Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie wykrywania impedancji podłoża elektrycznego, znanego jako eis, do scharakteryzowania zachowań komórek. Osiąga się to poprzez hodowanie komórek na elektrodach w matrycy i wykonywanie pomiarów w różnych trybach w celu ilościowego określenia tworzenia bariery śródbłonka, dojrzewania i manipulacji funkcji, takich jak zranienia elektryczne i dodawanie stymulantów, a następnie wykonuje się je w celu zbadania ruchliwości komórek i funkcji bariery. Uzyskuje się wyniki, które opisują przyłączanie komórek, proliferację, migrację, wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórek, komórek i substratów komórkowych na podstawie esis.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak zapewnienie generowania danych ilościowych online, charakteryzowanie komórek w ich naturalnym stanie konfluencji w standardowych warunkach hodowli komórek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, mają trudności, ponieważ podstawowa teoria wydaje się złożona i przed rozpoczęciem eksperymentu należy pamiętać o kilku podstawowych kwestiach. Aby rozpocząć, matryce muszą zostać oczyszczone i ustabilizowane, aby zapobiec dryfowaniu elektrod, poprawić odtwarzalność i zwiększyć współczynnik siły sygnału.

Dlatego po 15 minutach dodaj 200 mikrolitrów 10-milimolowego EL ine do każdej studzienki z ośmiodołkową matrycą W temperaturze pokojowej usuń EL cystynę za pomocą dwóch ultraczystych płukanek wodnych, a nie fosforanowych. Nie należy również wystawiać elektrod na działanie roztworów zawierających surowicę przed powlekaniem, ponieważ mogą one zakłócać wchłanianie białek. Następnie dodaj 200 mikrolitrów podgrzanej 1% żelatyny do każdej studzienki i inkubuj układ przez pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby usunąć żelatynę, użyj ultraczystej wody i nie pozwól, aby powierzchnie elektrod wyschły. Następnie napełnij studzienki 400 mikrolitrami kompletnej pożywki hodowlanej, która może teraz zawierać surowicę. Załaduj tablicę do uchwytu.

Sprawdź dziewięć złotych kwadratów. Powinny one stykać się z pinami POGO. Ostrożnie zabezpiecz macierz ręcznie na miejscu, dokręcając regulacyjną na komputerze.

Otwórz oprogramowanie pomiarowe. Naciśnij przycisk setup, a następnie sprawdź w sekcji zbierania danych, aby wykonać szybki pomiar impedancji każdego dołka z domyślną częstotliwością 4 000 herców. Wartości będą przechowywane w sekcji komentarzy.

Upewnij się, że podczas kontroli dokładnie wybrano typ używanej macierzy EISs w sekcji konfiguracji studni na schemacie tablicy. Kolor czerwony i zielony wskazują funkcjonalność połączeń. Jeśli czyszczenie i kodowanie powiodło się, osiem macierzy systemowych W one E powinno zarejestrować około pięciu do sześciu macierzy NANOFARAD i osiem macierzy W 10 E.

Rezystancja podstawowa od 50 do 60 nanofaradów przed wysiewem komórek wynosi zatem około 2000 omów. Aby modelować dane przy użyciu RB alpha i cm, rozpocznij nagrywanie MFT z tablicą medium failed. Poświęć 15 minut danych bez komórek i zakończ eksperyment, aby dodać komórki.

Teraz usuń tablicę i zasiej 400 mikrolitrów zawiesiny jednokomórkowej do każdej studzienki. Aby zbadać nasiona wzrostu komórek, 10 000 komórek na centymetr kwadratowy, na początek od prawie zlewającego się nasienia populacji, 60 000 komórek na centymetr kwadratowy. Po załadowaniu tablicy do uchwytu, w sekcji konfiguracji studni wybierz studzienki do pomiaru.

Następnie przejdź do opcji zbierania danych i wybierz tryb pomiaru dla szeregów czasowych przy stałej częstotliwości, wybierz SFT, a następnie wybierz częstotliwość pomiaru do pomiaru pokrycia elektrodą i model RB i alfa wybierz MFT, a urządzenie automatycznie wykona pomiary na wszystkich dostępnych częstotliwościach. Uruchom pomiar w trybie wieloczęstotliwościowym, gdy tylko jest to możliwe. Wymaga to danych ze wszystkimi dostępnymi częstotliwościami, a tym samym zapewnia większość spostrzeżeń.

W przypadku analizy mikroruchu wybierz RTC i dostosuj częstotliwość próbkowania. Standardowa rozdzielczość czasowa wynosi jeden herc, ale można ją zwiększyć, aby śledzić szybkie zmiany impedancji. Wartość tę można zwiększyć do 25 Hz dla z theta.

Aby sekwencyjnie mierzyć mikroruchy z wielu studzienek, wybierz menu pomocy. Następnie wybierz pokaż elementy menu paska narzędzi eksperta i uzyskaj i wielodołkowy zegar czasu rzeczywistego. W sekcji zbierania danych pamiętaj o określeniu limitu czasu w godzinach.

Podczas korzystania z tego ustawienia oprogramowanie zapyta o liczbę cykli po rozpoczęciu zbierania danych. W przypadku zbierania danych za pomocą SFT lub MFT należy wybrać przedział czasu między pomiarami określony w sekundach. Aby uzyskać maksymalne pobieranie danych, pozostaw tę opcję niezaznaczoną.

Teraz naciśnij start i określ, gdzie mają być przechowywane dane. Bieg jest zatrzymywany przez naciśnięcie przycisku Zakończ. Naciśnięcie pauzy spowoduje zatrzymanie akwizycji danych, ale zegar eksperymentalny będzie nadal działał.

Teraz wyjmij tablicę i pod okapem z przepływem laminarnym manipuluj studzienkami. Po zwróceniu macierzy do uchwytu kliknij sprawdź połączenie, aby zweryfikować połączenia elektryczne, a następnie wznów eksperyment, aby kontynuować zbieranie danych. Jeśli komórki nie muszą być sterylne po manipulacji, wówczas bodziec, taki jak trombina, może być dodany bezpośrednio do studzienki podczas pozyskiwania danych.

Tak wprowadzone wariacje można zaznaczyć na zegarze eksperymentalnym, naciskając znacznik i dodając komentarz. Inną opcją jest elektryczne nawijanie ogniw. Ustawienia tego wymagają pewnych poprawek, aby uzyskać krótki czas nawijania i nie jest to skuteczne zbyt długo, a elektrody mogą zostać uszkodzone.

Po prostu zacznij od domyślnych ustawień zapewnianych przez oprogramowanie i idź stamtąd. Przejdź do sekcji konfiguracji Wound electro parade i włącz wound. Teraz wybierz studnie do nawijania w konfiguracji studni.

Tylko sprawdzone studnie zostaną zranione. Kliknięcie przycisku aktywacji powoduje wyświetlenie wyskakującego okienka z prośbą o zranienie. Po zranieniu sprawdź, czy sygnał spada do wartości elektrody prawie bezkomórkowej.

Jeśli nie powtórzył zranienia w ogóle, aby pracować z danymi, użyj opcji eksportu danych i wybierz program Excel. Modelowanie RB i alfa można jednak wykonać z poziomu oprogramowania. Na podstawie danych MFT należy pamiętać, że modelowanie jest prawidłowe tylko w warstwach komórek konfluencji.

I nie zapomnij dodać odwołania bez komórek. Zacznij od automatycznego wybrania odniesienia bez komórek za pomocą funkcji wyszukiwania w sekcji modelowania i analizy skanowania częstotliwości. Zaakceptuj wartość za pomocą set.

Następnie naciśnij model, aby rozpocząć obliczenia. Nie przejmuj się, jeśli zajmie to kilka minut. Podczas typowego eksperymentu komórki przechodzą z fazy wzrostu do fazy plateau.

Kiedy dojdą do konfluencji, obrazy są pozyskiwane bezpośrednio z elektrody podczas tego procesu. Kolejnym etapem jest tworzenie i dojrzewanie bariery WE. Zranienie elektryczne jest następnie wykorzystywane do badania migracji komórek.

Po charakterystycznym spadku sygnału do linii podstawowej następuje ponowne ustanowienie stanu konfluencji. Wreszcie, reakcja na bodźce jest śledzona w czasie rzeczywistym. Tutaj zastosowano środek wazoaktywny trombinę.

Spowodowało to skurczenie się komórek, a tym samym przejściowe otwarcie małych szczelin w barierze, co spowodowało spadek rezystancji impedancyjnej, a pomiary pojemności dostarczają uzupełniających informacji na temat adhezji komórek i odporności na wzrost przy najbardziej czułym pomiarze. Częstotliwość reprezentuje jakość i funkcję bariery komórkowej i uwzględnia opór wobec przepływu prądu parakomórkowego i transkomórkowego. Kiedy ogniwa przyczepiają się do elektrod, ograniczają przepływ prądu, a pojemność proporcjonalnie spada.

Faza ta zapewnia ogólny pomiar pokrycia elektrodą i jest najlepiej określona ilościowo podczas rejestrowania pojemności przy częstotliwości wyższej niż 40 kiloherców. Rezystancja daje jasny obraz tego, jak dobre ogniwa mogą blokować przepływ prądu, a tym samym jakość bariery komórkowej. Dlatego komórki o różnych przejściach i różnych typach mają różne opory.

Nasze RB i alfa pomagają rozróżnić zrosty komórki, komórek i macierzy komórkowej. RB to rezystywność styków ogniwa komórkowego z przepływem prądu lub odwrotny pomiar przepuszczalności. Alfa jest miarą wkładów impedancji ze złączy elektrod ogniwa.

Zarówno wartości RB, jak i alfa można obliczyć z poziomu oprogramowania ISIS. Niewielkie wahania sygnału rezystancji mogą być spowodowane subtelnymi ruchami w warstwie komórek konfluencji lub mikroruchami. Można je mierzyć za pomocą jednej macierzy E na najbardziej czułej częstotliwości i analizować za pomocą szybkiej transformacji Fouriera w EIS, manipulacje programowe, które dają wgląd w zachowanie komórek, mogą być wykonane z precyzją.

Na przykład możliwe jest wykonanie 250-mikronowej rany elektrycznej, która zamknie się w ciągu kilku godzin, w celu zbadania migracji komórek. Spektroskopia impedancyjna doskonale nadaje się również do analizy wpływu dodanych substancji. Jak wspomniano wcześniej, trombina sprawia, że bariera komórkowa jest hiperprzepuszczalna poprzez obniżenie podstawnego napięcia komórkowego za pomocą inhibitora kinazy ARO, działanie trombiny może być zmniejszone Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, że ESIS jest niezwykle wrażliwy na zmiany w środowisku komórki, takie jak temperatura, pH, wyczerpanie pożywki i tak dalej.

Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie ologii do badania trendów i wpływu czynników wazoaktywnych na hodowle komórek konfluencji w czasie rzeczywistym.