Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

W tym eksperymencie generowane są znakowane fluorescencyjnie rekombinowane wirusy EO za pomocą modułowej i szybkiej metody opartej na przejściowej selekcji dominującej. Najpierw utwórz wektor rekombinowany zawierający znacznik fluorescencyjny otoczony zsyntetyzowanymi minimalnymi regionami homologii, a także markerami selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej. Transfekować ten wektor rekombinacji do zakażonych komórek i amplifikować w celu uzyskania rekombinowanych wirusów za pomocą selekcji metabolicznej i fluorescencji.

Następnie usuń selekcję metaboliczną, aby wyciąć kasetę markerową i wyizolować komórki zawierające rekombinowane wirusy za pomocą markera fluorescencyjnego. Selekcja. Wyniki blaszek wirusowych na monowarstwach komórkowych pozwalają na wizualizację pojedynczych cząstek wirusa, które są charakterystyczne dla genu znakowanego fluorescencyjnie. Opracowaliśmy tę metodę, ponieważ chcieliśmy wygenerować rekombinowane wirusy z wieloma modyfikacjami genetycznymi przy użyciu metody selekcji, która mogłaby być stosowana wielokrotnie i uniwersalnie, niezależnie od znacznika.

Chociaż zasada przejściowej selekcji dominującej została opisana wcześniej, chcieliśmy zastosować ją na większą skalę i w sposób modułowy, aby zapewnić nam większą elastyczność w dokonywaniu modyfikacji genomu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ badanie przesiewowe i izolacja rekombinowanych płytek wirusowych może być trudne. Ich częstotliwość może być niska, dlatego do skutecznego odzyskania wirusa wymagane są pewne unikalne metody.

W ten sposób oznaczono gen wirusa będący przedmiotem zainteresowania na końcu N lub C białka. W związku z tym zidentyfikuj 150 długich bocznych regionów homologii par zasad. Następnie zaprojektuj sekwencję oligonukleotydową składającą się ze 150 par zasad lewego i prawego ramienia, oddzielonych parą wybranych miejsc restrykcyjnych.

Flankuj również ten region drugą parą miejsc restrykcyjnych, które różnią się od pierwszej pary, aby umożliwić włączenie do wektora TDS. Po zsyntetyzowaniu sprawdź, czy oligonukleotyd z miejscami restrykcyjnymi jest zaprojektowany tak, aby znajdował się w ramce z pożądanym miejscem insercji. Do syntezy oligonukleotydów upewnij się, że miejsca restrykcyjne znajdują się między lewym i prawym ramieniem.

Dopasuj te po bokach otwartej ramki odczytu wybranego znacznika fluorescencyjnego. Włącz te same miejsca restrykcyjne po obu stronach znacznika fluorescencji za pomocą PCR. Sklonuj zsyntetyzowany fragment do wektora TDS.

Sklonuj również znacznik fluorescencji do wynikowego wektora rekombinacji, używając miejsc restrykcyjnych między lewym a prawym ramieniem. Regiony homologii. Zainfekuj monowarstwę komórek BSC one wirusem krowianki i pożywką wolną od surowicy.

Godzina po zakażeniu. Uratuj komórki za pomocą zmodyfikowanego przez ECCO transfektu orła z mieszaniną rekombinacji, plazmidu wektorowego i odczynników do transfekcji w stosunku trzy do jednego w pożywce wolnej od surowicy. Po 24 godzinach zeskrobać i odzyskać komórki w DMEM, które nie zawierają płodowej surowicy bydlęcej.

Poddaj komórki trzem cyklom swobodnego rozmrażania, aby rozbić otwarte komórki i uwolnić cząsteczki wirusa w pobliżu, aby uzyskać odpowiednią separację poszczególnych blaszek. Infekować 100% zlewające się monowarstwy komórek BSC one za pomocą seryjnych rozcieńczeń preparatu cząstek wirusa. Nakładka z płynem 10% FBS i DMEM plus wybór GPT, odczynniki i inkubacja przez 24 godziny.

Odessać płynną nakładkę i użyć mikroskopu fluorescencyjnego, aby poszukać blaszek miażdżycowych. Wykazujący rozlaną czerwoną fluorescencję odpowiadającą włączeniu wiśni M z wektora TDS do wirusa. W zależności od docelowego genu i wybranego znacznika fluorescencyjnego, zlokalizowaną fluorescencję genu znacznika można również zaobserwować w tej samej czerwonej blaszce.

Teraz, aby wybrać wiele blaszek dla każdego rekombinowanego wirusa, zeskrobać końcówką pipety i za pomocą 100 mikrolitrów 5% FBS zawierających DMEM przenieś komórki do probówki einor. Wykonaj trzy rundy zamrażania zeskrobanych komórek. Aby uwolnić rekombinowane wirusy.

Dodaj DMEM zawierający rozmrożony wirus do jednej warstwy komórek. W 12-dołkowej płytce w celu amplifikacji rekombinowanych wirusów za pomocą odczynników selekcyjnych GPT w pożywce wzrostowej. Następnie zeskrob udane amplifikacje w 24 godziny po zakażeniu, aby wykonać test płytki z pomyślnie amplifikowanymi blaszkami, wykazującymi czerwoną fluorescencję C dwa sześć, dobrze rozegrane z monowarstwą komórek BSC jeden.

Wykonać seryjne rozcieńczanie rekombinowanych wirusów i zainfekować studzienki rosnącym rozcieńczeniem wirusów w wolnym od FBS DME M1 godzinę po zakażeniu. Usuń płynne podłoże i pokryj każdą studzienkę 0,5% agros w kompletnym, minimalnym, niezbędnym podłożu trzy dni po zakażeniu. Wybierz tabliczki wyświetlające fluorescencję, która jest zarówno czerwona, jak i kolor wybranego znacznika fluorescencji.

Wzmocnij je ponownie bez wyboru GPT. Wybierz płytki, które utraciły rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowują zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Kontynuuj oczyszczanie płytki nazębnej bez selekcji, aby uzyskać czysty zapas rekombinowanych wirusów, które utraciły geny selekcyjne wiśni M i GPT, ale zachowują zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi.

Ocenić czystość podkładek za pomocą testu płytkiowego mającego na celu zbadanie wszystkich blaszek o podobnym fenotypie płytki. Amplifikować testowane zapasy wirusów w monowarstwie pojedynczych komórek BSC. Po 24 godzinach od infekcji zeskrob zainfekowane komórki do 250 mikrolitrów DMEM, odwiruj zainfekowane komórki.

Usuń supernat i ponownie zawieś osad komórek w 500 mikrolitrach 0,1% SDS w wirze buforowym TE, aby przeciąć komórki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego i odwróć, aby wymieszać wirówkę. Zbierz górną fazę i powtórz ekstrakcję.

Następnie, aby wytrącić DNA z warstwy wodnej, dodaj jeden mililitr schłodzonego, 100% etanolu i 50 mikrolitrów octanu sodu. Wymieszać przez odwrócenie i umieścić próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc. Po granulowaniu DNA przez odwirowanie, usuń całą ciecz i wysusz powietrzem osad DNA i resus.

Zawiesić go w 50 mikrolitrach buforu TE. Użyj tej matrycy genomowego DNA do badania przesiewowego PCR w celu insercji wirusa. Generuj rekombinowane wirusy z wieloma znacznikami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Te rekombinowane wirusy krowianki wykazują ekspresję białek oznaczonych markerami fluorescencyjnymi ukierunkowanymi na białka strukturalne wirusa, A 3 i F 13, które są częścią odpowiednio wewnętrznego rdzenia wirusa i zewnętrznej otoczki. Geny odpowiadające białkom zlokalizowanym w wirionie zostały wybrane do wizualizacji cząsteczek wirusa. Trójka jest białkiem rdzeniowym wirionu krowianki, a F 13 jest białkiem otoczki wirusa.

Pokazano również, że podwójnie znakowany wirus z fluorescencyjnie znakowanym A 3 i F 13 może być wykonywany w czasie rzeczywistym z podwójnie znakowanym wirusem. W tym przypadku wewnętrzne białko rdzenia wirusa krowianki. Trójka jest oznaczona na czerwono, a białko zewnętrznej otoczki F 13 jest oznaczone na zielono.

Nieopakowane cząsteczki wirusa z fabryki wirusów są wizualizowane na czerwono, a owinięty wirion jest reprezentowany przez kolokalizację kanałów czerwonego i zielonego. Analizę ilościową wykorzystano w celu określenia skuteczności rekombinacji między wektorami rekombinowanymi a genomem wirusa krowianki. Skuteczność homologicznej rekombinacji wektorów z genomem wirusa krowianki można wykryć już przy 70 regionach homologii par zasad.

Metoda ta została wykorzystana do stworzenia wirusów z wieloma znacznikami fluorescencyjnymi i/lub wieloma delecjami genów. Zostały one wykorzystane w badaniu zakaźnego cyklu życiowego wirusa, roli białek wirusowych w obalaniu systemów obronnych gospodarza, a także interakcji z procesami sygnalizacji gospodarza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować rekombinowane wirusy krowianki przy użyciu metody, która jest modułowa w używanych znacznikach, skrupulatna w rozwiązywaniu pożądanych rekombinantów i ma zastosowanie w różnych kontekstach badawczych.