Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie map czasu replikacji DNA całego genomu z zarodków danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cyklu komórkowego i biologii chromatyny, takie jak to, w jaki sposób zmiany chromatyny, które zachodzą podczas rozwoju embrionalnego, mogą wpływać na inicjację widełek replikacyjnych DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że odwzorowuje ona zmiany replikacji, które zachodzą in vivo na określonych etapach rozwoju embrionalnego.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w to, jak zmienia się replikacja DNA podczas rozwoju danio pręgowanego, można ją również zastosować do innych systemów lub organizmów modelowych, takich jak osłonice, żaby i muchy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ generowanie zawiesin jednokomórkowych z zarodków danio pręgowanego wymaga pewnej praktyki. W noc poprzedzającą pobranie zarodków umieść dziesiątki dorosłych osobników lęgowych w zbiornikach hodowlanych, używając w przybliżeniu równej liczby samców i samic.

W zależności od eksperymentu zastosuj jedną z następujących strategii hodowlanych. W przypadku pierwszej strategii hodowlanej umieść kilka samców i samic danio pręgowanego w indywidualnych zbiornikach hodowlanych i użyj przegrody, aby oddzielić samce od samic. Jeśli zastosujesz to podejście, skonfiguruj wiele różnych zbiorników hodowlanych i połącz zarodki z każdego z nich, aby zapewnić, że zmienność biologiczna jest reprezentatywna dla populacji.

W przypadku strategii hodowlanej numer dwa, połącz dziesiątki samców i samic danio pręgowanego w dużym zbiorniku hodowlanym. Stosuj tę strategię, o ile istnieje wystarczająco duża liczba zarodków. Rozsądnie jest założyć, że pochodzą one od różnych założycieli i dlatego są genetycznie reprezentatywne dla populacji.

Aby wykonać krycie czasowe, zacznij, gdy tylko cykle świetlne rozpoczną się rano. Pozwól rybom rozmnażać się w płytkiej wodzie przez okres 10 minut, z fałszywym dnem, przez które zarodki mogą się wydostać. Po 10 minutach zbierz zarodki, przelewając je przez sitko i używając butelki do mycia, aby wypłukać je na 10-centymetrową płytkę.

Zbierz wszystkie zarodki zebrane w tym samym punkcie czasowym, oznacz je godziną pobrania i natychmiast umieść je w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Aby zapewnić pobieranie synchronicznie rozwijających się zarodków, bardzo ważne jest, aby partie zarodków były pobierane co 10 minut. Jest to szczególnie ważne w przypadku najwcześniejszych etapów rozwoju embrionalnego.

Z jednej pary godowej można spodziewać się setek zarodków w ciągu jednego dnia. Pozwól dorosłym rozmnażać się w cyklach 10-minutowych, aż liczba uzyskanych zarodków będzie mniejsza niż 20. Około jednej do 1,5 godziny po pobraniu, aby posortować zarodki, wyjmij je z inkubatora, obserwuj je pod mikroskopem preparacyjnym i posortuj w celu usunięcia martwych i niezapłodnionych jaj.

Policz zarodki i umieść je w gęstości 100 zarodków na 10-centymetrową płytkę. Dodaj świeżą pożywkę E3 i umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Gdy zarodki osiągną pożądany etap rozwoju, zweryfikuj ten etap morfologicznie pod mikroskopem świetlnym zgodnie z etapami rozwoju embrionalnego danio pręgowanego.

Jeśli zarodki mają 48 hpf lub mniej, przenieś do 1500 zarodków w stadium do 15-mililitrowej stożkowej probówki i użyj E3, aby je kilkakrotnie umyć. Na każde 100 zarodków dodaj jeden mililitr E3 i 20 mikrolitrów roztworu Pronase i delikatnie zamieszaj. Do 1500 zarodków można zdekorionować w jednej probówce z 15 mililitrami E3. Połóż probówkę na boku i ułóż zarodki w równej warstwie, aby zapewnić maksymalny stosunek powierzchni do objętości.

Delikatnie poruszaj rurką co dwie do trzech minut, aż wszystkie kosmówki odpadną z zarodków. Całkowity czas dechorionacji będzie się różnić w zależności od aktywności Pronazy. Usuń supernatant i za pomocą 10 mililitrów E3 delikatnie opłucz zarodki trzy razy.

Po umieszczeniu zarodków na lodzie i usunięciu pozostałego E3, użyj jednego mililitra świeżo przygotowanego, lodowatego buforu do usuwania żółtek na każde 500 zarodków do przemycia próbki. Następnie, za pomocą P1000, delikatnie pipetuj zarodki w górę i w dół od pięciu do 10 razy, aby rozbić worek żółtkowy. Następnie przenieś jeden mililitr do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi i odwiruj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 500-krotności grawitacji przez pięć minut.

Próbki muszą być pipetowane na tyle energicznie, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową bez lizy komórek. Ten krok będzie wymagał trochę praktyki. Usuń supernatant i użyj jednego mililitra lodowatego 1x PBS do umycia osadu w celu usunięcia roztworu Ringera.

Następnie ponownie odwirować próbkę. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze 1x PBS. Następnie umieść probówkę na lodzie.

Dodaj trzy mililitry lodowatego etanolu do 15-mililitrowej stożkowej rurki i delikatnie zwiruj rurkę EtOH na niskim ustawieniu. Używając P1000, powoli wkraplaj zawiesinę komórek zarodka danio pręgowanego do EtOH, kontynuując wirowanie. Dodać w sumie jeden mililitr zawiesiny komórek zarodkowych, aby uzyskać końcowy roztwór utrwalający 75% EtOH.

Po dodaniu jednego mililitra zawiesiny komórkowej delikatnie zakręć probówką do wymieszania i umieść ją na boku w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę lub przechowuj zawiesinę w zamrażarce przez dwa do trzech tygodni. Aby zabarwić embrionalne DNA, po usunięciu komórek zarodkowych utrwalonych w EtOH z ujemnych 20 stopni Celsjusza, odwiruj probówkę pod ciśnieniem 1500 razy większym niż grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Umieścić probówkę na lodzie i ostrożnie usunąć supernatant.

Następnie, za pomocą P1000, delikatnie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego, zimnego PBS-BSA. Odwirować komórki w temperaturze 1500 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieścić próbkę na lodzie. Następnie należy usunąć supernatant i na każde 1000 zarodków dodać 200 mikrolitrów roztworu barwiącego jodek propidyny i ponownie zawiesić komórki.

Pozwól komórkom inkubować w roztworze PI przez 30 minut na lodzie, delikatnie mieszając co pięć minut. Umieść 40-mikrometrowe nylonowe sitko na 50-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie. Następnie delikatnie odpipetuj komórki, aby wymieszać i przefiltrować roztwór komórek przez siatkę.

Używając płaskiego, wewnętrznego końca tłoka strzykawki, delikatnie rozerwać wszelkie pozostałe grudki komórek na siatce. Na każde 1000 zarodków użyj 500 mikrolitrów zimnego PBS-BSA do przepłukania komórek przez filtr. Umieść siatkę o długości 40 mikrometrów na 15-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie i przefiltruj zawiesinę komórek z 50-mililitrowej stożkowej rurki po raz drugi do 15-mililitrowej probówki.

Na koniec, za pomocą odpowiedniego przyrządu do sortowania komórek, ustaw wzbudzenie lasera na 561 nanometrów i detekcję emisji na 610 na 20, aby wykryć jodek propidyny. Posortuj komórki i przeprowadź dodatkowe analizy zgodnie z protokołem tekstowym. Aby określić jakość odwzorowania odczytu, dane sekwencjonowania muszą najpierw zostać dopasowane do genomu, przy użyciu statystyk wartości mapQ.

Ponadto obliczone statystyki długości odczytu są wykreślane jako histogram rozkładu wielkości wkładek dla wszystkich odczytów sekwencyjnych. W tym konkretnym eksperymencie mediana wyniosła 170 pz. Ten wykres słupkowy ilustruje statystyki odczytu dla łącznej liczby zmapowanych odczytów, odczytów zawierających flagę niskiej jakości, odczytów z parami mapującymi do innego chromosomu, odczytów z parą powyżej progu odległości i duplikatów PCR.

Reprezentatywne liczby całkowitych zmapowanych, niezmapowanych i niesparowanych odczytów, pokrycia i rozdzielczości odczytu dla typowego przebiegu sekwencjonowania próbki danio pręgowanego są wymienione tutaj. Po filtrowaniu liczby odczytów są określane w oknach o zmiennym rozmiarze, a dane są wygładzane i normalizowane. Przedstawiono tutaj typowe wygładzone i znormalizowane profile czasu replikacji reprezentatywnego chromosomu danio pręgowanego dla kontrprób biologicznych.

Profile kontrprób biologicznych i eksperymentalnych powinny być bardzo podobne, a także wykazywać wysoką korelację na całej długości chromosomu. Profile powinny również wykazywać wysoką korelację między wartościami czasowymi w całym genomie. Mapa kolorów przedstawia współczynnik korelacji Pearsona.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby upewnić się, że pobierane są synchronicznie rozwijające się zarodki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak wstrzyknięcia morfolino lub mutageneza CRISPR-Cas9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jakie są mechanizmy, za pomocą których replikacja DNA jest koordynowana z innymi procesami rozwojowymi? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pobierać komórki na określonych etapach cyklu komórkowego z synchronicznie rozwijających się zarodków danio pręgowanego.

Pobranie tych próbek ma kluczowe znaczenie dla generowania map czasu replikacji DNA całego genomu.