Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie etapów, na których ekspresja genów wirusowych jest modyfikowana przez obróbkę chemiczną. W tym celu komórki hodowli tkankowej są wysiewane i inkubowane do momentu osiągnięcia konfluencji. Następnie komórki są infekowane albo potrójnym wirusem vaccinia z reporterami, albo kontrolnym wirusem pozbawionym promotora.

Następnie stosuje się związki testowe, a komórki inkubuje się przez 18 godzin, aby umożliwić zakończenie wszystkich etapów ekspresji genów wirusa. Następnie mierzy się powstałą fluorescencję za pomocą czytnika płytek. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące względne zmiany w ekspresji wywołane przez badane związki.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z zakażeniem wirusem wykazującym pojedyncze fluorescencyjne białko fuzyjne jest fakt, że ten zestaw wirusów dostarcza więcej informacji o tym, w którym momencie cyklu życia wirusa działa konkretny lek terapeutyczny, co pozwala zrozumieć jego mechanizm działania. Choć metoda ta może być wykorzystywana do identyfikacji inhibitorów infekcji wirusowej, może ona również służyć do wykrywania etapu replikacji wirusa ukończonego w liniach komórkowych niepodatnych na zakażenie lub w badaniach przesiewowych RNAi, co pozwala zidentyfikować czynniki komórkowe niezbędne do infekcji. W tym protokole wykorzystano potrójnego wirusa reporterowego wieloetapowego (TrpV), w którego dwuniciowy genom pojedynczego wirusa ospy krowiej wbudowano trzy spektralnie odmienne fluorofory.

Każdy z tych fluoroforów jest kontrolowany przez ściśle zdefiniowany promotor specyficzny dla danej fazy. Promotor C 11 R odpowiada za wczesną ekspresję Venus, promotor pośredni G eight R za ekspresję m-cherry, a promotor F 17 R za ekspresję tag BFP w późnej fazie. W związku z tym Venus, m-Cherry i tag BFP są ekspresowane sekwencyjnie podczas infekcji.

W ramach kontroli zastosowano wirusa pozbawionego promotora. PLV zawiera konstrukt Venus podobny do tego w TrpV, jednak nie posiada on funkcjonalnego promotora transkrypcyjnego.

Protokół należy rozpocząć od dysocjacji komórek Hela hodowanych na szalce o średnicy 10 cm. Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej do stężenia około 2,0 × 10⁵ komórek/ml. Następnie odpipetować 100 µL do każdego dołka czarnej płytki 96-dołkowej z przezroczystym, płaskim dnem. Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aż osiągną konfluencję. W celu rozcieńczenia wirusów rozmrozić TrpV oraz PLV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie poddać sonikacji przez pięć minut w celu rozagregowania. Następnie rozcieńczyć zapas wirusa do stężenia 1,0 × 10⁷ PFU/ml w pożywce do infekcji, uprzednio ogrzanej do 37 °C.

Aby zainfekować komórki, należy zastąpić pożywkę wzrostową 50 µL rozcieńczonego wirusa w każdej studzience. Dla każdego wariantu traktowania zainfekuj trzy powtórzenia w studzienkach wirusem TrpV oraz kolejne trzy wirusem PLV, aby uwzględnić fluorescencję tła specyficzną dla każdego traktowania. Moment ten definiuje się jako czas równy zero godzin po infekcji. Na przykład, przygotuj 350 µL dla 6 studzienek płytki 96-dołkowej przy objętości 50 µL na każdą studzienkę. Każdy związek powinien zostać rozcieńczony do dwukrotności stężenia końcowego, ponieważ zostanie on dodany do objętości inokulum znajdującej się już w studzience. Następnie, dla każdego warunku traktowania, przygotuj 2x mieszaninę główną (master mix), rozcieńczając badane związki lub rozpuszczalniki kontrolne, takie jak PBS lub DMSO, w wystarczającej ilości pożywki do infekcji dla wszystkich powtórzeń plus jedno dodatkowe. Należy pamiętać, że stężenie rozpuszczalnika zarówno w próbkach badanych, jak i w kontrolach z samym wektorem, powinno być takie samo. Na przykład, jeśli stosujesz IBT w stężeniu 1 µL/mL w DMSO, jako kontrolę wektora powinieneś zastosować samo DMSO w stężeniu 1 µL/mL. Bezpośrednio po dodaniu wirusa, dodaj do każdej studzience 50 µL pożywki do infekcji zawierającej odpowiednie związki traktujące i kontrolne, zgodnie z przedstawioną ilustracją.

Należy pamiętać, że każdy związek jest testowany z TrpV i PLV w trzech powtórzeniach, a dla każdego wirusa przeprowadzana jest kontrola nośnika w trzech powtórzeniach.

Inkubować przez 18 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Następnego dnia utrwalić komórki, dodając 100 µL 8% paraformaldehyde do pożywki zakażeniowej znajdującej się w każdej studzience. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc ją przed światłem.

Dodanie 2x lub 8% paraformaldehydu bezpośrednio do medium infekcyjnego zapobiegnie aerozolizacji wirusa, do której mogłoby dojść w przypadku bezpośredniego wylania niefiksowanego wirusa do naczynia z odpadami. Po upływie 15 minut usuń utrwalacz, wylewając zawartość płytki do naczynia z odpadami. Następnie dodaj 100 µL PBS o temperaturze pokojowej i szczelnie zamknij płytkę za pomocą optycznie przezroczystej folii klejącej.

Jeśli płytka nie zostanie odczytana natychmiast, należy przechowywać ją w temperaturze 4°C. Przed odczytem należy doprowadzić szczelnie zamknięte płytki do temperatury pokojowej, aby zapobiec powstawaniu kondensacji, która mogłaby zakłócić pomiary spektrofotometryczne.

Aby określić ilość namnożonego wirusa, należy użyć spektrofotometru do pomiaru końcowej fluorescencji. Wykonaj cztery pomiary z każdej studzienki, stosując zoptymalizowane ustawienia wzmocnienia dla każdego kanału. Czytnik płytek TECAN Infinite M 1000 Pro użyty w tym filmie eksportuje surowe pomiary fluorescencji do pliku Microsoft Excel. Po uzyskaniu odczytów otwórz surowe dane w programie Microsoft Excel.

Następnie skopiuj i wklej dane do arkusza wyników programu GraphPad Prism. W programie Prism wyznacz średnią dla powtórnych studni TrpV i PLV. Następnie od średniej wartości TrpV odejmij średnią wartość PLV dla każdej serii zabiegów. Aby ułatwić porównanie z powtórzonymi eksperymentami, znormalizuj dane, dzieląc dane po odjęciu tła przez wartości studni TrpV z samym nośnikiem. Po wielokrotnym powtórzeniu eksperymentu przeprowadź jednoczynnikową analizę wariancji (one-way ANOVA) oraz testy porównań wielokrotnych, aby ustalić, czy którykolwiek z zabiegów różni się istotnie od zabiegu z DMSO dla każdego kanału. Aby przeprowadzić analizy kinetyczne, zainfekuj komórki i zastosuj badane związki w ten sam sposób co wcześniej; szczególnie ważne jest zastosowanie medium buforowanego w celu utrzymania odpowiedniego pH bez dodawania 5% dwutlenku węgla.

Po zabezpieczeniu płytki folią klejącą, umieść ją w komorze czytnika płytek wyrównanej do 37 °C. Należy zadbać o to, aby płytki były stale utrzymywane w temperaturze 37 °C. Zapobiegnie to nadmiernemu stresowi komórkowemu oraz kondensacji pary wodnej.

Ręcznie ustaw wzmocnienie czytnika płytek, aby zapobiec nasyceniu sygnału w późniejszych punktach czasowych. Wykonuj odczyty co godzinę przez okres od 8 do 24 godzin po infekcji i znormalizuj wyniki w taki sam sposób, jak w przypadku analizy końcowej. Poszczególne punkty czasowe można analizować pod kątem istotności statystycznej, stosując metody podobne do opisanej wcześniej analizy końcowej.

Aby porównać punkty inhibicji, komórki HeLa zainfekowane szczepami ospy vaccinia TrpV lub PLV hodowano w obecności inhibitorów wirusów ospy: AraC, IBT, ryfampicyny i ST 246. Ten film poklatkowy przedstawia sekwencyjną ekspresję zielonych, czerwonych i niebieskich fluoroforów podczas wzrostu wirusa w komórkach kontrolnych. W przypadku infekcji w obecności AraC, leku blokującego replikację DNA, wczesny zielony fluorofor jest produkowany jak poprzednio, ale nie dochodzi do późniejszej produkcji fluorescencji czerwonej i niebieskiej.

Analiza ilościowa metodą spektrometrii wykazała 210% wzrost ekspresji genów wczesnych, ale brak ekspresji genów pośrednich i późnych w komórkach traktowanych araC. Komórki zainfekowane w obecności IBT, który według przypuszczeń promuje transkrypcję typu read-through, wykazały poziomy ekspresji genów pośrednich i późnych wynoszące odpowiednio 24,7% i 2,9% poziomów kontrolnych. Komórki zainfekowane w obecności ST246 i rifampicyny, które hamują ekspresję po genach późnych podczas montażu i dojrzewania wirionów, nie różniły się znacząco od kontroli. Wyniki te są zgodne ze znanym mechanizmem działania tych związków i sugerują, że wirus reporterowy TrpV może być wykorzystany do identyfikacji konkretnego etapu hamowania wirusa przez nieznane związki.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zastosowaniu odpowiednich kontroli. Pozwala to nie tylko na prawidłową normalizację wyników, ale także na określenie potencjalnego mechanizmu działania badanego związku eksperymentalnego. Należy pamiętać, że praca z wirusem ospy krowiej (vaccinia virus) może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i stosować zalecane techniki zabezpieczające dla poziomu BSL-2.