Indukcja inwazyjnego raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego u nienaruszonych immunologicznie ludzkich myszy transgenicznych MUC1: model rozwoju immunoterapii

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest skuteczne wywołanie cytotoksycznej odpowiedzi limfocytów T ukierunkowanej na antygen związany z nowotworem w raku pęcherza moczowego. Osiąga się to poprzez indukcję raka pęcherza moczowego u myszy, które wyrażają ludzki antygen związany z nowotworem mach one. Następnie myszom wstrzykuje się szczepionkę peptydową i generuje się około jednej specyficznej odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T.

Następnie izoluje się guz surowicy i śledzionę, a tkanki są analizowane odpowiednio pod kątem cytokin, antygenów i odpowiedzi immunologicznej. Wykorzystanie multipleksu western blot, mikrogranulek fluorometrycznych, immunohistochemii testu immunologicznego i analizy żywego miejsca pozwala nam przetestować skuteczność szczepionki peptydowej przeciwko rakowi pęcherza moczowego. Cześć, nazywam się dr Gregory Wetz, jestem naukowcem na Uniwersytecie Kalifornijskim Davis Health System w Sacramento w Kalifornii.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ksenoprzeszczepy, jest to, że ksenoprzeszczepy wymagają gospodarzy z obniżoną odpornością, podczas gdy nasz model wykorzystuje nienaruszoną immunologicznie transgeniczną mysz, która wyraża ludzki antygen związany z nowotworem, który jest celem szczepionki peptydowej. Techniki te zademonstrują ze mną Daniel V oraz doktorzy Chaga i Audrey Gutierrez, z których wszyscy są kolegami naukowcami, a także laboratorium dr Michaela de Gregorio i UC Davis Health System. Przed podaniem pierwszej dawki N-butylu, N-4hydroksy, butylu NITROZOAMINY lub O-H-B-B-N w celu wywołania raka pęcherza moczowego, wykonaj krwawienie podżuchwowe u każdej myszy, aby pobrać krew pełną i rurki do krzepnięcia krwi i odczekaj 30 minut, aż krew zacznie krzepnąć.

Począwszy od ósmego tygodnia życia przy użyciu igieł do gagłębników ze stali nierdzewnej o rozmiarze 20, podawaj O-H-V-B-N doustnie pięć dni w tygodniu przez 12 tygodni. W 20. tygodniu użyj 600 mikrolitrów 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby rozpuścić każdą fiolkę liofilizowanej szczepionki peptydowej i dokładnie zamieszaj, przeciągając roztwór przez igłę o rozmiarze 0,5 cala i rozmiarze 27 sześć razy przy użyciu soli fizjologicznej. Dostosować stężenie tak, aby żądana dawka została dostarczona w objętości 100 mikrolitrów po ostatniej dawce O-H-B-B-N i podawać szczepionkę co tydzień przez ośmiotygodniowy cykl, używając igły o rozmiarze 25 w celu wstrzyknięcia 100 mikrolitrów szczepionki osiem tygodni po ostatniej dawce O-H-B-B-N.

Po eutanazji wszystkich myszy przez uduszenie dwutlenkiem węgla, umieść każdą mysz na desce sekcyjnej i przygwoźdź wszystkie cztery kończyny. Następnie za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj poziome nacięcie w górnej części brzucha. Włóż nożyczki w nacięcie między warstwą naskórka a ścianą brzucha i za pomocą kleszczy delikatnie oddziel skórę od leżącej pod nią tkanki.

Wykonaj pionowe nacięcie od poziomego nacięcia wzdłuż środkowej osi w kierunku przedniego końca myszy. Następnie oddziel skórę od klatki piersiowej i za pomocą jednomililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 22 nakłuj serce i zbierz krew płynnym i równomiernym pobraniem za pomocą kleszczy i nożyczek. Odetnij i oderwij resztę warstwy naskórka w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Przeciąć przez ścianę brzucha i otrzewną oraz aseptycznie. Usuń guz pęcherza moczowego do immunohistochemii lub IHC i Western blot do IHC. Umieść próbkę guza pęcherza moczowego w kasecie na tkanki i utrwal ją w schłodzonej formie na noc.

W temperaturze pokojowej należy pobrać śledzionę do analizy żywotności komórek i miejsce leżenia w celu przeprowadzenia multipleksowego testu immunologicznego drobnoustrojów fluorometrycznych. Użyj 200 mikrolitrów buforu testowego do wstępnego zwilżenia. Dolna płyta filtra z 96 dołkami, umożliwiająca całkowite nasiąknięcie filtra.

Następnie użyj 96-dołkowego aparatu próżniowego, aby delikatnie opróżnić filtr i użyj ręczników papierowych, aby wysuszyć spód płytki krwią za pomocą wielokanałowej pipety, pipety, pipety 25 mikrolitrów matrycy surowicy do dołków przeznaczonych dla ślepych prób i wzorców, a następnie odpipetować 25 mikrolitrów buforu do testu do studzienek przeznaczonych dla kontroli i niewiadomych. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów ślepych wzorców, kontroli i niewiadomych do odpowiednich przypisanych studzienek. Wiruj mieszankę kulek przez 20 sekund i przenieś kulki do zbiornika.

Następnie odpipetuj 25 mikrolitrów kulki do każdego. Dobrze przykryj płytkę, aby chronić ją przed światłem i potrząsaj płytką na wytrząsarce z prędkością 500 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, odcedź płytkę i użyj 200 mikrolitrów PBST, aby umyć ją dwukrotnie przed odcedzeniem i osuszeniem. Aby przygotować roztwór przeciwciała wykrywającego, połącz wymaganą ilość 0,1% PBST i przeciwciała wykrywającego w 15-mililitrowej probówce i wiruj przez 10 sekund.

Następnie odpipetuj 25 mikrolitrów do każdego. Dobrze potrząsaj płytką z prędkością 500 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odcedzić i umyć płytkę 200 mikrolitrami 0,1% PBST dwukrotnie, odcedzić i osuszyć pipetą 25 mikrolitrów świeżo przygotowanego paciorkowca, AVID i FICO eryn lub SAPE do każdego, dobrze umieścić płytkę na wytrząsarce płytek i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 500 obr./min.

Odcedź i umyj dwukrotnie PBST. Aby zawiesić kulki, dodaj 100 mikrolitrów 0,1% PBST do każdej studzienki i wstrząsaj z prędkością 500 obr./min przez co najmniej dwie minuty. Użyj maszyny Luminex LX 200 do odczytu i analizy płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Przetrzyj śledziony myszy przez 100-mikrometrowe sita do tkanek nylonowych na pięć mililitrów sterylnego PBS na sterylnych szalkach Petriego. Ułóż ayte PLE na trzech mililitrach pożywki do separacji limfocytów w sterylnych 15-mililitrowych probówkach. Odwirować probówki o stężeniu 600 GS przez 15 minut.

Aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek, przenieś warstwowe limfocyty powyżej gradientu do nowych sterylnych 15-mililitrowych probówek w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych z zakrętką. Użyj odczynnika do żywotności liczenia, aby uzyskać seryjne rozcieńczanie limfocytów. Następnie przeanalizuj na muzie.

Przygotuj mapę płytkową próbek i warunków dla płytki plamki sprzymierzeńca, przygotowując płytkę zgodnie z protokołem producenta i odpipetuj 100 mikrolitrów pożywki peptydowej lub peptydu mieszającego do każdego. Dobrze dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla testu punktowego ALI i użyj mikroskopu preparacyjnego do analizy opracowanej płytki punktowej Aly.

Określ ilościowo wyniki, licząc liczbę kolorowych plamek odpowiadających każdemu analitowi w każdym dołku. Plamki odpowiadają liczbie komórek tworzących plamki w każdym dołku w naszym transgenicznym modelu myszy indukcji za pomocą chemicznego czynnika rakotwórczego. O-H-B-B-N powodował wysoki odsetek incydentów raka pęcherza moczowego z przewagą raka przejściowego lub TCC z niektórymi rakiem płaskonabłonkowym lub SCC, który jest podobny do raka pęcherza moczowego u ludzi, jak pokazano na tym rysunku.

Osiem tygodni po indukcji O-H-B-B-N częstość występowania raka pęcherza moczowego zarówno dla myszy transgenicznych lub TG, jak i myszy typu dzikiego wynosiła 67%, barwienie hematyną i eozyną potwierdziło obecność zarówno TCC, jak i SCC, przy czym TCC dominowały w stosunku dwa do jednego. Wśród nich zaobserwowaliśmy szereg nowotworów inwazyjnych o niskim i wysokim stopniu złośliwości od nieinwazyjnych do wysokiego stopnia. Wszystkie próbki raka pęcherza moczowego Mach one były dodatnie dla ekspresji Mach one przez IHC.

Podczas opracowywania modelu poziomy cytokin zapalnych w surowicy monitorowano seryjnie między ósmym a 28 tygodniem. Zaobserwowaliśmy, że poziomy cytokin zapalnych wzrastały w czasie od indukcji do końca badania. Ten wzorzec cytokin jest bardzo podobny do tego, co zaobserwowaliśmy wcześniej w naszym modelu raka płuc, co zdecydowanie sugeruje, że wzrost poziomu cytokin zapalnych może korelować z rozwojem guza.

Aby ocenić odpowiedź jednej cytokiny surowicy na szczepionkę peptydową, 15 zaszczepionych i 14 leczonych placebo myszy Mach One TG poddano eutanazji, a pod koniec badania pobrano krew. 24 godziny po ostatnim podaniu szczepionki. Analiza multipleksowa wykazała podwyższony poziom cytokin TNF, alfa interferonu gamma w surowicy, IL 2, IL 12 i IL 17 w grupie szczepionej.

W porównaniu z grupą placebo poziomy TNF, alfa, interferonu gamma i IL 17 były znacznie wyższe u myszy leczonych szczepionką. Wyniki te sugerują jedną spolaryzowaną odpowiedź cytokinową na szczepionkę peptydową w celu oceny odpowiedzi immunologicznej TH jeden, TH 2 na szczepionkę peptydową. Cyty SP oceniano za pomocą interferonu gamma IL cztery plamki ALI pokazane tutaj jest ocena izolowanych limfocytów pod kątem żywotności po wysianiu płytek plamkowych ALI żywotnymi limfocytami, wyniki w tym eksperymencie były jasne i specyficzna odpowiedź interferonu gamma na peptyd, co potwierdza TH jedną odpowiedź immunologiczną na szczepionkę peptydową Po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią nowotworów do zbadania nowych immunoterapeutyków wykorzystujących przedkliniczny model zaawansowanego raka pęcherza moczowego.