Name: Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Naucz się szybkiego genotypowania danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia wykrywanie mutacji i transgenów z dużą czułością i niezawodnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratoriów Blaschke, Grunwald i Wittwer za rady i pomoc techniczną. Praca ta jest wspierana przez Fundację PCMC, NIH R01 MH092256 i DP2 MH100008 oraz grant badawczy Fundacji March of Dimes #1-FY13-425 dla JLB.

1. Przygotowanie DNA
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do lizy DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Dodać świeżą proteinazę K do końcowego stężenia 1 mg/ml w dniu użycia12.</li>
	<li>Pobieranie tkanek:
	<ol>
		<li>Dla klipsa na płetwy dorosłej ryby:
		<ol>
			<li>Znieczulenie ryby: Umieść rybę w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj, aż ruch skrzeli zwolni.</li>
			<li>Połóż rybę na stosie 5-10 chusteczek Kimwipes i odetnij mały kawałek płetwy ogonowej, około 2-3 mm, sterylną żyletką.</li>
			<li>Szybko umieść rybę w oznakowanym zbiorniku ze świeżą wodą w celu odzyskania zdrowia; ostrożnie oznacz zarówno zbiornik, jak i odpowiednią rurkę, która będzie zawierać klips płetwowy. Zmieniaj wodę i karm ryby co drugi dzień.</li>
			<li>Podnieś zacisk płetwy ze sterylną końcówką pipety i przenieś go do probówki wypełnionej 100 μl buforu do lizy DNA.</li>
			<li>Wyrzuć końcówkę pipety, a żyletkę wyrzuć do pojemnika na ostre przedmioty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku klipsa na ogon zarodka:
		<ol>
			<li>Umieścić zarodki w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj 2 min.</li>
			<li>Wytnij kawałek ogona kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
			<li>Umieść ogon w oznakowanej probówce wypełnionej 30 μl buforem do lizy DNA.</li>
			<li>Szybko umieść zarodek w probówce zawierającej 100 μl 4% paraformaldehydu.</li>
			<li>Oznaczyć probówki z zarodkami i odpowiadającymi im rurkami ogonowymi.</li>
			<li>Probówki z zarodkami przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia.</li>
			<li>Oczyść kleszcze za pomocą wody Milli-Q i chusteczek Kimwipes między każdym zarodkiem, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla całych zarodków:
		<ol>
			<li>Umieścić zarodki w 0,004% roztworze MS-222 (trikainy). Poczekaj 2 min.</li>
			<li>Umieść 1-5 zarodków w probówce wypełnionej 100 μl buforu do lizy DNA. Dechorionacja nie jest konieczna.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie DNA 
	Inkubować probówki z tkankami (klipsami do płetw lub ogona lub zarodków) w temperaturze 55 °C przez 4 godziny do nocy12.</li>
	<li>Dezaktywuj proteinazę K 
	Podgrzewaj rurki do 95 °C przez 15 min12. DNA należy natychmiast wykorzystać do PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
</ol>
2. PCR
<ol>
	<li>Projektuj podkłady ręcznie lub za pomocą oprogramowania do projektowania podkładów (np. Lightscanner Primer Design Software - Biofire). Produkty PCR dla HRMA mają zwykle 50-200 pz; Produkty PCR do wykrywania SNP powinny być mniejsze, zwykle 50-80 pz.</li>
	<li>Metoda PCR
	<ol>
		<li>Przeprowadź reakcję PCR na płytce 96-dołkowej lub 384-dołkowej.</li>
		<li>Użyj 10 μl całkowitej objętości: 4 μl MasterScanner master mix (0,1 U polimerazy Taq-AB na gorąco, bufor, 0,2 mM dNTP, 2 mM chlorku magnezu i 1x fluorescencyjny dwuniciowy barwnik wiążący DNA); 5 pmol każdy starter i 1 μl genomowego DNA matrycy wyekstrahowanej z dorosłej płetwy ogonowej lub 3 μl genomowego DNA z embrionalnego ogona13.</li>
		<li>Przykryj próbki 30 μl oleju mineralnego.</li>
		<li>Przykryj płytkę optycznie przezroczystą uszczelką samoprzylepną.</li>
		<li>Zoptymalizuj warunki cykliczne PCR - typowe warunki to 95 °C przez 5 minut i 30 cykli po 10 sekund w temperaturze 95 °C, 25 sekund w temperaturze 60 °C, 30 sekund w temperaturze 72 °C, kończące się 95 °C przez 30 sekund i schłodzone do 15 °C.</li>
		<li>Przechowywać płytki PCR w temperaturze 4 °C lub kontynuować bezpośrednio do HRMA.</li>
		<li>Potwierdź nasz produkt PCR poprzez analizę jego wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym podczas wstępnej optymalizacji PCR; a jeśli jest to wskazane, przez sekwencjonowanie produktu PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HRMA
<ol>
	<li>Płyty grzewcze
	<ol>
		<li>Umieść płytkę w systemie analizy stopu.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie (LightScanner Software Call-IT 2.0).</li>
		<li>Płyty grzewcze od 60-95 °C.</li>
		<li>Utwórz nowy plik przechowywania danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane HRMA (rysunek 2). 
	Możliwych jest wiele etapów analizy. Pokazujemy najczęściej używany zestaw manipulacji danymi.
	<ol>
		<li>Ustawienie podzbioru 
		Kliknij kartę Podzestaw. Wybierz studzienki z próbkami.</li>
		<li>normalizacja
		<ol>
			<li>Wybierz kartę Normalizuj w lewym panelu. Aby wyeliminować wariancję fluorescencji, należy ręcznie ustawić równoległą podwójną linię w obszarach przed (początkowym) i po (końcowym) stopieniu, jak pokazano (rysunek 2C, groty strzałek) i znormalizować sygnały fluorescencji przed i po stopieniu wszystkich próbek odpowiednio do 1 i 0,14.</li>
			<li>Dostosuj położenie linii tak, aby obszar stopienia znajdował się w obszarze między liniami przed i po stopieniu, ale nie był zaznaczony. Ogólnie rzecz biorąc, linie temperatury Dolne Min i Dolne Max (oraz Górne Min i Górne Max) powinny być oddalone od siebie o około 1 °C.</li>
			<li>Wybierz pozycje temperatury do normalizacji w taki sposób, aby wszystkie próbki miały maksymalną lub pełną (100%) fluorescencję dla obszaru przed topnieniem i minimalną lub żadną (0%) fluorescencję dla obszaru po stopieniu (tak dobrze, jak to możliwe). Normalizacja powinna skutkować linią bliską poziomej przy maksymalnej fluorescencji 1, która rozciąga się do punktu topnienia, a następnie linią bliską poziomej od punktu topnienia przy minimalnej fluorescencji 0; nie powinno być poziomów fluorescencji powyżej 1 lub poniżej 0. Na przykład na rysunku 2C znormalizuj krzywe topnienia wstępnego, stosując zakresy temperatur 79-80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Grupowanie/Grupowanie 
		Rozróżniaj genotypy na podstawie ich temperatury topnienia (rysunek 2C, zielona ramka). Wybierz opcję Grupowanie.
		<ol>
			<li>Wybierz opcję Autogrupuj z listy wyboru Standardy w sekcji Grupowanie.</li>
			<li>Wybierz opcję Normalna lub Wysoka dla profili topnienia z pojedynczymi przejściami lub wieloma przejściami odpowiednio z listy wyboru Czułość w sekcji Grupowanie.</li>
			<li>Wybierz pozycję Grupy obliczeniowe w sekcji Grupowanie.</li>
			<li>Przejdź do menu Plik i kliknij Zapisz, aby zapisać wyniki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

PCR w połączeniu z HRMA to potężna technologia genotypowania danio pręgowanego. Zaletami tego podejścia są jego szybkość, solidność i czułość w wykrywaniu mutacji nawet punktowych. Cały protokół, od klipsa do analizy krzywej topnienia, może być wykonany w czasie krótszym niż osiem godzin przez jedną osobę. Ponadto technika ta nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych; nie wymaga stosowania bromku etydyny; i jest uszczelniony dla wszystkich etapów PCR i analizy, co pomaga zminimalizować problemy z zanieczyszcz...

Danio rerio) to system modelowania kręgowców szeroko stosowany do badań nad rozwojem i modelowaniem chorób. W ostatnim czasie opracowano liczne technologie transgeniczne i mutacyjne dla danio pręgowanego. Techniki szybkiej transgenezy, zwykle oparte na systemie transpozonów Tol21, zostały połączone z ulepszonymi opcjami klonowania w celu składania wielu fragmentów DNA2. Nukleazy palców cynkowych (ZFN) i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) zostały wykorzystane do celowania w loci zarówno w komórkach somatycznych, jak i rozrodczych u danio pręgowanego3,4. Techniki te mogą skutecznie generować genetycznie modyfikowane zwierzęta, z powstawaniem mutacji o wysokiej częstotliwości i przenoszeniem w linii zarodkowej3,4.
Pomimo tych postępów, tradycyjne techniki genotypowania u danio pręgowanego ograniczają pełną moc narzędzi do mutagenezy i transgenezy. PCR, po którym następuje elektroforeza żelowa, czasami połączona z trawieniem enzymem restrykcyjnym, jest szeroko stosowana do wykrywania modyfikacji genomu, ale jest czasochłonna i mniej wrażliwa na identyfikację małych insercji lub delecji. Testy sondami TaqMan wiążą się z wysokimi kosztami początkowymi i wymagają starannej optymalizacji. Sekwencjonowanie produktów PCR może trwać kilka dni i nie jest praktyczne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę. Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) może dyskryminować SNP wpływające tylko na ograniczony zakres miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych.

Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA), metoda analizy post-PCR w zamkniętej probówce, to niedawno opracowana metoda, która jest szybka, czuła, tania i podatna na badania przesiewowe dużej liczby próbek. HRMA może być używana do wykrywania SNP, mutacji i transgenów5-7. HRMA opiera się na denaturacji termicznej dwuniciowych DNA, a każdy amplikon PCR ma unikalną charakterystykę dysocjacji (stopienia)5. Próbki można rozróżnić ze względu na ich różny skład nukleotydowy, zawartość GC lub długość, zwykle w połączeniu z barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże tylko dwuniciowe DNA8. W ten sposób HRMA może rozróżniać różne genotypy w oparciu o różne charakterystyki krzywej topnienia. Ponieważ HRMA wykorzystuje tanie odczynniki i jest jednoetapowym procesem post-PCR, może być stosowany w strategiach o wysokiej przepustowości. HRMA jest nieniszczący, więc po analizie amplikony PCR mogą być wykorzystane do innych zastosowań. HRMA została zastosowana w wielu organizmach i systemach, w tym na liniach komórkowych, myszach i ludziach9-11. Jego zastosowanie zostało niedawno opisane u danio pręgowanego do wykrywania mutacji indukowanych przez nukleazy palca cynkowego (ZFN) iTALENy 6,12,13.

W tym artykule opisujemy, jak przeprowadzić HRMA na podstawie PCR u embrionalnego i dorosłego danio pręgowanego (Rysunek 1). Protokół ten jest odpowiedni do wykrywania SNP, transgenów i mutacji, w tym zmian pojedynczej pary zasad, insercji lub delecji.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki BLK/WHT do PCR z twardą skorupą</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Mikrouszczelki samoprzylepne "B"</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>www.bio-rad.com 96-dołkowy przyrząd LightScanner</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LightScanner z Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do projektowania podkładów</td><td>LightScanner BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI Software</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą pcr z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Danio pręgowany to potężny system modelowania kręgowców do badania rozwoju, modelowania chorób i przeprowadzania badań przesiewowych leków. Ostatnio wprowadzono różnorodne narzędzia genetyczne, w tym wiele strategii wywoływania mutacji i generowania linii transgenicznych. Jednak badania przesiewowe na dużą skalę są ograniczone tradycyjnymi metodami genotypowania, które są czasochłonne i pracochłonne. W tym miejscu opisujemy technikę analizy genotypów danio pręgowanego za pomocą PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA). To podejście jest szybkie, czułe i niedrogie, z mniejszym ryzykiem artefaktów skażenia. Genotypowanie metodą PCR z HRMA może być stosowane w przypadku zarodków lub dorosłych ryb, w tym w wysokoprzepustowych protokołach przesiewowych.

Protokół można przeprowadzić w ciągu jednego dnia lub podzielić na etapy rozłożone na kilka dni (schemat blokowy prac przedstawiono na Rysunku 1). Po ekstrakcji DNA następuje denaturacja termiczna i analiza produktów amplifikacji PCR. Temperatury denaturacji amplikonu zależą od jego wielkości i zawartości GC, jednak zazwyczaj odpowiednie są temperatury początkowa 50 ˚C i końcowa 95 ˚C (Rysunki 2A oraz 2B). Po przeprowadzeniu denaturacji analiza krzywych topnienia fluores...

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka analiza przesiewowa różnych genotypów, mutacji lub transgenów u danio pręgowanego. Jest to realizowane poprzez wstępną ekstrakcję DNA z cienkich wycinków tkanki, a następnie amplifikację DNA metodą PCR. Kolejnym krokiem jest denaturacja produktów amplifikacji PCR przy jednoczesnym rejestrowaniu krzywych topnienia, które są następnie analizowane za pomocą oprogramowania.Ostatecznie wyniki wykazują wyraźnie rozróżnialne krzywe topnienia dla różnych genotypów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroforeza żelowa po PCR, jest jej czułość na pojedyncze zmiany nukleotydowe, małe insercje oraz delecje, a ponadto technika ta jest szybka i niezawodna. Chociaż metoda ta może być wykorzystywana do szybkiego i skutecznego genotypowania danio pręgowanego, można ją również zastosować w innych systemach i organizmach modelowych, w tym w liniach komórkowych, u myszy oraz innych zwierząt.W dniu przygotowania DNA należy dodać świeżą proteinazę K do buforu lizującego w stężeniu 1 mg/mL. Tkankę można pobrać od dorosłej ryby za pomocą cienkiego klipsa lub od ryby w stadium embrionalnym. Najpierw należy znieczulić rybę w roztworze Tricaina.Należy odczekać, aż ruchy skrzeli zwolnią. Następnie umieścić rybę na stosie chusteczek i za pomocą sterylnego ostrza do golenia odciąć niewielki fragment płetwy ogonowej o długości około 2–3 mm. Szybko przenieść rybę do opisanego zbiornika z czystą wodą w celu rekonwalescencji.Pobierz wycinek płetwy za pomocą sterylnego końcówki do pipety i przenieś go do probówki wypełnionej 100 µL buforu do lizy DNA. Pamiętaj o oznakowaniu zarówno zbiornika zwierzęcia, jak i probówki; inkubuj wszystkie zebrane tkanki przez co najmniej cztery godziny, a maksymalnie przez noc w temperaturze 55 °C. Po inkubacji dezaktywuj białko ACE K, podgrzewając probówki w temperaturze 95 °C przez 15 minut.Próbki te należy wykorzystać do reakcji PCR niezwłocznie, lecz można je również przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do trzech miesięcy. Reakcję PCR należy przeprowadzić w płytce 96- lub 384-dołkowej. Połączyć nie więcej niż 1 µL DNA dorosłego osobnika z 4 µL light scanner.Master mix zawierający sondę fluorescencyjną oraz startery w końcowym stężeniu 5 pM każdy. Jeśli DNA pochodzi z zarodka, należy użyć do 3 µL. Reakcje przykryć 30 µL oleju mineralnego, a następnie szczelnie zamknąć probówki.Następnie należy przykryć napełnioną płytkę PCR optycznie przezroczystą folią uszczelniającą. Teraz należy zoptymalizować warunki cykli PCR. Typowy zestaw warunków rozpoczyna się od pięciominutowego czasu denaturacji.Następnie przeprowadza się 30 cykli PCR z dziesięciosekundową denaturacją, 25-sekundowym czasem przyłączania i 30-sekundową elongacją. Reakcję należy zakończyć dodatkową 32. denaturacją, a następnie schłodzić do 15 °C. Płytkę PCR należy przeanalizować, umieszczając ją w systemie analizy krzywych topnienia w oprogramowaniu.Ustaw temperaturę i utwórz nowy plik przechowywania danych. Skonfiguruj podzbiór. Wybierz studzienki z próbkami w lewym dolnym rogu ekranu.Wybierz zakładkę „normalized”, aby wyeliminować warianty fluorescencyjne. Ręcznie ustaw równoległą podwójną linię w obszarach prem, melt oraz post melt, a następnie znormalizuj sygnały fluorescencyjne wszystkich próbek w obszarach premelt i post melt odpowiednio do wartości jeden i zero. Następnie rozróżnij genotypy na podstawie ich temperatury topnienia, wybierając najpierw opcję grupowania.Następnie wybierz opcję auto group z standardowej listy wyboru. W sekcji grouping wybierz normal lub high dla profili topnienia z pojedynczymi lub wielokrotnymi przejściami odpowiednio. Znajdują się one na liście wyboru sensitivity w sekcji grouping.Teraz w sekcji grupowania należy wybrać grupy obliczeniowe, a następnie przejść do menu pliku i kliknąć zapisz, aby zapisać wyniki. Protokół można przeprowadzić w ciągu jednego dnia lub podzielić na etapy w ciągu kilku dni. Podczas przeprowadzania PCR temperatury topnienia amplikonu zależą od jego wielkości i zawartości GC, jednak zazwyczaj odpowiednie są temperatury początkowa 60 °C i końcowa 95 °C po przeprowadzeniu topnienia.Analiza fluorescencyjnych krzywych topnienia zazwyczaj wymaga normalizacji zmienności krzywych poszczególnych próbek przy użyciu obszarów przed i po topnieniu jako standardów. Poprawia to porównywalność wyników z różnych próbek, w których zmienność fluorescencji wynika z niewielkich różnic eksperymentalnych. Każda para linii temperatury służących do normalizacji powinna być rozmieszczona w odstępach około jednego stopnia Celsjusza.Dane można przedstawić na dwa sposoby: za pomocą wykresu pokazującego profile krzywych topnienia lub wykresu różnic odejmowanych w porównaniu z próbką referencyjną; po przeprowadzeniu analizy HRMA można wykryć mutacje lub transgeny. Dwie różne mutacje w genie EIF2B5 są zaznaczone krzywymi czerwoną i niebieską. Próbki zmutowane te są identyfikowane na podstawie znaczących różnic w kształcie ich krzywych topnienia lub zmian w fluorescencji w porównaniu z krzywymi standardowego typu dzikiego.Ten przykład czterech różnych genotypów w jednej kolekcji zarodków ilustruje możliwości i czułość tej metody. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż osiem godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania HRMA w celu wydajnego przesiewania genotypów rybek danio w dużej skali.

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie i wydajne genotypowanie rybek zebry za pomocą PCR z wysokorozdzielczym analizowaniem topnienia

Ten artykuł opisuje ekstrakcję DNA z klipsa do ogona danio pręgowanego. Protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę analizy genotypów danio pręgowanego.

Ekstrakcja DNA z klipsa ogonowego: metoda stosowana w genotypowaniu danio pręgowanego

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Naucz się szybkiego genotypowania danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia wykrywanie mutacji i transgenów z dużą czułością i niezawodnością.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów