Name: Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę ilościowego określania funkcji wirusa krowianki z wykorzystaniem fluorescencyjnego wirusa reporterowego. Technika umożliwia identyfikację etapów replikacji wirusowej wpływanych przez inhibitory małocząsteczkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy SIGA Technologies (Corvallis, OR) za dostarczenie ST-246. D.K.R. otrzymał wsparcie od NIH w zakresie immunologii (5T32AI 7309). Praca ta była częściowo wspierana przez P41 086180, NIH RO1AI1096159-01 i RO3 (do J.H.C.).

1. Komórki płytkowe
<ol>
	<li>Oddzielić komórki HeLa od płytki i rozcieńczyć w pożywce wzrostowej (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) do około 2,0 x 105 komórek/ml. Dozować 100 μl / studzienkę na czarnościenną, przezroczystą 96-dołkową płytkę z płaskim dnem (20 000 komórek / dołek).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny aż do zlewania się w inkubatorze o temperaturze 37 °C + 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Zainfekuj komórki
<ol>
	<li>Rozcieńczyć wirusa i zainfekować komórki.
	<ol>
		<li>Rozmrażanie TrpV (potrójny wirus; Wczesny wirus fluorescencyjny Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) i PLV (Wenus bez promotora) i dezagregować za pomocą sonikacji przez 5 minut. Alternatywnie, surowe zapasy wirusów można zmieszać w stosunku 1:1 z 0,25 mg/ml trypsyny w pożywce infekcyjnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć surowe zapasy wirusa w pożywce infekcyjnej o temperaturze 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). W przypadku zakażeń o wysokim MOI (10 PFU/komórkę) rozcieńczyć zapas wirusa do 1,0 x 107 PFU/ml, zakładając 5 x 104 komórek/basenik i objętość inokulum 50 μl. Zaplanuj zakażenie 3 dołków replikowanych dla każdego leczenia TrpV i kolejnych 3 studzienek replikowanych dla tego samego leczenia PLV, aby uwzględnić fluorescencję tła specyficzną dla każdego zabiegu.</li>
		<li>Infekować studzienki, dodając 50 μl/dobrze rozcieńczonego wirusa do pożywki infekcyjnej. Definiuje się to jako czas = 0 godzin po zakażeniu (0 hpi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć pożądane związki lecznicze w pożywce infekcyjnej. W przypadku wszystkich zabiegów należy wykonać pojedyncze 2-krotne rozcieńczenie mieszanki głównej i zastosować je w celu powtórzenia studzienek (np. 350 μl całkowitej objętości dla sześciu 96-dołków po 50 μl każdy).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć eksperymentalne związki w pożywce infekcyjnej.</li>
		<li>Rozcieńczyć rozpuszczalnik kontrolujący nośnik (np. PBS, DMSO) w pożywce infekcyjnej. Uwaga: Należy stosować podobne stężenia końcowe rozpuszczalników do kontroli nośnika, jak w przypadku związków doświadczalnych (np. jeśli zapas IBT jest wykonany z DMSO i stosowany w końcowych stężeniach 1 μl/ml, wówczas należy użyć samego DMSO w stężeniu 1 μl/ml jako kontroli nośnika).</li>
		<li>Rozcieńczyć związki kontrolne w pożywce infekcyjnej. Zalecane związki kontrolne to: 3,6 μM (1 μg/ml) 1-β-D-Arabinofuranozylocytozyna (AraC), 50 μM (11,7 μg/ml) β izosemikarbazon (IBT), 60 μM (50 μg/ml) ryfampicyna lub 5 μM (1,9 μg/ml) ST-246 8,15,16. Zobacz Reprezentatywne wyniki, aby uzyskać oczekiwane efekty. Uwaga: należy przeprowadzić to rozcieńczenie przy dwukrotnym (2x) pożądanym stężeniu końcowym, ponieważ dodaje się je w stosunku 1:1 do objętości już znajdującej się w studzience.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu wirusa dodać 50 μl pożywki infekcyjnej zawierającej pożądane zabiegi i kontrole, zgodnie z rozcieńczeniem w kroku 2.2. Uwaga: W celu oznaczenia zahamowania przed wczesnym etapem ekspresji, związek(-i) może być dodany bezpośrednio do inokulum rozcieńczonego wirusa (etap 2.1.2) lub do komórek gospodarza przed zakażeniem (przed etapem 2.1.3).</li>
	<li>Inkubować 6-24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C + 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Napraw komórki
<ol>
	<li>Napraw komórki, dodając 100 μl 8% paraformaldehydu do pożywki infekcyjnej już w każdym dołku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Uwaga: Zaleca się dodawanie 2x PFA (8%) bezpośrednio do pożywki infekcyjnej, aby zapobiec aerozolizacji zakaźnej krowianki, która może wystąpić, jeśli pożywka o wysokim mianie zostanie odwrócona bezpośrednio do naczynia na odpady przed utrwaleniem.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz, obracając płytkę do naczynia na odpady.</li>
	<li>Dodać 100 μl PBS o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płyta uszczelniająca z optycznie przezroczystą folią samoprzylepną. Uwaga: Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast odczytane. Pamiętaj, aby przed odczytem przywrócić uszczelnione płytki do temperatury pokojowej, aby zapobiec zniekształceniu pomiarów spektrofotometru przez kondensację.</li>
</ol>
4. Określ ilościowo wzrost wirusa
<ol>
	<li>Zmierz fluorescencję punktu końcowego na 515:530 dla Wenus, 587:610 dla mCherry i 415:457 dla TagBFP (wzbudzenie: długość fali emisji w nm). Cztery pomiary powinny być uśrednione na dołek przy użyciu zoptymalizowanych ustawień wzmocnienia dla każdego kanału. Uwaga: Odpowiednia długość fali emisji może się różnić w zależności od konkretnego modelu i charakterystyki filtra czytnika płytek. Można to określić empirycznie, wykonując skanowanie długości fali emisji w celu określenia punktu, w którym występuje największa różnica między TrpV i PLV dla każdego kanału.</li>
	<li>Znormalizuj nieprzetworzone dane, aby ułatwić porównywanie eksperymentów.
	<ol>
		<li>Dla każdego kanału należy określić średnią z duplikatów studzienek TrpV i PLV.</li>
		<li>Odejmij średnie pomiary tła zakażonego PLV od średnich pomiarów eksperymentalnych zakażonych TrpV dla każdego leczenia.</li>
		<li>Znormalizuj dane, dzieląc każdą odjętą wartość tła przez wartość tylko dla pojazdu.</li>
		<li>Po wielokrotnym powtórzeniu eksperymentu można przeprowadzić jednoczynnikową analizę wariancji (jednoczynnikowy test ANOVA) i wielokrotne porównanie po teście w celu określenia, czy którykolwiek z zabiegów odzwierciedla statystycznie istotną różnicę w stosunku do leczenia samym nośnikiem dla każdego kanału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Alternatywny protokół: Kinetyczne testy płytkowe
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie kroki, dodając zabiegi (krok 2.3).</li>
	<li>Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i umieścić w komorze czytnika płytek w temperaturze zrównoważonej do 37 °C. Uwaga: Należy zachować szczególną ostrożność, aby utrzymać płytki w stałej temperaturze 37 °C, aby zapobiec nadmiernemu naprężeniu komórek i kondensacji. W przypadku testów kinetycznych szczególnie ważne jest stosowanie pożywki buforowej (wodorowęglan sodu i HEPES) w celu utrzymania odpowiedniego pH bez dodatku 5% CO2 .</li>
	<li>Ustaw wzmocnienie czytnika płyt ręcznie, aby zapobiec nasyceniu późniejszych punktów czasowych. Uwaga: Dokładna optymalizacja wzmocnienia może być uzyskana, wykonując testy punktu końcowego w podobnych warunkach.</li>
	<li>Uzyskaj odczyty godzinowe dla 8-24 hpi i znormalizuj przy użyciu podobnej procedury, jak w teście punktu końcowego (krok 4.2).</li>
	<li>Poszczególne punkty czasowe mogą być analizowane pod kątem istotności statystycznej przy użyciu podobnych metod, jak poprzednio opisany test końcowy</li>.
</ol>

<ol><li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+infection+%26+temporal+analysis+of+virus+gene+expression%3A+part+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li>
<li>Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiZyme%3A+a+novel+fusion+protein-mediating+selection+of+vaccinia+virus+recombinants+by+fluorescence+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance.</a> BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).</li>
<li>Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+vaccinia+viruses+via+green+fluorescent+protein+selection%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection.</a> DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).</li>
<li>Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addition+of+tumor+necrosis+factor+plus+beta+interferon+induces+a+novel+synergistic+antiviral+state+against+poxviruses+in+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts.</a> Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).</li>
<li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).</li>
<li>Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high-throughput+vaccinia+virus+neutralization+assay+for+testing+smallpox+vaccine+efficacy+based+on+detection+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein.</a> Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).</li>
<li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid%2C+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).</li>
<li>Dower, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pyridopyrimidinone+inhibitor+of+orthopoxviruses+from+a+diversity-oriented+synthesis+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).</li>
<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Potential+of+the+Acyclic+Nucleoside+Phosphonates+Cidofovir%2C+Adefovir%2C+and+Tenofovir+in+Treatment+of+DNA+Virus+and+Retrovirus+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).</li>
<li>Prichard, M. N., Kern, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopoxvirus+Targets+for+the+Development+of+New+Antiviral+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents.</a> Antiviral Research. 10, (2012).</li>
<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+successful+eradication+campaign.+Global+eradication+of+smallpox%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox.</a> Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).</li>
<li>Breman, J. G., Henderson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+dilemmas--monkeypox%2C+smallpox%2C+and+biologic+terrorism.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England.</a> Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).</li>
<li>Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+antiviral+therapeutics+for+smallpox%2C+monkeypox+and+other+orthopoxvirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections.</a> Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).</li>
<li>Rimoin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+increase+in+human+monkeypox+incidence+30+years+after+smallpox+vaccination+campaigns+cease+in+the+Democratic+Republic+of+Congo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).</li>
<li>Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+vaccinia+virus%3A+effects+of+rifampin+on+the+intracellular+distribution+of+viral+protein+p65%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65.</a> Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).</li>
<li>Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+small-molecule+antiviral+ST-246+as+a+smallpox+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic.</a> Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).</li>
<li>Broyles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus transcription.</a> Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).</li>
<li>Condit, R. C., Niles, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+viral+transcription+elongation+and+termination+during+vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Structure+and+Expression%22%5BJournal%5D)">Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).</li>
<li>Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+the+2-5A+synthetase%2FRNase+L+system+results+in+inhibition+of+vaccinia+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication.</a> Virology. 227 (1), 220-228 (1997).</li>
<li>Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ppp%28A2%E2%80%99p%29nA-dependent+RNase+by+a+temperature-sensitive+mutant+of+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus.</a> Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).</li>
<li>Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+different+leukocyte+cell+types+to+Vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection.</a> Virology Journal. 1 (1), (2004).</li>
<li>Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+S2+cells+are+non-permissive+for+vaccinia+virus+DNA+replication+following+entry+via+low+pH-dependent+endocytosis+and+early+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription.</a> PLoS One. 6 (2), (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie ma żadnych patentów na wirusy ani metody badań przesiewowych.

W tym miejscu opisaliśmy praktyczne zastosowanie wieloetapowego wirusa reporterowego krowianki (TrpV), który zapewnia powtarzalne pomiary replikacji wirusa w czasie rzeczywistym. Stosując dobrze zdefiniowane inhibitory pokswirusa, byliśmy w stanie wykazać, że TrpV reaguje w sposób zgodny ze zrozumiałym mechanizmem działania każdego inhibitora. Podczas gdy wirus TrpV dostarcza najbardziej wyczerpujących informacji na temat progresji stadium wirusa, wirusy dwuetapowe (IREV, LREV) i jednoetapowe (EV, IV, LV) mogą być równie...

Tradycyjnie, ekspresja wirusa jest badana za pomocą technik biologii molekularnej (np. northern blotting, western blotting, hybrydyzacja mikromacierzy, itp.) 1. Chociaż metody te są w stanie dostarczyć szczegółowych informacji w odniesieniu do kategoryzacji zmian ekspresji poszczególnych mRNA lub białek, zazwyczaj nie są one podatne na procesy w czasie rzeczywistym i wysokoprzepustowe. Alternatywne podejścia wykorzystujące reportery oparte na fluorescencji były stosowane wcześniej podczas pracy z pokswirusami; Jednak ich rozwój i wykorzystanie było motywowane różnymi celami. Opracowano kilka takich metod selekcji rekombinowanych wirusów 2,3. Techniki te wyrażają EGFP po prawidłowym włączeniu i ekspresji egzogennego DNA z rekombinowanych klonów krowianki. Podobnie, kilka szczepów krowianki wykazujących stabilną ekspresję rozpuszczalnych białek znakowanych EGFP lub GFP ulega ekspresji pod natywnym promotorem krowianki. Są one zwykle używane do ilościowego określania wnikania i replikacji wirusa podczas testów neutralizacji opartych na przeciwciałach, hamowania chemicznego lub porównywania skuteczności przeciwwirusowej 4-6. Chociaż wirusy te okazały się przydatne, ich zdolność do dostarczania szczegółowych informacji o punkcie zahamowania jest ograniczona ze względu na użycie jednego niejednoznacznego wczesnego/późnego promotora wirusa. Poprzednie metody wykorzystywały również białko EGFP o nieoptymalnej charakterystyce sygnału do szumu.

Ze względu na złożoność replikacji poxwirusa i brak istniejących narzędzi do testowania zmian w ekspresji genów wirusa w czasie rzeczywistym, opracowaliśmy zestaw jedno- i wieloetapowych wirusów reporterowych 7,8. Jak opisano w poprzednich publikacjach, wirusy te wyrażają jedno, dwa lub trzy spektralnie odrębne białka fluorescencyjne z natywnych promotorów krowianki we wczesnych, pośrednich lub późnych stadiach infekcji. Wirusy te mogą być wykorzystywane jako wskaźniki postępu replikacji wirusa za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i równie dobrze nadają się do wysokoprzepustowych testów opartych na płytkach i czytnikach. Wirusy te są łatwe w użyciu zamiast wirusa typu dzikiego, rosną z podobną kinetyką, aby osiągnąć równoważne miana 7. Podczas planowania i tworzenia tych wirusów zwrócono dużą uwagę na wybór fluoroforów, które mają wysoką charakterystykę sygnału do tła z doskonałą wydajnością fałdowania, aby ułatwić wiarygodną kwantyfikację z szybkim sprzężeniem zwrotnym na zmiany w ekspresji (Venus, mCherry i TagBFP). Ponadto wybrano kombinacje promotorów wirusa, które dają wysoką wierność, jednoznaczną ekspresję specyficzną dla etapu, dostarczając informacji o pełnym zakresie ekspresji genów wczesnych (promotor C11R), pośrednich (promotor G8R) i późnych (promotor F17R), w przeciwieństwie do niejednoznacznych promotorów wczesnych/późnych.

Te wirusy mogą być używane jako narzędzie do badania cyklu życia prototypowego wirusa ospy, wirusa krowianki. Nadal wiele nie wiadomo na temat interakcji gospodarz-wirus, pomimo długiej historii badań. Krowianka jest złożona, wytwarza ponad 200 unikalnych białek, z których wiele jest immunomodulujących i antagonistycznych wobec gospodarza. Po zakażeniu wirus krowianki natychmiast rozpoczyna wczesną transkrypcję mRNA. Jest to ułatwione przez polimerazę RNA i czynniki transkrypcyjne, które zostały załadowane do genomu wirusa podczas pakowania wirionu i utrzymywane w stanie wstrzymania do czasu kolejnej infekcji. Ta wczesna ekspresja wytwarza głównie białka wymagane do supresji układu odpornościowego gospodarza (deapping mRNA, sekwestracja dsRNA i białka receptora wabika, a także inhibitory apoptozy, odpowiedzi na stres oraz sygnalizacji Toll, IL i NF-κB) oraz replikacji genomu. Wczesna ekspresja wytwarza również czynniki transkrypcyjne niezbędne do ekspresji pośredniej. Ekspresja pośrednia obejmuje ekspresję czynników transkrypcyjnych w późnym stadium. Ta kaskada ekspresji prowadzi do produkcji strukturalnych i enzymatycznych białek wirusa w późnych stadiach infekcji, które są niezbędne do pełnego złożenia dojrzałego wirionu krowianki. 

Nasz zestaw fluorescencyjnych wirusów reporterowych pozwala na szybki postęp w zrozumieniu biologii pokswirusa. Jedną z najczęstszych i najbardziej czasochłonnych metod w dziedzinie wirusologii jest próba wzrostu. Zazwyczaj obejmuje to infekowanie komórek, przeprowadzanie serii zabiegów, zbieranie wirusa poprzez lizę zakażonych komórek i ilościowe określanie wynikowego miana wirusa za pomocą testu płytki nazębnej. Wykorzystanie opisanych tutaj wirusów reporterowych pozwala na pomiar wzrostu wirusa w czasie rzeczywistym, który można łatwo ocenić i porównać między wieloma zabiegami wykonywanymi równolegle. Przewidujemy, że ten zestaw odczynników będzie używany w różnych protokołach do identyfikacji zmian w ekspresji genów wirusa w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, knockdown RNAi lub ograniczenie zakresu gospodarza.

Ta metoda umożliwia również analizę o wysokiej zawartości na większą skalę niż poprzednio dostępne, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków przeciwwirusowych dla konkretnie zdefiniowanych etapów docelowych będących przedmiotem zainteresowania. Chociaż zidentyfikowano wiele potencjalnych metod leczenia zakażenia pokswirusem, jedynymi zatwierdzonymi przez FDA terapiami skutecznymi w leczeniu zakażenia pokswirusem są alizatyczny nukleozyd fosfonianu, cydofowir i leczenie immunoglobuliną krowianki 9,10. Pomimo zwalczenia ospy prawdziwej w 1977 r. 11 wirusy ospy nadal stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego 12 . Zaprzestanie powszechnych szczepień przeciwko wirusowi ospy wietrznej doprowadziło do zwiększenia podatności na inne pokswirusy 13. Na przykład regiony Afryki Środkowej, które wcześniej były chronione przez szczepienia, doświadczają gwałtownego wzrostu zakażeń wirusem małpiej ospy 14. Poważne obawy wzbudziła również utajona podatność na celowe uwolnienie wirusa ospy wietrznej. Ze względu na ograniczoną liczbę dostępnych obecnie terapii istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich metod leczenia. Te wirusy reporterowe umożliwiają szybkie i wysokoprzepustowe badania przesiewowe inhibitorów małych cząsteczek w celu zahamowania określonego etapu replikacji wirusa. Identyfikacja inhibitorów, które są ukierunkowane na etapy ekspresji wirusa, które obecnie nie są celem hamowania, ułatwi opracowanie terapii skojarzonych o zwiększonej sile.


Wiele można dowiedzieć się o biologii komórek krowianki, obserwując zmiany w ekspresji genów na każdym etapie. Osłabienie zakażonej komórki gospodarza przez manipulację chemiczną lub genetyczną jest zwykle wyrażane w postaci obniżonych mian wirusa. Jednak porównując zmiany na każdym etapie kaskady ekspresji wirusa, można uzyskać pełniejsze zrozumienie, w jaki sposób określone leczenie wpływa na zdolność wirusa. Wykazano, że dane te dobrze korelują z tradycyjnym wynikiem miana wirusa, ale dostarczają bardziej szczegółowych informacji mechanistycznych, a także zapewniają wysoką przepustowość 7.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - Optima, inaktywowana termicznie (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina, (L-glut)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear Bottom Czarne polistyrenowe mikropłytki poddane TC</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>384 Dobrze płaskie, przezroczyste dno Czarne polistyren Mikropłytki poddane TC</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 2X, sterylna, napromieniowana</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>TRLVMF</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek dimetylu, hodowla komórkowa (DMSO)</td>Amerykański <td>AB03091</td><td></td> <td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>1-&beta;-D-Arabinofuranozycytozyna&nbsp; (AraC), MW= 280 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>isatin &beta; -tiosemikarbazon (IBT), MW= 234 g/mol</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9075202</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna, MW= 823 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ST-246, MW= 376 g/mol</td><td>SIGA Labs, Corvallis, OR 8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>TempPlate RT optycznie przezroczysta folia</td><td>USA Scientific</td><td>2978-2700</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowane serum</td><td>Medium Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr></tbody></table>

wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxwirusy to rodzina dwuniciowych wirusów DNA, które zawierają aktywne ludzkie patogeny, takie jak małpia ospa, zakaźny i wirus Contagalo. Do rodziny należy również wirus ospy prawdziwej, Variola. Ze względu na złożoność replikacji pokswirusa nadal pozostaje wiele pytań dotyczących strategii ekspresji genów. W tym artykule opisujemy konceptualizację i zastosowanie rekombinowanych wirusów krowianki, które umożliwiają pomiar w czasie rzeczywistym pojedynczych i wielu etapów ekspresji genów wirusa w formacie wysokoprzepustowym. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu spektralnie odrębnych białek fluorescencyjnych jako reporterów dla każdego z trzech etapów replikacji wirusa. Wirusy te zapewniają wysoki stosunek sygnału do szumu, zachowując jednocześnie specyficzne dla etapu wzorce ekspresji, umożliwiając testy na płytkach i mikroskopowe obserwacje rozprzestrzeniania się i replikacji wirusa. Narzędzia te mają zastosowanie w odkrywaniu leków przeciwwirusowych, badaniach interakcji wirus-gospodarz i biologii ewolucyjnej.

Jako przykład typowego zastosowania tych wirusów, wirus z potrójnym reporterem fluorescencyjnym został wykorzystany do porównania punktu inhibicji kilku dobrze zdefiniowanych inhibitorów poxwirusów.
Komórki HeLa wysiano do czarnych, przezroczystych płytek 96-dołkowych o płaskim dnie, przeznaczonych do hodowli tkanek, i inkubowano przez noc. Konfluencyjne monowarstwy zainfekowano z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 10, używając wirusa z potrójnym reporterem (TrpV; Tabela 1</stron...

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie etapów, na których ekspresja genów wirusowych jest modyfikowana przez obróbkę chemiczną. W tym celu komórki hodowli tkankowej są wysiewane i inkubowane do momentu osiągnięcia konfluencji. Następnie komórki są infekowane albo potrójnym wirusem vaccinia z reporterami, albo kontrolnym wirusem pozbawionym promotora.Następnie stosuje się związki testowe, a komórki inkubuje się przez 18 godzin, aby umożliwić zakończenie wszystkich etapów ekspresji genów wirusa. Następnie mierzy się powstałą fluorescencję za pomocą czytnika płytek. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące względne zmiany w ekspresji wywołane przez badane związki.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z zakażeniem wirusem wykazującym pojedyncze fluorescencyjne białko fuzyjne jest fakt, że ten zestaw wirusów dostarcza więcej informacji o tym, w którym momencie cyklu życia wirusa działa konkretny lek terapeutyczny, co pozwala zrozumieć jego mechanizm działania. Choć metoda ta może być wykorzystywana do identyfikacji inhibitorów infekcji wirusowej, może ona również służyć do wykrywania etapu replikacji wirusa ukończonego w liniach komórkowych niepodatnych na zakażenie lub

vaccinia-reporter-viruses-for-quantifying-viral-function-at-all

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wirusy reporterowe Vaccinia do ilościowego określania funkcji wirusowej na wszystkich etapach ekspresji genów

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 1 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 2 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 3 opisuje proces znakowania fluorescencyjnego namnożonego RNA z próbek gospodarza i wirusa poprzez sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallilowych. Część 3 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusowych: Część 3

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Źródło: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)Niniejszy materiał wideo demonstruje metodę monitorowania replikacji wirusa vaccinia z wykorzystaniem reporterów fluorescencyjnych regulowanych przez promotory specyficzne dla danej fazy. Sekwencyjna ekspresja zielonych, czerwonych i niebieskich białek fluorescencyjnych znakuje wczesną, pośrednią i późną fazę infekcji, co umożliwia wysokoprzepustową...

Monitorowanie etapowej ekspresji genów wirusa vaccinia z użyciem reporterów fluorescencyjnych

Ten film demonstruje technikę in vitro do wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) za pomocą rekombinowanego systemu reporterowego HBV. Po zakażeniu komórek gospodarza rekombinowany genom wirusa wykazuje ekspresję enzymu reporterowego lucyferazy, który wytwarza bioluminescencję po utlenieniu substratu - pomagając wykryć infekcję wirusową.

System reporterowy rekombinowanego wirusa in vitro do wykrywania infekcji wirusowych

Ten film demonstruje test do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem poxvirus. Niezakażone i zakażone wirusem komórki były współtransfekowane mRNA kodującymi lucyferazy świetlika (Fluc) i lucyferazy Renilla (Rluc), przy czym mRNA Fluc zawierało sekwencję liderową 5' poli(A). Po dodaniu substratów bioluminescencyjnych na lizowanych komórkach, zmierz sygnał z obu lucyferazy, aby zidentyfikować przewagę translacyjną mRNA Fluc w komórkach zakażonych wirusem, przyznaną przez...

Test reporterowy lucyferazy do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych ospą

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Poznaj metodę ilościowego określania funkcji wirusa krowianki z wykorzystaniem fluorescencyjnego wirusa reporterowego. Technika umożliwia identyfikację etapów replikacji wirusowej wpływanych przez inhibitory małocząsteczkowe.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów