Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie pomiaru impedancji podłoża komórkowego, znanego jako ECIS, do charakterystyki zachowań komórkowych. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek na elektrodach w matrycy i wykonywanie pomiarów w różnych trybach w celu ilościowego określenia tworzenia się, dojrzewania i funkcjonowania bariery śródbłonka; następnie przeprowadza się manipulacje, takie jak uszkadzanie elektryczne i dodawanie stymulantów, aby przetestować ruchliwość komórek i funkcję bariery. Uzyskane wyniki opisują adhezję, proliferację i migrację komórek, wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-podłoże w oparciu o ECIS.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórki, takie jak zapewnienie generowania danych ilościowych w czasie rzeczywistym oraz charakteryzacja komórek w ich naturalnym stanie konfluencji w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ teoria podstawowa wydaje się złożona, a przed rozpoczęciem eksperymentu należy zapoznać się z kilkoma podstawowymi kwestiami. Na początek matryce muszą zostać oczyszczone i ustabilizowane, aby zapobiec dryftowi elektrody, poprawić powtarzalność oraz zwiększyć stosunek siły sygnału.

Należy zatem dodać 200 µL 10 mM EL ine do każdej studzienki macierzy ośmiostudzienkowej. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej należy usunąć EL cystynę, wykonując dwa płukania wodą ultrapure, a nie buforami fosforanowymi. Ponadto nie należy wystawiać elektrod na działanie roztworów zawierających surowicę przed powlekaniem, ponieważ mogą one zakłócić absorpcję białek. Następnie do każdej studzienki należy dodać 200 µL podgrzanej 1% żelatyny i inkubować macierz przez pół godziny w temperaturze 37 °C.

Aby usunąć żelatynę, należy użyć wody ultrapure i nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni elektrod. Następnie należy wypełnić studzienki 400 µL pełnej pożywki hodowlanej, która może teraz zawierać surowicę. Umieść matrycę w uchwycie.

Sprawdź dziewięć złotych kwadratów. Powinny one stykać się z pinami POGO. Ostrożnie zamocuj matrycę ręcznie, dokręcając śrubę regulacyjną w komputerze.

Otwórz oprogramowanie pomiarowe. Naciśnij przycisk konfiguracji, a następnie w sekcji zbierania danych zaznacz opcję szybkiego pomiaru impedancji każdego dołka przy domyślnej częstotliwości 4, 000 hertz. Wartości zostaną zapisane w sekcji komentarzy.

Upewnij się, że w sekcji konfiguracji studniek na schemacie macierzy poprawnie wybrano typ zastosowanej macierzy EIS. Kolory czerwony i zielony wskazują sprawność połączeń. Jeśli czyszczenie i kodowanie przebiegły pomyślnie, osiem macierzy W one E sys powinno wykazać wartość około pięciu do sześciu NANOFARAD, podobnie jak osiem macierzy W 10 E.

Rezystancja bazowa od 50 do 60 nanofarad przed wysianiem komórek wynosi zatem około 2000 omów. Aby zamodelować dane przy użyciu RB alpha i cm, rozpocznij pomiar MFT z użyciem matrycy z medium. Zbierz dane bez komórek przez 15 minut, a następnie zakończ eksperyment, aby dodać komórki.

Teraz należy wyjąć matrycę i nanieść 400 µL zawiesiny pojedynczych komórek do każdej studni. Aby badać wzrost komórek, należy nanieść 10 000 komórek na cm², a aby rozpocząć z populacją niemal konfluencjalną, należy nanieść 60 000 komórek na cm². Po umieszczeniu matrycy w uchwycie, w sekcji konfiguracji studni, należy wybrać studnie do pomiaru.

Następnie przejdź do opcji zbierania danych i wybierz tryb pomiaru dla serii czasowej o stałej częstotliwości, wybierając SFT, a następnie określ częstotliwość pomiaru w celu zmierzenia pokrycia elektrody i modelu RB oraz alfa, wybierając MFT; urządzenie automatycznie wykona pomiary przy wszystkich dostępnych częstotliwościach. Jeśli to możliwe, przeprowadzaj pomiar w trybie wieloczęstotliwościowym. Wymaga to danych dla wszystkich dostępnych częstotliwości, co zapewnia najpełniejszy wgląd w wyniki.

W celu analizy mikroruchów należy wybrać RTC i dostosować częstotliwość próbkowania. Standardowa rozdzielczość czasowa wynosi 1 Hz, jednak można ją zwiększyć, aby monitorować szybkie zmiany impedancji. W przypadku z theta wartość tę można zwiększyć do 25 Hz.

Aby sekwencyjnie zmierzyć mikroruchy w wielu dołkach, wybierz menu pomocy. Następnie wybierz opcję pokazuj elementy paska narzędzi eksperta, a potem akwizycja i wielodołkowe RTC. W sekcji zbierania danych należy określić limit czasu w godzinach.

Przy użyciu tego ustawienia oprogramowanie poprosi o podanie liczby cykli po rozpoczęciu akwizycji danych. Podczas gromadzenia danych za pomocą SFT lub MFT należy wybrać odstęp czasu między pomiarami określony w sekundach. Aby uzyskać maksymalną akwizycję danych, pozostaw tę opcję niezaznaczoną.

Teraz naciśnij start i określ miejsce zapisu danych. Pomiar zostaje zatrzymany po naciśnięciu przycisku finish. Po naciśnięciu pause akwizycja danych zostanie wstrzymana, ale zegar eksperymentalny będzie nadal odliczał czas.

Teraz należy wyjąć matrycę i w komorze z laminarnym przepływem powietrza przeprowadzić manipulacje w dołkach. Po umieszczeniu matrycy z powrotem w uchwycie, kliknij check connection, aby zweryfikować połączenia elektryczne, a następnie resume experiment, aby kontynuować zbieranie danych. Jeśli komórki nie muszą pozostać sterylne po manipulacji, to podczas akwizycji danych do dołka można bezpośrednio dodać stymulator, taki jak trombina.

Wprowadzone w ten sposób wariacje można zaznaczyć na zegarze eksperymentalnym, naciskając przycisk mark i dodając komentarz. Inną opcją jest elektryczne uszkodzenie komórek. Ustawienia tej metody wymagają precyzyjnego dostrojenia, aby uzyskać krótki czas uszkodzenia, ponieważ zbyt długi czas jest nieskuteczny i może doprowadzić do uszkodzenia elektrod.

Zacznij od domyślnych ustawień dostarczonych przez oprogramowanie, a następnie przejdź do dalszych kroków. Przejdź do sekcji konfiguracji elektroforu rany (wound electro parade setup) i włącz funkcję rany (wound). Teraz w konfiguracji studzienek (well configuration) zaznacz studzienki, w których zostanie wykonana rana.

Uszkodzeniu ulegną tylko zaznaczone studzienki. Kliknięcie przycisku aktywuj otwiera okno pop-up z prośbą o wykonanie uszkodzenia. Po uszkodzeniu należy sprawdzić, czy sygnał spadł do wartości zbliżonej do wartości dla elektrody niemal pozbawionej komórek.

Jeśli dane nie zostały powtórzone w celu ogólnego przetworzenia, należy skorzystać z opcji eksportu danych i wybrać format Excel. Modelowanie RB oraz alpha może być jednak przeprowadzone bezpośrednio w oprogramowaniu. W przypadku danych MFT należy pamiętać, że modelowanie jest prawidłowe wyłącznie dla konfluentnych warstw komórek.

Należy również dodać referencję bezkomórkową. W sekcji modelowania i analizy skanowania częstotliwości należy rozpocząć od automatycznego wybrania referencji bezkomórkowej za pomocą funkcji wyszukiwania. Wartość tę należy zatwierdzić przyciskiem „set”.

Następnie naciśnij przycisk model, aby rozpocząć obliczenia. Nie należy niepokoić się, jeśli proces ten potrwa kilka minut. W typowym eksperymencie komórki przechodzą z fazy wzrostu do fazy plateau.

Po osiągnięciu konfluencji, w trakcie tego procesu obrazowanie jest prowadzone bezpośrednio z elektrody. Kolejnym etapem jest formowanie i dojrzewanie bariery EC. Następnie wykorzystuje się uszkadzanie elektryczne w celu zbadania migracji komórek.

Charakterystyczny spadek sygnału do poziomu linii bazowej następuje przed ponownym ustanowieniem stanu konfluencji. Na koniec w czasie rzeczywistym śledzi się odpowiedź na bodźce. W tym przypadku zastosowano czynnik wazoaktywny – trombinę.

Wywołało to skurcz komórek, a tym samym przejściowe otwarcie niewielkich szczelin w barierze, co spowodowało spadek impedancji; pomiary rezystancji i pojemności dostarczają uzupełniających informacji o adhezji komórek i oporze wzrostu podczas najbardziej czułego pomiaru. Częstotliwość odzwierciedla jakość i funkcję bariery komórkowej oraz uwzględnia opór dla parakomórkowego i transkomórkowego przepływu prądu. Gdy komórki przywierają do elektrod, ograniczają przepływ prądu, a pojemność spada proporcjonalnie.

Ta faza zapewnia ogólny pomiar pokrycia elektrody i jest najlepiej kwantyfikowana podczas pomiaru pojemności przy częstotliwości wyższej niż 40 kilohertz. Rezystancja daje jasny obraz tego, jak skutecznie komórki potrafią blokować przepływ prądu, a tym samym informuje o jakości bariery komórkowej. W związku z tym komórki o różnych numerach pasaży i różnych typach wykazują różną rezystancję.

Nasze parametry RB oraz alfa pomagają rozróżnić adhezje międzykomórkowe od adhezji komórek do macierzy. RB to rezystywność kontaktów międzykomórkowych dla przepływu prądu, czyli odwrotna miara przepuszczalności. Alfa jest miarą wkładu impedancyjnego z połączeń na styku komórka-elektroda.

Zarówno wartości RB, jak i alfa można obliczyć w oprogramowaniu ISIS. Małe fluktuacje sygnału rezystancji mogą wynikać z subtelnych ruchów w konfluentnej warstwie komórek lub mikroruchów. Można je zmierzyć za pomocą jednej macierzy E przy najczulszej częstotliwości i przeanalizować za pomocą szybkiej transformacji Fouriera w oprogramowaniu EIS; manipulacje, które pozwalają zrozumieć zachowanie komórek, mogą być wykonywane z precyzją.

Na przykład, w celu badania migracji komórek, możliwe jest wykonanie elektrycznego zranienia o szerokości 250 micron, które zamknie się w ciągu kilku godzin. Spektroskopia impedancyjna nadaje się również do analizy wpływu dodanych substancji. Jak wspomniano wcześniej, trombina zwiększa przepuszczalność bariery komórkowej poprzez obniżenie podstawowego napięcia komórek; przy zastosowaniu inhibitora kinazy ARO, efekt trombiny mógłby zostać osłabiony. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że ESIS jest niezwykle wrażliwa na zmiany w środowisku komórkowym, takie jak temperatura, pH, wyczerpanie pożywki i tak dalej.

Po opracowaniu techniki tej, utorowała ona drogę badaczom z zakresu ologii do badania trendów i efektów działania czynników wazoaktywnych na konfluentne kultury komórkowe w czasie rzeczywistym.