Name: Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T19:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę tworzenia mikrokanałów na chipie z komórkami śródbłonkowymi HUVEC, która naśladuje trójwymiarową geometrię naczyń mikrokrwionośnych in vivo. Technika umożliwia kontrolowaną perfuzję i wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez National Science Foundation (NSF 1227359), program WVU EPSCoR finansowany przez National Science Foundation (EPS-1003907), biuro WVU ADVANCE sponsorowane przez National Science Foundation (1007978), oraz WVU PSCoR, odpowiednio. Prace związane z mikrowytwarzaniem przeprowadzono w WVU Shared Research Facilities (obiekty w pomieszczeniach czystych) oraz Microfluidic Integrative Cellular Research on Chip Laboratory (MICRoChip Lab) na Uniwersytecie Zachodniej Wirginii. Obrazowanie konfokalne wykonano w Zakładzie Obrazowania Mikroskopowego WVU.

1. Fotolitografia Wytwarzanie formy wzorcowej fotorezystu
Poniższy protokół pokazuje proces wytwarzania mikrokanałów o średnicach 30-60 μm. Aby uzyskać mikrokanalik o mniejszej średnicy (mniej niż 30 μm), potrzebna jest pojedyncza powłoka spinowa fotorezystu.
<ol>
	<li>Fotorezystor rozpływowy przenieść z lodówki w temperaturze 4 °C do pomieszczenia czystego na 24 godziny przed użyciem i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Oczyść wafel silikonowy i piecz go przez godzinę w temperaturze 150 °C, aby mógł się odwodnić. Odwodnienie wspomoże przyczepność fotorezystu do podłoża silikonowego.</li>
	<li>Powlekaj wirowo pierwszą warstwę fotorezystu, korzystając z następującego przepisu:</li>
</ol>
<obramowanie tabeli="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>krok</td>
			<td>Czas (sekundy)</td>
			<td>Prędkość obrotowa (obr./min)</td>
			<td>przyspieszenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>300</td> szt.
			<td>najwyższy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>300</td> szt.
			<td>najwyższy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>60</td> Rozdział
			<td>600</td> szt.
			<td>najwyższy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>500</td> szt.
			<td>najwyższy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>600</td> szt.
			<td>najwyższy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="4">
	<li>Następnie piecz wafelek na płycie grzejnej o temperaturze 110 °C przez 90 sekund. Po miękkim upieczeniu grubość fotorezystu wyniesie 20-30 μm.</li>
	<li>Odwiruj drugą warstwę fotorezystu zgodnie z tą samą recepturą, która została użyta dla pierwszej warstwy.</li>
	<li>Ponownie upiecz wafelek na miękko, umieszczając go na płycie grzejnej o temperaturze 110 °C na 90 sekund. Po tym miękkim pieczeniu grubość fotorezystu wyniesie 40-60 μm.</li>
	<li>Generuj pozytywne wzorce wzorcowe, wystawiając fotorezystor na działanie światła UV o dawce ekspozycji 14 500 mJ/cm2 przez maskę filmową.</li>
	<li>Rozcieńczyć wywoływacz wodą dejonizowaną (DI) (1:2 (v/v)). Kilkakrotnie opłucz wafel w roztworze, aż wzór zostanie w pełni rozwinięty. Następnie umyj wafel wodą DI i wysusz go za pomocą gazowego azotu.</li>
	<li>Rozpływ: Umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 120 °C na 4 minuty i przykryj szklaną szalką Petriego, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Grubość fotorezystu po rozpływku wyniesie 50-60 μm.</li>
</ol>
2. Miękka litografia Produkcja sieci mikrokanałowej PDMS
<ol>
	<li>Przygotować roztwór polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku wagowym 10:1 (baza:utwardzacz) i dokładnie wymieszać za pomocą planetarnego mieszalnika odśrodkowego.</li>
	<li>Odlej roztwór PDMS na rozpływową formę wzorcową fotorezystu. Umieść odlewany PDMS w eksykatorze na 15 minut w celu odgazowania. W razie potrzeby użyj azotu, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki.</li>
	<li>Piecz PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 3 godziny, aby mógł się utwardzić. Następnie usuń utwardzoną warstwę PDMS z formy wzorcowej.</li>
	<li>Użyj zaostrzonego dziurkacza, aby utworzyć otwory wlotowe/wylotowe, wykrawając otwory w sieci kanałów. Oczyść powierzchnię PDMS za pomocą gazowego azotu.</li>
	<li>Potraktuj dwie warstwy PDMS plazmą tlenową przez 30 sekund wewnątrz myjki plazmowej pod ciśnieniem roboczym 4,5 x 10-2 Torr i natężeniem przepływu tlenu 3,5 stopy3/min. Następnie ręcznie wyrównaj powierzchnie PDMS pod mikroskopem optycznym. W razie potrzeby użyj kropli wody, aby lepiej kontrolować wyrównanie.</li>
	<li>Piecz urządzenie w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 30 minut, aby uzyskać trwałe połączenie.</li>
</ol>
3. Uprawa HUVEC i siew w chipie
<ol>
	<li>Hodowla HUVEC z pożywką hodowlaną z L-glutaminą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). W eksperymencie wykorzystano pasaże od 2 do 5.</li>
	<li>Gdy HUVEC zbliżą się, policz komórki i zbierz je, najpierw przepłukując komórki buforowanym roztworem soli fizjologicznej HEPES, A NASTĘPNIE potraktuj komórki trypsyną/EDTA i inkubuj przez 2-6 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trypsynizacji zneutralizuj trypsynę/EDTA roztworem neutralizującym trypsynę. Odwirować i zawiesić komórki w pożywce hodowlanej z 8% dekstranem, aby je zebrać. Dekstran zastosowano w celu zwiększenia lepkości podłoża, aby pomóc w lepszym wysiewaniu i przyczepianiu komórek.</li>
	<li>Traktuj urządzenie plazmą tlenową przez 5 minut przy ciśnieniu roboczym 4.5 x 10-2 Torr i natężeniu przepływu tlenu 3.5 ft3/min. Następnie załaduj urządzenie wodą DI i poddaj je działaniu światła UV przez 8 godzin w laminarnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego w celu sterylizacji.</li>
	<li>Na dzień przed przygotowaniem komórek umyj urządzenie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (1x PBS), a następnie pokryj fibronektyną (100 μg/ml, rozcieńczoną 1x PBS) i inkubuj w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Po pokryciu fibronektyną umyj urządzenie 1x PBS, a następnie załaduj pożywką hodowlaną. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Załaduj komórki HUVEC do 8% pożywki hodowlanej dekstranu o stężeniu komórek 3-4 x 106 komórek/ml. Umieść kroplę komórek o wielkości 20 μl na jednym wlocie urządzenia i przechyl ją, aby wprowadzić komórki do kanału mikroprzepływowego. Po 15-20 minutach komórki zaczną przyczepiać się do bocznych ścianek kanałów. Obracaj urządzenie co 15 minut, aby uzyskać bardziej równomierny rozkład komórek. W razie potrzeby można wykonać dodatkowe obciążenie.</li>
</ol>
4. Długoterminowa konfiguracja perfuzji
Po 5-6 godzinach statycznej hodowli, dołączone HUVEC zaczną się w pełni rozprzestrzeniać. Ustawić perfuzję za pomocą zdalnie sterowanego systemu pompy strzykawkowej o stałym przepływie 10 μl/h. Perfuzję można dostosować w celu uzyskania wyższego natężenia przepływu i może trwać od 4 dni do 2 tygodni.
5. Barwienie komórek i charakterystyka mikroskopowa
<ol>
	<li>Gdy komórki osiągną zbieg wewnątrz urządzenia, najpierw umyj urządzenie 1x PBS, aby dokładnie usunąć pożywkę. Następnie załaduj urządzenie czerwonym barwnikiem rozcieńczonym rozcieńczalnikiem (4 μl-1 ml). Załaduj barwnik podobnie jak w przypadku procedury ładowania komórek. Inkubuj urządzenie w ciemności przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj urządzenie pożywką hodowlaną, aby zatrzymać barwienie. Długa inkubacja barwnika może powodować toksyczność komórkową i dysadhezję.</li>
	<li>Załaduj urządzenie niebieskim barwnikiem rozcieńczonym 1x PBS (2 krople na ml). Inkubować w ciemności przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dokładnie umyć urządzenie 1x PBS.</li>
	<li>Zbadaj barwienie komórek pod odwróconym mikroskopem optycznym. Jeśli barwienie było dobre, załaduj mikrokanaliki środkiem utrwalającym (3,5% paraformaldehydu rozcieńczonego 1x PBS), a następnie zanurz urządzenie w podłożu utrwalającym i całkowicie przykryj folią aluminiową. Przechowuj urządzenie w lodówce w temperaturze 4 °C, aby zapobiec wysychaniu i fotowybielaniu. Stałe urządzenie jest teraz gotowe do obrazowania konfokalnego, które można wykonać za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

1. Wykonanie formy głównej
Jedną z zasad projektowych i wytycznych dla morfometrii naczyniowej jest prawo Murraya16, zgodnie z którym rozkład średnic naczyń w całej sieci jest regulowany przez rozważania dotyczące minimalizacji energii. Stanowi ono również, że sześcian średnicy naczynia macierzystego w punkcie rozgałęzienia jest równy sumie sześcianów średnic naczyń potomnych (<img alt="Równanie wielomianowe, formuła, obliczenia algebraiczne, koncepcja matematyczna, analiza wyrażenia s...

Mikronaczynia, jako część systemu krążenia, pośredniczą w interakcjach między krwią a tkankami, wspierają aktywność metaboliczną, definiują mikrośrodowisko tkanek i odgrywają kluczową rolę w wielu stanach zdrowotnych i patologicznych. Rekapitulacja funkcjonalnych mikronaczyń in vitro może stanowić platformę do badania złożonych zjawisk naczyniowych. Jednak konwencjonalne testy mikronaczyń in vitro, takie jak testy migracji komórek śródbłonka, testy tworzenia rurki śródbłonka oraz testy pierścienia aortalnego u szczurów i myszy, nie są w stanie odtworzyć mikronaczyń in vivo w odniesieniu do geometrii trójwymiarowej (3D) i ciągłej kontroli przepływu1-8. Badania mikronaczyń krwionośnych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych i testów in vivo, takich jak test angiogenezy rogówki, test angiogenezy błony kosmówkowo-omoczniowej piskląt i test czopa Matrigel, są bardziej czasochłonne, kosztowne, stanowią wyzwanie w odniesieniu do obserwacji i kwantyfikacji oraz wiążą się z kwestiami etycznymi1, 9-13.
Postępy w mikroprodukcji i technologiach chipów mikroprzepływowych umożliwiły różnorodne wglądy w nauki biomedyczne, jednocześnie ograniczając wysokie koszty eksperymentalne i zawiłości związane z badaniami na zwierzętach i in vivo 14, takie jak łatwo i ściśle kontrolowane warunki biologiczne i dynamiczne środowiska płynowe, które nie byłyby możliwe przy użyciu konwencjonalnych technik makroskalowych.
Tutaj prezentujemy podejście do konstruowania śródbłonkowego mikrokanału na chipie, który naśladuje geometrię 3D mikronaczyń in vivo i działa pod kontrolowanym ciągłym przepływem perfuzyjnym, wykorzystując kombinację fotolitografii reflowalnej techniki fotorezystu, miękkiej litografii i mikrofluidyki.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik/Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reflow Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZP4620</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>AZ Electronic Materials AZ</td><td>400K</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Podłoże hodowlane</td><td>Invitrogen</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>NacBlue Nuclei Staining</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>PKH Red Stain</td><td>Sigma</td><td>MINI26 i PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buforowany roztwór soli</td><td>fizjologicznej Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Utwardzacz</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik C</td><td>Sigma</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Invitrogen, sondy molekularne</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran</td><td>Sigma</td><td>95771</td><td></td></tr><tr><td>3,5% paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Science</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>WS-400BZ-6NPP/ Eksykator LITE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Produkty BelArt 999320237</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>System</td><td></td> pompy strzykawkowej Nikon Eclipse Ti <td></td></tr><tr><td></td><td>Aparat Harvarda Kaptur</td> bezpieczeństwa biologicznego <td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>laminarny Planetarny</td> mikser odśrodkowy <td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-246-516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Zeiss</td><td>Invertoskop 40C</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td><td>SP131635</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Wysiłki skupione zostały na opracowaniu testów in vitro do badania mikronaczyń, ponieważ badania na zwierzętach in vivo są bardziej czasochłonne, kosztowne, a obserwacja i kwantyfikacja są bardzo trudne. Jednak konwencjonalne testy mikronaczyń in vitro mają ograniczenia, jeśli chodzi o przedstawianie mikronaczyń in vivo w odniesieniu do geometrii trójwymiarowej (3D) i zapewniania ciągłego przepływu płynu. Wykorzystując kombinację fotolitograficznej techniki fotorezystu rozpływowego, miękkiej litografii i mikrofluidyki, opracowaliśmy wielogłębokościowo-kołowe, śródbłonkowe mikrokanały na chipie, które naśladują geometrię 3D mikronaczyń in vivo i działają pod kontrolowanym ciągłym przepływem perfuzyjnym. Dodatni fotorezystor rozpływowy został użyty do wytworzenia formy wzorcowej z półkolistą siecią mikrokanałów o przekroju poprzecznym. Poprzez wyrównanie i połączenie dwóch mikrokanalików polidimetylosiloksanu (PDMS) replikowanych z formy wzorcowej, stworzono cylindryczną sieć mikrokanałów. Średnice mikrokanalików mogą być dobrze kontrolowane. Ponadto pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) wysiane wewnątrz chipa wykazały, że komórki wyściełały wewnętrzną powierzchnię mikrokanałów pod kontrolowaną perfuzją trwającą przez okres od 4 dni do 2 tygodni.

Nasze podejście do wytwarzania sieci mikrokanałów o wielu głębokościach naśladuje złożoną geometrię 3D naczyń krwionośnych in vivo, w których mikrokanały mają zaokrąglone przekroje poprzeczne15. Dodatkowo średnice głównych kanałów rozgałęzionych oraz kanałów potomnych w przybliżeniu spełniają prawo Murraya, co pozwala utrzymać przepływ płynu na wymaganym poziomie, dzięki czemu całkowity opór kanałów jest niski, a prędkości przepływu są bardziej jednorodne w całej sieci16-18. Procesy i wynik...

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie chipa z mikrokanałami dla komórek endotelialnych o okrągłym przekroju i wielu głębokościach, który naśladuje geometrię 3D naczyń mikrokrwionośnych in vivo i pracuje w warunkach kontrolowanego, ciągłego przepływu perfuzyjnego. Zostaje to osiągnięte poprzez najpierw fotolitograficzne wykonanie formy matki z siecią mikrokanałów o półkolistym przekroju przy użyciu pozytywnego, przepływnego fotorezystu. Drugim krokiem jest wykorzystanie formy matki do powielenia dwóch mikrokanałów z polidimetylosiloksanu, ich wyrównanie i połączenie w celu utworzenia cylindrycznej sieci mikrokanałów.Następnie pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej są osadzane w sieci mikrokanałów przed hodowlą komórek w kontrolowanych warunkach ciągłej perfuzji medium przez okres od czterech dni do dwóch tygodni. Ostatecznie, wzdłuż wewnętrznej powierzchni sieci mikrokanałów rozwija się konfluencja monowarstwy komórkowej, wskazywana przez obecność błony i jąder komórkowych pod mikroskopem, co umożliwia obliczenie funkcjonalnych mikonaczyniń, które mogą stanowić platformę do badania złożonych zjawisk naczyniowych. Jednak konwencjonalne testy pojedynczych mikonaczyniń, takie jak testy migracji komórek, testy tworzenia rurek oraz testy pierścieni endotelialnych, mają ograniczone możliwości w odtwarzaniu pojedynczych mikonaczyniń pod kątem geometrii trójwymiarowej i kontroli ciągłego przepływu.Główną zaletą naszych technik, a konkretnie stosowanej przez nas metody mikrofabrykacji, jest możliwość konwencjonalnego wytwarzania wielopoziomowej sieci kanałów mikrofluidycznych, która naśladuje złożoną geometrię 3D naczyń mikrokrążenia in vivo o zaokrąglonych przekrojach poprzecznych. Pozwala ona również na projektowanie biomagnetycznych systemów mikronaczyniowych, które w przybliżeniu spowalniają i utrzymują przepływ cieczy na wymaganym poziomie, tak aby całkowity opór kanałów był niski, a uzyskany przepływ był bardziej jednolity w całej sieci; procedurę tę zaprezentuje doktorant z mojego laboratorium. Procedura ta rozpoczyna się od wykonania wzorca z fotorezystu, składającego się z mikrokanałów o średnicach od 30 µm do 60 µm, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym; w skrócie: przenieś fotorezyst reflow z lodówki o temperaturze 4 °C do pomieszczenia czystego na 24 godziny przed użyciem i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej.Zacznij od naniesienia metodą spin coatingu warstwy pozytywnego fotorezystu reflow na uprzednio oczyszczoną podłożze krzemowe, zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie naświetl fotorezyst światłem UV przez maskę z wzorem, a następnie wywołaj wzór mikrokanałów. Na koniec, po procesie reflow, utwórz sieć mikrokanałów o półkolistym przekroju poprzecznym.Po przygotowaniu formy matki, należy przygotować roztwór polidimetylosiloksanu (PDMS), zachowując stosunek wagowy bazy do utwardzacza wynoszący 10:1, a następnie dokładnie go wymieszać za pomocą planetarnej mieszadarki odśrodkowej. Roztwór PDMS należy wylać na formę matkę z przetopionym fotorezystem. Wylany PDMS należy umieścić w eksykatore na 15 minut w celu odgazowania.W razie potrzeby użyć gazu azotowego, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza. Wypiec PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez trzy godziny, aby umożliwić jego utwardzenie. Następnie oddzielić utwardzoną warstwę PDMS od formy matki.Za pomocą naostrzonego przebijaka wykonaj otwory wlotowe i wylotowe, przebijając sieć kanałów. Oczyść powierzchnię PDMS za pomocą gazu azotowego. Poddaj dwie warstwy PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 sekund w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przy ciśnieniu roboczym 45 milato i przepływie tlenu wynoszącym 3,5 cubic feet per minute.Następnie ręcznie wyrównaj powierzchnie PDMS pod mikroskopem optycznym. W razie potrzeby użyj kropli wody, aby uzyskać lepszą kontrolę nad procesem wyrównywania. Na koniec wypiecz urządzenie w piekarniku w temperaturze 60°C przez 30 minut, aby uzyskać trwałe połączenie warstw.Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej lub VE w pożywce hodowlanej z L-glutaminą, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej. Poddać urządzenie działaniu plazmy tlenowej przez pięć minut przy ciśnieniu roboczym 45 milit i przepływie tlenu wynoszącym 3,5 stóp sześciennych na minutę. Następnie wypełnić urządzenie wodą dejonizowaną i poddać działaniu światła UV przez osiem godzin w laminarnym dygestorium biologicznym w celu sterylizacji.Na jeden dzień przed przygotowaniem komórek należy przemyć urządzenie jednokrotnym roztworem fosforanowo-buforowanym (PBS), a następnie pokryć je fibronektyną. Inkubować w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji należy je zebrać, najpierw płucząc je roztworem buforu Hanksa, a następnie traktując trypsyną z EDTA po dodaniu trypsyny.Inkubować komórki od dwóch do sześciu minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trypsynizacji zneutralizować trypsynę z EDTA za pomocą roztworu neutralizującego trypsynę. Policzyć komórki, a następnie poddać je wirowaniu przed resuspensją.Zawieszenie w pożywce hodowlanej z 8% dekstryną służy do zwiększenia lepkości medium, co wspomaga lepsze osadzanie się i przywieranie komórek po powłoce FI enc ENC. Przemyć urządzenie raz roztworem XPBS, a następnie napełnić je pożywką hodowlaną przed inkubacją w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie do urządzenia nanosi się komórki w pożywce hodowlanej z 8% dekstryną w stężeniu od 3 do 4 milionów komórek na ml.Nanieś kroplę zawiesiny komórek o objętości 20 µL do jednego z wlotów urządzenia i przechyl je, aby wprowadzić komórki do kanału mikrofluidycznego. Po 15 do 20 minutach komórki zaczną przytwierdzić się do ścianek bocznych kanałów. Obracaj urządzenie co 15 minut, aby uzyskać bardziej jednorodny rozkład komórek.W razie potrzeby można przeprowadzić dodatkowe zasiewanie. Po pięciu do sześciu godzinach statycznej hodowli przytwierdzone komórki zaczną całkowicie się rozprzestrzeniać. Należy uruchomić długotrwałą perfuzję przy użyciu zdalnie sterowanego systemu pompy strzykawkowej ze stałym przepływem 10 µL/h; przepływ ten można dostosować do wyższej wartości, a perfuzja może trwać od czterech dni do dwóch tygodni.Gdy komórki osiągną konfluencję wewnątrz urządzenia, należy najpierw przemyć urządzenie raz XPBS w celu całkowitego usunięcia pożywki. Następnie należy wprowadzić do urządzenia rozcieńczony czerwony barwnik po inkubacji urządzenia w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przemyć urządzenie pożywką hodowlaną, aby przerwać barwienie.Długotrwała inkubacja barwnika może powodować toksyczność komórkową oraz odklejanie się komórek. Następnie należy załadować do urządzenia niebieski barwnik rozcieńczony w 1XPBS i inkubować w ciemności przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie dokładnie przemyć urządzenie 1XPBS. Barwienie komórek należy ocenić pod odwróconym mikroskopem optycznym.Jeśli barwienie przebiegło pomyślnie, należy wypełnić mikrokanały medium utrwalającym, a następnie zanurzyć urządzenie w medium utrwalającym i całkowicie owinąć je folią aluminiową. Urządzenie należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aby zapobiec jego wyschnięciu oraz odbarwieniu. Utrwalone urządzenie jest teraz gotowe do obrazowania konfokalnego, które można przeprowadzić za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii optycznej. Metody te zostały wykorzystane do charakterystyki fotorezystu po procesie reflow oraz replikowanego kanału PDMS przed i po przebiegu procesu reflow.Wykazano i scharakteryzowano cechy geometryczne sieci mikrokanałów z PDMS. Przekroje poprzeczne form z PDMS o kształcie koła obrazują wymiary kanałów na każdym poziomie rozgałęzień. Wyniki wskazują, że technika przepływu fotorezystu pozwala w bardziej dogodny sposób tworzyć sieci kanałów z rozgałęzieniami o wielu głębokościach, co umożliwia projektowanie biomimetycznych systemów mikronaczyniowych w przybliżeniu zgodnych z prawem Murraya; przedstawione tutaj obrazy mikroskopowe wykonano z użyciem czerwonego barwnika do błon komórkowych oraz niebieskiego barwnika do jąder komórkowych.Przekroje poprzeczne w rzucie kołowym wykazały, że VE wyściela wewnętrzną powierzchnię sieci cylindrycznych mikrokanałów w różnych regionach rozgałęzień. Ze względu na złożoną geometrię mikrokrążenia in vivo, monitorowanie tych małych naczyń w czasie rzeczywistym jest trudne. Opracowany chip oparty na PDMS oferuje dobre właściwości optyczne i umożliwia wysokiej jakości obrazowanie mikrokanałów śródbłonkowych w czasie rzeczywistym, co pokazano na tym filmie konfokalnym przedstawiającym wyścielkę komórkową wzdłuż kołowej sieci kanałów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób wykonania przepływu dla tego trybu masowego. Utwórz sieć mikrokanałów PDMS o okrągłym przekroju poprzecznym, wprowadź komórki śródbłonka do urządzeń i skonfiguruj długoterminową perfuzję pożywki. Podsumowując, opracowane zserializowane mikrokanały śródbłonkowe na chipie zapewniają szybkie i powtarzalne podejście do tworzenia wielopoziomowych sieci mikrokanałów o okrągłym przekroju poprzecznym, które naśladują geometrię mikro naczyń InVivo.Niniejsza procedura ilustruje wykorzystanie unikalnych możliwości w zaawansowanej mikrowytwarzalności oraz technologiach mikroprzepływowych do stworzenia modelu naczyniowego z długoterminową, ciągłą kontrolą perfuzji, a także wysokiej jakości obrazowaniem w czasie rzeczywistym, co podkreśla rosnącą użyteczność kanałów mikroprzepływowych w biologii komórki, inżynierii tkankowej i zastosowaniach bioinżynieryjnych. Układ z szeregowo połączonych mikrokanałów endotelialnych na chipie stanowi potencjalny model do badań nad naczyniami włosowatymi.

procedure-for-development-multi-depth-circular-cross-sectional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Procedura rozwoju wielowarstwowymi mikrokанаłów z endotelialnymi ściankami na chipie o okrężnym przekroju poprzecznym

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Dostępnych jest kilka metod wytwarzania kanałów o przekrojach nieprostokątnych osadzonych w urządzeniach mikroprzepływowych z polidimetylosiloksanu. Większość z nich wiąże się z wieloetapową produkcją i rozległym wyrównaniem. W artykule przedstawiono jednoetapowe podejście do wytwarzania kanałów mikroprzepływowych o różnych przekrojach geometrycznych za pomocą sekwencyjnego trawienia na mokro polidimetylosiloksanu.

Jednoetapowe podejście do wytwarzania kanałów mikroprzepływowych z polidimetylosiloksanu o różnych przekrojach geometrycznych za pomocą sekwencyjnych procesów trawienia na mokro

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Poznaj metodę tworzenia mikrokanałów na chipie z komórkami śródbłonkowymi HUVEC, która naśladuje trójwymiarową geometrię naczyń mikrokrwionośnych in vivo. Technika umożliwia kontrolowaną perfuzję i wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Przeglądaj więcej filmów