Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie mikrokanałów o wielogłębokościowym przekroju poprzecznym śródbłonka na chipie, który naśladuje geometrię 3D mikronaczyń in vivo i działa w kontrolowanym ciągłym przepływie obfitości. Osiąga się to poprzez pierwsze litograficzne wytworzenie formy wzorcowej z półokrągłą siecią mikrokanałów o przekroju poprzecznym przy użyciu dodatniego rozpływowego fotorezystu. Drugim krokiem jest użycie formy głównej do odtworzenia dwóch mikrokanałów polidimetylosozonowych, wyrównania ich i połączenia w celu stworzenia cylindrycznej sieci mikrokanałów.

Następnie pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej są umieszczane w sieci mikrokanałów przed hodowlą komórek w kontrolowanych warunkach ciągłej perfuzji pożywki przez okres od czterech dni do dwóch tygodni. Ostatecznie, wzdłuż wewnętrznej powierzchni sieci mikrokanałów rozwija się monowarstwa komórek konfluencji, na którą wskazuje stanie błona i jądra stojące pod mikroskopami. Obliczenia funkcjonalnych mikronaczyń, w których mogą stanowić platformę do badania złożonych zjawisk naczyniowych. Jednak konwencjonalne testy pojedynczych mikronaczyń, takie jak testy migracji komórek anso i testy tworzenia So two oraz testy z pierścieniem prawym i mos tic, są ograniczone do odtworzenia pojedynczych mikronaczyń w odniesieniu do geometrii trójwymiarowej i ciągłej kontroli przepływu.

Główną zaletą naszych technik, naszej istniejącej metody mikrowytwarzania, jest to, że może ona konwencjonalnie wytwarzać sieć kanałów mikroprzepływowych o wielu głębokościach, która naśladuje złożoną geometrię 3D mikronaczyń in vivo, które mają zaokrąglone przekroje poprzeczne. Pozwala to również na zaprojektowanie mikronaczyniowych systemów biomagnetycznych, które w przybliżeniu działają wolniej i utrzymują przepływ płynu na wymaganym poziomie, dzięki czemu ogólna odporność kanału jest niska, a utracony przepływ jest bardziej równomierny w całej sieci, co pokazuje, że procedura będzie doktorantem z mojego laboratorium. Procedura ta rozpoczyna się od wytworzenia wzorcowej formy fotorezystu składającej się z mikrokanałów o średnicach od 30 mikronów do 60 mikronów, jak opisano w protokole tekstowym, krótkiego przeniesienia fotorezystu rozpływowego z lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czystego pomieszczenia na 24 godziny przed użyciem i pozostawienia go do ogrzania do temperatury pokojowej.

Rozpocznij od wirowego powlekania dodatniej warstwy fotorezystu rozpływowej na wstępnie oczyszczonym podłożu silikonowym, postępując zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie wystaw fotorezystor na działanie światła UV przez wzorzystą maskę przed rozwinięciem wzorzystych mikrokanałów. Na koniec, po rozpływie, utwórz półkolistą przekrojową sieć mikrokanałów.

Gdy forma wzorcowa jest gotowa, przygotuj roztwór polimetylosoanu lub PDMS w stosunku wagowym 10 do jednej bazy do utwardzacza i dokładnie wymieszaj go za pomocą planetarnego miksera odśrodkowego. Odlej roztwór PDMS na rozpływową formę wzorcową fotorezystu. Umieść odlewany PDMS w osuszaczu na 15 minut, aby Degas.

W razie potrzeby użyj azotu, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki. Piecz PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby mógł się utwardzić. Następnie usuń utwardzoną warstwę PDMS z formy wzorcowej.

Użyj zaostrzonego dziurkacza, aby utworzyć otwory wlotowe i wylotowe, wykrawając otwory w sieci kanałów. Oczyść powierzchnię PDMS za pomocą gazowego azotu. Potraktuj dwie warstwy PDMS plazmą tlenową przez 30 sekund wewnątrz myjki plazmowej pod ciśnieniem roboczym 45 milato i natężeniem przepływu tlenu 3,5 stopy sześciennej na minutę.

Następnie ręcznie wyrównaj powierzchnie PDMS pod mikroskopem optycznym. W razie potrzeby użyj kropli wody, aby lepiej kontrolować wyrównanie. Na koniec piecz urządzenie w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby uzyskać trwałą kulturę wiązania.

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub VE w pożywce hodowlanej z L-glutaminą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą. Traktuj urządzenie plazmą tlenową przez pięć minut przy ciśnieniu roboczym 45 mil i natężeniu przepływu tlenu 3.5 stopy sześciennej na minutę. Następnie załaduj urządzenie wodą dejonizowaną i poddaj działaniu światła UV przez osiem godzin w laminarnym okapie bezpieczeństwa biologicznego w celu sterylizacji.

Na dzień przed przygotowaniem komórek umyj urządzenie solą fizjologiczną lub PBS lub PBS, a następnie pokryj fibronektyną. Inkubować w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Gdy komórki zlewają się, zbierz je, najpierw przepłukując komórki zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej, a następnie traktując komórki trypsyną EDTA po dodaniu trypsyny.

Inkubuj komórki przez dwie do sześciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu trypsyny zneutralizować tripsinę EDTA roztworem neutralizującym trypsynę. Policz komórki, a następnie odwiruj je przed resusem.

Zawieszenie w pożywce hodowlanej z 8% dekstryną dekstryny stosuje się w celu zwiększenia lepkości podłoża, aby pomóc w lepszym osadzeniu i przyczepieniu komórek po pokryciu FI enc ENC. Umyj urządzenie jednym XPBS, a następnie załaduj urządzenie pożywką hodowlaną przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie do urządzenia ładowane są komórki w pożywce hodowlanej 8% Dextrin o stężeniu od trzech do 4 milionów komórek na mililitr.

Umieść kroplę komórek o pojemności 20 mikrolitrów na jednym wlocie urządzenia i przechyl ją, aby wprowadzić komórki do kanału mikroprzepływowego. Po 15 do 20 minutach komórki zaczną przyczepiać się do bocznych ścian kanałów. Obracaj urządzenie co 15 minut, aby uzyskać bardziej równomierny rozkład komórek.

W razie potrzeby można wykonać dodatkowe obciążenie. Po pięciu do sześciu godzinach hodowli statycznej przyłączone komórki zaczną się w pełni rozprzestrzeniać. Ustaw długotrwałą perfuzję za pomocą zdalnie sterowanego systemu pompy strzykawkowej o stałym przepływie 10 mikrolitrów na godzinę, perfuzję można dostosować w celu uzyskania wyższego natężenia przepływu i może trwać przez okres od czterech dni do dwóch tygodni.

Gdy komórki osiągną zbieg wewnątrz urządzenia, najpierw umyj urządzenie jednym XPBS, aby dokładnie usunąć podłoże. Następnie załaduj urządzenie rozcieńczonym czerwonym barwnikiem po inkubacji urządzenia w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj go pożywką hodowlaną, aby zatrzymać barwienie.

Długa inkubacja barwnika może powodować toksyczność komórkową i dysadhezję. Następnie załaduj urządzenie niebieskim barwnikiem rozcieńczonym jednym XPBS, inkubuj w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed dokładnym umyciem urządzenia jednym XPBS. Zbadaj barwienie komórek pod odwróconym mikroskopem optycznym.

Jeśli barwienie jest dobre, załaduj mikrokanaliki środkiem utrwalającym, a następnie zanurz urządzenie w medium utrwalającym i całkowicie przykryj folią aluminiową. Przechowuj urządzenie w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zapobiec wysychaniu i wybielaniu urządzenia, stałe urządzenie jest teraz gotowe do obrazowania konfokalnego, które można wykonać za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, skaningowej mikroskopii elektronowej i mikroskopii optycznej. Wykorzystano je do scharakteryzowania fotorezystu rozpływowego i replikowanego kanału PDMS przed i po postępie rozpływu.

W artykule scharakteryzowano i pokazano cechy geometryczne sieci mikrokanałów PDMS. Okrągłe przekroje form PDMS pokazują wymiary kanału na każdym poziomie rozgałęzienia. Wyniki pokazują, że technika rozpływu fotorezystu może tworzyć sieci kanałów rozgałęziających o wielu głębokościach w wygodniejszym podejściu za pomocą technik rozpływowych fotorezystu i umożliwiają projektowanie mikronaczyniowych systemów biomimetycznych , które w przybliżeniu są zgodne z prawem Murraya, pokazane tutaj obrazy mikroskopowe przy użyciu fluorescencyjnego barwnika błony komórkowej w kolorze czerwonym i barwnika jądra komórkowego w kolorze niebieskim.

Okrągłe widoki przekroju poprzecznego ujawniły, że VE wyściełał wewnętrzną powierzchnię cylindrycznej sieci mikrokanałów w różnych rozgałęzionych regionach. Ze względu na złożoną geometrię mikronaczyń krwionośnych in vivo, monitorowanie tych małych naczyń w czasie rzeczywistym jest trudne. Opracowany chip oparty na P DM S oferuje dobre właściwości optyczne i pozwala na wysokiej jakości obrazowanie mikrokanałów śródbłonka w czasie rzeczywistym, jak pokazano na tym filmie konfokalnym wyściółki komórki wzdłuż sieci kanałów kołowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować rozpływ dla tego trybu masowego. Stwórz sieć mikrokanałów PDMS o przekroju kołowym, załaduj komórki komórkowe endo do urządzeń i ustaw długoterminową obfitość mediów. Podsumowując, opracowane mikrokanały szeregowe endo na chipie zapewniają szybkie i powtarzalne podejście do tworzenia sieci mikrokanałów o przekroju kołowym i wielu głębokościach, które naśladują geometrię mikronaczyń InVivo.

Procedura ta ilustruje wykorzystanie unikalnych możliwości w zaawansowanych technologiach mikroprodukcji i mikrożywności w celu stworzenia modelu mikronaczyniowego z długoterminową ciągłą kontrolą perfuzji, a także wysoką jakością i możliwością obrazowania w czasie rzeczywistym wraz z rosnącą użytecznością mikrokanałów pokarmowych w biologii komórki, inżynierii tkankowej i zastosowaniach bioinżynieryjnych. Serializowane mikrokanały endo na chipie to potencjalny esej do badań mikronaczyniowych.