Name: Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj protokół edycji genomu CRISPR/Cas9 w zebrafii Danio rerio. Ta metoda umożliwia generowanie nokautów genów i identyfikację mutacji, wspierając badania funkcji genów w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R21CA182197 do J.O.), Ralph W. and Grace M. Showalter Research Trust, oraz przez program Purdue Agricultural Science and Extension for Economic Development (AgSEED). Dane sekwencjonowania Sangera zostały pozyskane przez placówkę Purdue Genomics Core wspieraną przez P30 CA023168. Mary Witucki była wspierana przez Purdue University Center for Cancer Research Summer Undergraduate Research Program, wspierany przez Carroll County Cancer Association. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Benjaminowi Carterowi, Ellen Denning i Taylor Sabato za krytyczne opinie na temat rękopisu. Dziękujemy Wydziałowi Biochemii za wsparcie tej pracy oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Purdue za ich poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Na koniec dziękujemy Purdue Genomics Core Facility oraz wkładowi Phillipa San Miguela w usługi NGS.

Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez New England Biolabs.

Protokół ten opisuje wytwarzanie nokautów genów w systemie modelowym kręgowców danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Wcześniej opisano szereg protokołów mających na celu przeprowadzenie inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR u danio pręgowanego 15,25,26,50,51,52. Protokół ten opiera się na wcześniejszych wysiłkach, łącząc szereg prostych, ale odtwarzalnie spójnych technik eksperymentalnych, w szczególności HMA i NGS wielu heterozygotycznych ryb, w celu stworzenia prostego, ekonomicznego i solidnego eksperymentalnie protokołu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u danio pręgowanego, który jest odpowiedni dla laboratoriów zatrudniających personel z różnymi szkoleniami i doświadczeniem, a także laboratoriów dydaktycznych.
Zalecenia dotyczące projektowania i syntezy przewodnikowych RNA są zawarte w tym protokole. Głównym czynnikiem branym pod uwagę przy projektowaniu przewodnika RNA jest minimalizacja efektów poza celem. Opracowano kilka algorytmów predykcyjnych, aby umożliwić użytkownikom CRISPR dostęp do narzędzi obliczeniowych z przyjaznymi dla użytkownika interfejsami graficznymi, które przewidują zarówno aktywność przewodnika na celu, jak i prawdopodobieństwo wystąpienia efektów niedocelowych 34,35,36. Szczególną zaletą systemu danio pręgowanego jest obniżone wskaźniki efektów niedocelowych, ponieważ Cas9 jest wstrzykiwany do zarodków, a zatem ekspresja jest przejściowa, co, jak wykazano u myszy, powoduje zmniejszenie efektów poza celem53. Niemniej jednak wykazano, że efekty niezamierzone występują u danio pręgowanego54. Jednym ze sposobów kontrolowania efektów niedocelowych jest fenotypowanie danio pręgowanego, który został wygenerowany przez dwa niezależne przewodniki RNA, które celują w ten sam gen, ponieważ te przewodniki z dużym prawdopodobieństwem wpłynęłyby na różne miejsca poza celem. Alternatywną metodą minimalizacji efektów off-target, która nie jest opisana w tym protokole, jest użycie zmutowanego Cas9, który generuje pojedyncze pęknięcia nici w docelowym DNA, które są naprawiane z wysoką wydajnością. Parowanie nacięć DNA w pobliżu siebie, które są komplementarne do przeciwległych nici, powoduje skuteczne tworzenie indel w pożądanym locus i minimalizuje efekty off-target55,56.
Oprócz różnych wskaźników efektów off-target, różne sgRNA mogą mieć różne wskaźniki mutagenezy pożądanego celu 57,58,59. Protokół ten wykorzystuje HMA do analizy skuteczności mutagenezy danego sgRNA przy użyciu tworzenia pasma heterodupleksu33,40. Pasma heterodupleksowe są tworzone przez hybrydyzację nici DNA generowanych przez PCR, które zawierają niezgodności i można je łatwo rozwiązać za pomocą elektroforezy żelowej. W przeciwieństwie do innych metod powszechnie stosowanych do pomiaru tworzenia indelu, takich jak test endonukleazy T7 lub analiza stopu w wysokiej rozdzielczości25,26, HMA nie wymaga drogiego enzymu do cięcia niedopasowanego DNA i nie wymaga skomplikowanej analizy krzywych topnienia PCR. Co ważne, wykorzystanie HMA do weryfikacji wysokiego tempa powstawania indeli w wstrzykiwanej populacji umożliwia również badaczowi zminimalizowanie liczby ryb potrzebnych do późniejszej produkcji linii knock-out, co zmniejsza koszt identyfikacji mutacji o pożądanych cechach.
Względna łatwość generowania indeli opartych na CRISPR umożliwia tworzenie wielu alleli wielu genów jednocześnie. Oprogramowanie internetowe jest dostępne do analizy pojedynczych mutacji u ryb heterozygotycznych przy użyciu sekwencjonowania Sangera produktów PCR49. W przypadku, gdy analizowane są trzy lub więcej alleli z mutacją CRISPR, NGS w celu scharakteryzowania charakteru indela będzie prawdopodobnie bardziej opłacalne w celu scharakteryzowania charakteru indelu, ponieważ takie podejście pozwala na scharakteryzowanie puli do 50 różnych alleli jednocześnie (patrz Tabela materiałów)60,61, Lokal mieszkalny 62. Taka ekonomia skali byłaby prawdopodobnie szczególnie przydatna w warunkach laboratoryjnych na studiach licencjackich.
Podsumowując, protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące powtarzalnego generowania wysokiej jakości odczynników CRISPR (w szczególności sgRNA), dzięki czemu trzeba tworzyć i analizować mniej dorosłych ryb, aby skutecznie zidentyfikować zmutowane allele będące przedmiotem zainteresowania, co również skraca czas i koszt generowania pożądanych linii. Co ważne, protokół ten został opracowany w taki sposób, aby mógł być stosowany przez laboratoria o ograniczonych zasobach do produkcji zmutowanych danio pręgowanego w przystępny sposób. Co więcej, stwierdziliśmy, że takie podejście jest odpowiednie dla studentów studiów licencjackich, a tym samym rozszerza możliwości edukacji i szkolenia studentów studiów licencjackich zainteresowanych praktycznym doświadczeniem w edycji genomu opartej na CRISPR.

Zachowanie maszynerii molekularnej u eukariontów leży u podstaw możliwości wykorzystania organizmów modelowych do badań. Wiele z tych systemów modelowych ułatwia stosowanie podejść opartych na odwróconej genetyce, takich jak celowane nokauty genów, w celu scharakteryzowania wkładu produktu genetycznego w proces biologiczny lub chorobowy będący przedmiotem zainteresowania. Techniki zakłócania genów u organizmów takich jak danio pręgowany historycznie opierały się na ukierunkowanym wprowadzaniu mutacji przesunięcia ramki odczytu, które wynikają z nieprecyzyjnej naprawy DSBs1,2. Kiedy DSB jest wprowadzany do genomu, uszkodzenie DNA jest naprawiane przez jeden z dwóch szlaków, które są powszechnie obecne w prawie wszystkich typach komórek i organizmów: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR)3,4. Nieprecyzyjny charakter maszyn NHEJ często wytwarza indele o różnych długościach5,6,7,8,9. Wprowadzenie mutacji przesunięcia ramki odczytu w sekwencji kodującej gen może wytworzyć przedwczesny kodon stop, który często powoduje, że gen staje się niefunkcjonalny.
Wczesne strategie inżynierii genomu u danio pręgowanego mające na celu promowanie indeli obejmowały meganukleazy, nukleazy palców cynkowych i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji, z których wszystkie wykorzystywały interakcje DNA-białko do kierowania nukleazy do określonego celu genomowego, gdzie wprowadzały DSB10,11,12,13,14,15. Jednak technologie te są często trudne do zastosowania ze względu na pracochłonną i złożoną inżynierię potrzebną do wygenerowania nukleazy, która celuje w sekwencję DNA, która jest przedmiotem zainteresowania. W przeciwieństwie do poprzednich strategii, edycja genów oparta na CRISPR nie opiera się na interakcjach białko-DNA w celu ukierunkowania. Zamiast tego endonukleaza związana z CRISPR (Cas) jest kierowana przez przewodnik RNA, który wykorzystuje interakcje parowania zasad nukleotydowych, aby celować w interesujące miejsce genomu16,17,18,19,20,21. Ze względu na prostotę projektowania przewodnika RNA z pożądanymi interakcjami parowania zasad do celowania, stosunkowo łatwo jest skierować endonukleazę Cas do pożądanego locus. W szczególności system CRISPR typu II został szeroko opracowany do zastosowań związanych z edycją genomu ze względu na kilka korzystnych cech, w tym zastosowanie pojedynczej wielodomenowej nukleazy Cas (Cas9), która wymaga interakcji z DNA w celu stymulacji aktywności endonukleazy oraz użycie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) w celu ukierunkowania go na pokrewną sekwencję DNA18. Wymagania dotyczące sekwencji niezbędne do celowania w pokrewne sgRNA są dobrze poznane19, a pożądany sgRNA można łatwo wygenerować przez transkrypcję in vitro. Prostota i solidność podejścia opartego na CRISPR/Cas9 znacznie ułatwia ukierunkowaną modyfikację genetyczną u danio pręgowanego i wielu innych organizmów.
Zwiększona zdolność do celowej edycji genomu u ryb pręgowanych w wyniku opracowania odczynników opartych na CRISPR znacznie zwiększyła możliwość badania procesów charakterystycznych dla organizmów kręgowców, takich jak rozwój ośrodkowego układu nerwowego. Genom danio pręgowanego zawiera ortologi 70% genów kodujących białka znajdujących się w ludzkim genomie, a także 84% genów związanych z chorobami u ludzi22. Rozwój danio pręgowanego wykazuje kilka kluczowych cech, które zwiększają jego zastosowanie w odwrotnych badaniach genetycznych: zarodki są składane w dużych lęgach, rozwijają się zewnętrznie od matki, co czyni je podatnymi na manipulację genetyczną przez mikroiniekcję, a dorosłe danio pręgowane osiągają dojrzałość płciową w wieku 3 miesięcy, co pozwala na szybkie rozmnażanie pożądanych linii23.
Dostępnych jest wiele protokołów, które opisują różne podejścia do generowania i identyfikacji indeli pochodzących z CRISPR u danio pręgowanego24,25,26,27,28,29,30,31. Jednak wiele z tych procedur jest czasochłonnych, wymaga dostępu do drogiego sprzętu i może stanowić wyzwanie dla laboratoriów o ograniczonej wiedzy specjalistycznej. Kroki opisane w tym dokumencie zapewniają prostą, solidną i ekonomiczną strategię CRISPR/Cas9 do projektowania linii do wybijania danio pręgowanego. Protokół ten opisuje użycie wysoce wydajnego zestawu do syntezy sgRNA przy użyciu oligonukleotydów DNA (oligonukleotydów), podobnie jak w przypadku innych podejść, które zostały wcześniej opisane32. Opisany protokół obejmuje w szczególności dwa kroki, które znacznie upraszczają analizę linii zmutowanych przez CRISPR: krok po kroku użycie opartego na PCR HMA33 w celu łatwego określenia obecności modyfikacji genomu oraz analizę sekwencjonowania heterozygotycznego danio pręgowanego w celu szybkiego i łatwego określenia charakteru wielu indeli w ekonomiczny sposób. Ponadto dołączone są instrukcje krok po kroku dotyczące solidnej selekcji, niezawodnej produkcji i wstrzykiwania przewodników RNA. Przedstawione tutaj kroki są przykładem solidnego, stosunkowo niedrogiego protokołu, który umożliwia personelowi laboratoryjnemu posiadającemu szeroką wiedzę specjalistyczną przyczynienie się do identyfikacji nokautów genów u danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie do</td><td>analizy sgRNA</td> CRISPOR<td></td><td></td>. Oprogramowanie do analizy sgRNA http://crispor.tefor.net/</tr> <tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>oprogramowanie do analizy sgRNA ChopChop</td><td></td><td></td><td></td>. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</tr> <tr><td>Konstrukcja startera PCR</td> <td>Primer 3</td><td></td><td></td>. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</tr><tr>Technika <td></td><td></td><td>wolna od rnaz</td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Synteza przewodnikowych RNA. Zarówno Thermo Fisher, jak i Qiagen mają przy sobie odpowiednią wodę.</td></tr><tr><td>Etanol bez rnazy</td><td>Etanol dowolnej marki</td><td></td><td>klasy biologii molekularnej nie zawiera Rnazy. Fischer, VWR sprzedają odpowiedni etanol.</td></tr><tr><td>Białko Cas9</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>Białko Cas9 z sygnałem lokalizacji jądrowej.</td></tr><tr><td>Celuj w specyficzne oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td>Syntetyzuj przewodnikowe RNA.</td></tr><tr><td>Startery PCR flankujące prowadnicę RNA miejsce cięcia Zintegrowane</td><td>technologie DNA (IDT)</td><td></td><td>Służy do analizy heterodupleksowej, produkt 100-300 pz.</td></tr><tr><td>Startery PCR flankujące prowadnicę RNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td>Służy do sekwencjonowania alleli CRISPR, zalecany produkt 300-600 pz.</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy sgRNA EnGen</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>Przewodnik transkkrybacji in vitro RNA.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>Bufor wolny od RNaz do elektroforezy kwasów nukleinowych.</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Ładowanie DNA do elektroferezy.</td></tr><tr><td>5M octan amonu</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Odczynnik czyszczący do oczyszczania prowadzących RNA.</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof, bez nukleazy)</td> <td>Odczynnik do czyszczenia dowolnej marki</td><td></td><td>do oczyszczania przewodnikowych RNA. Materiały klasy molekularnej są wolne od RNaz.</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Do syntezy i oczyszczania przewodnikowych RNA.</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>Eliminuje zanieczyszczenie RNazą z powierzchni, sprzętu, szkła.</td></tr><tr><td>Drabinka DNA, 100 pz</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Wzorce masy cząsteczkowej do elektroforezy żelowej DNA.</td></tr><tr><td>Drabinka DNA, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S Wzorce</td><td>masy cząsteczkowej do elektroforezy żelowej DNA.</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Jednoniciowy marker RNA do sprawdzenia, czy zsyntetyzowano sgRNA na całej długości</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Casting żel poliakrylamidowy.</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Odlewniczy żel poliakrylamidowy.</td></tr><tr><td>40% Poliakrylamid (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Odlewniczy denaturujący żel poliakrylamidowy.</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Odlewniczy żel poliakrylamidowy denaturujący.</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel RNA (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Przewodnik ładowania RNA na żel denaturujący do elektroforezy.</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Wizualizacja kwasów nukleinowych.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Alternatywna metoda do bromku etydyny do wykrywania dsDNA w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych.</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Oczyszczanie RNA, oczyszczanie PCR.</td></tr><tr><td>MyTaq Polimeraza</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Do amplifikacji DNA za pomocą PCR.</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Wzmacniacz PCR</td> <td>dowolnej marki</td><td></td>.</tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>NanoDrop lub pokrewny produkt do ilościowego określania ilości DNA / RNA.</td></tr><tr><td>Pożywka dla zarodków E3</td><td>Wykonana w domu</td><td></td><td>Pożywka do hodowli zarodków i wytwarzania płytki injeciton. Przepis: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Dodawany do 1x pożywki E3, aby zapobiec rozwojowi grzybów na zarodkach.</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Przechowuj zarodki, odlewana płytka iniekcyjna.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Odlewnicza płytka wtryskowa, żele agarozowe.</td></tr><tr><td>Forma mikroinekcyjna</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>TU-1</td><td>Do tworzenia studzienek do przetrzymywania zarodków podczas wstrzykiwania.</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp;</td><td>Barwnik do wizualizacji iniekcji.</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Do kalibracji objętości iniekcji igły.</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Przenoszenie zarodków.</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Igła do iniekcji tnącej, obcinanie ogona dorosłej ryby.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Utrzymywanie zarodków w temperaturze 28,5 oC.</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet pionowych</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Igły Geneate do wstrzykiwań. Dodatkowe instrukcje dotyczące wyciągania igły: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Igły Geneate do wstrzykiwań.</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarki</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Roztwór należy załadować do igieł iniekcyjnych.</td></tr><tr><td>Mikrowstrzykiwacz</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Wstrzykiwanie zarodków.</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td></td><td>Wstrzykiwanie zarodków.</td></tr><tr><td>30% Poliacyloamid (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Odlew żelowy Heteroduplex.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Znieczulenie danio pręgowanego do obcinania ogonów i ekstrakcji gDNA z zarodków. Przepis: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Odlewana płytka wtryskowa, żele agarozowe.</td></tr><tr><td>Skala</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Odlewana płyta wtryskowa, żele agarozowe.</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Dla wszystkich aspektów protokołu.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Do usuwania płynu z naczynia włosowatego w celu wstrzyknięcia zarodka.</td></tr><tr><td>1 000 i mikro; L&nbsp; wskazówki</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Dla wszystkich aspektów protokołu.</td></tr><tr><td>200 i mikro; L napiwki</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Dla wszystkich aspektów protokołu.</td></tr><tr><td>10 &mikro; L napiwki</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Dla wszystkich aspektów protokołu.</td></tr><tr><td>Probówki paskowe do PCR</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Dla wszystkich aspektów protokołu.</td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Dla wszystkich aspektów protokołu.</td></tr><tr><td>Platforma sekwencjonowania NGS: Wideseq</td><td></td><td></td><td>Jeśli Twoja instytucja nie oferuje tej usługi, odwiedź: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (koszt zewnętrzny: 35 USD).</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy</td><td></td><td></td> sekwencji <td>Do sekwencjonowania Sangera ryb heterozygotycznych. Odwiedź: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do analizy</td><td></td><td></td> sekwencji <td>SnapGene Viewer, Sequence Scanner do analizy sekwencjonowania NGS.</td></tr></tbody></table>

wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez crispr/cas9 w systemie modelowym danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Charakterystyka systemu CRISPR (ang. clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat) Streptococcus pyogenes umożliwiła rozwój konfigurowalnej platformy do szybkiego generowania modyfikacji genów w wielu różnych organizmach, w tym u danio pręgowanego. Edycja genomu oparta na CRISPR wykorzystuje pojedynczy przewodnik RNA (sgRNA) do kierowania endonukleazy związanej z CRISPR (Cas) do celu genomowego DNA (gDNA) będącego przedmiotem zainteresowania, gdzie endonukleaza Cas generuje pęknięcie podwójnej nici (DSB). Naprawa DSB przez mechanizmy podatne na błędy prowadzi do wstawień i/lub delecji (indels). Może to powodować mutacje z przesunięciem ramki odczytu, które często wprowadzają przedwczesny kodon stop w sekwencji kodującej, tworząc w ten sposób allel zerowy białka. Inżynieria genomu oparta na CRISPR wymaga tylko kilku składników molekularnych i można ją łatwo wprowadzić do zarodków danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji. Protokół ten opisuje metody stosowane do generowania odczynników CRISPR do mikroiniekcji danio pręgowanego oraz do identyfikacji ryb wykazujących transmisję genów zmodyfikowanych CRISPR w linii zarodkowej. Metody te obejmują transkrypcję sgRNA in vitro, mikroiniekcję odczynników CRISPR, identyfikację indeli indukowanych w miejscu docelowym za pomocą metody opartej na PCR zwanej testem ruchliwości heterodupleksowej (HMA) oraz charakterystykę indeli przy użyciu zarówno niskiej przepustowości, jak i potężnego podejścia opartego na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS), które może analizować wiele produktów PCR zebranych od ryb heterozygotycznych. Protokół ten został uproszczony w celu zminimalizowania zarówno liczby wymaganych ryb, jak i rodzajów sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia analiz. Co więcej, protokół ten został zaprojektowany tak, aby mógł być używany przez pracowników laboratoriów na wszystkich poziomach doświadczenia, w tym studentów, co umożliwia ekonomiczne zastosowanie tego potężnego narzędzia przez każdą grupę badawczą zainteresowaną przeprowadzeniem modyfikacji genomu u danio pręgowanego opartej na CRISPR.

Podejścia eksperymentalne opisane w niniejszym protokole umożliwiają wydajną i kosztowo efektywną produkcję linii knock-out u rybek zebrafish z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9. W artykule zamieszczono następujące ryciny, aby ułatwić interpretację i rozwiązywanie problemów z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu tego protokołu. Po pomyślnym wytworzeniu i mikroiniekcji odczynników CRISPR, embriony zebrafish można analizować pod kątem wyraźnych fenotypów oraz tworzenia indeli za pomocą HMA. Pomocną kontrolą do wizualizacji sukcesu eksperymentu CRISPR jest zastosowanie sgRNA opisanego w kroku 1.5, celującego w gen odpowiedzialny za produkcję pigmentu tyrosinase. Tworzenie indeli w genie tyrosinase indukowane przez Cas9 skutkuje utratą pigmentacji, co jest łatwo ocenialne do 48 hpf (Rycina 1). Inną pomocną kontrolą zapewniającą poprawność przygotowania odczynników CRISPR do iniekcji jest weryfikacja syntezy pełnowymiarowego (120 nt) sgRNA przy użyciu denaturującego żelu poliakrylowego (Rycina 2, ścieżka 1 i 2). Jeśli RNA uległo degradacji, może pojawić się w formie smugi; na przykład ścieżka 3 (Rycina 2) pokazuje zdegradowane RNA, które nie nadaje się do iniekcji.
W celu analizy częstotliwości tworzenia indeli w genach celowanych przez CRISPR-Cas9, które nie wywołują wyraźnych fenotypów, takich jak tyrosinase, analiza HMA stanowi prostą i niezawodną metodę. Analiza HMA embrionów, do których wstrzyknięto sgRNA/Cas9, prowadzi do powstania prążków heterodupleksowych oraz zmniejszenia intensywności prążka homodupleksowego (Rysunek 4). Obecność prążków heterodupleksowych jest dalej wykorzystywana w niniejszym protokole do identyfikacji potencjalnych ryb założycieli wśród embrionów poddanych mikroiniekcji oraz u osobników dorosłych (Rysunek 4 i Rysunek 5), do analizy wydajności transmisji linii zarodkowej u założyciela (Rysunek 6), a także do weryfikacji obecności indela u heterozygotycznej ryby F1 (Rysunek 7). Ryby heterozygotyczne zawierające indel są kandydatem do sekwencjonowania NGS w celu zidentyfikowania charakteru indela oraz ustalenia, czy w regionie kodującym genu docelowego występuje przedwczesny kodon stop.
<img alt="Rozwój zarodka danio pręgowanego; obraz mikroskopowy; analiza porównawcza; badania biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zarodki danio pręgowanego wykazują defekt pigmentacji po wstrzyknięciu sgRNA celującego w gen tyrosinase w stadium jednego komórki. (A) Zarodek typu dzikiego, niewstrzyknięty, w 48 hpf oraz (B) zarodek wstrzyknięty w 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej, pasma DNA 120 nt w ścieżkach 1-3, analiza rozdziału DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Transkrypcja in vitro sgRNA przy użyciu zestawu do syntezy.Oligonukleotydy zsyntetyzowano metodą transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do syntezy sgRNA. 500 ng RNA poddano elektroforezie na żelu urea/PAGE zgodnie z opisem. sgRNA naniesione na ścieżki 1 i 2 wykazuje pasmo odpowiadające pełnej długości, nienaruszonego RNA o długości 120 nt. sgRNA w ścieżce 3 wykazuje zdegradowaną próbkę RNA, która nie nadaje się do wstrzyknięcia.
<img alt="Obraz mikroskopowy faz rozwoju zarodka, porównanie, skala 500 µm, analiza eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Porównanie stanu zdrowotnego wstrzykniętych zarodków w 24 hpf. Żywy zarodek (A) rozwinięty do 24 hpf można łatwo odróżnić od zarodka, którego rozwój został przerwany (B). Zarodki przypominające (B) lub wykazujące cechy drastycznie odmienne od (A), takie jak skrzywienie kręgosłupa lub zaburzony rozwój głowy i oczu, powinny zostać usunięte z naczynia. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel elektroforetyczny wykazujący prążki DNA heterodupleksowego i homodupleksowego; ścieżki M, 1, 2, 3; marker 100 bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza mobilności heterodupleksów w embrionach ryb zebrafish po mikroiniekcji sgRNA-Cas9. Pobrano grupy po 5 embrionów na próbkę w 72 hpf i wyekstrahowano gDNA. Analizę heterodupleksów przeprowadzono zgodnie z opisem; na ścieżki naniesiono równą ilość 500 ng DNA. Ścieżki: M = marker 100 bp; 1 = kontrola nieiniekcyjna; 2 = próbka iniekcyjna 1; 3 = próbka iniekcyjna 2. Przewidywana wielkość prążka = 98 bp.
<img alt="Żel do elektroforezy DNA pokazujący prążki heterodupleksowe i homodupleksowe dla analizy sekwencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza mobilności heterodupleksów gDNA wyizolowanego z ogona dorosłego danio pręgowanego po wstrzyknięciu CRISPR. Zarodki, którym wstrzyknięto sgRNA i białko Cas9, hodowano do osiągnięcia dojrzałości (3 miesiące). Ryby B i C wykazują prążki heterodupleksowe i zostały następnie wykorzystane do rozrodu w celu zidentyfikowania indeli przenoszonych w linii zarodkowej; ryba A nie została użyta w dalszej analizie, ponieważ nie wykazuje dodatniego prążka heterodupleksowego. Ścieżki: 1 = kontrola typu dzikiego; 2 = Ryba A; 3 = Ryba B; 4 = Ryba C. Oczekiwana wielkość prążka = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; analiza heterodupleksu z markerem 100 bp w ścieżkach; proces rozdziału DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Analiza mobilności heterodupleksu pojedynczych zarodków uzyskanych z krzyżowania osobników F0 zebrafish wstrzykniętych CRISPR z rybami typu dzikiego w celu zidentyfikowania indeli przekazywanych w linii zarodkowej. Ryby zebrafish zostały skrzyżowane, a zarodki F1 hodowano przez 72 h. Zebrano pojedyncze zarodki i przeprowadzono analizę heterodupleksu zgodnie z opisem. Ścieżki: 1 = kontrola typu dzikiego; 2-10 = jeden zarodek F1 na ścieżkę. Żel ten pokazuje, że 7 z 10 zarodków wykazuje pozytywny prążek heterodupleksu, co wskazuje na 70% odsetek przekazywania indela w linii zarodkowej. Oczekiwana wielkość prążka = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej, prążki DNA, ścieżki WT 1-3, pokazujące markery 139 bp i 120 bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Analiza mobilności heterodupleksów w wycinkach ogonów dorosłych ryb zebrafish F1. Dorosłe ryby F1 oceniono za pomocą HMA w celu zidentyfikowania indeli. Ryby, które wykazały obecność prążka heterodupleksu, poddano amplifikacji PCR i analizie sekwencjonowania szerokiego w celu określenia charakteru mutacji. (A) Ścieżki: 1 = kontrola typu dzikiego; 2 = ryba A (delecja 4 bp, niedopasowanie 1 bp). (B) Te ryby F1 zostały zidentyfikowane z tego samego osobnika założyciela, a mimo to wykazują różne wzory heterodupleksów, co wskazuje na transmisję linii zarodkowej wielu zmodyfikowanych alleli od jednego założyciela. Ścieżki: 1 = kontrola typu dzikiego; 2 = ryba B (insercja 4 bp, niedopasowanie 7 bp), 3 = ryba C (delecja 4 bp, niedopasowanie 4 bp). Każdy z tych indeli spowodował powstanie przedwczesnego kodonu stop w sekwencji kodującej genu docelowego, co ustalono za pomocą NGS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie ukierunkowanej edycji genomu przy użyciu technologii CRISPR/Cas9 u danio pręgowanego w celu inżynierii nokautów genów w solidny i niedrogi sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologicznej roli genu w kontekście systemu modelowego kręgowców, takie jak to, w jaki sposób gen przyczynia się do procesów rozwojowych u eukariontów wyższego rzędu. Dzięki tym prostym, solidnym procedurom personel laboratoryjny na wszystkich poziomach doświadczenia, w tym studenci, może przeprowadzać ukierunkowane modyfikacje genomu u danio pręgowanego.Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, powinny być w stanie postępować zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby zidentyfikować optymalne cele genomowe dla mutagenezy CRISPR, wykonać mikroiniekcję zarodka danio pręgowanego i zidentyfikować zmodyfikowane allele. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ metoda ta jest przeznaczona dla studentów, którzy mogą nie być zaznajomieni z jedną lub kilkoma niezbędnymi technikami. Wytyczne dotyczące projektowania specyficznych dla matrycy oligonukleotydów do produkcji przewodnikowego RNA znajdują się w protokole tekstowym.Na początek zawiesić białko Cas9 w buforze, aby wytworzyć jeden miligram na mililitr roztworu. Roztwór ten należy przechowywać w podwielokrotnościach gotowych do wstrzykiwań, w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Następnie zsyntetyzuj sgRNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro, takiego jak ten sugerowany w materiałach tego artykułu, zgodnie z instrukcjami producenta.Oczyść zsyntetyzowane sgRNA za pomocą wytrącania octanu amonu wolnego od RNAzy. Dodaj 25 mikrolitrów pięciomolowego octanu amonu do zsyntetyzowanego RNA i wymieszaj roztwór przez wirowanie. Następnie dodaj do próbki 150 mikrolitrów 200-procentowego etanolu wolnego od nukleaz.I umieść reakcję w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 20 minut. Następnie odwirować próbki z maksymalną prędkością. Użyć pipety, aby usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu RNA.Następnie dodaj jeden mililitr 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć rurkę, aby zmyć resztki soli z tubki. Ponownie odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem minut. Użyj pipety P1000, aby usunąć większość roztworu.Następnie użyj pipety P200, aby usunąć jak najwięcej pozostałego roztworu bez naruszania granulki. Uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia RNAzą, wysuszyć osad w czystym miejscu, aż w probówce nie będą widoczne krople cieczy. Zawiesić osad w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNA i użyć spektrofotometru do ilościowego określenia produktu.Podaj roztwór do długotrwałego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj od 300 do 500 nanogramów sgRNA z równą objętością barwnika ładującego żel 2X RNA. Następnie, za pomocą pipety P1000, kilkakrotnie oczyść każdą z studzienek żelu agarozowego z zanieczyszczeń za pomocą buforu bieżącego.Załaduj roztwory do studzienek żelu agarozowego i uruchom żel pod napięciem 10 woltów na centymetr przez wystarczająco dużo czasu, aby oddzielić prążki RNA na żelu. Czas może się różnić w zależności od aparatu do elektroforezy. Ogólnie rzecz biorąc, przód barwnika powinien być prowadzony do 2/3 s długości żelu.Następnie użyj barwnika kwasu nukleinowego, aby uwidocznić pasma. Nienaruszone RNA pojawia się jako pojedynczy prążek, taki jak na pierwszym i drugim pasie pokazanym tutaj. Zdegradowany RNA przebiega jako rozmaz, taki jak na trzecim pasie.Po pierwsze, przygotuj osoby badane danio pręgowanego do rozmnażania w noc poprzedzającą wykonanie zastrzyków, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie połącz białko Cas9 i sgRNA w stosunku dwa do jednego. Inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut, podczas gdy Cas9 i sgRNA tworzą kompleks rybonukleoproteinowy.Następnie dodaj 0,5 mikrolitra 2,5% roztworów czerwieni fenolowej do wystarczającej ilości wody wolnej od RNA, aby uzyskać końcową objętość pięciu mikrolitrów. Aby przygotować igłę do wstrzykiwań, należy użyć ściągacza do mikropipet, aby naciągnąć szklaną kapilarnę o średnicy jednego milimetra. Następnie odetnij końcówkę powstałej szklanej igły żyletką, aby uzyskać kątowy otwór.Umieść igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza. Używając mikroskopu świetlnego, wyreguluj ciśnienie wstrzykiwania, aż igła będzie konsekwentnie wstrzykiwać jeden nanometr roztworu na szalkę Petriego. Przed wykonaniem mikroiniekcji zarodka należy przećwiczyć przygotowywanie igieł i wstrzykiwanie zarodków kontrolnych przy użyciu roztworu zawierającego wyłącznie barwnik i odnotować przeżycie po 24 godzinach od rozwoju.Powinieneś być w stanie uzyskać więcej niż 90% przeżycia w porównaniu z grupą kontrolną bez wstrzyknięcia. Następnie wybierz od 10 do 15 zarodków jako populację kontrolną i umieść je na osobnej oznakowanej szalce Petriego. Za pomocą pipety transferowej ostrożnie ułożyć pozostałe zarodki na płytce do wstrzykiwań o temperaturze pokojowej.Pod mikroskopem preparacyjnym wstrzyknąć jeden nanolitr roztworu do woreczka żółtkowego każdego zarodka. Następnie umieść wstrzyknięte zarodki na oznakowanej szalce Petriego i przykryj je pożywką 1X E3 z błękitem metylenowym. Umieść wstrzyknięte zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 24 godziny.Następnie należy sprawdzić wstrzyknięte zarodki, aby usunąć martwe lub nieprawidłowo rozwijające się osoby. Najpierw należy pobrać dwa zestawy pięciu 72-godzinnych zarodków z płytek zawierających wstrzyknięte zarodki i jeden zestaw pięciu 72-godzinnych zarodków z niewstrzykniętej grupy kontrolnej do probówek mikrowirówkowych. Delikatnie odpipetować pożywkę z każdego zestawu zarodków i znieczulić je.Usuń środek znieczulający po dwóch minutach i dodaj 45 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu. Następnie inkubować próbki w temperaturze 95 stopni przez 10 minut. Następnie wyjmij próbki z inkubatora i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.Dodać pięć mikrolitrów jednego molowego chlorowodorku tris o pH i energicznie wirować próbki. Następnie odwiruj roztwór z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Przenieś supernatant, który zawiera genomowe DNA, do nowej znakowanej probówki i przechowuj gDNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Użyj starterów przeznaczonych do amplifikacji wokół regionu docelowego sgRNA, jak opisano w tekście, aby amplifikować fragment PCR do analizy heterodupleksowej. Użyj zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić produkty reakcji PCR. Rozcieńczyć próbki w 30 mikrolitrach wody i użyć spektrofotometru do ilościowego określenia DNA.Umieścić probówki zawierające amplikony PCR w pływającym stojaku we wrzącej łaźni wodnej. Następnie przygotuj 15% poliakryloamidowy żel do KZMiK przy użyciu 30% poliakrylamidu. Po stężeniu żelu należy umieścić go w aparacie do elektroforezy z buforem do pracy TBE.Następnie załaduj 500 nanogramów odnowionych produktów PCR i załaduj kontrolę obok każdego zestawu próbek sgRNA. Uruchom żel pod napięciem 150 woltów przez dwie i pół godziny lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się na dnie żelu. Dorastaj z wstrzykniętymi zarodkami danio pręgowanego do dorosłości, które wykazują heterodupleksowe prążki w HMA.Aby zinterpretować HMA, należy porównać intensywność pasma homodupleksu z PCR niewstrzykniętej kontroli typu dzikiego z odpowiednimi wstrzykniętymi próbkami. Jeśli nastąpiło wystarczające cięcie, intensywność pasma od wstrzykniętych ryb powinna być o około 50% mniejsza niż w przypadku kontroli typu dzikiego. Aby potwierdzić obecność indeli u potencjalnych ryb rodzicielskich, należy znieczulić rybę w 0,004% tricainie i użyć czystej żyletki, aby usunąć od 1/2 do 3/4 płetwy ogonowej.Następnie umieść ogon w 45 mikrolitrach 50-milimolowego wodorotlenku sodu. Zwróć rybę do zbiornika regeneracyjnego i przeprowadź ekstrakcję gDNA zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie wykonaj HMA na gDNA klipsa ogonowego, aby określić, czy dana osoba została pomyślnie zmodyfikowana przez wstrzyknięcie CRISPR.Następnie rozmnażaj dorosłe osobniki, które wykazują heterodupleksowe prążki w DNA ogona, z rybami typu dzikiego. Wybierz rybę założyciela, aby wygenerować ryby F1 na podstawie analizy HMA puli. Na koniec zsekwencjonuj gDNA interesującej ryby, aby scharakteryzować naturę indela.Po udanej produkcji i mikrowstrzyknięciu odczynników CRISPR, zarodki danio pręgowanego przeanalizowano pod kątem jawnych fenotypów i tworzenia indeli za pomocą HMA. Tworzenie indelu indelowego przez Cas9 w tyrozynazie powoduje utratę pigmentacji i jest łatwe do oceny w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu. Identyfikacja alleli zmodyfikowanych przez CRISPR, które nie powodują jawnych fenotypów rozwojowych, odbywa się za pomocą HMA.Skuteczne ukierunkowanie na gen będący przedmiotem zainteresowania powoduje powstawanie prążków heterodupleksowych i zmniejszenie intensywności pasma homodupleksu, np. na pasach trzecim i czwartym. Nie zapominaj, że praca z organizmem kręgowców wiąże się z odpowiedzialnością etyczną. Protokół ten opisuje strategie, które minimalizują liczbę danio pręgowanego potrzebnego do uzyskania nokautu, cel, który należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania tej procedury.Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do szybkiego generowania i identyfikacji danio pręgowanego przenoszących allele zmodyfikowane CRISPR, które będą przekazywane w linii zarodkowej z wysoką wydajnością. Co ważne, technika ta została zoptymalizowana tak, aby była tanim podejściem dostępnym dla studentów i innych osób z niewielkim wcześniejszym doświadczeniem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo zaprojektować i wdrożyć podejście do nokautowania genów oparte na CRISPR przy użyciu danio pręgowanego.

efficient-production-identification-crisprcas9-generated-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Poznaj protokół edycji genomu CRISPR/Cas9 w zebrafii Danio rerio. Ta metoda umożliwia generowanie nokautów genów i identyfikację mutacji, wspierając badania funkcji genów w biologii rozwoju.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Przeglądaj więcej filmów