Name: On-Chip Śródbłonkowe fenotypowanie zapalne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-21T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj technikę lab-on-a-chip do fenotypowania zapalnego komórek śródbłonkowych przy użyciu mikroprzepływowych komór z przepływowymi. Metoda ta pozwala badać wpływ naprężenia ścinającego na adhezję komórek monocytowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant NIH/NHLBI R01 HL082689 przyznany Scottowi I. Simonowi i Anthony'emu G. Passerini.

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie podłoża
 <ol>
 <li>Za pomocą tokarki wyciąć okrągłe podłoża o średnicy 3 cali z naczynia do hodowli tkankowej 100 x 20 mm (BD Falcon). Podłoża wysterylizować poprzez zanurzenie w 70% etanolu. Umieścić w czarce Petriego i pokryć 4 ml kolagenu typu I (100 μg/ml) przez 1 hr w temperaturze pokojowej, a następnie przepłukać 4 ml 1 x PBS. </li>
 <li>Resuspendować ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAEC, pasaż 4-6) w stężeniu 6,5x105 komórek/ml i wysiać, nakładając 1 ml bezpośrednio na podłoże. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozwolić komórkom przytwierdzić się do podłoża przez 1 hr. </li>
 <li>Do komórek dodać 9 ml pożywki Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) uzupełnionej o 1x roztwór antybiotyk-antymykotyk. Wymieniać pożywkę co 2 dni, aż komórki osiągną 90% konfluencji. </li>
 <li>Hodować komórki THP-1 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS i 1x roztwór antybiotyk-antymykotyk. Pasażować komórki po osiągnięciu gęstości 106 komórek/ml. </li>
</ol>
2. Protokół ścinania komórek
Komórki są warunkowane w specjalistycznym urządzeniu do ścinania komórek (CSD) typu stożek i płyta. Szczegóły dotyczące urządzenia oraz specyfikacje projektowe zostały przedstawione w Tabeli 1 i na Rysunku 4.
<ol>
 <li>Przygotować CSD. Zdezynfekować komorę obudowy etanolem i wypłukać sterylnym PBS. Podgrzać obudowę do 37 °C i wypoziomować, aby upewnić się, że stożek jest prostopadły do monowarstwy komórek. Złożyć podłoże z komórkami w dolnej części obudowy i ustawić stożek na pożądanej wysokości.</li>
 <li>Jako medium do ścinania zastosować medium Leibovitz-15 (L-15) uzupełnione o Endothelial BulletKit, aby utrzymać odpowiednie pH w warunkach braku CO2. W celu stymulacji stanu zapalnego dodać czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α, 0.5 ng/ml) do medium do ścinania i wstrzyknąć 6 ml do urządzenia za pomocą strzykawki podłączonej do portu wlotowego, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do komory.</li>
 <li>Poddać komórki działaniu wysokiego stałego naprężenia ścinającego (HSS, 15 dyne/cm2) lub oscylacyjnego naprężenia ścinającego (OSS, 0 ± 5 dyne/cm2, 1 Hz) przez 4 hr. Pożądane SS uzyskuje się poprzez obracanie stożka nad komórkami, co jest precyzyjnie kontrolowane za pomocą silnika krokowego, zgodnie z wcześniejszym opisem.6 Przybliżone naprężenie ścinające ścianki na powierzchni (τw) oblicza się według wzoru:
 
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Wzór dynamiki płynów: τw = μω/α, równanie reprezentujące naprężenie ścinające w systemie przepływu płynu" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
 
gdzie μ to lepkość medium, ω to prędkość kątowa stożka, a α to kąt stożka (0.5°). Wyśrodkowanie stożka względem podłoża jest regulowane z dokładnością do 0.05° poprzez precyzyjne poziomowanie, a wysokość szczeliny ustawia się na 20 ± 10 μm za pomocą głębokościomierza, aby zminimalizować obwodowe i radialne wariacje τw. Urządzenie zostało zwalidowane w celu zapewnienia charakterystyk przepływu laminarnego. Wyjąć komórki z urządzenia i przygotować do analizy adhezji monocytów.</li>
</ol>
3. Wykonanie mikrofluidycznej komory z PDMS
<ol>
 <li>Należy uzyskać formę główną (master mold) dla pożądanej liczby kanałów mikroprzepływowych oraz wysokości kanału, zależnie od zastosowania. Charakterystyka konkretnego projektu użytego w tym protokole została szczegółowo opisana w Tabeli 1. Metoda ich tworzenia jest już dobrze udokumentowana w literaturze.1 W skrócie, sieć kanałów jest projektowana przy użyciu oprogramowania CAD (Autodesk Inventor) i drukowana w rozdzielczości 5000 dpi na folii przezroczystej. Negatywny fotorezst (SU8) jest nanoszony metodą spin-coatingu na wafelek krzemowy do uzyskania grubości 100 μm. Następnie nakłada się folię i poddaje na działanie światła UV. Nie spolimeryzowany fotorezst jest usuwany, aby uzyskać pozytywową formę główną. </li>
 <li>Aby przygotować roztwór PDMS, należy wymieszać bazę silikonową z utwardzaczem silikonowym w stosunku masowym 10:1 w naczyniu wagowym i wymieszać za pomocą pipety serologicznej o objętości 5 ml. Należy uważać, aby nie zeskrobać ścianek naczynia wagowego, aby uniknąć dodania plastikowych opiłków do roztworu.</li>
 <li>Wafelek z formą główną należy umieścić w szalce Petriego o wymiarach 100x15mm i wlać do niej roztwór PDMS.</li>
 <li>Szalce należy przykryć i umieścić w komorze próżniowej na 15 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Po 15 minutach należy wyjąć szalkę Petriego i usunąć pozostałe pęcherzyki, delikatnie dmuchając w powierzchnię.</li>
 <li>Szalkę Petriego należy umieścić w piekarniku na 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Po wyjęciu szalki należy wyciąć komory mikroprzepływowe za pomocą ostrego ostrza.</li>
</ol>
4. Montaż urządzenia na mikroskopie
<ol>
 <li>Włącz źródło światła mikroskopu odwróconego i ustaw grzejnik na 37 °C. Podłącz rurkę do strzykawki o pojemności 10 ml i napełnij ją wodą destylowaną w taki sposób, aby nie było pęcherzyków powietrza. Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw szybkość przepływu tak, aby wywołać naprężenie ścinające (SS) na ściankach równe 1 dyne/cm2. Naprężenie ścinające na ściance (τw) generowane wzdłuż linii środkowej kanału jest przybliżane przy użyciu standardowego równania dla komory przepływowej z równoległymi płytami: 
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Równanie naprężenia ścinającego τw=6μQ/h²w; formuła dynamiki płynów; zastosowanie edukacyjne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
gdzie μ to lepkość medium, Q to objętościowa szybkość przepływu, h to wysokość kanału, a w to szerokość kanału. Uwaga: ponieważ kanały mają skończoną szerokość, rzeczywiste τw będzie różnić się wraz z w w zależności od proporcji kanału, a pomiarów nie wykonuje się w obszarze 25% najbliższym ściankom bocznym.1,7</li>
 <li>Umieść komorę PDMS w wodzie i użyj mikropipety 100μl, aby usunąć powietrze z poszczególnych kanałów. Podłącz adapter próżniowy do komory, upewniając się, że zawór jest ustawiony w pozycji wyłączonej.</li>
 <li>Umieść szalkę Petriego z monowarstwą HAEC nad obiektywem. Umieść komorę PDMS nad szalką Petriego i ostrożnie ustaw ją na monowarstwie HAEC, upewniając się, że między urządzeniem a monowarstwą nie powstały pęcherzyki powietrza. Przekręć zawór tak, aby włączyć próżnię i stabilnie przymocować komorę.</li>
 <li>Odetnij tępym narzędziem igły 19G w taki sposób, aby pozostało tylko 5 mm metalu. Napełnij plastikowy zbiornik buforem i umieść go w wejściu komory PDMS. Powtórz czynność dla odpowiedniej liczby użytych kanałów. Podłącz rurki z pomp strzykawkowych do wyjść kanałów PDMS.</li>
</ol>
5. Analiza adhezji monocytów w warunkach naprężenia ścinającego
<ol>
 <li>Resuspendować komórki THP-1 w stężeniu 2x106 komórek/ml w HBSS + Ca2+/Mg2+ + 0,1% HSA. Aktywować komórki THP-1 poprzez inkubację z czynnikiem pochodzenia zialnego-1 (SDF-1, 50 μg/ml) przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Włączyć pompę strzykawkową w celu ustanowienia przepływu, a następnie dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do zbiornika, unikając wprowadzenia pęcherzyków powietrza. Po pełnym ustabilizowaniu przepływu rozpocząć akwizycję danych.</li>
 <li>Prowadzić pomiar przez 5 min przy odpowiedniej prędkości przepływu, dodając bufor do zbiornika w przypadku niskiego poziomu roztworu. Kontynuować przepływ buforu przez kanały, aby wypłukać wszelkie niezwiązane komórki ze strumienia przepływu.</li>
</ol>
6. Pozyskiwanie i analiza danych
<ol>
 <li>Należy zarejestrować sekwencje obrazów cyfrowych z częstotliwością 3 klatek/s przez 2 min po pełnym rozwinięciu przepływu wzdłuż osi podłużnej kanału w 3 lokalizacjach, dbając o to, aby nie nagrywać bezpośrednio za portami wlotowymi lub przed portami wylotowymi oraz w obszarze 25% najbliższym ściankom bocznym.</li>
 <li>Należy policzyć liczbę zatrzymanych komórek na pole widzenia, identyfikując ich jasny wygląd w fazie w tej samej płaszczyźnie ogniskowania co monowarstwa.</li>
 <li>Stabilne zatrzymanie komórek definiuje się jako ruch &lt; ½ średnicy komórki w 10 s. Dane należy uśrednić dla 3 losowych pól na kanał i ilościowo ocenić przy użyciu oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Chociaż śródbłonek naczyniowy jest jednolicie narażony na agonistów przyczyniających się do systemowego stanu zapalnego, miażdżyca jest chorobą ogniskową, która rozwija się preferencyjnie w miejscach zaburzeń przepływu w tętnicach, co wskazuje na heterogeniczność przestrzenną funkcji śródbłonka.8 Krążące mediatory zapalne, takie jak TNF-α, są podwyższone w surowicy ludzkiej w warunkach stresu metabolicznego i korelują z upośledzeniem funkcji śródbłonka.9, 10 TNF-α indukuje w komórkach śródbłonka (EC) dobrze opisaną odpowiedź, obejmującą zwiększoną ekspresję cząsteczek adhezyjnych (CAM; np. VCAM-1, ICAM-1, E-selektyna) oraz chemokin rekrutujących monocyty z krwiobiegu, co jest cechą charakterystyczną wczesnych zmian miażdżycowych.11 Hemodynamika jest ważnym regulatorem zapalnego fenotypu śródbłonka.12 Wysokie naprężenie ścinające (HSS; np. 15 dynes/cm2) lub pulsacyjne naprężenie ścinające (PSS; np. 15 ± 5 dynes/cm2), występujące w miejscach tętnic odpornych na miażdżycę, hamują odpowiedzi indukowane przez TNF-α. Przeciwnie, niskie naprężenie ścinające (LSS; np. 2 dynes/cm2) lub przepływ oscylacyjny (OSS; np. 0 ± 5 dynes/cm2), charakterystyczne dla miejsc podatnych in vivo, nasilają zapalenie indukowane cytokinami.13, 14 Nasze mikrofluidalne urządzenia z PDMS stanowią platformę do prowadzenia badań mechanistycznych w celu weryfikacji hipotez dotyczących nałożenia się stresu metabolicznego i czynników hydrodynamicznych w regulacji funkcji i patologii śródbłonka. Przydatność i wszechstronność tego podejścia zostały szeroko zilustrowane za pomocą poniższych reprezentatywnych wyników.
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Analiza adhezji komórek THP-1, obrazy kultur komórkowych, wykres słupkowy porównujący HSS i OSS z wartością p = 0,023." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Naprężenie ścinające różnie moduluje adhezję komórek THP-1 do warstw endotelialnych stanu zapalnego indukowanego TNF-α. Dane te uzyskano zgodnie ze szczegółowym protokołem opisanym powyżej i udokumentowanym w filmie. Monowarstwy HAEC poddano jednoczesnemu działaniu niskiej dawki cytokiny zapalnej TNF-α (0,5 ng/ml, ~EC50 dla upregulacji VCAM-1) oraz albo HSS (15 dynes/cm2), albo OSS (0 ± 5 dynes/cm2, 1 Hz) w specjalnie zaprojektowanym urządzeniu CSD przez 4 h, zgodnie z opisem w szczegółowym protokole. Adhezję komórek THP-1 określono w warunkach przepływu ścinającego w komorze przepływowej PDMS. Wybrano tę linię komórkową, która naśladuje fenotyp ludzkich monocytów, ze względu na jej powtarzalność i łatwość w obsłudze. HSS osłabiło odpowiedź zapalną w porównaniu z OSS, co doprowadziło do zmniejszenia adhezji komórek THP-1. Dane analizowano za pomocą testu t Studenta i przedstawiono jako średnia ± SEM z 3 niezależnych eksperymentów. Zaadaptowano za zgodą DeVerse i wsp.5
Poniższe dane demonstrują wszechstronność naszego podejścia na przykładach z naszych opublikowanych prac. W stosownych przypadkach wskazano odstępstwa od powyższego protokołu.
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Wpływ naprężenia ścinającego na ekspresję VCAM-1 w układzie mikrokanałowym; wykresy przedstawiają dane dotyczące odpowiedzi na naprężenie." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Modulacja indukowanej cytokinami ekspresji VCAM-1 i rekrutacji monocytów w gradiencie naprężenia ścinającego. A) Monowarstwy HAEC stymulowano TNF-α (0.3 ng/ml) przez 4 hr w warunkach przepływu w VMMC zaprojektowanym w oparciu o teorię przepływu Hele-Shaw.15 Liniowy spadek wartości SS wzdłuż linii środkowej kanału osiągnięto poprzez zaprojektowanie ścian bocznych komory tak, aby pokrywały się z liniami prądu dwuwymiarowego przepływu stagnacyjnego, oraz ukształtowanie końca kanału zgodnie z liniami izopotencjalnymi. Naprężenie ścinające przy ściance (τw) generowane wzdłuż linii środkowej tego kanału w odległości osiowej od wlotu (x) opisuje wzór: 
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Równanie dynamiki płynów; wzór na naprężenie ścinające przy ściance; analiza naukowa; τw=6μQ/h²w₁(1-x/L); równanie." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 

gdzie μ to lepkość ośrodka, Q to objętościowe natężenie przepływu, h to wysokość kanału, w1 to szerokość wlotu kanału, a L to całkowita długość kanału. Wartość Q dobrano tak, aby wytworzyć gradient wartości SS od 16 dynes/cm2 na wlocie do 0 w punkcie stagnacji „a” tuż przed wylotem. B)-C) Ekspresję VCAM-1 zmierzono in situ za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej z użyciem przeciwciał sprzężonych z kropkami kwantowymi; wyniki przedstawiono jako procent mediany intensywności fluorescencji (MFI) w stosunku do niepobudzonej kontroli statycznej. SS nie modulowało podstawowego poziomu VCAM-1, który jest niski w niepobudzonych HAEC (szare trójkąty). Jednak ekspresja VCAM-1 wzrosła w stosunku do TNF-α przy wartościach LSS, osiągając szczyt przy ~2 dynes/cm2 i powracając do poziomu bazowego TNF-α lub poniżej przy wartościach ścinania &gt; 5 dynes/cm2 (czarne kwadraty). D) Monocyty (106/ml) perfundowano przy 2 dynes/cm2 przez 5 min w kanałach o przepływie równoległym nad monowarstwami poddanymi warunkowaniu zgodnie z opisem w A). Rekrutacja monocytów do śródbłonka korelowała ilościowo z ekspresją VCAM-1 przy danej wartości naprężenia ścinającego. Co istotne, możliwość badania ekspresji VCAM-1 i rekrutacji monocytów z wysoką rozdzielczością przestrzenną w monowarstwie ujawniła znaczące zmiany w wąskim zakresie wartości SS, których nie zauważono by, stosując jedynie kilka dyskretnych wartości ścinania w oddzielnych eksperymentach. Dane analizowano za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a różnice oceniano testem post-hoc Newmana-Keulsa, *P &lt; 0.05 względem TNF-α w warunkach statycznych. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z 3-6 niezależnych eksperymentów. Zaadaptowano za zgodą Tsou i wsp.2
<img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Wykres i histogram zależności zatrzymania monocytów od ekspresji VCAM-1; analiza wpływu TNFα, dane statystyczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Lipoproteiny bogate w trójglicerydy (TGRL) modulują indukowany cytokinami stan zapalny proporcjonalnie do poziomu trójglicerydów w surowicy dawcy i ekspresji VCAM-1. Monowarstwy HAEC stymulowano TNF-α (0,3 ng/ml) przez 4 h jednocześnie z TGRL (10 mg/dl ApoB) wyizolowanymi od ludzi po posiłku wysokotłuszczowym w kulturze statycznej. A) Ekspresję VCAM-1 mierzono osobno w zawiesinie EC za pomocą cytometrii przepływowej, a adhezję monocytów określono przy użyciu VMMC zgodnie z opisem w szczegółowym protokole. Dane przedstawiono jako % zmiany względem TNF-α. Zatrzymanie monocytów zmieniało się w proporcji bezpośredniej do śródbłonkowej ekspresji VCAM-1, która wzrastała bezpośrednio wraz z poziomem trójglicerydów w surowicy dawcy. B) Zatrzymanie monocytów dla podgrupy dawców prozapalnych zostało zniesione w obecności przeciwciała blokującego VCAM-1. Istotność określono za pomocą sparowanego testu t Studenta, średnie ± SEM z 3–5 niezależnych eksperymentów. Za adaptacją z uprawnieniem od Wang i wsp.4

<ol><li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li>
<li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li>
<li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li>
<li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li>
<li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li>
<li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endothelial+phenotypes+evoked+by+arterial+waveforms+derived+from+atherosclerosis-susceptible+and+-resistant+regions+of+human+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).</li>
<li>Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+adhesion+of+vascular+and+valvular+endothelial+cells+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).</li>
<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+associated+with+regional+athero-susceptibility+and+adaptation+to+disturbed+blood+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo.</a> Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).</li>
<li>Burdge, G. C., Calder, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cytokine+response+during+the+postprandial+period%3A+A+potential+causal+process+in+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease.</a> Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).</li>
<li>Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li>
<li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+shear+stress+and+atherosclerosis%3A+A+matter+of+site+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li>
<li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li>
<li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li>
<li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li>
<li>Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+cytoskeletal+mechanics+by+hemodynamic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces.</a> Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).</li>
<li>Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd11c%2Fcd18+expression+is+upregulated+on+blood+monocytes+during+hypertriglyceridemia+and+enhances+adhesion+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).</li>
<li>Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+cd11c%2B+monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li>
<li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy zastosowanie mikrofluidycznych urządzeń z PDMS do oceny fenotypu zapalnego śródbłonka na chipie poprzez obrazowanie w czasie rzeczywistym ekspresji CAM oraz adhezji monocytów. Główną zaletą naszego podejścia jest możliwość ilościowego określenia wyników związanych z dysfunkcją śródbłonka w komórkach wystawionych na działanie mediatorów zapalnych, takich jak lipidy dietetyczne i cytokiny, w określonych warunkach hydrodynamicznych odzwierciedlających naprężenie ścinające w naczyniach aterogennych. VMMC umożliwiaj...

<table><tbody><tr><td>Szalki Petri 100 x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td>EMD Chemicals</td><td>EX0290-1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I wyizolowany z ogona szczura</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka aorty</td><td>Genlantis</td><td>PH30405A</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe dla komórek śródbłonka-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Przewody poliuretanowe</td><td>Tygon</td><td>ABW0001</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Leibovitz-15</td><td>Gibco</td><td>11415-069</td><td></td></tr><tr><td>Baza elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Utwardzacz elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Matryca z fotorezystu SU8</td><td>Laboratorium Pan na UC Davis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Eclipse TE200</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE200</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD2000</td><td></td></tr><tr><td>igła podskórna 19G</td><td>Kendall</td><td>8881</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa monocytów THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (roztwór soli buforowej Hanksa) z Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; </td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>czynnik martwiczy nowotworów alfa (TNF-&amp;alpha;)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>210-TA-010</td><td></td></tr><tr><td>czynnik pochodzenia komórek macierzystych 1 (SDF-1)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy ludzkiej (HSA)</td><td>ZLB Behring</td><td>NDC 0053-7680-32</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać treść źródłową do przetłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Aterogeneza jest potęgowana przez nieprawidłowości metaboliczne, które przyczyniają się do wzmocnienia stanu systemowego zapalenia, prowadząc do dysfunkcji śródbłonka. Jednak wczesne zmiany funkcjonalne w śródbłonku, które wskazują na poziom ryzyka u danej osoby, nie są bezpośrednio oceniane klinicznie w celu pomocy w wyborze strategii terapeutycznej. Co więcej, regulacja stanu zapalnego przez lokalną hemodynamikę przyczynia się do nierównomiernego przestrzennie rozkładu miażdżycy, jednak mechanizmy te są trudne do określenia in vivo. Opisujemy podejście oparte na technologii lab-on-a-chip do ilościowego badania zaburzeń metabolicznych zdarzeń zapalnych w ludzkich komórkach śródbłonka (EC) i monocytach w precyzyjnie określonych warunkach przepływu. Standardowe metody litografii miękkiej są wykorzystywane do mikrofabrykacji mikrofluidycznych komór naśladujących naczynia (VMMC), które są wiązane bezpośrednio z hodowanymi monowarstwami EC.1 Urządzenia te mają tę zaletę, że wykorzystują małe objętości odczynników, zapewniając jednocześnie platformę do bezpośredniego obrazowania zdarzeń zapalnych w błonie EC narażonej na dobrze zdefiniowane pole ścinania. Z powodzeniem zastosowaliśmy te urządzenia do badania zapaleń indukowanych cytokinami,2 lipidami3, 4 oraz białkiem RAGE5 w ludzkich komórkach śródbłonka aorty (HAEC). W niniejszej pracy dokumentujemy zastosowanie VMMC do badania toczenia i zatrzymywania się komórek monocytarnych (THP-1) na monowarstwach HAEC, które są poddawane różnym charakterystykom ścinania i aktywowane zapalną cytokiną TNF-α. Badania tego typu dostarczają wglądu w mechanizmy podatności na miażdżycę w obecności metabolicznych czynników ryzyka.

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Aterogeneza jest potęgowana przez zaburzenia metaboliczne, które przyczyniają się do nasilenia stanu systemowego stanu zapalnego, prowadzącego do uszkodzenia śródbłonka...

Celem tego filmu jest zaprezentowanie techniki typu lab-on-a-chip do charakteryzowania stanu zapalnego komórek śródbłonka. W pierwszej kolejności ludzkie komórki śródbłonka aorty hoduje się do osiągnięcia konfluencji na podłożu do hodowli tkanek, a następnie umieszcza je w urządzeniu do wywołania naprężenia ścinającego w płytce typu Cone-and-Plate. Komórki poddaje się działaniu cytokiny prozapalnej, TNF alpha, i jednocześnie wystawia na zróżnicowane warunki naprężenia ścinającego przez cztery godziny poprzez precyzyjne kontrolowanie rotacji stożka nad podłożem; naprężenie ścinające moduluje dobrze scharakizowaną odpowiedź zapalną na cytokiny.Obejmuje to nadekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak VCAM-1 i ICAM-1. Podłoże przenosi się na stolik mikroskopu, gdzie mikrofluidyczne urządzenie PDMS jest uszczelniane próżniowo bezpośrednio do monowarstwy, co tworzy kanały przepływowe. Aktywowane komórki monocytowe THP-1 są przepuszczane nad wstępnie przygotowanymi hSEC, gdzie wiążą się proporcjonalnie do poziomu ekspresji cząsteczek adhezyjnych.Stan zapalny śródbłonka określa się poprzez kwantyfikację całkowitej liczby trwale przytwierdzonych komórek THP one. Cześć, nazywam się she D

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Fenotypowanie zapaleń śródbłonka na chipie

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Na rozwój poważnych niekorzystnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, które wpływają na rokowanie sercowo-naczyniowe po angioplastyce wieńcowej, wpływa zakres uszkodzenia naczyń wieńcowych i naprawy naczyń krwionośnych. Zastosowanie nowych biomarkerów wieńcowych i rozpuszczalnych, reagujących na uszkodzenia i naprawę naczyń krwionośnych, jest przydatne do przewidywania rozwoju MACE i rokowania.

Komórki progenitorowe naczyń wieńcowych i rozpuszczalne biomarkery w rokowaniu sercowo-naczyniowym po angioplastyce wieńcowej

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Mechaniczne cechy glikokaliksu śródbłonka zostały zmierzone za pomocą wgłębień za pomocą kulek o rozmiarach mikronowych na wspornikach AFM. Komórki śródbłonka hodowano w niestandardowej komorze w fizjologicznych warunkach przepływu w celu wywołania ekspresji glikokaliksu. Dane analizowano przy użyciu modelu cienkowarstwowego w celu określenia grubości i modułu glikokaliksu.

Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Naszym celem było zaprojektowanie, wyprodukowanie i przetestowanie ferromagnetycznych stentów do wychwytywania komórek śródbłonka. Dziesięć stentów przetestowano pod kątem złamań, a 10 kolejnych stentów przetestowano pod kątem magnetyzmu zatrzymanego. Na koniec przetestowano 10 stentów in vitro, a 8 kolejnych stentów wszczepiono 4 świniom, aby wykazać wychwytywanie i zatrzymywanie komórek.

Ferromagnetyczny stent z gołego metalu do wychwytywania i zatrzymywania komórek śródbłonka

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Poznaj technikę lab-on-a-chip do fenotypowania zapalnego komórek śródbłonkowych przy użyciu mikroprzepływowych komór z przepływowymi. Metoda ta pozwala badać wpływ naprężenia ścinającego na adhezję komórek monocytowych w czasie rzeczywistym.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Przeglądaj więcej filmów