System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Interakcje między komórkami leukocytów i śródbłonka odgrywają ważną rolę w chorobach zapalnych, takich jak sepsa. Rozregulowanie stanu zapalnego często powoduje zmienioną funkcję bariery śródbłonka naczyń krwionośnych i nadmierny transport leukocytów, co może prowadzić do uszkodzenia narządów. Biomimetyczny test mikroprzepływowy, który nazywamy bMFA, odtwarza topografię i warunki przepływu sieci mikronaczyniowych in vivo i pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym zwijania, twardej adhezji, rozprzestrzeniania się i migracji neutrofili do przedziału tkankowego.

Mocną stroną biomimetycznego testu mikroprzepływowego jest możliwość wykorzystania pierwotnych komórek ludzkich i klinicznie istotnych próbek pacjentów w celu zwiększenia translacji klinicznej i szybkiego badania przesiewowego potencjalnych środków terapeutycznych. Procedury zademonstruje pan Qingliang Yang, asystent naukowy z mojego laboratorium. Zacznij wkładać rurkę o długości około jednego cala do portów za pomocą drobnych kleszczyków, z wyjątkiem jednego portu wlotowego.

Za pomocą zacisków szczękowych zaciśnij razem dwa porty wylotowe i komorę na chusteczki. Rozcieńczyć roztwór podstawowy fibronektyny do 100 mikrogramów na mililitr za pomocą PBS. Załaduj jednomililitrową strzykawkę podłączoną do igły o rozmiarze 24 z rozcieńczonym roztworem fibronektyny i podłącz strzykawkę do rurki o długości czterech cali.

Włóż rurkę do otwartego portu wlotowego, a następnie popchnij tłok, aż ludzka fibronektyna zostanie uwolniona z innego portu wlotowego i zaciśnij go. Powtarzaj proces dla pozostałych portów, aż wszystkie kanały, przedział tkankowy i rurki zostaną wypełnione roztworem ludzkiej fibronektyny. Wyjmij igłę, ale rurkę o długości czterech cali należy włożyć i odkręcić.

Aby przeprowadzić odgazowanie, podłącz niezaciśniętą rurkę do pneumatycznego podkładu podłączonego do zbiornika sprężonego azotu o ciśnieniu pięciu funtów na cal kwadratowy przez 15 minut. Pod mikroskopem sprawdź, czy w kanale lub komorze na chusteczki nie ma pęcherzyków powietrza uwięzionych i ponownie podłącz urządzenie, jeśli pęcherzyki powietrza są obecne. Wyjmij urządzenie z podkładu pneumatycznego i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Używając wstępnie podgrzanych pożywek do hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc ludzkich, przepłucz wszystkie kanały i przedział tkankowy. Po pobraniu komórek śródbłonka zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, osadzać komórki przez odwirowywanie przez pięć minut G.In 150 razy za pomocą programowalnej pompy strzykawkowej, zamontować jednomililitrową strzykawkę i przymocować rurkę do igły. Wciągnąć około 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do rurki, nie wpuszczając jej do cylindra strzykawki.

Usuń clamp z portu wylotowego urządzenia. Podłącz rurkę do portu wlotowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do kanału. Zatrzymaj pompę przy natężeniu przepływu od czterech do ośmiu mikrolitrów na minutę i obserwuj pod mikroskopem.

Zatrzymaj pompę, gdy kanały zostaną wypełnione komórkami. Clamp wylot i odciąć rurkę dopływową. Umieść urządzenie w inkubatorze na cztery godziny w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza.

Po czterech godzinach inkubacji przygotuj kolejną strzykawkę i napełnij ją świeżą pożywką do hodowli komórkowych. Zamontuj strzykawkę w pompie strzykawkowej i podłącz ją do portu wlotowego. Usuń clamp z portu wylotowego.

Przepuszczaj świeżą pożywkę przez urządzenie przez około pięć minut z prędkością od czterech do ośmiu mikrolitrów na minutę, aby usunąć pływające lub nieprzyłączone komórki. Przygotować strzykawkę, wypełniając ją świeżą pożywką do hodowli komórkowych. Zamontuj strzykawkę w pompie strzykawkowej i podłącz ją do jednego portu wlotowego, pozostawiając otwarty port wylotowy.

Umieść urządzenie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zaprogramować pompę strzykawkową do hodowli komórek śródbłonka pod przepływem zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Za pomocą mikroskopu sprawdź bMFA po 48 godzinach hodowli pod przepływem.

Mikroskopia konfokalna wykazała, że wszystkie powierzchnie kanałów naczyniowych były pokryte komórkami śródbłonka, tworząc pełne światło 3D w bMFA. Po przygotowaniu trzech różnych urządzeń bMFA załaduj trzy jednomililitrowe strzykawki z pożywką do hodowli komórkowych lub TNF-alfa lub TNF-alfa w połączeniu odpowiednio z inhibitorem PKC delta, gdzie TNF-alfa i cytokina zapalna są używane do stymulacji komórek śródbłonka i neutrofili. Inhibitor PKC delta jest nowym inhibitorem przeciwzapalnym.

Podłączyć trzy załadowane strzykawki do trzech urządzeń bMFA. Używając buforu TNF-alfa lub TNF-alfa z dodatkiem inhibitora, leczyć ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc przez cztery godziny w dawce 0,1 mikrolitra na minutę. Po wyizolowaniu ludzkich neutrofili zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, ponownie zawiesić neutrofile w 999 mikrolitrach buforu HEPES i dodać jeden mikrolitr 10-milimolowego roztworu podstawowego barwnika CFDA SE do zawiesiny, otrzymując 10-mikromolowy roztwór roboczy CFDA SE i inkubować go przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Przemyć komórki dwukrotnie buforem HEPES, odwirowując roztwór przez pięć minut w temperaturze 315 razy G. Po zliczeniu komórek zawiesić ponownie przy 2 milionach neutrofili na mililitr w pożywce do hodowli komórkowych lub TNF-alfa lub TNF-alfa z dodatkiem inhibitora PKC delta i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Napełnij strzykawkę jednomikromolowym chemowatraktantem fMLP, przygotowanym w pożywce do hodowli komórkowych. Otwórz jeden port wlotowy i jeden wylotowy bMFA.

Wyjmij rurkę portu z komory na chusteczki i włóż rurkę fMLP. Wstrzyknąć około 20 mikrolitrów fMLP do przedziału tkankowego dla wszystkich bMFA, pozostawiając ten potraktowany pożywką do hodowli komórkowych. Przetnij rurkę i zaciśnij ją.

Napełnić strzykawkę około 200 mikrolitrami zawiesiny neutrofili i zamontować strzykawkę na pompie strzykawkowej. Po umieszczeniu urządzenia na stoliku mikroskopu odwróconego należy ustawić natężenie przepływu na jeden mikrolitr na minutę i uruchomić pompę. Poczekaj, aż niewielka kropla zawiesiny neutrofili wydostanie się z rurki i włóż rurkę do portu wlotowego.

Znakowane fluorescencyjnie neutrofile wpływają do kanałów naczyniowych i oddziałują z komórkami śródbłonka oraz fizjologicznie istotnymi warunkami przepływu. Po 10 minutach od rozpoczęcia eksperymentu otwórz oprogramowanie do analizy obrazu, przełącz soczewkę obiektywu na 10x i użyj joysticka stage, aby wyśrodkować urządzenie pod mikroskopem. Aby uzyskać mapę przyczepności, przejdź do opcji Acquire (Pobierz), kliknij opcję Scan Large Image (Skanuj duży obraz).

Pojawi się nowe okno. Wybierz soczewkę obiektywu 10x i ustaw opcję pola, na przykład 5 na 3. Kliknij przycisk Skanuj, kliknij przycisk Plik i zapisz mapę przyczepności.

Aby uzyskać mapę migracji do analizy migracji, wyśrodkuj urządzenie pod mikroskopem za pomocą joysticka stolika. Kliknij pozycję Widok, Formanty pozyskiwania, Pobieranie ND. Pojawi się nowe okno.

Ustaw ścieżkę, aby zapisać plik i wpisz nazwę pliku. Sprawdź funkcję dużego obrazu, ustaw obszar skanowania, na przykład 5 na 3. Sprawdź funkcję czasu, ustaw interwał na pięć minut, a czas trwania na 60 minut.

Zrób zdjęcia poklatkowe przedziału tkankowego, z jednym zdjęciem wykonywanym co pięć minut przez następną godzinę. Symulacja CFD pokazuje wzorzec przepływu laminarnego w kanałach naczyniowych, z wyjątkiem obszarów bifurkacji, w których wzorzec przepływu jest zaburzony. Po wykonaniu testu biomimetycznego mikropłynów, obrazy kontrastu fazowego ujawniły, że powierzchnie kanałów naczyniowych były pokryte komórkami śródbłonka i wyrównane w kierunku przepływu ścinającego po 48 godzinach hodowli.

Obrazowanie fluorescencyjne przeprowadzono za pomocą mikroskopii konfokalnej, wskazując, że komórki śródbłonka tworzą pełne trójwymiarowe światło w bMFA Uzyskano mapę adhezji neutrofili, która ujawniła, że w bMFA występuje znaczna adhezja neutrofili do komórek śródbłonka. Mapa migracji neutrofili w bMFA wykazała, że po aktywacji TNF-alfa dochodzi do znacznej migracji neutrofili wewnątrz przedziału tkankowego, podczas gdy takiej migracji nie zaobserwowano bez aktywacji TNF-alfa. Mapa adhezji korelująca przestrzenny rozkład neutrofili z szybkością ścinania wykazała, że adhezja neutrofili występowała preferencyjnie w naczyniach o niskiej szybkości ścinania i w pobliżu obszarów rozwidlenia.

Ponadto leczenie TNF-alfa znacznie zwiększa adhezję, która została zahamowana przez inhibitor PKC delta. Analiza obrazów poklatkowych wykazała, że aktywacja TNF komórek śródbłonka zwiększa migrację neutrofili w odpowiedzi na fMLP, podczas gdy leczenie inhibitorem PKC delta zmniejszyło migrację w porównaniu z komórkami leczonymi TNF-alfa. W ten sposób bMFA może być wykorzystany do przetestowania skuteczności nowego leku w leczeniu chorób zapalnych.

bMFA może być również używany do badania integralności śródbłonka poprzez pomiar zmiennych, takich jak przepuszczalność i transśródbłonkowy opór elektryczny, tak zwany TEER i ekspresja cząsteczki adhezyjnej podczas stanu zapalnego. Biomimetyczny test mikroprzepływowy może naśladować mikrośrodowisko różnych narządów i nie ogranicza się do pojedynczych typów lub gatunków komórek, a także może modelować komunikację między komórkami o krytycznym znaczeniu dla funkcji narządów i modelować różne choroby.