On-Chip Śródbłonkowe fenotypowanie zapalne

Celem tego filmu jest zademonstrowanie laboratorium na technice chipowej do charakteryzowania stanu zapalnego komórek śródbłonka. Na początek ludzkie komórki śródbłonka aorty są hodowane do zbiegu na podłożu do hodowli tkankowej, a następnie umieszczane w urządzeniu do ścinania płytki Conan. Komórki są traktowane cytokiną prozapalną, TNF alfa, i jednocześnie wystawione na warunki zróżnicowanego naprężenia ścinającego przez cztery godziny poprzez precyzyjną kontrolę obrotu stożka nad substratem naprężenie ścinające moduluje dobrze scharakteryzowaną odpowiedź zapalną na cytokinę.

Obejmuje to regulację w górę cząsteczek adhezyjnych, takich jak VCA i ICAM. Podłoże jest przenoszone do stolika mikroskopowego, gdzie urządzenie mikroprzepływowe A-P-D-M-S jest uszczelniane próżniowo bezpośrednio do monowarstwy, tworząc kanały przepływowe. Aktywowane monocyty, THP one komórki są przenoszone nad wstępnie uwarunkowanym hs, gdzie wiążą się proporcjonalnie do poziomu adhezji komórki Ekspresja cząsteczki.

Stan zapalny śródbłonka określa się poprzez ilościowe określenie całkowitej liczby komórek THP jeden, które są mocno zatrzymane. Cześć, nazywam się D Diverse i nazywam się Greg Foster. A ja nazywam się Keith Bailey.

Jesteśmy w laboratoriach profesorów, pastora i Simona na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis. Dzisiaj opiszemy zastosowanie podejścia laboratoryjnego opartego na chipie do ilościowego badania dysfunkcji śródbłonka i stanu zapalnego. Narzędzia te stanowią dla nas platformę do prowadzenia badań związanych z superpozycją stresu metabolicznego czynnikami hydrodynamicznymi oraz regulacją fenotypu zapalnego śródbłonka i podatności na miażdżycę.

Dlatego nasze urządzenia nazywamy komorami mimetycznymi naczyniowymi, mikroprzepływowymi lub vmmc. Urządzenia te pozwalają nam określić ilościowo wyniki zapalne w komórkach śródbłonka i monocytach w warunkach, które naśladują te w naczyniach miażdżycowych. VMMC ułatwia stosowanie niewielkich ilości odczynników lub materiałów, których podaż może być ograniczona.

Mogą być również konstruowane w wielu konfigurowalnych układach i geometriach, dzięki czemu doskonale nadają się do szerokiego zakresu zastosowań. Dzisiaj zademonstrujemy reprezentatywny eksperyment z wykorzystaniem naszego laboratorium w oparciu o podejście chipowe. Monowarstwy ludzkiego śródbłonka będą narażone na aktywację cytokin pod wpływem dobrze zdefiniowanych naprężeń ścinających.

Zademonstrujemy zastosowanie VMC do ilościowego określenia rekrutacji ludzkich komórek monocytowych do monowarstwy w czasie rzeczywistym jako funkcjonalny odczyt aktywacji śródbłonka za pomocą tokarki: trzycalowe okrągłe podłoża są mielone ze 100-milimetrowych naczyń do hodowli tkankowych. Trzycalowe podłoża myje się wodą destylowaną, a następnie sterylizuje przez namoczenie w 70% etanolu. Sterylne podłoża umieszcza się na 100-milimetrowych szalkach Petriego i pozostawia do wyschnięcia.

Następnie inkubuje się je z kolagenem typu pierwszego w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr przez godzinę w temperaturze pokojowej i myje PBS. Ludzkie komórki śródbłonka aorty lub HA są zawieszone w stężeniu 650 000 komórek na mililitr. Jeden mililitr zawiesiny komórkowej umieszcza się w kropelkach na wysuszonym podłożu pokrytym kolagenem i rozprowadza w równomiernej zawiesinie.

Osadzone substraty są następnie umieszczane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni 5% CO2 i pozostawiane do przyczepienia się do powierzchni podłoża. Po jednej godzinie dodaje się dziewięć mililitrów wzrostu E GM dwa, pożywkę i komórki pozwalają rosnąć w monowarstwy przy płynności około 90% Co, monowarstwy są gotowe do użycia w kolejnych eksperymentach przezroczystych. Naczyniowe mimetyczne komory mikroprzepływowe są konstruowane przez wylanie formy A-P-D-M-S na główną formę zawierającą pożądany kanał. Geometria.

Bazę silikonową wlewa się do plastikowej łodzi, a następnie utwardza się silikonowy środek utwardzający w stosunku wagowym 10 do jednego. Żel PDMS jest następnie dobrze wymieszany, uważając, aby nie zeskrobać boków łodzi, a tym samym nie wprowadzić do mieszanki plastikowych wiórów. Wzorce fotorezystu są czyszczone heksanem i przygotowywane do formowania VMMC.

Mieszaninę PDMS wylewa się następnie na formę główną, a następnie umieszcza w komorze próżniowej. W komorze. Powietrze jest usuwane z mieszaniny PDMS i unosi się na powierzchnię po 15 minutach.

Forma jest wyjmowana z komory, a powietrze jest delikatnie wdmuchiwane na powierzchnię PDMS, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza z formy. Forma jest następnie przykrywana i umieszczana w piekarniku o temperaturze 37 stopni na godzinę, gdzie PMS może się utwardzić. Wyjmij zestalony żel PDMS z piekarnika i wykonaj okrągłe nacięcia wokół komory za pomocą małego skalpela.

Ważne jest, aby robić to stopniowo, aby uniknąć kontaktu z materiałem fotorezystancyjnym, ponieważ spowoduje to uszkodzenie formy wzorcowej. Wytnij komorę mikroprzepływową z otworów wlotowych i wylotowych stempla formy dla każdego kanału za pomocą igły blokującej przynętę o rozmiarze 19. Dodatkowo przebij otwory na rury próżniowe z dala od kanałów.

Przygotowania do VMMC zostały zakończone. Pipetować prozapalną cytokinę TNF alfa do sześciu mililitrów pożywki L 15, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 nanograma na mililitr. Media L 15 są tutaj wykorzystywane jako płyn ścinający ze względu na jego zdolność buforową pH przy braku 5% CO2.

Pożywka jest następnie pobierana do sterylnej 10-mililitrowej strzykawki, która służy do ładowania urządzenia do ścinania. Monowarstwa Confluent jest następnie przenoszona do urządzenia do ścinania komórek, które zostało wysterylizowane za pomocą wypoziomowanego etanolu i ustawiono wysokość szczeliny stożka. Substrat jest usuwany z płytki Petriego i umieszczany na szklanym bloku wzorcowym, wyśrodkowany i ostrożnie włożony na dno komory obudowy, tak aby stożek znajdował się bezpośrednio nad komórkami.

Podłoże jest zabezpieczone poprzez równomierne dokręcenie ze stali nierdzewnej wokół bloku manometru. Środek ścinający jest następnie ładowany do komory, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Następnie komputer jest wykorzystywany do wprowadzenia żądanego programu naprężeń ścinających i włączany jest mikro oddzielny silnik.

Tutaj wykorzystujemy ścinanie oscylacyjne wynoszące zero plus minus pięć dinów na centymetr kwadratowy. Po czterech godzinach program ścinania zostaje zatrzymany. Blok wzorcowy jest usuwany, a substrat jest ostrożnie umieszczany z powrotem na szalce Petriego.

Komórki są teraz gotowe do testu adhezji monocytów. Bezpośrednio po ścinaniu monowarstwy kwasu hialuronowego są transportowane do stacji mikroskopowej w celu montażu VMMC. VMMC jest przymocowany do węża podciśnieniowego i zanurzony w wodzie DI w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza uwięzionych w kanałach.

Gdy zawór podciśnieniowy jest początkowo zdjęty, komora jest ostrożnie dociskana do wierzchu monowarstwy i włącza się zawór próżniowy. Bardzo ważne jest przy tym upewnienie się, że w kanałach komory nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Teraz 80 mikrolitrów HBSS z wapniem i magnezem pipetuje się do zbiornika wykonanego z odcięcia końcówki przynęty o rozmiarze 19 Płyn igłowy Lock jest wypychany z końcówki poprzez mocne naciśnięcie górnej części zbiornika, który jest następnie wkładany do portu wlotowego VMMC.

Cały zespół umieszcza się na stoliku mikroskopu, a kamera mikroskopu i monitor wideo są włączane. Szklana strzykawka o pojemności 10 mililitrów jest ładowana na pompę strzykawkową. Następnie rurka strzykawki jest podłączana do portu wylotowego VMMC.

Natężenie przepływu jest ustawione tak, aby wywołać czyste naprężenie jednego dine na centymetr kwadratowy w kanale, a następnie działać w trybie napełniania, tak aby strzykawka wyciągała płyn ze zbiornika przez kanał. Komórki P jeden stymulowane SDF one są zawieszone w stężeniu 2 milionów komórek na mililitr. W ciągu dwóch minut od aktywacji przepływu do zbiornika dodaje się 50 mikrolitrów zawiesiny komórek.

Ponownie, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza po pełnym rozwinięciu przepływu. Wideo jest rejestrowane z prędkością trzech klatek na sekundę, a dane są wyliczane za pomocą oprogramowania Image J. Przylegająca. Jednokomórkowe THP definiuje się jako poruszające się nie więcej niż o połowę średnicy komórki w ciągu 10 sekund.

Tutaj pokazujemy dane przedstawiające jedną adhezję THP do monowarstw ha stymulowanych TNF alfa i kondycjonowanych pod stałym wysokim naprężeniem ścinającym ścianki wynoszącym 15 dines na centymetr kwadratowy lub oscylacyjnym naprężeniem ścinającym wynoszącym zero plus lub minus pięć dinów na centymetr kwadratowy monowarstwy ha kondycjonowane oscylacyjnym naprężeniem ścinającym wykazywały trzykrotnie większą rekrutację TP do jednej komórki w porównaniu z monowarstwami, które doświadczyły dużego naprężenia ścinającego. Dzisiaj demonstrujemy zastosowanie konfigurowalnych technik in vitro, które można łączyć, aby uzyskać ważny wgląd we wczesne zdarzenia zapalne leżące u podstaw miażdżycy. W szczególności określamy ilościowo wyniki związane z dysfunkcją śródbłonka i komórkami narażonymi na bodźce zapalne w dobrze zdefiniowanych warunkach hydrodynamicznych.

Zastosowanie VMM CS pozwala na zbadanie specyficznych mechanizmów leżących u podstaw interakcji adhezyjnych śródbłonka i leukocytów. Urządzenia te mają również tę zaletę, że są elastyczne i niedrogie oraz ułatwiają korzystanie z materiałów, których podaż może być ograniczona, takich jak składniki surowicy pochodzące od ludzi. Nasze badania z zastosowaniem tych urządzeń obejmowały badania nad stanem zapalnym wywołanym cytokinami, lipidami i wściekłością w komórkach śródbłonka.

Opracowaliśmy również testy on-chip badające mechanizmy adhezji w wielu typach leukocytów, a także we krwi pełnej. Ostatecznie przewidujemy, że ta technologia doprowadzi do podejść ex vivo do oceny indywidualnego ryzyka chorób sercowo-naczyniowych związanych ze stanem zapalnym.