Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie etapów, w których na ekspresję genów wirusa wpływa leczenie chemiczne. Aby to zrobić, komórki hodowli tkankowej są powlekane i inkubowane. Aż do zlewania się, komórki są następnie zakażane albo potrójnym wirusem krowianki reporterowej, albo wirusem z listy promotorów kontroli.

Następnie stosuje się związki lecznicze, a komórki inkubuje się przez 18 godzin, aby umożliwić zakończenie wszystkich etapów ekspresji genów wirusa. Uzyskana fluorescencja jest następnie oznaczana za pomocą czytnika płytek. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują względne zmiany w ekspresji spowodowane przez eksperymentalne związki.

Główną przewagą tej techniki nad zakażeniem wirusem, który wyraża pojedyncze fluorescencyjne białko fuzyjne, jest to, że ten zestaw wirusów dostarcza więcej informacji o tym, gdzie w cyklu życiowym wirusa działa określony lek terapeutyczny, zapewniając wgląd w jego mechanizm działania. Chociaż metoda ta może być stosowana do identyfikacji inhibitorów infekcji wirusowej, może być również stosowana do wykrywania etapu replikacji wirusa zakończonego w niepermisywnych liniach komórkowych lub w badaniach przesiewowych RNAi, identyfikując czynniki komórkowe niezbędne do infekcji. Protokół ten wykorzystuje potrójnego wirusa lub wieloetapowego wirusa reporterowego Trip V, w którym trzy spektralnie odrębne czwórki fluorowe są włączone do dwuwarstwowego genomu pojedynczego wirusa venii.

Każda z tych czwórek fluorowych jest kontrolowana przez dobrze zdefiniowany promotor specyficzny dla etapu. Promotor C 11 R do wczesnej ekspresji Wenus, promotor pośredni G 8 R do ekspresji wiśni m i promotor F 17 R do późnej ekspresji znacznika BFP. W ten sposób Venus m Cherry i tag BFP ulegają sekwencyjnej ekspresji podczas infekcji.

Jako kontrola, używany jest wirus listy promotorów. PLV zawiera podobny konstrukt żylny do tego w Trip V. Jednak nie ma funkcjonalnego promotora transkrypcji. Rozpocznij ten protokół od dysocjacji.

Komórki Hela hodowane na 10-centymetrowej szalce, rozcieńcz komórki w pożywce wzrostowej do około 2,0 razy 10 do piątych komórek na mililitr. Następnie dozować 100 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej o czarnych ściankach, z przezroczystym płaskim dnem, inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż do zlewania się w celu rozcieńczenia wirusów, rozmrożenia Tripp V i PLV w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie sonikacji przez pięć minut w celu dezagregacji. Następnie rozcieńczyć zapas wirusa do 1,0 razy 10 do siódmego PFU na mililitr w pożywce infekcyjnej, która została wstępnie podgrzana do 37 stopni Celsjusza, aby zainfekować komórki.

Zastąp pożywkę wzrostową 50 mikrolitrami rozcieńczonego wirusa do każdego dołka dla każdego zabiegu. Zainfekuj trzy dołki replikowane Tripp V, a kolejne trzy PLV, aby uwzględnić fluorescencję tła specyficzną dla każdego zabiegu. Definiuje się to jako czas równy zero godzin.

Na przykład po infekcji zrób 350 mikrolitrów na 6 96 studzienek po 50 mikrolitrów każdy. Każdy związek należy rozcieńczyć do dwukrotności końcowego stężenia, ponieważ zostanie on dodany do objętości inokulum już w studzience. Następnie, dla każdego warunku poddawania działaniu substancji, należy przygotować mieszaninę wzorcową w dwóch częściach, rozcieńczając związki doświadczalne lub rozpuszczalniki kontrolne nośnika, takie jak PBS lub DMSO, do wystarczającej ilości pożywki infekcyjnej dla wszystkich kontrprób.

Plus jeden, Zauważ, że stężenie rozpuszczalnika zarówno w kontrolach eksperymentalnych, jak i tylko wektorowych powinno być takie samo. Na przykład, jeśli używasz IBT przy jednym mikrolitrze na promil w DMSO, powinieneś również użyć samego DMSL przy jednym mikrolitrze na promil jako kontrolki wektorowej. Natychmiast po dodaniu wirusa dodaj 50 mikrolitrów pożywki infekcyjnej zawierającej pożądane związki lecznicze i kontrolne do każdej studzienki, jak pokazano na tej ilustracji.

Należy zauważyć, że każdy związek jest badany z użyciem Tripp V i PLV w trzech egzemplarzach, a kontrola nośnika jest przeprowadzana w trzech egzemplarzach dla każdego wirusa. Inkubować przez 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza plus 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia utrwal komórki, dodając 100 mikrolitrów 8% aldehydu paraform do pożywki infekcyjnej już w każdej studzience inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem.

Dodanie dwóch x lub 8% aldehydu paraform bezpośrednio do pożywki infekcyjnej zapobiegnie aerozolizacji wirusa, która w przeciwnym razie mogłaby wystąpić, gdyby nieutrwalony wirus został bezpośrednio wrzucony do naczynia na odpady. Po upływie 15 minut usunąć utrwalacz, obracając płytkę do naczynia na odpady. Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS o temperaturze pokojowej i uszczelnij płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.

Jeśli tabliczka nie zostanie odczytana od razu, przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pamiętaj, aby przywrócić uszczelnione płytki do temperatury pokojowej przed ich odczytaniem, aby zapobiec zniekształceniu pomiarów spektrofotometru przez kondensację. Aby określić ilościowo wzrost wirusa, użyj spektrofotometru do pomiaru fluorescencji w punkcie końcowym.

Wykonaj cztery pomiary na studzienkę, korzystając ze zoptymalizowanych ustawień wzmocnienia dla każdego kanału. Czytnik płytek TAN Infinite M 1000 Pro użyty w tym filmie eksportuje surowe pomiary fluorescencji do pliku Microsoft Excel. Po uzyskaniu odczytów otwórz surowe dane w programie Microsoft Excel.

Następnie skopiuj i wklej go do pryzmatu GraphPad. Arkusz wyników w Prism określa średnią z powtórzonych studzienek Tripp v i PLV. Następnie odejmij średnią wartość PLV od średniej wartości Tripp V dla każdego zabiegu.

Aby ułatwić porównanie z powtórzonymi eksperymentami, znormalizuj dane, dzieląc odjęte dane tła tylko przez pojazd Tripp v Wells. Po wielokrotnym powtórzeniu eksperymentu należy przeprowadzić jednoczynnikową analizę wariancji lub jednoczynnikowy test NOVA oraz wielokrotne porównanie po teście, aby ustalić, czy którakolwiek z metod leczenia znacząco różni się od leczenia DMSO. Aby każdy kanał mógł przeprowadzić testy kinetyczne zainfekować komórki i zastosować związki testowe jak poprzednio, szczególnie ważne jest użycie buforowanej pożywki w celu utrzymania odpowiedniego pH bez dodatku 5% dwutlenku węgla.

Po uszczelnieniu płytki folią samoprzylepną należy umieścić ją w komorze czytnika płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Należy zwrócić szczególną ostrożność, aby utrzymać talerze w stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zapobiegnie to nadmiernemu stresowi komórkowemu i kondensacji.

Ręcznie ustaw wzmocnienie czytnika płytek, aby zapobiec nasyceniu późniejszych punktów czasowych. Uzyskaj odczyty godzinowe przez osiem do 24 godzin po infekcji i normalizuj. Jeśli chodzi o test punktu końcowego, poszczególne punkty czasowe mogą być analizowane pod kątem istotności statystycznej przy użyciu podobnych metod, jak poprzednio opisany test punktu końcowego.

Aby porównać punkty hamowania, komórki heela zakażone krowianką TPV lub PLV hodowano w obecności inhibitorów wirusa ospy, Aris, CIBT, ryfampicyny i ST 2 46. Tym razem film poklatkowy pokazuje sekwencyjną ekspresję zielonych, czerwonych i niebieskich czwórek fluorowych podczas wzrostu wirusa w komórkach kontrolnych po zakażeniu w obecności leku blokującego replikację DNA aee. Wczesny zielony fluoro four jest wytwarzany jak poprzednio, ale pośrednia i późna produkcja czerwonej i niebieskiej fluorescencji nie występuje.

Analiza ilościowa za pomocą spektrometrii wykazała 210% wzrost wczesnej ekspresji genów, ale brak ekspresji pośredniej i późnej w komórkach leczonych komórkami C zakażonymi w obecności IBT, co uważa się za sprzyjające. Odczytana transkrypcja miała pośrednie i późne poziomy ekspresji, które wynosiły 24,7% i 2,9% poziomów kontrolnych, komórki zakażone w obecności ST 2 46 i ryfampicyny, które hamują po późnej ekspresji genów podczas składania wirionu i dojrzewania, nie różniły się istotnie od kontrolnych. Wyniki te są zgodne ze zrozumiałym mechanizmem działania tych związków i sugerują, że wirus reporterowy Trip V może być wykorzystany do identyfikacji specyficznego etapu hamowania wirusa dla nieznanych związków.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu odpowiednich elementów sterujących. Pozwala to nie tylko na właściwą normalizację wyników, ale także na określenie potencjalnego mechanizmu dla Twojego eksperymentalnego związku. Nie zapominaj, że praca z wirusem krowianki może być bardzo niebezpieczna, zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej i postępuj zgodnie z zalecanym bsl.

Dwie techniki przechowawcze.