Name: Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę szybkiego wytwarzania rekombinowanych wirusów krowianki z fluorescencyjnie znakowanymi białkami. Protokół oparty na przejściowej selekcji dominującej umożliwia modułową modyfikację genomową i usprawnia izolację wirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana z grantu Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych Federacji Discovery Project #1096623.

1. Tworzenie wektora rekombinacji
<ol>
	<li>Zidentyfikuj 150 pz długie boczne obszary homologii (określane jako lewe i prawe ramię) wymagane do N- lub C-końcowego znakowania interesującego genu wirusa (patrz ryc. 1b).</li>
	<li>Zaprojektuj sekwencję oligonukleotydową składającą się z lewego i prawego ramienia o długości 150 pz oddzielonych parą wybranych miejsc restrykcyjnych. Cała ta sekwencja musi być również otoczona przez drugą parę miejsc restrykcyjnych (inną niż pierwsza para), aby umożliwić włączenie do wektora TDS po zsyntetyzowaniu. Podczas projektowania oligonukleotydu z miejscami restrykcyjnymi należy zwrócić uwagę, aby sekwencje znajdowały się w ramce z pożądanym miejscem insercji.</li>
	<li>Podczas projektowania oligonukleotydu do syntezy należy uwzględnić miejsca restrykcyjne między lewym i prawym ramieniem, które muszą pasować do tych otaczających otwartą ramkę odczytu wybranego znacznika fluorescencyjnego (patrz rysunek 1b). Możliwe jest użycie miejsca restrykcyjnego NotI jako łącznika trzech aminokwasów między lewym ramieniem a początkiem znacznika fluorescencyjnego.</li>
	<li>Włączyć te same miejsca restrykcyjne po obu stronach znacznika fluorescencyjnego metodą PCR (patrz rysunek 1c).</li>
	<li>Sklonuj zsyntetyzowany fragment do wektora TDS.</li>
	<li>Sklonuj znacznik fluorescencyjny do wynikowego wektora rekombinacji, używając miejsc restrykcyjnych między obszarami homologii lewego i prawego ramienia (patrz rysunek 1d).</li>
</ol>
2. Generacja rekombinowanego wirusa
<ol>
	<li>Jak pokazano na rysunku 2, zainfekuj monowarstwę komórek BS-C-1 wirusem krowianki w pożywce bez surowicy w wielu infekcjach (MOI) > 1.</li>
	<li>1 godzinę po zakażeniu, uratuj komórki zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco i transfekcją mieszaniny plazmidu wektora rekombinacji i odczynnika do transfekcji w stosunku 3:1 w pożywce bez surowicy.</li>
	<li>Po 24 godzinach zeskrob i odzyskaj komórki w DMEM nie zawierające płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i wykonaj trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić otwarte komórki i uwolnić cząsteczki wirusa.</li>
	<li>Wykonaj test płytki nazębnej z płynną nakładką 10% odczynników selekcyjnych FBS, DMEM i GPT, kwasu mykofenolowego (25 μg / ml) i ksantyny (250 μg / ml) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wysiewaj 6-dołkową płytkę z monowarstwą komórek BS-C-1.</li>
		<li>Infekować w 100% zlewające się monowarstwy komórek seryjnymi rozcieńczeniami zamrożonych i rozmrożonych komórek zawierających cząsteczki wirusa, aby zapewnić odpowiednią separację poszczególnych blaszek.</li>
		<li>Nakładka z płynem 10% FBS zawierającym DMEM zawierającym odczynniki selekcyjne GPT - kwas mykofenolowy i ksantynę w końcowych stężeniach odpowiednio 25 μg/ml i 250 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24-godzinnej inkubacji usunąć płynną nakładkę i za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego poszukać blaszek wykazujących rozproszoną czerwoną fluorescencję odpowiadającą włączeniu mCherry z wektora TDS do wirusa. W zależności od docelowego genu i wybranego znacznika fluorescencyjnego, w tej samej czerwonej blaszce można również zaobserwować miejscową fluorescencję znakowanego genu.</li>
	<li>Wybierz wiele blaszek dla każdego rekombinowanego wirusa przez miejscowe skrobanie końcówką pipety i 100 μl 5% FBS zawierającego DMEM w celu przeniesienia komórek do probówki Eppendorfa, a następnie trzy rundy zamrażania i rozmrażania zeskrobanych komórek w celu uwolnienia rekombinowanych wirusów.</li>
	<li>Dodaj DMEM zawierający zamrożonego i rozmrożonego wirusa do monowarstwy komórek na 12-dołkowej płytce w celu amplifikacji rekombinowanych wirusów za pomocą odczynników selekcyjnych GPT w pożywce wzrostowej. Zeskrob udane amplifikacje 24 godziny po infekcji.</li>
	<li>Wykonaj test płytki z pomyślnie amplifikowanymi blaszkami wykazującymi czerwoną fluorescencję, tym razem z nakładką agarozową i selekcją GPT, w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wysiewaj 6-dołkową płytkę z monowarstwą komórek BS-C-1.</li>
		<li>Wykonać seryjne rozcieńczanie rekombinowanych wirusów i zainfekować studzienki rosnącym rozcieńczeniem wirusów w DMEM wolnym od FBS.</li>
		<li>1 godzinę po zakażeniu usuń płynne podłoże i pokryj każdą studzienkę 0,5% agarozą w minimalnym niezbędnym podłożu (MEM) zawierającym 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, wraz z odczynnikami selekcyjnymi GPT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2-3 dni po infekcji wybierz blaszki wyświetlające fluorescencję, która jest zarówno czerwona, jak i kolor wybranego znacznika fluorescencyjnego, aby ponownie wzmocnić, tym razem bez wyboru GPT.</li>
	<li>Wykonaj następny test płytki nazębnej z nakładką agarozową bez selekcji.</li>
	<li>Wybierz blaszki, które utraciły swoją rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowują zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi.</li>
	<li>Kontynuuj oczyszczanie płytki nazębnej bez selekcji, aby uzyskać czysty zapas rekombinowanych wirusów, które utraciły geny selekcji mCherry i gpt, ale zachowują zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Sprawdź, czy zapasy są czyste za pomocą testu płytki nazębnej, wszystkie blaszki powinny mieć podobny fenotyp płytki.</li>
	<li>Stosuj badania przesiewowe PCR genomowego DNA, aby upewnić się, że stada wirusów są czyste.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery, które otaczają miejsce insercji genu fluorescencyjnego oraz startery, które wzmacniają sam wstawiony gen fluorescencyjny. Różne kombinacje tych starterów będą wytwarzać amplikony PCR, które wykryją insercję genu i wskażą czystość.</li>
		<li>Amplifikacja zapasów wirusa do badania przesiewowego PCR w jednym dołku monowarstwy 12-dołkowej płytki komórek BS-C-1.</li>
		<li>24 godziny po zakażeniu zeskrob zainfekowane komórki do 250 μl DMEM.</li>
		<li>Odwirować zakażone komórki (18 000 x g przez 10 min, 4 °C), usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl TE (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA, pH 8) z 0,1% (v/v) SDS. Wir do lizy komórek.</li>
		<li>Dodać 500 μl akolu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego, odwrócić do mieszania. Wirówka (18 000 x g przez 4 min, 4 °C). Weź supernatant i powtórz.</li>
		<li>Przeprowadzić wytrącanie etanolu na supernatencie, dodając 1 ml 100% etanolu (schłodzonego) i 50 μl octanu sodu, odwrócić w celu wymieszania.</li>
		<li>Pozostawić w temperaturze -20 °C na noc lub -80 °C na 1 godzinę. Odwirować (18 000 x g przez 30 min, 4 °C), usunąć cały płyn i pozostawić wytrącone DNA do wyschnięcia na powietrzu. Zawiesić ponownie w 50 μl TE.</li>
		<li>Użyj tego jako szablonu do badań przesiewowych genomowego DNA PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generowanie rekombinowanych wirusów zawierających więcej niż jeden znacznik
<ol>
	<li>Współinfekować tę samą monowarstwę komórkową fluorescencyjnymi rekombinowanymi wirusami, aby utworzyć podwójnie lub potrójnie znakowane wirusy lub powtórzyć procedurę z Protokołu 1) z innym znacznikiem.</li>
	<li>Oczyszczanie wirusów na podstawie fenotypu płytki nazębnej lub badania przesiewowego PCR wirusa izolowanego genomowego DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li>
<li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li>
<li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li>
<li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li>
<li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3+%27-to-5+%27+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li>
<li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li>
<li>Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).</li>
<li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25%2C000%5BTitle%5D)+AND+%22Base-Pairs+of+Foreign+DNA.+Gene%22%5BJournal%5D)">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li>
<li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+%26%2334%3Bhoneycomb%26%2334%3B+surface+coat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &#34;honeycomb&#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li>
<li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li>
<li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li>
<li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li>
<li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li>
<li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li>
<li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li>
<li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li>
<li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li>
<li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+%28Tian-Tan+strain%29+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+China+Ser.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li>
<li>Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li>
<li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li>
<li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li>
<li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li>
<li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li>
<li>Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).</li>
<li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37%2C000-dalton+outer+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li>
<li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+Navigating+the+subcellular+space%3A+Lessons+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Transport%2C+Assembly+and+Egress%22%5BJournal%5D)">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).</li>
<li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li>
<li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2%2F3-complex-dependent+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li>
<li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid%2C+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li>
<li>Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li>
<li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li>
<li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Technika ta opisuje skuteczny i modułowy protokół tworzenia rekombinowanych wirusów, które wyrażają fluorescencyjnie znakowane białka wirusowe. Metoda zapewnia, że jedyną zmianą w genomie wirusa jest dodanie znacznika lub markera, nie pozostawiając żadnych markerów selekcyjnych. Krótka długość ramienia wymagana do rekombinacji homologicznej umożliwia jej bezpośrednią syntezę, eliminując kilka czasochłonnych rund PCR i klonowania, podczas gdy fluorescencja mCherry i metaboliczna selekcja GPT są wykorzystywane do izolowania produktów pośrednich rekombinacji wirusa. Te produkty pośrednie mogą zostać rozwiązane, po usunięciu selekcji, do wirusa ze znakowanym genem lub z powrotem do typu rodzicielskiego. Podobna metoda, obejmująca zastosowanie zarówno selekcji fluorescencyjnej, jak i metabolicznej, została opisana wcześniej27 , chociaż metoda zastosowana w tym badaniu wykorzystuje krótsze, zsyntetyzowane regiony homologii, umożliwiając identyfikację pożądanego rekombinowanego wirusa poprzez obrazowanie fluorescencji znakowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ta wtórna selekcja ma zastosowanie tylko do znakowania genów wirusowych o wysokiej ekspresji, które wytwarzają wystarczającą fluorescencję w teście płytki nazębnej. Alternatywnie można przewidzieć wprowadzenie kompletnej kasety ekspresyjnej, na przykład białka fluorescencyjnego pod silnym promotorem wirusowym. W tym przypadku lewe i prawe ramię określałyby punkt insercji, a nie gen wirusa, który ma zostać oznaczony.
Istnieje kilka kluczowych kroków, które okazały się pomocne podczas procedury eksperymentalnej. Płynna powłoka w kroku 2.3.3 opisana powyżej okazała się kluczowa dla wykrywania i izolowania czerwono-zielonych blaszek fluorescencyjnych. Uważamy, że połączenie odczynników selekcyjnych GPT i nakładki agarozowej powstrzymało wzrost rekombinowanych wirusów i dlatego przestawiono się na płynną nakładkę jako pierwszy etap amplifikacji wirusów po transfekcji. Ważne jest również, aby wybrać blaszki fluorescencyjne wykazujące zlokalizowaną fluorescencję koloru znacznika w celu wzbogacenia i oczyszczenia, ponieważ produkty pośrednie wynikające z rekombinacji lewego ramienia mogą powodować rozproszoną fluorescencję obserwowaną w blaszkach, jeśli lewe ramię zawiera również sekwencję promotorową. Gen markera mCherry w wektorze TDS może być również zastąpiony przez gfp, na przykład, aby umożliwić łatwe włączenie i wybór mCherry jako znacznika fluorescencyjnego.
Niektóre techniki opisane powyżej różnią się nieznacznie od ustalonych metod tworzenia rekombinowanego wirusa krowianki. Na przykład MOI wirusa używanego do tworzenia rekombinantów jest zwykle mniejszy niż 128, jednak użycie wyższych MOI było wystarczające do stworzenia rekombinowanego wirusa krowianki tą metodą. Stosowanie odczynników selekcyjnych GPT zwykle wymaga wstępnej inkubacji komórek za pomocą odczynników selekcyjnych18, jednak dodanie ich w fazie ratunkowej po infekcji nadal zapewniało wystarczającą selekcję pożądanych rekombinantów, szczególnie ze względu na obecność fluorescencyjnego markera selekcyjnego.
Jak wspomniano wcześniej, jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że etap selekcji fluorescencji wtórnej opiera się na wysokiej ekspresji znakowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania, na poziomie, który umożliwia jego wykrycie wzrokowo w teście płytki nazębnej. Bez tego możliwe byłoby oczyszczenie wirusów, które wykazywały tylko fluorescencję mCherry , z których co najmniej 50% zawierałoby pożądane wirusy rekombinowane, które można zidentyfikować za pomocą strategii molekularnych, takich jak PCR opisanych w kroku 2.12 powyżej. Innym ograniczeniem może być inaktywacja niektórych białek w wyniku ich znakowania. Znacznik fluorescencyjny może ulegać mutacjom lub zostać wycięty przez rekombinowany wirus z pasażowaniem w czasie. W związku z tym zaleca się regularne pobieranie próbek z rekombinowanych zapasów wirusa za pomocą mikroskopii i PCR. Wreszcie, może istnieć ograniczenie liczby fluorescencyjnie znakowanych białek, które mogą być włączone do pojedynczego wirusa. Jednym z aspektów tego jest możliwość wizualizacji ich wszystkich jednocześnie; Biorąc pod uwagę nakładający się na siebie charakter widm emisyjnych dostępnych znaczników fluorescencyjnych, ważne jest, aby starannie je dobierać, aby zapewnić minimalne przenikanie widma. Ponadto zastosowanie blisko spokrewnionych znaczników, takich jak GFP i Cerulean, otwiera możliwość rekombinacji między nimi, w zależności od ich lokalizacji w rekombinowanym genomie.
Modułowy charakter tej techniki umożliwia proste zastępowanie znaczników fluorescencyjnych w oparciu o kompatybilność z innymi opcjami barwienia i/lub znaczników. Poprzez wycinanie markerów wybieralnych, metoda TDS pozwala na seryjne dodawanie różnych białek fluorescencyjnych lub połączenie znakowania opartego na TDS z delecjami genów opartymi na TDS w analizach fenotypowych29. Jako przykład użyteczności tego podejścia wygenerowano podwójnie oznakowanego wirusa fluorescencyjnego, który znakuje rdzenie wirusa i błonę WV. Badania obrazowe z użyciem tego wirusa mogą być wykorzystane do badania ruchu, morfogenezy i owijania wirusa podczas replikacji wirusa. Niescharakteryzowane do tej pory białka wirusa krowianki mogą być również znakowane i badane za pomocą tej techniki.
Wirus krowianki jest szeroko stosowany w badaniach obrazowych ze względu na wiele cech wirusa, które są korzystne dla mikroskopii żywych komórek. Znaczniki fluorescencyjne ulegają ekspresji z genomu wirusa, eliminując potrzebę transfekcji, umożliwiając łatwą analizę komórek pierwotnych pochodzących od zakażonych zwierząt lub komórek nietransfekcyjnych. Początkowo fluorescencyjne VACV były używane do prostego subkomórkowego śledzenia ruchu wirusa30, ale nowsze podejścia rozszerzyły ich użyteczność o badania FRET31, FRAP na pojedynczych cząsteczkach wirusa32, reportery promotorów33, obrazowanie przyżyciowe34 i badania strukturalne35-37. Wszystkie te techniki mogą być w łatwiejszym i bliższym zasięgu w połączeniu z tą metodą tworzenia rekombinowanych wirusów fluorescencyjnych.

Wirus krowianki (VACV) jest prototypowym wirusem ospy i jest wysoce spokrewniony z wirusem ospy wietrznej, czynnikiem wywołującym ospę prawdziwą. Oba te wirusy należą do rodzaju Orthopox, który obejmuje inne godne uwagi patogeny, takie jak małpia ospa i wirus ektromelii (ospa myszy)1. Ortopokswirusy mają duże dwuniciowe genomy DNA (180-220 kb), które kodują ponad 200 przewidywanych otwartych ramek odczytu2,3. Replikacja tych wirusów obejmuje tworzenie okołojądrowej fabryki wirusów, w której wytwarzane są dojrzałe wirusy (MV), oraz sieci trans-Golgiego, w której podzbiór MV uzyskuje dwie dodatkowe błony w celu wytworzenia wirusów owiniętych (WV) (przegląd Robertsa i Smitha4). Genomy ortopoksów są wysoce podatne na manipulacje genetyczne ze względu na wysoki stopień rekombinacji genetycznej, która jest cechą replikacji genomu VACV i jest pośredniczona przez wirusową polimerazę DNA5. Generowanie rekombinowanych wirusów opiera się na rekombinacji homologicznej i liniowych cząsteczkach DNA o homologiach tak małych jak 12 pz, które są wystarczające do pośredniczenia w rekombinacji w komórkach zakażonych wirusem krowianki6. Znakowanie fluorescencyjne wirusa krowianki może dać niezwykle jasne cząsteczki wirusa ze względu na duży rozmiar cząstek ortopoksy, co pozwala na włączenie wielu białek fluorescencyjnych na wirion7. Krowianka ma zdolność przenoszenia dużych fragmentów obcego DNA8, a ponadto brak sztywnej symetrii kapsydu może pozwolić na pewien stopień elastyczności podczas ekspresji fuzji genów białek wirusowych z ich endogennych loci9. Znakowanie fluorescencyjne białek VACV okazało się nieocenione w badaniu interakcji gospodarz-patogen na poziomie subkomórkowym, szczególnie w dziedzinie wnikania wirusa10, transportu11-13 i morfogenezy, szczególnie owiniętych wirionów7.
Rekombinowane wirusy mogą być wybrane przez uratowanie osłabionego fenotypuwzrostu 14,15, selekcję metaboliczną16-18, lub przez ekspresję genu markerowego (np. X-gal19 lub białko fluorescencyjne13,20). W tym miejscu opisujemy selekcję wirusów fluorescencyjnych przy użyciu potężnej kombinacji selekcji fluorescencyjnej i metabolicznej. Przejściowe wektory selekcji dominującej (TDS), opracowane przez Faulknera i Mossa (1990)21, umożliwiają integrację markerów wraz z pożądanym genem znakowanym fluorescencyjnie. Po usunięciu selekcji metabolicznej może wystąpić wtórne zdarzenie rekombinacji, które wycina geny selekcyjne, ale pozostawia nienaruszone fluorescencyjnie znakowane białko wirusa. Rysunek 2 poniżej przedstawia przegląd procedury eksperymentalnej. Geny selekcyjne wykorzystane w tym badaniu to mCherry i gen fosforybozylotransferazy guaninowej Escherichia coli (gpt), oba ulegające ekspresji z syntetycznego promotora wczesnego / późnego wirusa i używane wcześniej przez Cordeiro i wsp.22 Ponadto występuje fluorescencja znakowanego białka fuzyjnego, które jest przedmiotem zainteresowania. Po usunięciu selekcji metabolicznej markery selekcyjne (mCherry i gpt) są wycinane, pozostawiając tylko fluorescencję znakowanego genu, co pozwala na identyfikację prawidłowych rekombinowanych wirusów. Wycięcie markerów selekcyjnych daje możliwość łączenia wielu znaczników fluorescencyjnych, co pozwala na tworzenie wirusów ze zdolnością do fluorescencyjnego znakowania kilku białek wirusowych jednocześnie. Wcześniejsze badania określiły minimalne wymagania homologiczne dla rekombinacji krowianki liniowych i kolistych cząsteczek DNA transfekowanych do komórek zakażonych wirusem krowianki6. Chcieliśmy określić wydajność rekombinacji różnych długości homologii ramion flankujących w wektorze TDS gpt-mCherry poprzez jego włączenie do genomu wirusa krowianki. Stwierdzono, że regiony homologiczne o wartości 100 pz w wektorze TDS są wystarczające do celowania i pośredniczenia w insercji rekombinowanego DNA do genomu VACV przez rekombinację homologiczną (ryc. 4). Podczas gdy mniejsze długości homologii również umożliwiłyby rekombinację, długości homologii 100 pz zapewniły wystarczającą ilość rekombinowanych wirusów, które można było łatwo zidentyfikować za pomocą selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej. Fragmenty DNA tej wielkości mogą być komercyjnie syntetyzowane przy stosunkowo niskich kosztach i znacznie ułatwiają produkcję wielu wektorów do tworzenia rekombinowanych wirusów. Zdecydowaliśmy się na zwiększenie długości homologii do 150 pz, aby zapewnić większą częstotliwość rekombinacji przy jednoczesnym utrzymaniu niskich kosztów syntezy sekwencji oligonukleotydowej regionów flankujących.

<table><tbody><tr><td>Kwas mykofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Rozpuszcza się w 0,1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>Rozpuszcza się w 0,1 N NaoH</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w filtry Chroma 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Oznaczanie białek wirusowych białkami fluorescencyjnymi okazało się nieodzownym podejściem do pogłębiania naszego zrozumienia interakcji wirus-gospodarz. Wirus krowianki (VACV), żywa szczepionka stosowana w zwalczaniu ospy prawdziwej, jest szczególnie podatny na fluorescencyjną mikroskopię żywych komórek ze względu na duży rozmiar wirionu i łatwość, z jaką można go zmodyfikować na poziomie genomu. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół generowania rekombinowanych wirusów. Określono minimalne wymagania dotyczące celowanej rekombinacji homologicznej podczas replikacji krowianki, co pozwala na uproszczenie generowania konstruktów. Umożliwiło to połączenie przejściowej selekcji dominującej (TDS) z fluorescencyjnym reporterem i selekcją metaboliczną w celu zapewnienia szybkiego i modułowego podejścia do fluorescencyjnego znakowania białek wirusowych. Usprawniając wytwarzanie rekombinowanych wirusów fluorescencyjnych, jesteśmy w stanie ułatwić dalsze zastosowania, takie jak zaawansowana analiza obrazowa wielu aspektów interakcji wirus-gospodarz, która zachodzi podczas replikacji wirusa.

Rysunek 1 przedstawia poszczególne konstrukty wymagane do przeprowadzenia tej procedury, które zostały albo zsyntetyzowane (Rysunki 1b i 1c), albo stworzone w etapach klonowania (Rysunek 1d). Rysunek 2 zawiera schemat procedury eksperymentalnej z reprezentatywnymi obrazami fluorescencyjnych plam rekombinowanego VACV A3-GFP, przedstawionymi dla każdego etapu procesu selekcji. Na Rysunku 3 pokazano rekombinowane wirusy ospy krowiej ekspresujące białka znakowane markerami fluorescencyjnymi, skierowane przeciwko wirusowym białkom strukturalnym A3 i F13, które stanowią odpowiednio część wewnętrznego rdzenia wirusa23 i zewnętrznej otoczki24. Przedstawiono obserwacje plam wirusowych oraz zainfekowanych komórek dla każdego z wytworzonych wirusów rekombinowanych. Przebadano wydajność homologicznej rekombinacji wektorów z genomem VACV, zawierających regiony homologii o długości nawet 70 bp, a wyniki przedstawiono na Rysunku 4. Stosunkowo wysoka skuteczność identyfikacji plam wirusowych powstałych w wyniku rekombinacji z wektorami zawierającymi 100 bp homologii była podstawą decyzji o syntezie lewego i prawego ramienia homologii o długości 150 bp do genu docelowego.
<img alt="Schemat procesu edycji genów; konstrukcja wektora plazmidowego, ligacja, rekombinacja dla wektora TDS." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wektor rekombinacyjny Transient Dominant Selection (TDS). (a) Wektor TDS z markerami selekcyjnymi gpt i mCherry. (b) Lewe i prawe ramiona homologii są zaprojektowane ze specyficznymi miejscami restrykcyjnymi pomiędzy nimi oraz flankującymi ramiona homologii. Miejscami restrykcyjnymi pomiędzy lewym a prawym ramieniem wykorzystanymi w tej metodzie były NotI i BamHI, przy czym miejsce NotI służyło również jako linker pomiędzy genem a znacznikiem fluorescencyjnym. (c) Znaczniki fluorescencyjne kompatybilne z tą metodą są flankowane przez odpowiadające im miejsca restrykcyjne. Niektóre z zastosowanych znaczników to GFP (zielone białko fluorescencyjne), RFP (czerwone białko fluorescencyjne), Cerulean (udoskonalona wersja ECFP, cyjanowego białka fluorescencyjnego, otrzymana poprzez mutogenezę celowaną25) oraz mini-SOG, białko fluorescencyjne zaprojektowane na bazie GFP, które po naświetleniu tworzy produkt możliwy do rozdzielenia za pomocą EM26. (d) Etapy klonowania zaangażowane w generowanie końcowego wektora rekombinacyjnego TDS. Syntetyczny oligonukleotyd zawierający lewe i prawe ramiona flankujące jest najpierw klonowany do wektora TDS. Zapewnia to wektor rekombinacyjny, do którego można wprowadzać i usuwać dowolny wybrany znacznik poprzez klonowanie w miejsca restrykcyjne wbudowane pomiędzy lewym a prawym ramieniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Proces testu plackowego wirusa vaccinia, schemat z selekcją GFP, mCherry; metoda rekombinacji genetycznej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat procedury eksperymentalnej w celu stworzenia rekombinowanego wirusa vaccinia. Przedstawiono zdarzenia zachodzące na poziomie genetycznym i komórkowym, wraz z reprezentatywnymi obrazami placków opisującymi etapy następujące po stworzeniu fluorescencyjnego wirusa vaccinia znakowanego A3-GFP. (A) Komórki zainfekowane wirusem vaccinia są transfekowane wektorem rekombinacyjnym TDS. (B) Na tym rysunku przedstawiono jedynie wynik rekombinacji lewostronnej, a w przykładzie zastosowano GFP jako wybrany znacznik fluorescencyjny. Rekombinacja prawostronna doprowadziłaby do wbudowania całego plazmidu TDS do genomu w podobny sposób, z tą różnicą, że znacznik zostałby połączony z całym genem docelowym w kroku pośrednim, t.j. w kroku C. Test plackowy jest przeprowadzany na monowarstwie komórek z mieszaniną rekombinacyjną i poddany selekcji GPT. (C) Placki wykazujące zarówno czerwoną, jak i zieloną fluorescencję, odpowiadające odpowiednio ekspresji mCherry i GFP, są wybierane i namnażane. Po usunięciu selekcji nastąpi utrata czerwonej fluorescencji odpowiadająca utracie genów gpt i mCherry (D), a następnie wybierane i namnażane są placki wykazujące wyłącznie zieloną fluorescencję (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, znakowanie GFP/RFP, barwienie DAPI, analiza ekspresji białek, skala 100-10 μm." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki systemu rekombinacji TDS. Obrazy przedstawiają całe plaques rekombinowanego VACV infekującego komórki po 48 godzinach (a, c, e; pasek skali 100 µm), wraz z obrazem pojedynczej komórki zainfekowanej odpowiednim wirusem rekombinowanym po 8 godzinach (b, d, f; pasek skali 10 µm). W celu wizualizacji cząsteczek wirusa wybrano geny odpowiadające białkom zlokalizowanym w wirionie. A3 jest białkiem rdzeniowym wirionu ospy krowiej (a, b), a F13 (c, d) jest białkiem otoczki wirusowej. Przedstawiono również wirusa z podwójnym znacznikiem, z fluorescencyjnie znakowanymi białkami A3 i F13 (e, f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykres słupkowy: Długość homologii wektora rekombinacyjnego a liczba udanych zdarzeń rekombinacji (skala logarytmiczna)." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Analiza ilościowa wydajności rekombinacji pomiędzy wektorami rekombinacyjnymi a genomem VACV.Monowarstwy BS-C-1 zainfekowano VACV, a 1 godzinę po infekcji przetransfekowano trzema wektorami rekombinacyjnymi zawierającymi regiony homologii do genomu VACV o długości odpowiednio 500 bp, 100 bp lub 70 bp. Każdy wektor zawierał również kasetę TDS obejmującą geny selekcyjne gpt i mCherry. Komórki odzyskano 24 godziny po infekcji i poddano lizie w celu uwolnienia powstałych wirusów rekombinacyjnych. Na lizatach komórkowych przeprowadzono testy płytkowe z zastosowaniem pożywek selekcyjnych GPT; plaki wykazujące fluorescencję mCherry policzono jako udane rekombinanty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Schemat mapy plazmidu wektora gpt-mCherry TDS, 4393 bp, pokazujący miejsca restrykcyjne HindIII, ClaI, SalI." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Mapa wektora gpt-mCherry TDS pokazująca wielomiejscowy kloning (MCS). Wektor został opisany wcześniej22, a mapa wektora została stworzona za pomocą programu EZ Plasmid Map v1.9 z Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Niniejszy eksperyment pozwala na generowanie rekombinowanych wirusów ospy krowiej (vaccinia) znakowanych fluorescencyjnie za pomocą modułowej i szybkiej metody opartej na przejściowej selekcji dominującej. W pierwszej kolejności należy stworzyć wektor rekombinowany zawierający znacznik fluorescencyjny otoczony syntetycznymi minimalnymi regionami homologii, a także markery do selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej. Wektor rekombinacyjny należy wprowadzić do zainfekowanych komórek za pomocą transfekcji, a następnie namnożyć wirusy rekombinowane, stosując selekcję metaboliczną i fluorescencyjną. Następnie należy usunąć selekcję metaboliczną, aby wyciąć kasetę markerową i wyizolować komórki zawierające wirusy rekombinowane poprzez selekcję za pomocą znacznika fluorescencyjnego. Analiza plam wirusowych na monowarstwach komórkowych umożliwia wizualizację poszczególnych cząstek wirusowych charakterystycznych dla fluorescencyjnie znakowanego genu.Opracowaliśmy tę metodę, ponieważ chcieliśmy generować wirusy rekombinowane z wieloma modyfikacjami genetycznymi, stosując metodę selekcji, którą można wykorzystywać wielokrotnie i uniwersalnie, niezależnie od zastosowanego znacznika. Choć zasada przejściowej selekcji dominantowej była opisana wcześniej, chcieliśmy zastosować ją na większą skalę i w sposób modułowy, aby zapewnić sobie większą elastyczność w wprowadzaniu modyfikacji genomowych. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ przesiewanie i izolacja placków wirusów rekombinowanych mogą być trudne. Ich częstość występowania może być niska, w związku z czym niezbędne są specjalistyczne metody w celu efektywnego odzyskania wirusa.Należy zatem oznakować interesujący gen wirusowy na N- lub C-końcu białka. Następnie należy zidentyfikować flankujące regiony homologii o długości 150 par zasad. Potem należy zaprojektować sekwencję oligonukleotydową obejmującą lewe i prawe ramiona o długości 150 par zasad, oddzielone wybraną parą miejsc restrykcyjnych. Region ten należy dodatkowo flankować drugą parą miejsc restrykcyjnych, różną od pierwszej pary, aby umożliwić wbudowanie w wektor TDS po syntezie. Teraz należy zweryfikować, czy oligonukleotyd z miejscami restrykcyjnymi jest zaprojektowany tak, aby zachować ramkę odczytu z pożądanym miejscem insercji. W przypadku syntezy oligonukleotydowej należy upewnić się, że miejsca restrykcyjne wbudowane pomiędzy lewym a prawym ramieniem są zgodne z miejscami flankującymi otwartą ramkę odczytu wybranego znacznika fluorescencyjnego. Te same miejsca restrykcyjne należy wprowadzić po obu stronach znacznika fluorescencyjnego za pomocą PCR. Zsyntetyzowany fragment należy sklonować do wektora TDS. Należy również sklonować znacznik fluorescencyjny do otrzymanego wektora rekombinacyjnego, wykorzystując miejsca restrykcyjne znajdujące się pomiędzy lewym a prawym ramieniem regionów homologii. Monowarstwę komórek BS-C-one należy zainfekować wirusem vaccinia w pożywce bezsurowiczej.Godzinę po zakażeniu należy uratować komórki, stosując pożywkę Dulbecco's modified eagle medium. Wykonać transfekcję mieszaniną plazmidu wektora rekombinacyjnego i odczynników do transfekcji w stosunku trzech do jednego w pożywce bezzsółkowej. Po 24 godzinach zeskrobować i odzyskać komórki w DMEM niezawierającym płodowej surowicy bydlęcej. Poddać komórki trzem cyklom zamrażania i rozmrażania, aby rozbić komórki i uwolnić cząstki wirusa. Następnie, aby uzyskać odpowiednią separację pojedynczych plam (plaque), zakażać 100% konfluencyjne monowarstwy komórek BS-C-one seryjnymi rozcieńczeniami preparatu cząstek wirusa. Przykryć warstwą ciekłą z 10% FBS i DMEM z dodatkiem odczynników selekcyjnych GPT i inkubować przez 24 godziny.Odssać warstwę ciekłą i przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego poszukać plam wykazujących rozproszoną czerwoną fluorescencję, odpowiadającą wbudowaniu M-cherry z wektora TDS do wirusa. W zależności od genu docelowego i wybranego znacznika fluorescencyjnego, w tej samej czerwonej plamie może być obserwowana również zlokalizowana fluorescencja genu znacznika.Następnie należy wybrać kilka plak dla każdego wirusa rekombinowanego, zebrać je za pomocą końcówki pipety i przenieść komórki do probówki Eppendorf w 100 µL DMEM zawierającego 5% FBS. Aby uwolnić wirusy rekombinowane, należy przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania zebranych komórek.Dodaj DMEM zawierający wirusa poddanego cyklowi zamrażania i rozmrażania do monowarstwy komórek w płytce 12-dołkowej, aby namnożyć wirusy rekombinowane z użyciem odczynników selekcyjnych GPT w pożywce wzrostowej. Następnie, 24 godziny po infekcji, zeskrob udanie namnożone wirusy. W celu przeprowadzenia testu płytek dla udanie namnożonych płytek wykazujących czerwoną fluorescencję, wysiej monowarstwę komórek BS-C-one w płytce 6-dołkowej.Przeprowadzić rozcieńczenia seryjne wirusów rekombinowanych i zainfekować studzienki roztworami wirusów o zwiększonym stopniu rozcieńczenia w medium DMEM bez FBS. 1 godzinę po infekcji usunąć medium płynne i pokryć każdą studzienkę 0,5% agarozą w kompletnym minimalnym medium niezbędnym (MEM). Trzy dni po infekcji wyselekcjonować plakietki wykazujące fluorescencję zarówno czerwoną, jak i w kolorze wybranego znacznika fluorescencyjnego.Ponownie namnożone wirusy należy przenieść bez selekcji GPT. Wybrać placki, które utraciły rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Kontynuować oczyszczanie placków bez selekcji w celu uzyskania czystego zapasu wirusów rekombinowanych, które utraciły geny M-cherry i selekcji GPT, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi.Oceń czystość zapasów za pomocą testu plackowego, dążąc do uzyskania placków o podobnym fenotypie. Namnóż testowane zapasy wirusowe w monowarstwie komórek BS-C-one. Po 24 godzinach od infekcji zeskrobuj zainfekowane komórki do 250 µL DMEM. Odwiruj zainfekowane komórki, usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 500 µL 0,1% SDS w buforze TE. Wymieszaj na wortexie, aby zlizować komórki. Następnie dodaj 500 µL fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. Odwiruj. Pobierz fazę górną i powtórz ekstrakcję.Następnie, aby wyprecypitować DNA z warstwy wodnej, dodaj 1 ml schłodzonego, 100% etanolu oraz 50 µL octanu sodu. Wymieszaj poprzez odwracanie probówki i pozostaw próbkę w temperaturze -20 °C przez noc. Po odwirowaniu DNA, usuń cały płyn, wysusz pellet DNA na powietrzu i resuspenduj go w 50 µL buforu TE. Wykorzystaj ten matrycowy genomowy DNA do przesiewania PCR w celu wykrycia insercji wirusa. Wygeneruj wirusy rekombinowane z wieloma znacznikami zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym.Te rekombinowane wirusy ospy krowiej (vaccinia) wykazują ekspresję białek znakowanych markerami fluorescencyjnymi, skierowanymi przeciwko wirusowym białkom strukturalnym A3 i F13, które są odpowiednio częścią wewnętrznego rdzenia wirusa oraz zewnętrznej otoczki. W celu wizualizacji cząstek wirusa wybrano geny odpowiadające białkom zlokalizowanym w wirionie. A3 jest białkiem rdzenia wirionu vaccinia, a F13 jest białkiem otoczki wirusowej.Przedstawiono również wirusa z podwójnym znakowaniem, w którym zarówno białko A3, jak i F13 są znakowane fluorescencyjnie. Mikroskopia fluorescencyjna w czasie rzeczywistym może być przeprowadzona z użyciem wirusa z podwójnym znakowaniem. W tym przypadku dotyczy to białka rdzenia wewnętrznego wirusa ospy krowiej (vaccinia virus). Białko A3 jest znakowane na czerwono, a białko otoczki zewnętrznej F13 na zielono.Nieopakowane cząstki wirusa z fabryki wirusowej są widoczne na czerwono, natomiast opakowane wiriony są reprezentowane przez kolokalizację kanałów czerwonego i zielonego. Analizę ilościową wykorzystano do określenia wydajności rekombinacji pomiędzy wektorami rekombinowanymi a genomem wirusa vaccinia. Wydajność rekombinacji homologicznej wektorów z genomem wirusa vaccinia może być wykrywana przy regionach homologii o długości zaledwie 70 par zasad.Niniejsza metoda była wykorzystywana do tworzenia wirusów z wieloma znacznikami fluorescencyjnymi oraz/lub wielokrotnymi delecjami genów. Zostały one zastosowane w badaniach nad zakaźnym cyklem życiowym wirusa, rolą białek wirusowych w przełamywaniu systemów obronnych gospodarza, a także w analizie oddziaływań z procesami sygnalizacyjnymi gospodarza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania rekombinowanych wirusów ospy krowiej (vaccinia) przy użyciu metody, która jest modularna pod względem stosowanych znaczników, precyzyjna w wyodrębnianiu pożądanych rekombinantów i możliwa do zastosowania w różnych kontekstach badawczych.

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metodologia efektywnego generowania biełkowań Wirusa Ospy Prawdziwej z oznaczeniem fluorescencyjnym

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Expansion of Mutant Vaccinia Virus in Mammalian Cells

Źródło: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)Niniejszy materiał wideo demonstruje metodę monitorowania replikacji wirusa vaccinia z wykorzystaniem reporterów fluorescencyjnych regulowanych przez promotory specyficzne dla danej fazy. Sekwencyjna ekspresja zielonych, czerwonych i niebieskich białek fluorescencyjnych znakuje wczesną, pośrednią i późną fazę infekcji, co umożliwia wysokoprzepustową...

Monitorowanie etapowej ekspresji genów wirusa vaccinia z użyciem reporterów fluorescencyjnych

Źródło: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)W niniejszym filmie zaprezentowano sposób generowania rekombinowanych wirusów odry z wykorzystaniem liposomów do dostarczania plazmidów kodujących antygenom wirusa oraz niezbędne białka pomocnicze do komórek producentów. Transkrypcja i replikacja RNA prowadzą do powstania cząstek wirusowych wykazujących ekspresję białek immunostymulujących oraz...

Generowanie rekombinowanego wirusa odry kodującego białko immunostymulujące

Identyfikacja komórek zainfekowanych rekombinowanym wirusem ospy prawdziwej z wykorzystaniem selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Herpeswirus indyków (HVT) jest szeroko stosowany jako platforma wektorowa do generowania rekombinowanych szczepionek przeciwko wielu chorobom ptaków. W artykule opisano proste i szybkie podejście do wytwarzania rekombinowanych szczepionek wektorowych HVT przy użyciu zintegrowanego systemu NHEJ-CRISPR/Cas9 i Cre-Lox.

Generowanie rekombinowanych wektorów herpeswirusa ptasiego z edycją genów CRISPR/Cas9

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Poznaj metodę szybkiego wytwarzania rekombinowanych wirusów krowianki z fluorescencyjnie znakowanymi białkami. Protokół oparty na przejściowej selekcji dominującej umożliwia modułową modyfikację genomową i usprawnia izolację wirusów.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Przeglądaj więcej filmów