemyć urządzenie pożywką hodowlaną, aby przerwać barwienie.

Długotrwała inkubacja barwnika może powodować toksyczność komórkową oraz odklejanie się komórek. Następnie należy załadować do urządzenia niebieski barwnik rozcieńczony w 1XPBS i inkubować w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie dokładnie przemyć urządzenie 1XPBS. Barwienie komórek należy ocenić pod odwróconym mikroskopem optycznym.

Jeśli barwienie przebiegło pomyślnie, należy wypełnić mikrokanały medium utrwalającym, a następnie zanurzyć urządzenie w medium utrwalającym i całkowicie owinąć je folią aluminiową. Urządzenie należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aby zapobiec jego wyschnięciu oraz odbarwieniu. Utrwalone urządzenie jest teraz gotowe do obrazowania konfokalnego, które można przeprowadzić za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii optycznej. Metody te zostały wykorzystane do charakterystyki fotorezystu po procesie reflow oraz replikowanego kanału PDMS przed i po przebiegu procesu reflow.

Wykazano i scharakteryzowano cechy geometryczne sieci mikrokanałów z PDMS. Przekroje poprzeczne form z PDMS o kształcie koła obrazują wymiary kanałów na każdym poziomie rozgałęzień. Wyniki wskazują, że technika przepływu fotorezystu pozwala w bardziej dogodny sposób tworzyć sieci kanałów z rozgałęzieniami o wielu głębokościach, co umożliwia projektowanie biomimetycznych systemów mikronaczyniowych w przybliżeniu zgodnych z prawem Murraya; przedstawione tutaj obrazy mikroskopowe wykonano z użyciem czerwonego barwnika do błon komórkowych oraz niebieskiego barwnika do jąder komórkowych.

Przekroje poprzeczne w rzucie kołowym wykazały, że VE wyściela wewnętrzną powierzchnię sieci cylindrycznych mikrokanałów w różnych regionach rozgałęzień. Ze względu na złożoną geometrię mikrokrążenia in vivo, monitorowanie tych małych naczyń w czasie rzeczywistym jest trudne. Opracowany chip oparty na PDMS oferuje dobre właściwości optyczne i umożliwia wysokiej jakości obrazowanie mikrokanałów śródbłonkowych w czasie rzeczywistym, co pokazano na tym filmie konfokalnym przedstawiającym wyścielkę komórkową wzdłuż kołowej sieci kanałów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób wykonania przepływu dla tego trybu masowego. Utwórz sieć mikrokanałów PDMS o okrągłym przekroju poprzecznym, wprowadź komórki śródbłonka do urządzeń i skonfiguruj długoterminową perfuzję pożywki. Podsumowując, opracowane zserializowane mikrokanały śródbłonkowe na chipie zapewniają szybkie i powtarzalne podejście do tworzenia wielopoziomowych sieci mikrokanałów o okrągłym przekroju poprzecznym, które naśladują geometrię mikro naczyń InVivo.

Niniejsza procedura ilustruje wykorzystanie unikalnych możliwości w zaawansowanej mikrowytwarzalności oraz technologiach mikroprzepływowych do stworzenia modelu naczyniowego z długoterminową, ciągłą kontrolą perfuzji, a także wysokiej jakości obrazowaniem w czasie rzeczywistym, co podkreśla rosnącą użyteczność kanałów mikroprzepływowych w biologii komórki, inżynierii tkankowej i zastosowaniach bioinżynieryjnych. Układ z szeregowo połączonych mikrokanałów endotelialnych na chipie stanowi potencjalny model do badań nad naczyniami włosowatymi.