Name: Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę profilowania czasu replikacji DNA w zarodkach danio pręgowanego. Technika ta pozwala badać zmiany chromatyny podczas rozwoju embrionalnego i ich wpływ na inicjację replikacji DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health poprzez granty 5P20GM103636-02 (w tym wsparcie dla cytometrii przepływowej) i 1R01GM121703, a także nagrody od Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research.

<ol><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721284/">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dynamics+of+replication+timing+revealed+by+in+vitro+models+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis.</a> Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li>
<li>Link, B. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-59745-285-4_13">Zebrafish as a Model for Development.</a> Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+during+development+anticipates+transcriptional+programs+and+parallels+enhancer+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation.</a> Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Danio pręgowany zapewnia nowy i unikalny system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA. Kiedy krzyżowanie w czasie jest wykonywane zgodnie z opisem w tym protokole eksperymentalnym, tysiące zarodków może zostać pobranych w ciągu jednego dnia do eksperymentów. Zarodki te rozwijają się synchronicznie przez precyzyjnie określone w czasie i wyraźnie scharakteryzowane etapy rozwoju. Danio pręgowany można łatwo i dokładnie określić pod względem morfologii za pomocą stereomikroskopu, ponieważ zarodki danio pr...

Aby komórki mogły się pomyślnie podzielić, muszą najpierw dokładnie i wiernie odtworzyć cały swój genom. Duplikacja genomu zachodzi w powtarzalnym wzorcu, znanym jako program do pomiaru czasu replikacji DNA1. Czas replikacji DNA jest skorelowany z organizacją chromatyny, znakami epigenetycznymi i ekspresją genów2,3. Zmiany w czasie replikacji zachodzą w trakcie rozwoju i są istotnie związane z programami transkrypcyjnymi oraz zmianami w znacznikach chromatyny i organizacji4,5. Co więcej, czas replikacji jest skorelowany z częstością mutacji, a zmiany w czasie są obserwowane w różnych typach raka6,7,8. Pomimo tych obserwacji, mechanizmy i determinanty ustalania i regulacji czasu replikacji są nadal w dużej mierze nieznane, a rola, jaką odgrywa w rozwoju i chorobie, jest nieokreślona. Ponadto do niedawna zmiany w czasie replikacji całego genomu, które zachodzą w trakcie rozwoju kręgowców, były badane tylko w modelach hodowli komórkowych.
Danio rerio, Danio rerio, są dobrze przystosowane do badania czasu replikacji in vivo podczas rozwoju, ponieważ pojedyncza para godowa może dać setki zarodków, które rozwijają się szybko z wieloma podobieństwami do rozwoju ssaków9,10. Co więcej, w trakcie rozwoju danio pręgowanego zachodzą zmiany w cyklu komórkowym, organizacji chromatyny i programach transkrypcyjnych, które mają związek z czasem replikacji DNA11. Danio pręgowany jest również doskonałym modelem genetycznym, ponieważ są szczególnie podatne na manipulacje poprzez transgenezę, mutagenezę i mutacje celowane, a badania genetyczne zidentyfikowały wiele genów wymaganych do rozwoju kręgowców12. W związku z tym danio pręgowany może być wykorzystywany do identyfikacji genów zaangażowanych w ustalanie i utrzymywanie czasu replikacji oraz do obserwacji wpływu deregulacji czasu replikacji na rozwój kręgowców. Linie transgeniczne mogą być również wykorzystywane do oceny czasu replikacji z poszczególnych typów komórek wyizolowanych w różnych punktach czasowych rozwoju lub w warunkach chorobowych. Co ważne, istnieją różne modele chorób człowieka u danio pręgowanego, które można wykorzystać do zbadania roli czasu replikacji w powstawaniu i postępie choroby9,13,14.
Niedawno, pierwsze profile czasu replikacji zostały wygenerowane z danio pręgowanego, ustanawiając go modelowym systemem do badania czasu replikacji in vivo15. Aby to osiągnąć, pobrano komórki z zarodków danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju i w typie komórki wyizolowanym od dorosłego danio pręgowanego. Komórki zostały następnie posortowane za pomocą FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją) na podstawie zawartości DNA w celu wyizolowania populacji faz G1 i S. Używając próbki G1 jako kontrolki liczby kopii, określono wariacje liczby kopii w populacjach fazy S i wykorzystano je do wywnioskowania względnego czasu replikacji16. Zmiany w czasie replikacji można następnie bezpośrednio porównać między różnymi próbkami rozwojowymi i typami komórek, co wykorzystano do określenia zmian w czasie replikacji, które zachodzą in vivo w trakcie rozwoju kręgowców. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami genomicznymi, przede wszystkim dlatego, że nie wymaga znakowania analogami tymidyny ani immunoprecypitacji DNA4,6.
Tutaj szczegółowo opisano protokoły do profilowania czasu replikacji DNA w całym genomie w wysokiej rozdzielczości u danio pręgowanego. Protokoły te zostały wykorzystane do określenia relacji z cechami genomicznymi i epigenetycznymi w genomie danio pręgowanego, a także do profilowania zmian w tych relacjach, które zachodzą w trakcie rozwoju. Protokoły te można również łatwo dostosować do badania zmian w czasie replikacji w zmutowanych szczepach danio pręgowanego oraz w modelach chorób. Ponadto metody te stanowią podstawę, którą można rozszerzyć w celu zbadania czasu replikacji w określonych typach komórek, najpierw sortując poszczególne typy komórek od danio pręgowanego. Danio pręgowany może służyć jako doskonały system modelowy in vivo do badania czasu replikacji i ostatecznie ujawnienia biologicznych funkcji tej ważnej cechy epigenetycznej.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td>roztwór proteazy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Chloroform</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>JT Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>Odczynniki do ilościowego oznaczania DNA na podstawie fluorescencji</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>specjalistyczna probówka do sonikacji</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>skoncentrowany ultrasonograf</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>automatyczna maszyna do elektroforezy</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Odczynniki do automatycznej maszyny do elektroforezy</td></tr><tr><td>Zestaw NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit dla Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>multipleksowe oligonukleotydy do zestawu</td></tr> <tr><td>do przygotowania biblioteki DNANEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td><td>dodatkowe multipleksowe oligonukleoty do zestawu do przygotowania biblioteki DNA</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit dla Illumina</td><td>NEB</td><td>Zestaw do kwantyfikacji</td>NEB <td>E7630L</td> do przygotowania biblioteki</tr><tr><td>Koraliki Agencourt AMPure XP Koraliki</td><td>magnetyczne</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td>platforma sekwencjonowania DNA nowej generacji</td></tr><tr><td>40 i mikro; m Nylonowe sitko komórkowe Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szalka Petriego VWR 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 6,0 ml do Nichiryo Model 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Posi-Click, 1,7 mL, kolor naturalny</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Vortex Genie bez Dnazy/Rnazy</td></tr><tr><td>2 Scientific</td><td>Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Butelki do mycia</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Polietylen o niskiej gęstości, sitko z szerokimi ustami</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6,9 cm, drobne oczka</td></tr><tr><td>Zbiornik do korków</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>indywidualny zbiornik hodowlany</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A</td><td>duży zbiornik hodowlany</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>maszyna do sortowania komórek</td></tr><tr><td>Dziki mikroskop steromikroskopowy M5a</td> Mikroskop <td>preparacyjny</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>ilościowa metoda oznaczania stężenia DNA</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>wersja 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics</td><td>Toolbox Mathworks</td><td>wersja 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Curve Fitting Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>w wersji 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie czasu replikacji dna przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Czas replikacji DNA jest ważną cechą komórkową, wykazującą znaczące związki ze strukturą chromatyny, transkrypcją i szybkością mutacji DNA. Zmiany w czasie replikacji zachodzą podczas rozwoju i raka, ale rola, jaką czas replikacji odgrywa w rozwoju i chorobie, nie jest znana. Danio pręgowany został niedawno opracowany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania danio pręgowanego do określenia czasu replikacji DNA. Po posortowaniu komórek od zarodków i dorosłych ryb danio pręgowanego można skonstruować wzorce replikacji DNA w całym genomie o wysokiej rozdzielczości, określając zmiany w liczbie kopii DNA poprzez analizę danych sekwencjonowania nowej generacji. System modelowy danio pręgowanego pozwala na ocenę zmian w czasie replikacji, które zachodzą in vivo w trakcie rozwoju, a także może być wykorzystywany do oceny zmian w poszczególnych typach komórek, modelach chorób lub zmutowanych liniach. Metody te umożliwią badania nad mechanizmami i determinantami ustanawiania i utrzymywania czasu replikacji podczas rozwoju, rolą, jaką czas replikacji odgrywa w mutacjach i nowotworzeniu oraz wpływem zakłócającego czasu replikacji na rozwój i chorobę.

Wykorzystując opublikowane dane dotyczące czasu replikacji, przedstawiono reprezentatywne profile czasu replikacji oraz środki kontroli jakości15. Wstępne etapy przetwarzania obejmują mapowanie danych sekwencjonowania do genomu, obliczenie statystyk długości odczytów oraz pokrycia genomu, a także filtrowanie odczytów o niskiej jakości, nieparzystych oraz duplikatów PCR. Statystyki odczytów dla typowej próbki sekwencjonowania ryb zebrafish przedstawiono na <strong c...

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie map czasu replikacji DNA całego genomu z zarodków danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cyklu komórkowego i biologii chromatyny, takie jak to, w jaki sposób zmiany chromatyny, które zachodzą podczas rozwoju embrionalnego, mogą wpływać na inicjację widełek replikacyjnych DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że odwzorowuje ona zmiany replikacji, które zachodzą in vivo na określonych etapach rozwoju embrionalnego.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w to, jak zmienia się replikacja DNA podczas rozwoju danio pręgowanego, można ją również zastosować do innych systemów lub organizmów modelowych, takich jak osłonice, żaby i muchy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ generowanie zawiesin jednokomórkowych z zarodków danio pręgowanego wymaga pewnej praktyki. W noc poprzedzającą pobranie zarodków umieść dziesiątki dorosłych osobników lęgowych w zbiornikach hodowlanych, używając w przybliżeniu równej liczby samców i samic.W zależności od eksperymentu zastosuj jedną z następujących strategii hodowlanych. W przypadku pierwszej strategii hodowlanej umieść kilka samców i samic danio pręgowanego w indywidualnych zbiornikach hodowlanych i użyj przegrody, aby oddzielić samce od samic. Jeśli zastosujesz to podejście, skonfiguruj wiele różnych zbiorników hodowlanych i połącz zarodki z każdego z nich, aby zapewnić, że zmienność biologiczna jest reprezentatywna dla populacji.W przypadku strategii hodowlanej numer dwa, połącz dziesiątki samców i samic danio pręgowanego w dużym zbiorniku hodowlanym. Stosuj tę strategię, o ile istnieje wystarczająco duża liczba zarodków. Rozsądnie jest założyć, że pochodzą one od różnych założycieli i dlatego są genetycznie reprezentatywne dla populacji.Aby wykonać krycie czasowe, zacznij, gdy tylko cykle świetlne rozpoczną się rano. Pozwól rybom rozmnażać się w płytkiej wodzie przez okres 10 minut, z fałszywym dnem, przez które zarodki mogą się wydostać. Po 10 minutach zbierz zarodki, przelewając je przez sitko i używając butelki do mycia, aby wypłukać je na 10-centymetrową płytkę.Zbierz wszystkie zarodki zebrane w tym samym punkcie czasowym, oznacz je godziną pobrania i natychmiast umieść je w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Aby zapewnić pobieranie synchronicznie rozwijających się zarodków, bardzo ważne jest, aby partie zarodków były pobierane co 10 minut. Jest to szczególnie ważne w przypadku najwcześniejszych etapów rozwoju embrionalnego.Z jednej pary godowej można spodziewać się setek zarodków w ciągu jednego dnia. Pozwól dorosłym rozmnażać się w cyklach 10-minutowych, aż liczba uzyskanych zarodków będzie mniejsza niż 20. Około jednej do 1,5 godziny po pobraniu, aby posortować zarodki, wyjmij je z inkubatora, obserwuj je pod mikroskopem preparacyjnym i posortuj w celu usunięcia martwych i niezapłodnionych jaj.Policz zarodki i umieść je w gęstości 100 zarodków na 10-centymetrową płytkę. Dodaj świeżą pożywkę E3 i umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Gdy zarodki osiągną pożądany etap rozwoju, zweryfikuj ten etap morfologicznie pod mikroskopem świetlnym zgodnie z etapami rozwoju embrionalnego danio pręgowanego.Jeśli zarodki mają 48 hpf lub mniej, przenieś do 1500 zarodków w stadium do 15-mililitrowej stożkowej probówki i użyj E3, aby je kilkakrotnie umyć. Na każde 100 zarodków dodaj jeden mililitr E3 i 20 mikrolitrów roztworu Pronase i delikatnie zamieszaj. Do 1500 zarodków można zdekorionować w jednej probówce z 15 mililitrami E3. Połóż probówkę na boku i ułóż zarodki w równej warstwie, aby zapewnić maksymalny stosunek powierzchni do objętości.Delikatnie poruszaj rurką co dwie do trzech minut, aż wszystkie kosmówki odpadną z zarodków. Całkowity czas dechorionacji będzie się różnić w zależności od aktywności Pronazy. Usuń supernatant i za pomocą 10 mililitrów E3 delikatnie opłucz zarodki trzy razy.Po umieszczeniu zarodków na lodzie i usunięciu pozostałego E3, użyj jednego mililitra świeżo przygotowanego, lodowatego buforu do usuwania żółtek na każde 500 zarodków do przemycia próbki. Następnie, za pomocą P1000, delikatnie pipetuj zarodki w górę i w dół od pięciu do 10 razy, aby rozbić worek żółtkowy. Następnie przenieś jeden mililitr do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi i odwiruj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 500-krotności grawitacji przez pięć minut.Próbki muszą być pipetowane na tyle energicznie, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową bez lizy komórek. Ten krok będzie wymagał trochę praktyki. Usuń supernatant i użyj jednego mililitra lodowatego 1x PBS do umycia osadu w celu usunięcia roztworu Ringera.Następnie ponownie odwirować próbkę. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze 1x PBS. Następnie umieść probówkę na lodzie.Dodaj trzy mililitry lodowatego etanolu do 15-mililitrowej stożkowej rurki i delikatnie zwiruj rurkę EtOH na niskim ustawieniu. Używając P1000, powoli wkraplaj zawiesinę komórek zarodka danio pręgowanego do EtOH, kontynuując wirowanie. Dodać w sumie jeden mililitr zawiesiny komórek zarodkowych, aby uzyskać końcowy roztwór utrwalający 75% EtOH.Po dodaniu jednego mililitra zawiesiny komórkowej delikatnie zakręć probówką do wymieszania i umieść ją na boku w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę lub przechowuj zawiesinę w zamrażarce przez dwa do trzech tygodni. Aby zabarwić embrionalne DNA, po usunięciu komórek zarodkowych utrwalonych w EtOH z ujemnych 20 stopni Celsjusza, odwiruj probówkę pod ciśnieniem 1500 razy większym niż grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Umieścić probówkę na lodzie i ostrożnie usunąć supernatant.Następnie, za pomocą P1000, delikatnie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego, zimnego PBS-BSA. Odwirować komórki w temperaturze 1500 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieścić próbkę na lodzie. Następnie należy usunąć supernatant i na każde 1000 zarodków dodać 200 mikrolitrów roztworu barwiącego jodek propidyny i ponownie zawiesić komórki.Pozwól komórkom inkubować w roztworze PI przez 30 minut na lodzie, delikatnie mieszając co pięć minut. Umieść 40-mikrometrowe nylonowe sitko na 50-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie. Następnie delikatnie odpipetuj komórki, aby wymieszać i przefiltrować roztwór komórek przez siatkę.Używając płaskiego, wewnętrznego końca tłoka strzykawki, delikatnie rozerwać wszelkie pozostałe grudki komórek na siatce. Na każde 1000 zarodków użyj 500 mikrolitrów zimnego PBS-BSA do przepłukania komórek przez filtr. Umieść siatkę o długości 40 mikrometrów na 15-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie i przefiltruj zawiesinę komórek z 50-mililitrowej stożkowej rurki po raz drugi do 15-mililitrowej probówki.Na koniec, za pomocą odpowiedniego przyrządu do sortowania komórek, ustaw wzbudzenie lasera na 561 nanometrów i detekcję emisji na 610 na 20, aby wykryć jodek propidyny. Posortuj komórki i przeprowadź dodatkowe analizy zgodnie z protokołem tekstowym. Aby określić jakość odwzorowania odczytu, dane sekwencjonowania muszą najpierw zostać dopasowane do genomu, przy użyciu statystyk wartości mapQ.Ponadto obliczone statystyki długości odczytu są wykreślane jako histogram rozkładu wielkości wkładek dla wszystkich odczytów sekwencyjnych. W tym konkretnym eksperymencie mediana wyniosła 170 pz. Ten wykres słupkowy ilustruje statystyki odczytu dla łącznej liczby zmapowanych odczytów, odczytów zawierających flagę niskiej jakości, odczytów z parami mapującymi do innego chromosomu, odczytów z parą powyżej progu odległości i duplikatów PCR.Reprezentatywne liczby całkowitych zmapowanych, niezmapowanych i niesparowanych odczytów, pokrycia i rozdzielczości odczytu dla typowego przebiegu sekwencjonowania próbki danio pręgowanego są wymienione tutaj. Po filtrowaniu liczby odczytów są określane w oknach o zmiennym rozmiarze, a dane są wygładzane i normalizowane. Przedstawiono tutaj typowe wygładzone i znormalizowane profile czasu replikacji reprezentatywnego chromosomu danio pręgowanego dla kontrprób biologicznych.Profile kontrprób biologicznych i eksperymentalnych powinny być bardzo podobne, a także wykazywać wysoką korelację na całej długości chromosomu. Profile powinny również wykazywać wysoką korelację między wartościami czasowymi w całym genomie. Mapa kolorów przedstawia współczynnik korelacji Pearsona.Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby upewnić się, że pobierane są synchronicznie rozwijające się zarodki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak wstrzyknięcia morfolino lub mutageneza CRISPR-Cas9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jakie są mechanizmy, za pomocą których replikacja DNA jest koordynowana z innymi procesami rozwojowymi? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pobierać komórki na określonych etapach cyklu komórkowego z synchronicznie rozwijających się zarodków danio pręgowanego.Pobranie tych próbek ma kluczowe znaczenie dla generowania map czasu replikacji DNA całego genomu.

profiling-dna-replication-timing-using-zebrafish-as-an-vivo-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Danio pręgowany stanowi potężny model kręgowców, który był niewystarczająco wykorzystywany w badaniach metabolicznych. W niniejszej pracy opisujemy szybką metodę pomiaru profilu metabolicznego in vivo rozwijających się rybek danio, która umożliwia porównanie różnych parametrów funkcji mitochondriów między zarodkami manipulowanymi genetycznie lub farmakologicznie, zwiększając tym samym możliwości zastosowania tego organizmu.

Analiza profilu metabolicznego embrionów rybki danio-ostrogona

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj metodę profilowania czasu replikacji DNA w zarodkach danio pręgowanego. Technika ta pozwala badać zmiany chromatyny podczas rozwoju embrionalnego i ich wpływ na inicjację replikacji DNA.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Przeglądaj więcej filmów