Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie badanie przesiewowe pod kątem różnych genotypów, mutacji lub transgenów u danio pręgowanego. Osiąga się to najpierw poprzez ekstrakcję DNA z cienkich klipsów, a następnie amplifikację DNA metodą PCR. Następnym krokiem jest denaturacja amplikonów PCR przy jednoczesnym rejestrowaniu krzywych topnienia, które są analizowane przez oprogramowanie.

Ostatecznie wyniki wskazują na wyraźne krzywe topnienia dla różnych genotypów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą, taką jak elektroforeza żelowa objętościowa PCR, jest to, że jest wrażliwa na zmiany pojedynczego nukleotydu, małą insercję, wszystkie delecje, a technika ta jest szybka i niezawodna. Chociaż technika ta może być stosowana do szybkiego i skutecznego genotypowania ryb danio pręgowanego, może być również stosowana do innych systemów i organizmów modelowych, w tym linii komórkowych, myszy i innych zwierząt.

W dniu przygotowania DNA dodać świeżą proteinazę K do buforu do lizy w stężeniu jednego miligrama na mililitr. Tkankę można pobrać od dorosłej ryby za pomocą cienkiego klipsa lub od ryby embrionalnej. Najpierw znieczulij rybę w roztworze Trica.

Poczekaj, aż ruchy skrzeli zwolnią. Następnie połóż rybę na stosie chusteczek i sterylną żyletką odetnij mały kawałek płetwy ogonowej o długości około dwóch do trzech milimetrów. Szybko umieść rybę w oznakowanym zbiorniku ze świeżą wodą w celu odzyskania sił.

Podnieś klips do płetwy ze sterylną końcówką pipety i przenieś go do probówki wypełnionej 100 mikrolitrami buforu do lizy DNA. Pamiętaj, aby oznaczyć zarówno zbiornik zwierzęcia, jak i probówkę, inkubować wszystkie zebrane tkanki przez co najmniej cztery godziny i do nocy w temperaturze 55 stopni Celsjusza po inkubacji. Dezaktywuj białko ACE K, podgrzewając probówki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Próbki te powinny być natychmiast wykorzystane do PCR, ale mogą być również przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy. Wykonaj PCR na płytce 96 lub 384-dołkowej dla każdej reakcji. Połącz nie więcej niż jeden mikrolitr dorosłego DNA z czterema mikrolitrami skanera świetlnego.

Główna mieszanina zawierająca sondę fluorescencyjną i startery o końcowym stężeniu pięciu pikomolowców każdy. Jeśli DNA pochodziło z zarodka, użyj do trzech mikrolitrów. Przykryj reakcje 30 mikrolitrami oleju mineralnego, a następnie zamknij je.

Następnie przykryj załadowaną płytkę PCR optycznie przezroczystą uszczelką samoprzylepną. Teraz zoptymalizuj warunki cyklu PCR. Typowy zestaw warunków zaczyna się od pięciu minut czasu topnienia.

Następnie następuje 30 cykli PCR z dziesięciosekundowym topnieniem, 25 sekundami klęczenia i 30 sekundami wydłużania. Reakcja powinna zakończyć się dodanym 32. stopieniem, a następnie schłodzić się do 15 stopni Celsjusza. Przeanalizuj płytkę PCR, umieszczając ją w systemie analizy stopu w oprogramowaniu.

Ustaw temperaturę i utwórz nowy plik do przechowywania danych. Skonfiguruj podzbiór. Wybierz studzienki z próbkami w lewym dolnym rogu ekranu.

Wybierz zakładkę znormalizowaną, aby wyeliminować warianty fluorescencyjne. Ręcznie ustaw równoległą podwójną linię w obszarach prem, melt i post melt i znormalizuj sygnały fluorescencyjne przed i po stopieniu wszystkich próbek odpowiednio do jednego i zera. Następnie rozróżnij genotypy na podstawie ich temperatury topnienia, wybierając najpierw grupowanie.

Następnie wybierz grupę automatyczną z listy wyboru standardowego. W sekcji grupowania wybierz normalną lub wysoką dla profili topnienia z pojedynczymi przejściami lub wieloma przejściami. Znajdują się one na liście wyboru poufności w sekcji grupowania.

Teraz wybierz grupy obliczeniowe w sekcji grupowania, a następnie przejdź do menu plik i kliknij Zapisz, aby zapisać wyniki. Protokół może być wykonywany w ciągu jednego dnia lub podzielony na etapy przez kilka dni. Podczas wykonywania PCR temperatury stopienia amplikonu zależą od wielkości i zawartości GC, ale generalnie temperatury początkowe i końcowe 60 stopni Celsjusza i 95 stopni Celsjusza są odpowiednie po przeprowadzeniu stopienia.

Analiza fluorescencyjnych krzywych topnienia zazwyczaj wymaga normalizacji zmienności różnych krzywych próbki przy użyciu regionów przed i po stopieniu jako wzorców. Ułatwia to porównywanie wyników z różnych próbek, w których zmienność fluorescencji jest związana z niewielkimi zmianami eksperymentalnymi. Każda para linii temperatury do normalizacji powinna być oddalona od siebie o około jeden stopień Celsjusza.

Dane można przedstawić na dwa sposoby za pomocą wykresu, który pokazuje pliki profili krzywej topnienia, lub za pomocą wykresu, który pokazuje wykres różnic subtraktywnych w porównaniu z próbką referencyjną po wykryciu mutacji lub transgenów w analizie HRMA. Dwie różne mutacje w genie EIF dwa B pięć są oznaczone czerwonymi i niebieskimi krzywymi. Te zmutowane próbki są identyfikowane na podstawie ich znaczącej różnicy w krzywej topnienia, kształtach lub zmianie fluorescencji w porównaniu ze standardowymi krzywymi typu dzikiego.

Ten przykład czterech różnych genotypów w jednej kolekcji zarodków ilustruje moc i czułość tej metody. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż osiem godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać HRMA w celu skutecznego badania przesiewowego genotypów danio pręgowanego na dużą skalę.